Labinfo

LNRN A T I O N A L ER E F E R E N T I ELABORATORIA

L A B O R ATO I R E SN A T I O N A U XD E R E F E R E N C ENRLN A T I O N A L

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AFSCACA-Botanique Food Safety Center, Boulevard du Jardin botanique 55, 1000 Bruxelles

Publication destinée aux laboratoires de sécurité alimentaire agréés

PUBLICATION SEMESTRIELLE - N° 12 JUILLET 2014

Edite

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4 Dépistage des mycotoxines

10 Dépistage des porteurs de BVD chez les veaux nouveaux-nés dans le secteur bovin belge

14 Méthodes de dépistage pour la détermination des protéines animales

17 Exigences relatives aux tests de dépistage qualitatif et aux critères spécifi ques applicables aux tests de dépistage des antibiotiques dans le lait

20 Screening pour les résidus de pesticides

23 Méthode PCR espèce-spécifi que pour la détection des espèces de moutarde (Sinapis alba, Brassica nigra, Brassica juncea) comme allergènes potentiels “cachés” dans l’alimentation

29 Migration de photo-initiateurs depuis les emballages en carton

32 Test inter-laboratoires du LNR-OGM belge au sujet du système CoSYPS (combinatory sybr®green pcr screening) 36 Workshops & Symposia

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LabInfoPublication destinée aux laboratoires de sécurité alimentaire agréés

Equipe de rédactionDirk Courtheyn, Marnix De Gruyter, Conny De Schepper, Alain Dubois, Marc Evrard, Geert Janssens, Alain Laure, Kathleen Martens, Eva Wevers et Marie-Christine Wilem

Ont participé à ce numéro :Geert De Poorter, Bart Huybrechts, Miet De Baere, Jeroen Vancutsem, Leo van Raamsdonk, Monique Bremer, Marc Evrard, Wim Reybroeck, Laure Joly, Philippe Szternfeld, Vincent Hanot, Taverniers Isabel, Van Droogenbroeck Bart, De Loose Marc, Kathy Van Den Houwe, Els Van Hoeck, Caroline Evrard, Joris Van Loco, Fabien Bolle, Nina Papazova, Sylvia Broeders, Nancy Roosens, Isabel Taverniers, Marc De Loose, Eric Janssen, Gilbert Berben, Ronny Martens et Ingrid De Vuyssere

TraductionService de traduction de l’AgenceEquipe de rédaction

Photos et illustrationsFournies par les laboratoires

Mise en pageGert Van Kerckhove

Secrétariat de rédactionLabInfop.a. D. CourtheynAFSCACA-Botanique – Food Safety Center4ème étage, bureau K04/120218Boulevard du Jardin botanique 551000 BruxellesTel 02.211.87.33dirk.courtheyn@favv.be

LNRN A T I O N A L ER E F E R E N T I ELABORATORIA

L A B O R ATO I R E SN A T I O N A U XD E R E F E R E N C ENRLN A T I O N A L

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Cher lecteur,

2014 a déjà fait un certain nombre de victimes dans le monde en éternel mouvement du laboratoire. La concurrence est menée sur le fil du rasoir. C’est pourquoi il importe que les autorités réalisent correctement leurs tâches de contrôle afin de créer ce faisant un “level playing field”.Dans ce cadre, il est important de signaler qu’après une enquête très longue et appro-fondie, l’autorité en matière de concurrence s’est exprimée dans le cadre des analyses EST. L’accusation a été estimée non fondée dans sa totalité et aucune infraction à la loi en matière de concurrence n’a été constatée. Cela marque la fin d’un temps exaspérant pour les laboratoires EST et cette fâcheuse période peut finalement être clôturée.Nous pouvons tous être fiers de la manière dont la Belgique a abordé la crise EST et du fait que la collaboration entre autorités et laboratoires externes puisse continuer à être perçue comme efficace et novatrice.

Dans le dernier Labinfo, je mentionnais déjà que le client est de plus en plus exigeant: il veut des temps de rotation continuellement plus courts, des limites de détection encore plus faibles (mais pas toujours!), encore plus de composants dans le même run, un service plus rapide après le résultat (explications, délivrance d’avis, notification obligatoire,...). Il s’agit d’items relevant du management quotidien d’un laboratoire fonctionnant bien et de manière flexible. C’est pourquoi ce Labinfo est consacré aux méthodes de screening.

Entre-temps la procédure pour l’attribution du programme de contrôle (analyses partim) avance bien. J’invite chaque laboratoire agréé à y participer. Nous souhaitons continuer à collaborer dans une bonne entente avec nos partenaires signataires du contrat cadre. Comme certains l’ont déjà appris, je quitterai l’AFSCA le 1er août 2014 afin d’intégrer la fonction de directeur général Qualité et Sécurité auprès du SPF Économie, Énergie, PME et Classes moyennes.Après 8,5 ans à la tête de l’Administration des Laboratoires, il est temps de faire souffler un vent nouveau. Je souhaite remercier chaleureusement tous mes collaborateurs car ils ont rendu mon travail plus aisé: l’administration est devenue une référence et notre approche innovante au sein de l’AFSCA est source d’inspiration dans le pays comme à l’étranger. J’ai toujours essayé de respecter les accords convenus avec les laboratoires externes et ils m’ont également beaucoup appris. Je continuerai, à l’avenir, à garder contact avec les laboratoires de manière générale via Belac qui relève de mes compétences futures.Impossible encore pour l’instant de voir dans ma boule de cristal qui sera mon successeur. Nous attendons donc la clôture de la procédure de sélection au Selor et la création d’un gouvernement de plein exercice. Bert Matthijs me remplace provisoirement ad interim.

Je vous souhaite bonne lecture de cette douzième édition du Labinfo.

Geert De PoorterDirecteur général Laboratoires

EditorialPublication destinée aux laboratoires de sécurité alimentaire agréés

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Dépistage des mycotoxines

Bart HuybrechtsCentre d’Etudes et de Recherches vétérinaires et agrochimiques (CODA-CERVA)Direction opérationnelle Sécurité chimique de la chaîne alimentaire,Service Toxines et Substances naturelles Laboratoire national de référence pour les MycotoxinesLeuvensesteenweg 17, 3080 Tervuren, Belgique

Introduction

Les problèmes de sécurité alimentaire sont essentiellement associés à la présence potentielle de contaminants issus des activités humaines, tels que les pesticides, par exemple. Une attention bien moindre est prêtée aux contaminants d’origine naturelle. Les mycotoxines sont un bon exemple de contaminant ‘naturel’ : il s’agit des substances toxiques produites par les moisissures. Début de l’année dernière, les mycotoxines ont fait parler d’elles lorsque du maïs-fourrage importé d’Europe de l’Est et contaminé par l’aflatoxine, une des mycotoxines les plus connues et les plus toxiques, est entré dans l’alimentation de bêtes laitières. Les moisissures des familles Aspergillus, Fusarium et Penicillium sont les principaux producteurs de mycotoxines dans les denrées alimentaires. Une première condition pour limiter autant que possible la présence de mycotoxines dans l’alimentation est de prévenir le développement des moisissures à tout moment de la production et de la transformation. Le stoc-kage de la récolte représente également un moment critique ; la température et le taux d’humidité doivent être contrôlés en permanence. Les mycotoxines sont des composés très stables qui résistent à la plupart des procédés de préparation et de transformation. Cela signifie que les mycotoxines peuvent encore être présentes alors même que la moisissure qui les a produites ne peut plus être décelée. De plus, les mycotoxines peuvent pénétrer dans la chaîne alimentaire par différentes voies. Outre la possibilité d’une contamination primaire, une contamination secondaire peut également se produire, avec, par exemple, l’introduction d’aflatoxines dans la chaîne alimentaire humaine par le biais du lait.

Tests rapides versus méthodes de confirmation

Étant donné qu’une contamination par ces toxines ne peut jamais être totalement exclue et qu’une décontami-nation systématique ne constitue pas une option acceptable en raison de la dégradation olfactive inévitable du produit, il est recommandé de surveiller la présence de ces toxines dans les denrées alimentaires. Il n’est pas si évident de développer des méthodes d’analyse capables de détecter ces toxines de manière fiable et en routine, dans des matrices diverses (des céréales à la viande, en passant par le miel), d’autant plus que la norme applicable à plusieurs de ces toxines peut être relativement basse. Le fait qu’une méthode d’analyse nouvellement dévelop-pée soit adaptée ou non à une utilisation commerciale en routine est déterminé par trois critères pratiques : (a) la fiabilité, c.-à-d. l’exactitude et la précision (b) la rapidité et donc, dans une large mesure, le prix de l’analyse (c) la possibilité de réaliser l’analyse “sur le terrain”. Sur base de ces critères, les techniques d’analyse des mycotoxines peuvent être classées en deux catégories : (1) les tests rapides de dépistage et (2) les méthodes de confirmation. Tandis que les méthodes de la catégorie 1 ont principalement pour but de détecter les toxines le plus rapidement possible, de préférence déjà sur le terrain et de manière plutôt qualitative, c.-à-d. en donnant une réponse “oui” ou “non”, les méthodes de la catégorie 2 sont essentiellement utilisées pour confirmer un résultat positif obtenu avec un test rapide, et/ou pour fournir un résultat quantitatif plus précis (“quelle est la quantité exacte présente ?”). Les deux catégories de méthodes ont en commun qu’elles nécessitent une étape d’extraction, lors de laquelle la toxine est extraite de l’échantillon au moyen d’un solvant (p.ex. alcool). Leur différence fondamentale est la manière dont se fait la détection.

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Tests rapides

La majorité des tests rapides se basent sur les anticorps (essais immunologiques) pour la détection et diff èrent essentiellement entre eux suivant la manière dont est utilisé l’anticorps. Trois formats sont actuellement com-mercialisés : (1) les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent-assays) (2) les tests à bandelette réactive et à fl ux latéral et (3) les FPIA (immunoessais à polarisation de fl uorescence). Ces derniers ne sont presque plus utilisés en raison de leur complexité. Dans les tests ELISA, la toxine doit se lier à un certain nombre de sites de liaison d’un anticorps dans la solution d’extraction, immobilisés dans une plaque multititre, ce qui entraîne une extinction du signal ; en d’autres termes, moins le test émet de signal, plus la toxine est présente. Un inconvénient de ce test est qu’il réclame une main-d’œuvre relativement élevée et qu’il est diffi cilement applicable sur le terrain. Les tests à bandelette réactive et à fl ux latéral sont des tests immunochromatographiques où la présence de la toxine est mesurée au moyen d’une bandelette jetable. Ces bandelettes contiennent un anticorps lié à une particule de couleur ; lorsque l’agent d’extraction est ajouté, la toxine présente se lie à la particule de couleur, la bandelette de papier se colore et démontre ainsi la présence de la toxine. Le grand avantage de ce test par rapport au test ELISA est qu’il peut être appliqué sur le terrain, raison pour laquelle il a récemment fortement gagné en popularité. Ces tests immunologiques ont cependant un point faible : les autres composants présents dans l’échantillon sont susceptibles d’infl uencer la liaison de l’anticorps et d’ainsi donner lieu à un faux négatif ou à un faux positif.

Figure 1 : Test rapide de type ELISA avec plaque de titration de 96 puits. Chaque position exige plusieurs étapes de pipetage pour parvenir à un résultat.

Figure 2 : Test bandelette. La solution d’échantillon peut directement être appli-quée sur cette bandelette. Une colora-tion indique ensuite le résultat positif ou négatif.

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Nouvelles tendances

L’évolution récente des méthodes de détection peut être perçue comme la réponse à deux demandes conflic-tuelles : d’une part, la demande de méthodes toujours plus rapides et toujours plus simples, avec une meilleure applicabilité “sur le terrain”, et d’autre part l’évolution vers des méthodes de référence davantage fiables et capables de détecter le plus de toxines possible en une seule analyse. Indépendamment de ceci, on a également une demande de méthodes d’extraction nécessitant des agents organiques d’extraction moins nocifs, sans pour autant toucher à la qualité des analyses.

Tests rapides

Tests à flux multi-toxines (multiplex)

Grâce à leur manipulation beaucoup plus aisée, les tests rapides sous la forme de bandelettes ont rapidement gagné des parts de marché, comparativement aux tests ELISA. Un inconvénient important qu’ils partageaient avec les tests ELISA est qu’ils ne pouvaient détecter qu’une seule mycotoxine par analyse. Récemment, plusieurs tests à flux capables de mesurer plusieurs toxines au cours d’une même analyse ont été mis à disposition sur le marché. Leur inconvénient, cependant, est qu’ils sont pour l’instant encore moins sensibles que les tests à bande-lette réactive mono-toxine.

Polymères à empreintes moléculaires (MIP) & Aptamères

Jusqu’il y a peu, les tests rapides étaient basés sur des anticorps d’origine biologique (p.ex. de lapins, de souris) mais, récemment, des tests rapides à base d’éléments de liaison non biologiques ont été commercialisés. Les MIP sont des polymères avec une mémoire moléculaire intégrée qui, à l’instar des anticorps, ont la capacité de lier spé-cifiquement une toxine via un mécanisme “clé-serrure”. La stabilité, la réutilisabilité, la reproductibilité, les faibles coûts de production et l’absence d’éventuelles questions éthiques autour de l’utilisation d’animaux de laboratoire constituent des atouts commerciaux importants. Des aptamères (éléments de liaison basés sur l’ADN) sont déjà utilisés à l’échelle du laboratoire comme alternative aux anticorps mais leur avenir commercial est encore incertain.

Méthodes rapides de spectroscopie

Les techniques spectroscopiques où, par exemple, un laser infrarouge est dirigé sur l’échantillon et où l’absorption spécifique d’une certaine longueur d’onde de la lumière révèle la présence d’une toxine, possèdent un très grand atout : elles permettent d’omettre l’étape d’extraction. Cela ouvre un nombre infini de nouvelles possibilités : par exemple, des grains de maïs peuvent être soumis à un screening individuel tandis qu’ils passent sur un tapis rou-lant et ainsi être éliminés individuellement, ce qui évite la destruction de tout un lot. Cependant, cette technique est relativement sensible aux interférences, une conséquence inévitable de l’absence de toute forme de prépara-tion de l’échantillon, et la technologie utilisée est relativement coûteuse. Par contre, une fois mises en œuvre, ces analyses se déroulent de façon entièrement automatique.

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Biocapteurs

Un biocapteur est un appareil permettant de détecter des molécules, qui combine un composé biologique comme élément sensible à une lecture physico-chimique. Un biocapteur se compose de 3 parties : un élément biologique sensible, un convertisseur (transducteur) et un détecteur physico-chimique. Si la toxine est présente, elle se lie à l’élément et provoque ainsi une altération physico-chimique dans le détecteur. Bien que cette tech-nologie ait jusqu’à présent donné des résultats prometteurs à l’échelle du laboratoire, elle ne semble pour le moment pas présenter d’avantages concluants par rapport aux technologies existantes et elle n’est pas disponible sur le marché.

Bead-based assays

Dans les bead-based assays, des petites billes (beads) codées avec une couleur ou des billes magnétiques sont ajoutées à une solution d’échantillon. Outre leur codage d’identification, ces billes sont également marquées au moyen d’un anticorps dirigé contre une certaine toxine. Les altérations causées aux billes par le complexe anti-corps-antigène peuvent alors être mesurées au moyen d’un laser, par exemple. Un des grands avantages de cette technologie est qu’elle est particulièrement bien adaptée aux analyses multi-toxines. Des kits commerciaux sont déjà attendus dans le courant de cette année.

Spectrométrie de masse à haute résolution

Dans le domaine des méthodes de référence, la spectrométrie de masse se profile indubitablement comme la référence en matière de détection.

La spectrométrie de masse à haute résolution (HR-MS) met en œuvre une très haute résolution de masse. Afin d’identifier un composé de manière univoque, le spectromètre de masse doit pouvoir déterminer la masse du composé le plus précisément possible, c’est-à-dire posséder une haute précision de masse, et en même temps pouvoir différencier cette masse le plus précisément possible des autres masses moléculaires, c’est-à-dire possé-der une résolution la plus grande possible. Il faut ici bien garder à l’esprit qu’une résolution la plus haute possible est particulièrement utile mais qu’il ne s’agit pas d’une condition indispensable, ni d’une condition suffisante, pour obtenir une précision de masse satisfaisante.

Les spectromètres de masse à haute résolution actuellement disponibles sur le marché peuvent être classés en quatre catégories, suivant leur principe d’action : (1) les spectromètres de masse à secteur magnétique (2) les spectromètres de masse à temps de vol (Time-of-Flight, TOFMS) (3) les spectromètres de masse à résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FT-ICR) (4) l’Orbitrap à transformée de Fourier.Les deux premiers types de spectromètre de masse sont généralement comptés parmi les spectromètres de masse à scanning continu (secteur magnétique) ou semi-continu (TOFMS) ; les deux derniers sont ce qu’on appelle des trappes ioniques. Dans le spectromètre de masse à secteur magnétique, une molécule chargée élec-triquement est tout d’abord activée jusqu’à une très haute vitesse, après quoi elle doit passer par un champ ma-gnétique situé perpendiculairement à sa trajectoire ; les molécules les plus lourdes, en raison de leur plus grande inertie de masse, seront déviées différemment des molécules plus légères. Jusque dans les années nonante, les secteurs magnétiques étaient l’outil privilégié lorsqu’une haute résolution était requise dans un environnement de routine. À l’heure actuelle, ils ont en grande partie disparu en raison d’une série d’inconvénients : le coût

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d’investissement est très élevé, et ils ne peuvent scanner que masse par masse et non pas établir en une fois un profil complet de l’échantillon. En outre, ils ne peuvent pas être combinés à la chromatographie en phase liquide mais uniquement à la chromatographie en phase gazeuse. Les spectromètres de masse à temps de vol utilisent le principe selon lequel, si on donne la même énergie à deux molécules, la masse la plus lourde va se déplacer plus lentement au travers d’un tube sous vide qu’une molécule plus légère. Ces spectromètres de masse ont, depuis les années nonante, plus ou moins repris le rôle des secteurs magnétiques en tant qu’outil à haute résolution grâce à une série d’avantages : coût d’investissement relativement bas, vitesse de scanning très élevée, robustesse (principe d’action très simple), possibilité d’être combinés à presque toutes les méthodes de préparation d’échan-tillon et de séparation d’échantillon. Ils présentent néanmoins deux grands inconvénients : leur résolution est très basse, selon les normes HR-MS, et leur sensibilité diminue fortement si l’utilisateur demande une plus grande résolution. Bien que l’on ait travaillé à ce problème ces dernières années, par exemple avec la technologie du réflectron, la technologie TOFMS est pour l’instant encore à la traîne par rapport au système de trappe à ions du point de vue de la résolution de masse.

Les spectromètres de masse dits trappes à ions, tels que le spectromètre de masse ICR ou Orbitrap, offrent de très hautes résolutions, jusqu’à 100 fois plus élevées que les autres types. Avec ces spectromètres de masse à transformée de Fourier, les ions sont capturés dans une cage en métal (trappe), après quoi ils sont soumis à un champ magnétique (ICR) ou à un champ électrique à courant continu (Orbitrap). La manière dont ils réagissent à l’exposition à ce champ est dictée uniquement par leur masse. L’énergie éventuelle que les ions reçoivent par exemple pendant l’introduction dans le détecteur n’a pas d’incidence sur le mesurage. D’où leur principale qualité : une résolution extrêmement élevée. Étant donné qu’ils stockent des ions dans une trappe et, de cette manière, les concentrent pour ainsi dire, ils présentent en général une excellente sensibilité qui, en plus, ne diminue pas lorsqu’une plus grande résolution est demandée. Par contre, ils commencent à scanner plus lentement si une plus grande résolution est demandée, un inconvénient que n’a pas le TOFMS, ce qui complique leur intégration avec les dernières techniques chromatographiques ultra rapides. De plus, ils ne concentrent pas seulement les molé-cules d’analyte souhaitées dans leur trappe mais toutes les molécules qui proviennent de l’échantillon. La trappe peut ainsi se retrouver surchargée, ce qui entraîne une précision de masse erronée (effet de matrice). Cela peut être évité en ne laissant par exemple que 1% des ions entrer dans la trappe, mais alors la sensibilité s’en retrouve bien entendu diminuée. La règle suivante s’applique dès lors en spectrométrie de masse : une plus grande sen-sibilité signifie soit une moindre résolution dans le cas des spectromètres de masse à scan continu (quadripôle, secteur) ou semi-continu (TOFMS), soit des faibles vitesses de scan dans le cas des spectromètres de masse avec trappe à ions.

La principale différence entre l’ICR et l’Orbitrap est le champ auquel sont soumis les ions. Dans le cas de l’ICR, il s’agit d’un champ magnétique extrêmement puissant. Ce qui génère les résolutions les plus élevées actuellement disponibles dans les spectromètres de masse commercialisés. Les aimants coûtent cependant très cher (un ICR typique coûte plus de 2.000.000 euros) et sont très fragiles. De plus, l’ICR est trop lent pour pouvoir être combiné aux nouvelles techniques chromatographiques rapides. Il est donc en grande partie inapproprié pour les analyses de routine.

L’Orbitrap est le dernier des rejetons dans les spectromètres de masse à haute résolution, il soumet les ions à un champ électrique à courant continu plutôt qu’à un champ magnétique. Étant donné qu’un champ électrique à courant continu est “plus pur” qu’un champ magnétique, il possède une résolution plus élevée que l’ICR, du moins en théorie ; il y a pour le moment encore des limites techniques à la production de la trappe proprement dite, qui entravent cette résolution. La vitesse de scan relativement lente typique des spectromètres de masse à transformée de Fourier, une opération mathématique où le signal de ces détecteurs, lié au temps, est transposé en une lecture de masse, entre ici également en jeu. On peut augmenter leur vitesse de scan, sans pour autant réduire la résolution, en diminuant la taille physique de la trappe mais cela les rend alors plus sensibles aux effets de surcharge dans la trappe, avec pour conséquence une inexactitude de la masse (et des résultats faux positifs ou faux négatifs). En tout cas, la génération actuelle peut être combinée aux techniques chromatographiques de

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séparation. On s’attend à ce que d’ici quelques années, les Orbitraps dépassent les ICR du point de vue de la réso-lution, et ce pour seulement une fraction du coût des ICR. Ajoutez à cela une sensibilité actuellement meilleure que les TOFMS et presque aussi bonne que les spectromètres de masse quadripôle, et il n’est donc pas étonnant que beaucoup considèrent cette technologie comme l’avenir de la HR-MS.

La spectrométrie de masse à haute résolution ouvre une perspective très intéressante : le screening dit générique ou non ciblé, où le détecteur scanne en continu un large champ de masses moléculaires pendant l’analyse de l’échantillon. De cette manière, une sorte de profi l complet de contamination de l’échantillon peut être établi, incluant non seulement les mycotoxines mais aussi les toxines végétales par exemple, les pesticides, les fongi-cides, etc. Une analyse rétroactive fait ici également partie des possibilités, par exemple si un client demande une analyse supplémentaire (suite à une nouvelle réglementation, par exemple), ces informations peuvent facilement être récupérées au moyen d’un logiciel pour les échantillons déjà analysés. En outre, cette technologie permet aussi d’examiner, en plus des toxines, les métabolites de celles-ci. Bien souvent, les toxines comme les toxines de moisissures sont modifi ées par la plante en un produit moins nocif pour elle, mais lorsque celle-ci se retrouve dans le système digestif de l’homme, les toxines sont susceptibles de retrouver leur forme initiale (supposée plus toxique). Ces métabolites ne sont toutefois pas détectés par les techniques d’analyse classiques (toxines “masquées”). La spectrométrie HR-MS permet d’en eff ectuer un screening en routine. Les limites de détection de cette approche restent cependant relativement élevées, il faut donc examiner application par application si cette approche fonctionne ou non. Une limite supplémentaire est le développement encore à la traîne du logiciel adapté ; le screening manuel de centaines de composants dans chaque échantillon n’est pas applicable dans un environnement de routine.

Figure 3 : Spectromètre de masse orbitrap de Thermo Fisher Scientifi c

Figure 4 : Spectre de masse avec résolution 100000 (au-dessus) et 10000 (en-dessous). On voit clairement que la plus forte résolution de masse donne lieu à des pics plus étroits. Cela signifi e que le spectromètre de masse peut déterminer la masse exacte avec plus de précision avec un plus faible risque de résultats faux positifs ou faux négatifs.

Bart.Huybrechts@coda-cerva.be

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Dépistage des porteurs de BVD chez les veaux nouveaux-nés dans le secteur bovin belge

Miet De BaereCODA-CERVADirection opérationnelle maladies viralesUnité maladies virales enzootiques et (ré)émergentes

Introduction

La diarrhée virale bovine ou BVD est une maladie virale qui touche les bovins et qui est causée par le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV). Tout comme le Border Disease Virus (BDV) et le virus de la peste porcine clas-sique (CSFV), le BVDV appartient au genre pestivirus de la famille des Flaviviridae. Ce virus est endémique dans la plupart des pays producteurs de bovins et occasionne de lourdes pertes économiques dans le monde entier. Le BVDV peut se manifester de différentes manières dans une exploitation bovine, ce qui complique souvent la réalisation d’un diagnostic rapide. En effet, malgré le nom donné au virus, l’absence de diarrhée n’exclut pas la circulation du BVDV dans l’exploitation. La présence de la BVD dans une exploitation peut aussi bien être clinique que subclinique, et peut entraîner une mortalité, principalement chez les veaux. En outre, elle peut donner lieu à des troubles de la reproduction et causer des pertes de production, telles que diminution de la production de lait, animaux chétifs, ralentissement de la croissance des animaux. Le virus entraîne également une baisse des défenses immunitaires et une immunosuppression générale, ce qui rend le bovin infecté plus sensible à toutes sortes d’infections secondaires telles que diarrhée, problèmes de santé au niveau des mamelles, gale et troubles respiratoires. Il est donc difficile de donner une description d’un syndrome “typique” de la BVD ; il convient souvent de penser à la BVD lorsque les diagnostics élémentaires établis sur base de signes cliniques bien définis s’avèrent erronés.

Infection transitoire versus infection persistante

Lorsqu’un bovin est infecté pour la première fois par le virus BVD après la naissance, quel que soit l’âge, on observe une infection aiguë transitoire accompagnée ou pas de signes cliniques. En l’absence de complications, l’animal se rétablit dans les deux semaines et il aura développé des défenses immunitaires contre le virus de la BVD, qui le protègeront de toute nouvelle infection pendant une longue période. Dans la plupart des cas, cet ani-mal ne sera que dans une faible mesure capable d’infecter d’autres animaux étant donné que seules des quantités limitées du virus sont excrétées et ce durant seulement quelques jours. Toutefois, lorsqu’une femelle gestante n’a encore jamais connu d’infection BVDV et qu’elle n’a donc pas développé d’anticorps à l’encontre du virus BVD (animal dit ‘naïf’), si elle contracte une infection aiguë au cours de la gesta-tion, le fœtus sera alors lui aussi infecté par le virus. Cette infection fœtale peut conduire à une forte baisse de la fertilité (mortalités embryonnaires), à des avortements, des naissances prématurées ou à la naissance de veaux

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affaiblis ou de veaux présentant des malformations congénitales. De plus, si l’infection de la mère se déclare entre le 30e et le 125e jour de la gestation, le fœtus va reconnaître le virus comme une partie intégrante de lui-même, ce qui conduit alors à la naissance de veaux infectés de manière permanente, appelés bovins porteurs de BVD ou encore bovins IPI (infectés permanents immunotolérants). De manière générale, ces porteurs de BVD présentent un retard de croissance et meurent tôt ou tard d’une forme chronique appelée « maladie des muqueuses » (mucosal disease, MD). On estime tout de même qu’environ 10% des porteurs de BVD dépassent l’âge de 2 ans ; en apparence ces animaux semblent souvent en bonne santé alors qu’ils continuent à propager le virus sans être suspectés d’être porteurs, causant ainsi d’énormes dommages à l’exploitation bovine. Contrairement aux bovins infectés de manière transitoire, les porteurs de BVD ne développent pas d’immunité à l’égard du virus dont ils sont infectés, et sont par conséquent séronégatifs. Par contre, ces porteurs de BVD excrètent des quantités énormes du virus BVD tout au long de leur vie, faisant de ces animaux la source principale de nouvelles infections chez les ani-maux naïfs d’une exploitation bovine. La détection précoce et la mise à l’écart rapide de ces animaux constituent une étape essentielle dans tout programme de lutte contre la BVD.

Tableau: Aperçu des statuts sérologiques et virologiques possibles des bovins en ce qui concerne le BVDV.

Statut sérologique

Statut virologique

Transmissiondu virus

Animal naïf - - -

Animal infecté transitoirePendant l’infection - + - to +

Après l’infection + - -

IPI Toute la vie - +++ +++

Légende : - : négatif ; +: positif ; +++: fortement positif

Dépistage des porteurs de BVD chez les veaux nouveaux-nés

Au vu du grand impact de la BVD sur le secteur bovin, des programmes d’éradication de la BVD ont déjà été lan-cés avec succès dans différents pays européens. Cela fait un moment déjà que le secteur bovin belge est lui aussi intéressé par la mise en œuvre d’un programme d’éradication de la BVD en Belgique. Cela a conduit à l’élaboration d’un plan de lutte national par les différents acteurs du secteur bovin, actuellement en cours de finalisation. La base de ce plan de lutte est la détection et l’élimination des porteurs de BVD (= animaux IPI) et l’attribution d’un statut ‘non IPI’ à tous les bovins qui s’avèrent non porteurs, pour finalement parvenir à un troupeau totalement indemne de la maladie. Dans une première phase de ce plan de lutte, tous les veaux nouveaux-nés devront être soumis à un test de dépistage afin d’établir s’ils sont ou non porteurs de BVD et ce dans les 7 jours qui suivent leur naissance. Concrètement, à partir de janvier 2015, tous les bovins nouveaux-nés seront systématiquement soumis à ce test, soit environ 900.000 veaux testés annuellement.

Afin que ce dépistage se déroule de la manière la plus efficace et économique possible, on a choisi de tester les veaux au moyen de prélèvements auriculaires réalisés au moment de l’identification des veaux nouveaux-nés. Tout veau nouveau-né doit en effet être inscrit au registre dans les 7 jours qui suivent sa naissance ; lors de cette déclaration de naissance, il reçoit un numéro d’identification unique qui concorde avec le numéro mentionné sur la marque auriculaire posée. Les prélèvements auriculaires peuvent être réalisés par l’éleveur même au moment de la pose de la marque auriculaire d’identification de chaque veau. À cet effet, de nouvelles marques auriculaires sont déjà utilisées, qui seront rendues obligatoires dès janvier 2015. Par ailleurs, des échantillons de sérum et de sang d’animaux individuels peuvent également être utilisés comme matrice pour le test, après échantillonnage du bovin par le vétérinaire d’exploitation.

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ELISA antigène BVDV versus RT-qPCR

Afin de pouvoir éradiquer la BVD, il est nécessaire de disposer de tests diagnostiques précis pouvant être utilisés de manière efficace et ciblée. Dans une première phase du plan de lutte, il faut des tests ciblés sur la détection du virus BVD, avec une spécificité élevée (détecter tous les animaux infectés, éviter les résultats faux négatifs), en plus d’une sensibilité élevée (éviter les résultats faux positifs, tout animal positif au test doit réellement être infecté par le BVDV). En outre, ces tests doivent pouvoir être réalisés en routine d’une manière rapide, économique et pra-tique. Tant le test ELISA antigène BVDV que la PCR par transcriptase inverse en temps réel (RT RT-PCR ou RT-qPCR) peuvent être utilisés à cet effet.

La première phase du programme d’éradication vise à détecter tous les bovins IPI afin de pouvoir par la suite les retirer du cheptel. Étant donné que la charge virale chez les IPI est en règle générale beaucoup plus élevée que chez les bovins infectés transitoires (IT), la détection de ces animaux se fait avec une grande certitude aussi bien avec l’ELISA antigène qu’avec la RT-qPCR. Mais vu que l’ELISA antigène est moins sensible que la RT-qPCR, les ani-maux infectés transitoires ne seront bien souvent pas détectés par ce test contrairement au test RT-qPCR, qui est capable de détecter des “charges virales” relativement basses. La valeur de Ct obtenue donnera ici une indication de la charge virale et indiquera donc si un animal est IPI ou IT. Si on veut être certain que le BVDV ne circule pas dans une exploitation, la RT-qPCR est par conséquent la méthode à privilégier. Par contre, si on souhaite unique-ment identifier les porteurs permanents de BVD, un ELISA antigène est suffisant. De plus, les tests ELISA antigène sont meilleur marché et plus simples à réaliser, ils sont donc préconisés pour tester systématiquement les veaux nouveaux-nés dans le cadre du plan belge d’éradication.

Dans certains cas, par exemple en cas d’exportation, de participation à des rassemblements d’animaux ou à des marchés, d’introduction dans un centre d’insémination artificielle, on souhaite tester les animaux pour démontrer qu’ils sont indemnes du BVDV, indépendamment du type d’infection (IPI ou IT). Pour une telle certification, un test RT-qPCR est fortement recommandé vu qu’il est le seul test suffisamment sensible pour pouvoir identifier tout animal IT.

La meilleure sensibilité de la RT-qPCR permet, outre la détection des animaux IT, de tester des pools d’échantil-lons de sérum ou de sang de telle façon à comprimer le coût du dépistage, lié à l’analyse d’un grand nombre d’échantillons individuels. Cette méthode est souvent utilisée en combinaison avec l’ELISA antigène, en analysant d’abord des pools d’échantillons de sérum ou de sang à l’aide de la RT-qPCR et en identifiant ensuite les animaux IPI à l’aide de tests ELISA antigène réalisés sur les échantillons individuels des pools positifs. Cette combinaison RT-qPCR et ELISA antigène est souvent utilisée pour le dépistage d’animaux plus âgés dans le cadre des dépistages d’exploitation (sur base volontaire). Il convient ici de noter que lorsque des tests ELISA antigène sont effectués sur du sang ou du sérum de veaux de moins de 3 mois, il existe un risque d’obtenir des résultats faux négatifs en raison de l’interférence avec les anticorps maternels qui peuvent masquer le virus présent dans l’échantillon, ce qui n’est pas le cas avec les tests RT-qPCR.

Conclusion

L’éradication du BVDV du cheptel bovin belge n’est possible qu’en combinant l’analyse effective de tous les bovins et l’utilisation de tests diagnostiques appropriés pour une cible bien définie. L’analyse et l’élimination des animaux IPI sont d’une grande importance au début d’un programme d’éradication afin d’enrayer la source principale de contamination du cheptel et de faire chuter la prévalence de troupeaux infectés. D’un point de vue épidé-miologique, l’abattage des animaux IT revêt en effet peu de sens. De plus, cela représenterait une opération très

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coûteuse pour le secteur, vu la forte prévalence du BVDV en Belgique. Aussi bien l’ELISA antigène que la RT-qPCR peuvent ici jouer un rôle important. Lors d’une phase ultérieure du programme de lutte, lorsque la prévalence du BVDV aura suffi samment diminué, la détection des infections transitoires jouera cependant un rôle plus impor-tant, lorsque les exploitations voudront prouver qu’elles sont eff ectivement indemnes du virus BVD. Dans ce cas, la RT-qPCR est la seule méthode suffi samment sensible pour la détection des infections transitoires. Il faudra donc toujours veiller à choisir la bonne méthode d’analyse, en fonction de l’objectif visé.

Contact : miet.debaere@coda-cerva.be.

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Méthodes de dépistage pour la détermination des protéines animales

J. Vancutsem (FLVVT), L.W.D. van Raamsdonk (RIKILT), M.G.E.G. Bremer (RIKILT) et M. Evrard (LFSAL)

Le Règlement européen 56/2013, entré en application le 1er juin 2013, autorise la réintroduction des protéines animales transformées (PAT) de non-ruminants dans les aliments pour animaux d’aquaculture. En 2013 éga-lement, l’identification de l’ADN (PCR) a été introduite comme méthode officielle de contrôle (Règlement EU 51/2013). Elle permet d’établir précisément la provenance des PAT (ruminants vs. autres espèces animales) sans toutefois faire de distinction quant au tissu,ce qui signifie que les ingrédients autorisés comme le lait sont égale-ment détectés. C’est pourquoi, le cas échéant, il est important de pouvoir détecter l’espèce et le type. Pour cette raison, outre les méthodes d’analyse officielles, la possibilité de détecter les PAT de ruminants à l’aide d’un kit ELISA (Bremer et al., 2013; van Raamsdonk et al., 2012) et d’un dispositif à flux latéral (LFD) (van Raamsdonk et al., 2012) a également été évaluée. Ces deux tests sont basés sur la détection de la variante ‘ruminant’ d’une protéine musculaire : la troponine I. Pour cette évaluation, il a été fait usage d’une analyse de risque de l’EFSA, qui indique qu’en cas de contamination de l’ordre de 2% de PAT de ruminants dans des PAT de non-ruminants, le risque est acceptable (EFSA, 2011). En d’autres termes, il s’agit de contrôler si ces méthodes conviennent pour une utilisation sur les matières premières utilisées dans les aliments pour animaux d’aquaculture.

Kit MELISA-TEKTM ruminant

Pour le test ELISA, le kit MELISA-TEKTM ruminant a été utilisé. Il s’agit d’un dosage immunologique « type sandwich » pour la détection de la troponine-I, une protéine musculaire thermostable, spécifique aux ruminants. Ce kit a été utilisé en combinaison avec le High Sensitivity Sample Extraction kit de MELISA-TEK pour concentrer la troponine-I. Le protocole d’extraction est résumé ci-dessous :- prélever 5 g et ajouter 50 ml de solution d’extraction ;- laisser incuber 30 minutes ;- chauffer à 95-100°C pendant 15 minutes ;- centrifuger 8 ml du liquide surnageant à 10.000 g pendant 10 minutes ;- centrifuger 4 ml de liquide surnageant à 7.000 g dans un concentrateur de protéine pendant 30 minutes.

Les échantillons, et les contrôles correspondants, sont analysés en duplo et le résultat est lu au moyen d’un lec-teur de plaques à 450 nm.Les critères de performance utilisés sont les suivants :- Spécificité : la proportion de résultats positifs corrects, exprimée en pourcentage;- Sensibilité : la proportion de résultats négatifs corrects, exprimée en pourcentage.

Le résultat optimal est un score de 100 %.

Les PAT de ruminants utilisées étaient des matériels bovins et ovins transformés à différentes températures (entre 133 et 145°C). Pour la validation interne (Bremer et al., 2013), des mélanges contenant entre 0,1 % et 2 % de PAT de ruminants ont été préparés avec ces matériels. 72 PAT de non-ruminants, parmi lesquelles du porc, de la volaille, du plasma sanguin, de la farine de poisson et du lait en poudre, ont été utilisées afin de tester la spécificité. Les résultats de la validation interne étaient bons (voir tableau 1).

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Sur base des résultats de la validation interne, une étude inter-laboratoire a été organisée (van Raamsdonk et al., 2012) à laquelle le LFSAL a participé. Après une première série avec des échantillons test (voir figure 1), l’étude inter-laboratoire proprement dite a été organisée. Dans cette étude, 21 échantillons différents ont été analysés, composés de 6 PAT différentes de non-ruminants et de PAT de ruminants préparées à deux températures (133°C et 137°C) et deux concentrations (1 % et 2 %) différentes. Elles ont été extraites en double et appliquées en duplo sur la plaque.

Figure 1 (à gauche) : Plaque ELISA MELISA-TEK Figure 2 (à droite) : Bandelettes réactivesavec échantillons test – Si deux lignes sont visibles, le test est positif

Tableau 1 : Les principaux résultats du test MELISA-TEK sont résumés dans le tableau ci-dessous

Validation interne Etude inter-laboratoires

Température de transformation des PAT 133°C-145°C 133°C and 137°C 133°C and 137°C

Spécificité 99% 99% 99%

Sensibilité

0,5% PAT 100%

1,0% PAT 92% 100% 100%

2,0% PAT 100% 100% 100%

Le test fonctionne donc très bien aux niveaux testés. La sensibilité plus faible de 92 % pour la série entière des quatre températures était principalement due à une plus faible sensibilité aux températures plus élevées.

‘Reveal for Ruminant in feed’

En plus du MELISA-TEK, un LFD (lateral flow device) a également été évalué dans le cadre de cette même étude : ‘Reveal for Ruminant in feed’. Le protocole d’extraction est résumé ci-dessous :- prélever 10 g, ajouter l’additif d’extraction et ajouter 100 ml de solution d’extraction ;- chauffer 10 minutes dans de l’eau bouillante ;- transvaser 0,5 ml d’extrait dans un tube de microcentrifugation ;- Ajouter la bandelette et lire le résultat après 15 minutes (voir figure 2).

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Tableau 2 : Les résultats pour le test ‘Reveal for Ruminant in feed’

Spécificité 97%

Sensibilité

0,5% PAT 99%

1% PAT 99%

2% PAT 100%

De bons résultats ont également été obtenus avec le Reveal test.

Conclusion :

Les dosages immunologiques pour la détection des PAT de ruminants, MELISA-TEK et Reveal ont été validés à 0,5 % et plus pour la détection de PAT de ruminants dans une matrice de PAT de non-ruminants. En se basant sur une limite souhaitée de 2 % de PAT de ruminants présentes dans des matériels de non-ruminants, on peut en conclure que les méthodes sont adaptées au monitoring des PAT de non-ruminants destinées à l’alimentation des animaux d’aquaculture. Un avantage de l’essai MELISA-TEK ruminant par rapport à la méthode PCR est qu’il n’émet pas de signal pour le lait en poudre (protéines autorisées), alors que la PCR émet, elle, un signal positif. Par contre, il est plus difficile de détecter les PAT de ruminants en cas de proportion élevée d’os, accompagnée d’une faible proportion de fibres musculaires.

Littérature

- Bremer, M.G.E.G., R.J.C.F. Margry, J.C.H. Vaessen, A.M.H. van Doremalen, J.G.P. van der Palen, R.G.C. Van Kaatho-ven, A.E.M. Kemmers-Vonken, L.W.D. van Raamsdonk (2013). Evaluation of a commercial ELISA for Detection of Ruminant processed animal proteins in non-Ruminant processed animal proteins. J. AOAC. Intl. 96: 552-559.

- European Food Safety Authority (2011). The EFSA journal 9, p. 1947

- EU-Verordening N° 51/2013 (2013). Off J. Eur. Commun. L20, 33-43

- EU-Verordening N° 56/2013 (2013). Off J. Eur. Commun. L21, 3-16

- van Raamsdonk, L.W.D., R.J.C.F. Margry, R.G.C. van Kaathoven, M.G.E.G. Bremer (2012). Detection of animal proteins in aqua feed. An inter-laboratory study of two immunochemical methods for detection of ruminant PAPs in non-ruminant PAPs intended as ingredient in aquafeed. Report 2012.014, RIKILT, Wageningen, pp. 78.

jeroen.vancutsem@favv.be

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Exigences relatives aux tests de dépistage qualitatif et aux critères spécifiques applicables aux tests de dépistage des antibiotiques dans le laitDr. Wim Reybroeck, ILVO-T&VILVO-T&V, Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek – Eenheid Technologie en Voeding, Brusselsesteenweg 370, B-9090 Melle

Les tests de dépistage qualitatif sont souvent employés lors de l’analyse de résidus pour détecter la présence d’une substance ou d’une classe de substances à un niveau de concentration ou niveau d’intérêt considéré. Le niveau de concentration considéré se définit ici comme étant la concentration, dans un échantillon, d’une subs-tance ou d’un analyte qui est significative pour déterminer si cet échantillon est conforme à la législation. Pour les substances reprises dans le tableau 1 de l’annexe du Règlement (UE) 37/2010, il s’agit de la limite maximale en résidus (LMR). Pour certaines substances non autorisées figurant dans le tableau 2 de l’annexe du même règle-ment, le niveau de concentration considéré correspond à la limite de performances minimales requises (MRPL) ou à la valeur de référence (reference point for action, RPA). En ce qui concerne les méthodes appliquées dans le cadre de la Directive 96/23/CE, les laboratoires de référence de l’Union européenne ont fixé des concentrations recommandées (CR) pour certaines substances dénuées de LMR dans certaines matrices. Ces CR peuvent être utilisées comme niveau de concentration considéré. Les méthodes de dépistage doivent avoir une capacité de détection équivalente au niveau de concentration considéré ou située en deçà de celui-ci.

Les tests de dépistage présentent généralement un court délai d’analyse des échantillons et sont souvent employés pour sélectionner, parmi un grand nombre d’échantillons, ceux susceptibles de générer des résultats non conformes. Les tests de ce type sont développés spécialement pour éviter les faux résultats conformes. Selon la Décision 2002/657/CE de la Commission, le pourcentage de faux résultats conformes appliqués aux fins de dépistage conformément à la Directive 96/23/CE, doit être inférieur à 5 % (erreur β). Cela doit être démontré dans le dossier de validation. Si on obtient un résultat suspecté d’être non conforme, ce résultat doit alors être confirmé au moyen d’une méthode de confirmation qui doit fournir des informations complètes ou complémentaires quant à l’identification explicite de la substance et, si nécessaire, à sa quantification au niveau de concentration considéré.

En outre, la Décision 2002/657/CE de la Commission prévoit que, pour les tests de dépistage qualitatif, il doit être démontré au moyen d’une validation que la méthode d’analyse satisfait aux critères relatifs aux caractéristiques de performance suivantes : capacité de détection CCβ ; sélectivité/spécificité et applicabilité/robustesse/stabilité, toutefois sans précision supplémentaire pour les tests de dépistage. Entre-temps, des directives pour la validation des tests de dépistage ont cependant été mises au point par les laboratoires de référence européens en matière de résidus (Anon., 2010). Par exemple, le nombre minimal de répétitions à effectuer pour déterminer la capacité de détection est fixé dans ce document. La distinction est faite ici entre une validation initiale et une validation par transfert (Anon., 2010).

La législation ne fait pas mention d’un pourcentage autorisé de faux résultats non conformes de dépistage mais, bien entendu, l’utilisateur a tout intérêt à ce que ce pourcentage reste limité, sans quoi les coûts liés à l’analyse de confirmation des échantillons dépistés positifs risquent de grimper très rapidement. L’utilisation d’un test de dépistage présentant une capacité de détection fortement en deçà de la LMR peut également donner lieu à un nombre accru de tests de confirmation.

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Outre les critères européens, relativement flous, applicables aux tests de dépistage, il existe des critères plus précis pour certaines applications spécifiques. Il existe par exemple des critères d’acceptation imposés par l’AFSCA pour les tests de dépistage utilisés par les organismes interprofessionnels lors de l’analyse des substances inhibitrices dans le cadre de la détermination officielle de la qualité et de la composition du lait cru livré aux acheteurs (Anon., 2014a). L’AFSCA a également fixé récemment des critères auxquels doivent répondre les tests rapides qui sont ap-pliqués par les laiteries lors du contrôle d’entrée du lait cru issu de camions-citernes (Anon., 2014b). Si une laiterie achète plus de 2.000.000 de litres de lait cru par an directement auprès des producteurs en vue de la transforma-tion, elle doit systématiquement contrôler la présence de substances inhibitrices dans le lait, que ce soit au niveau de la cuve de stockage, au niveau du camion-citerne ou au niveau de toute autre unité de collecte (conteneur, cuves,...) avant de procéder à la transformation du lait. Les conditions d’agrément d’un test rapide pouvant être employé à cette fin sont les suivantes (Anon., 2014b) :• spectre de détection: le test doit pouvoir détecter les résidus de marqueurs de tous les antibiotiques

β-lactame enregistrés en Belgique comme substances pharmacologiquement actives pour une utilisation chez les vaches laitières. Il s’agit des substances suivantes: benzylpénicilline, ampicilline, amoxicilline, cloxacil-line, nafcilline, ceftiofur, desfuroylceftiofur, cefquinome, céfazoline, céphapirine, desacetyl céphapirine, céfopé-razone, céfalexine et céfalonium.

• capacité de détection (CCβ): le test doit pouvoir détecter au minimum 85% (ou 12/14) des résidus de mar-queurs mentionnés ci-dessus au niveau de leur limite maximale en résidus (LMR) respective (Règlement (UE) 37/2010) dans minimum 95% des cas.

• faux résultats conformes: le test doit être robuste et peut entraîner au maximum 5% de résultats négatifs au niveau CCβ.

• validation: le test doit avoir été validé, aux frais du fabricant du kit et conformément à la Décision 2002/657/CE de la Commission, par un LNR ou un laboratoire accrédité agréé. Pour les tests commercialisés après janvier 2010, la validation doit également avoir été réalisée suivant les directives des LR-UE (Anon., 2010).

Ces critères visent une harmonisation de l’autocontrôle des substances inhibitrices par les laiteries et une pro-tection encore meilleure du consommateur. De plus, ils permettent de combler une lacune dans la législation européenne. Après l’Espagne, la Belgique est le deuxième pays européen à apporter davantage de clarté quant aux types de résidus d’antibiotiques qui doivent être contrôlés dans le lait lors du contrôle d’entrée. En outre, la Belgique impose également des critères aux tests rapides appliqués.

Références :

- Anonymous. 2010. Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer). Community Reference Laboratories Residues (CRLs). 20/01/2010: 1-18.

- Anonymous. 2014a. http://www.afsca.be/laboratoires/laboratoiresagrees/generalites/_docu-ments/2014-03-01_Listedesmethodesagreeesv06_fr.pdf

- Anonymous. 2014b. http://www.afsca.be/productionanimale/produitsanimaux/circulaires/_docu-ments/2014-04-07_circulaire_tests_detection_subs_inhibitrices_lait_FR.pdf

- Décision 2002/657/CE de la Commission du 12 août 2002 portant modalités d’application de la directive 96/23/CE du Conseil en ce qui concerne les performances des méthodes d’analyse et l’interprétation des résultats. Journal officiel des Communautés européennes. L221: 8-36.

- Directive 96/23/CE du Conseil du 29 avril 1996 relative aux mesures de contrôle à mettre en œuvre à l’égard de certaines substances et de leurs résidus dans les animaux vivants et leurs produits et abrogeant les directi-ves 85/358/CEE et 86/469/CEE et les décisions 89/187/CEE et 91/664/CEE. Journal officiel des Communautés européennes. L125: 10-32.

- Règlement (CE) N° 37/2010 de la Commission du 22 décembre 2009 relatif aux substances pharmacologi-quement actives et à leur classification en ce qui concerne les limites maximales de résidus dans les aliments d’origine animale. Journal officiel de l’Union européenne. L15: 1-72.

wim.reybroeck@ilvo.vlaanderen.be

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Screening pour les résidus de pesticidesLaure Joly, Philippe Szternfeld & Vincent HanotISP, Rue Juliette Wytsman 14, 1050 Bruxelles

Analyse de pesticide : un contrôle effi cace quotidien

Avec plus de 900 pesticides (et leurs produits de dégradation) sur le marché, le contrôle des denrées alimentaires est un challenge quotidien. Les laboratoires offi ciels réalisent chaque jour des dizaines d’analyses sur des denrées alimentaires prélevées par l’AFSCA. Ces analyses majoritairement quantitatives sont contraignantes pour les labo-ratoires tant pour la validation avant leurs applications que pour l’ensemble des critères qualités à vérifi er lors des analyses de routine.

Le screening pour élargir le scope

Depuis une dizaine d’année, les scopes des laboratoires ont dû augmenter considérablement pour analyser le maximum de pesticides. Dans ce cadre, le screening (ou analyse qualitative) s’est révélé être une alternative inté-ressante à l’analyse quantitative.

Figure 1: Extracted chromatogram of 200 pesticides using the Agilent 1200 Series SL LC with the Agilent 6230 TOF.

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L’avantage du screening est qu’il confère un sérieux gain de temps aussi bien au moment de la validation qu’au moment des analyses. En eff et, la validation en screening est fortement réduite, chaque pesticide doit être détecté dans 20 échantillons fortifi és à la limite de détection par screening (SDL) avec un taux d’acceptation de faux négatif de 5%. La vérifi cation de la fi abilité de l’analyse quant à elle, est moins lourde puisque les critères sont moins nombreux que pour une analyse quantitative. Par exemple, il est possible de s’aff ranchir de la préparation d’une droite de calibration ainsi que de la vérifi cation des rendements. Cependant, afi n de prouver que la SDL est atteinte pour chaque série d’analyse, un échantillon de contrôle (CS) fortifi é à cette limite est analysé avec chaque série d’échantillon. Ce CS est injecté deux fois (avant et après la séquence d’échantillons) pour prouver le bon fonctionnement du système de détection.

Le screening pour les combinaisons matrice / pesticide à faible fréquence de détection

Le screening n’est pas seulement une solution intéressante pour accroître son scope mais s’applique aussi pour l’analyse de pesticides détectés sporadiquement, comme par exemple les pyréthrinoïdes dans les denrées d’ori-gine animale.

La réalisation de cette analyse en screening permet de réduire considérablement le temps d’analyse en évitant par exemple une calibration en matrice, le contrôle systématique des rendements,…. L’analyse quantitative n’est faite dans un deuxième temps que si un pesticide est détecté.

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Une pratique entrée dans les mœurs au niveau européen

Dans les dernières versions du document de référence pour l’analyse de pesticide (SANCO/12571/2013), plusieurs paragraphes traitent exclusivement du screening. Ceux-ci détaillent clairement les différents critères de valida-tion, de performance et de rapportage de résultats devant être respectés.

L’EURL-FV (European reference laboratory for fruits and vegetables) organise chaque année depuis 6 ans un test inter-laboratoire de type screening. Ce test permet d’une part une meilleure évaluation des laboratoires officiels concernant la détection de pesticides «exotiques» et d’autre part d’encourager les laboratoires officiels à étendre leur scope et à se tourner vers des appareils plus performants.

A l’heure actuel, tout pesticide détecté lors d’une analyse de screening doit être confirmé, ce qui limite l’appli-cation de méthode de screening plus large. Ainsi, l’EFSA qui calcule le risque associé à la présence de pesticides dans les denrées alimentaires, ne peut gérer un résultat de détection d’un pesticide sans en avoir sa concentra-tion. Or cette information est intéressante pour tous les laboratoires pour mieux cibler les pesticides qui doivent être inclus dans la méthode quantitative. La notion de SDL, pouvant être différente de la LOQ (limite de quantifi-cation) peut également compliquer le rapportage aux autorités européennes.

Conclusion

Les analyses en screening sont moins contraignantes pour les laboratoires que les analyses quantitatives tant au niveau de la validation que de l’assurance qualité à implémenter lors des analyses de routine. Ce type d’analyse permet aux laboratoires, d’une part d’élargir plus facilement leur scope et d’autre part de gagner un temps considérable lors d’analyse d’échan-tillons négatifs.

Cependant dès qu’un pesticide est détecté par screening, c’est une obligation légale de réaliser des analyses quantitatives supplémentaires afin de connaitre la quantité exacte de pesticide présente dans l’échantillon et d’évaluer les risques associés aux pesticides détectés.

Contact: Laure.joly@wiv-isp.be

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Méthode PCR espèce-spécifique pour la détection des espèces de moutarde (Sinapis alba, Brassica nigra, Brassica juncea) comme allergènes potentiels “cachés” dans l’alimentationTaverniers Isabel, Van Droogenbroeck Bart et De Loose Marc ILVO, unité Technologie & Alimentation, Burg. Van Gansberghelaan 115, 9820 Merelbeke

Introduction : espèces de moutarde et protéines allergisantes

La moutarde appartient à la famille des Brassicaceae – comptant plus de 3200 espèces et 375 genres – et plus par-ticulièrement aux genres Sinapis et Brassica. La moutarde blanche (Sinapis alba), la moutarde brune ou jaune (Bras-

sica juncea) et la moutarde noire (Brassica nigra) sont cultivées partout à travers le monde et sont utilisées comme source d’huile végétale, comme exhausteur de goût ou comme engrais vert. Ces plantes sont originaires de la région méditerranéenne et du Proche-Orient mais on les retrouve désormais un peu partout dans le monde sous forme cultivée ou en tant que mauvaises herbes. Les graines de moutarde sont vendues entières ou moulues. Elles peuvent être transformées et/ou mélangées dans des produits alimentaires. Les graines de moutarde jaune, mieux connues sous le nom de “moutarde de table”, se composent généralement d’un mélange de plusieurs espèces. Sinapis alba est l’espèce de moutarde la plus utilisée en Europe, alors qu’aux USA et au Japon, il s’agit de l’espèce Brassica juncea (Monsalve et al., 1993).

Les allergies alimentaires constituent un problème croissant, surtout dans les pays occidentaux. Des doses très faibles d’allergènes peuvent déjà provoquer une réaction chez les personnes sensibles. Des protéines avec un potentiel allergène ont été trouvées dans la moutarde. En raison de leur résistance à la chaleur et de leur dégra-dation enzymatique limitée, elles sont difficiles à neutraliser dans le processus de production. L’utilisation très courante de graines de moutarde dans les mélanges d’aromates fait également de ces espèces des “allergènes cachés”, donc potentiellement dangereux. Un allergène caché est un allergène qui n’est pas mentionné sur l’emballage ; dès lors, le consommateur ne sait pas que la denrée alimentaire contient l’allergène ou qu’il y est allergique. Une étude de 2007 sur la prévalence, le rôle et la cause de la présence d’allergènes cachés dans l’ali-mentation, a révélé que ceux-ci sont à la base de 22,4% de toutes les réactions aux denrées alimentaires (Anibarro et al., 2007). La manière dont les allergènes cachés se retrouvent dans l’alimentation est très variée. Il s’agit souvent d’une imprudence commise par le consommateur ou de la contamination des aliments dans des restaurants, par exemple via des grils qui ne sont pas suffisamment nettoyés. Cependant, une contamination durant le processus de production de la denrée alimentaire est également possible. Pour ces raisons, des avertissements tels que “peut contenir des traces de...” sont imprimés sur de nombreux emballages.

La principale protéine allergisante caractérisée dans la moutarde est l’albumine 2S, une protéine de stockage (Menendez-Arias et al., 1988). C’est une petite protéine (12-15 kDa) constituée de deux polypeptides reliés entre eux par des ponts disulfures. L’albumine 2S a aussi été isolée dans le colza, dans des plantes légumineuses (p.ex. pois et soya), dans les noix, les graines de sésame et autres espèces du genre Brassica. Dans la moutarde blanche, l’albumine 2S est désignée par Sin a 1 et, dans la moutarde brune, par Bra j 1. La caractérisation de ces protéines a montré qu’il y avait des homologies générales dans les épitopes entre les différentes espèces. Ce n’est pas étonnant étant donné les parentés génétiques étroites qui existent entres les espèces. Les moutardes brune et noire sont deux des six espèces du “triangle de U”, qui reflète la parenté entre ce que l’on appelle collectivement les “Brassica cultivées” (Fig 1). Les angles du “triangle de U” sont formés par trois espèces avec un génome de

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base propre: B. rapa (génome A), B. nigra (génome B) et B. oleracea (génome C). Les côtés se composent de trois espèces amphiploïdes constituées des génomes de base : B. juncea (AB), B. napus (AC) et B. carinata (BC).amphip-loid species formed by the elementary genomes. B. juncea (AB), B. napus (AC) and B. carinata (BC).

Fig. 1 : Le “triangle de U” décrit la parenté génétique entre les trois végétaux diploïdes B. oleracea, B. nigra et B. rapa et leurs parents allopolyploïdes B. carinata,

B. juncea et B. napus. Figure reprise du site http://en.wikipedia.org.

Les albumines de stockage 2S Sin a 1 et Bra j 1 sont donc structurellement similaires et étroitement apparentées aux allergènes d’autres espèces comme le colza (Brassica napus). Les deux sont thermorésistantes (EFSA, 2004). Il a été prouvé que la Sin a 1 partage des déterminants antigéniques et allergéniques avec l’allergène principal Bra n 1 du colza (Monsalve et al.1997). D’autres protéines allergisantes ont été identifi ées dans les graines de mou-tarde, dont entre autres la globuline 11S Sin a 2, la protéine de transfert lipidique Sin a 3, et les profi lines Sin a 4 et Bra n 8.

Problématique et objectif

Bien qu’il ait été prouvé que des personnes allergiques à la moutarde peuvent aussi être sensibles à d’autres espèces de la famille des Brassicacées (Poikonen et al. 2008), seule la moutarde est soumise à l’étiquetage obliga-toire conformément au Règlement européen 1169/2011. Des méthodes sensibles et spécifi ques pour la détection des ingrédients allergènes sont nécessaires afi n de pouvoir détecter les faibles concentrations d’allergènes dans les diverses matrices. Plusieurs fabricants ont mis sur le marché des kits qPCR ou kits ELISA prêts-à-l’emploi pour la détection et la quantifi cation des espèces de moutarde. Cependant, les méthodes et les kits de détection existant pour la moutarde détectent la plupart du temps les trois espèces ensemble et montrent en outre souvent une ac-tivité croisée avec d’autres espèces. Cela peut poser problème quand une denrée alimentaire produite à base de moutarde contient aussi du colza ou d’autres espèces apparentées du genre Brassica (présence intentionnelle ou suite à une contamination). De plus, l’utilisation de la moutarde comme engrais vert peut constituer une source de contamination lors de la culture et de la récolte de colza. Enfi n, les récoltes mixtes et successives d’espèces de colza et de moutarde provoquent aussi une possible contamination du produit fi ni.

Un certain nombre de méthodes ELISA et PCR décrites dans la littérature (Fuchs et al., 2010; Mustorp et al. 2008, Palle-Reisch et al. 2013) ainsi que des kits prêts-à-l’emploi disponibles sur le marché ont été testés sur leur spéci-fi cité dans le cadre d’une étude comparative sur les méthodes de détection moléculaire des espèces de mou-tarde. En outre, des amorces ont été développées pour l’amplifi cation spécifi que aux espèces de moutarde par la méthode qPCR. Dans une tentative de diff érencier les espèces au niveau du SNP, des amorces ont aussi été créées pour l’analyse des courbes de fusion à haute résolution (HRMa ou HRM-PCR).

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Système expérimental

Pour tester les méthodes existantes ELISA et qPCR ainsi que les nouvelles méthodes PCR mises au point, un total de 37 échantillons de graines a été utilisé, provenant des espèces Brassica juncea, B. nigra et Sinapis alba, mais aussi B. oleracea (chou-rave), B. napus (colza), Raphanus sativus (chou-navet) et Arabidopsis thaliana (arabette des dames). Ceux-ci provenaient de l’ILVO, du CER-Groupe et de l’IPK à Gatersleben, Allemagne.

Quatre kits ELISA et deux kits qPCR commerciaux pour la moutarde ont tout d’abord été testés. Ensuite, une mé-thode qPCR tirée de la littérature (Fuchs et al., 2010) a été évaluée sur sa spécifi cité à l’égard de Sinapis alba (mou-tarde blanche). Enfi n, des nouvelles méthodes PCR ont été développées et évaluées pour B. nigra et B. juncea.

Résultats et discussion

Les quatre kits ELISA testés ont détecté les 3 espèces de moutarde. Les cibles de ces kits commerciaux ne sont pas spécifi ées mais ce sont vraisemblablement les anticorps polyclonaux contre l’albumine 2S (Sin a 1, Bra j 1, Bna

III napin) ou des protéines allergisantes homologues. Les deux kits qPCR testés ont amplifi é les trois espèces de moutarde mais ont également donné lieu à une amplifi cation aspécifi que avec notamment B. napus et A. thaliana.

Un exemple des résultats d’évaluation d’un test qPCR est donné à la Fig. 2.

La méthode qPCR de Fuchs et al. (2010), spécifi que à S. alba, s’avère eff ectivement spécifi que à la moutarde blanche. Aucune autre espèce n’a montré d’amplifi cation dans une réaction de PCR en temps réel avec ce kit. Les amorces et la sonde TaqMan visent une séquence spécifi que dans le gène codant pour la protéine à domaine MADS.

Fig. 2 : graphique d’amplifi cation qPCR comme exemple de résultat d’un kit qPCR prêt-à-l’emploi commercialisé pour la détection de la moutarde. Le tracé obtenu montre l’aspécifi cité des amorces utilisées.

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Les nouvelles analyses qPCR développées ont fourni deux sets d’amorces potentiellement utilisables pour la détection spécifi que de B. nigra. L’évaluation de la paire d’amorces Bni COL-Fa/Ra1 à l’égard de 37 échantillons de 7 espèces d’origines diff érentes a révélé une spécifi cité complète pour la moutarde noire mais 3 des 7 échantillons de Brassica nigra n’ont pas donné d’amplifi cation. Dans une première évaluation, la paire Bni COL-Fa/Ra2 semble aussi spécifi que à la moutarde noire. Ces paires d’amorces amplifi ent un fragment de respectivement 146 paires de base (bp) et 100 paires de base du gène de type Constans codant pour la protéine. Les résultats des pics de fusion optimalisés pour le set de 37 échantillons de graines, obtenus avec la paire d’amorces Bni COL-Fa/Ra1, sont représentés à la Fig. 3.

Fig. 3: Courbes de fusion de l’essai SYBR Green I qPCR avec la paire d’amorces Bni COL-Fa/Ra1 spécifi que à B-nigra (146

bp). Un pic de fusion spécifi que de 84°C est obtenu pour 4 des 7 échantillons de B. nigra testés. Le pic de fusion aspécifi que

à 78°C peut être dû aux dimères d’amorces.

Une augmentation de la spécifi cité du set d’amorces Bni COL-Fa/Ra1 est visée à condition d’utiliser une sonde Taqman avec les amorces et/ou d’adapter la température d’hybridation et les concentrations des amorces et/ou d’appliquer la méthode dans l’analyse PCR-Courbe de fusion à haute résolution (HRM-PCR).

Pour B. juncea, la seule protéine connue, à savoir la protéine de stockage 2S, a été sélectionnée comme cible pour le développement d’amorces. Vu que les homologies de ce gène avec d’autres espèces du genre Brassica sont très importantes, il a été décidé de tester directement une dizaine de paires d’amorces via la méthode HRM-PCR. Le but était d’obtenir une plus forte diff érentiabilité des espèces entre elles. Les résultats d’analyses HRM-PCR n’ont en général pas donné de résultats univoques spécifi ques à une espèce. Les accessions de diff érentes espèces ont souvent été mises en commun. Au moins une paire d’amorces semble spécifi que à la moutarde brune (voir Fig. 4).

2726

Sept des huit échantillons de B. juncea testés sont en eff et classés dans le même groupe (groupe V à la Fig. 4) ; cependant, au moins 2 des 7 échnatillons de B. nigra s’y retrouvent également. Le test s’avère être spécifi que pour B. nigra (5/7 dans le groupe I) mais, de nouveau, pas à 100%. Des essais répétés pour vérifi er la reproductibilité de la méthode ainsi que des étapes d’optimalisation éventuelles complémentaires dans la HRM-PCR sont nécessaires afi n de parvenir à une spécifi cité univoque pour B. juncea versus B. nigra. De surcroît, il faudra également exami-ner la pureté de plusieurs échantillons aux résultats ambigus.

Références

Añìbarro B., Seoane F. J., Múgica M. V. (2007) Involvement of hidden allergens in food allergic reactions. J. Invest. Allergol. Clin. Immunol. 17: 168-172

European Food Safety Authority (EFSA). (2004) Opinion of the scientifi c panel on dietetic products, nutrition and allergies on a request from the commission relating to the evaluation of allergenic foods for labelling purposes. EFSA J. 32: 120-128

Fuchs M., Cichna-Markl M., Hochegger R. (2010) Development and validation of a real-time PCR method for the detection of white mustard (Sinapis alba) in foods. J. Agric. Food Chem. 58 (21): 11193-11200

Menéndez-Arias L., Moneo I., Domínguez J., Rodríguez R. (1988) Primary structure of the major allergen of yellow mustard (Sinapis alba L.) seed, Sin a I. Eur. J. Biochem. 177: 159-166

Monsalve R. I., González De La Peña M. A., López-Otíín C., Fiandor A., Fernández C., Villalba M., Rodrígueze R. (1997) Detection, isolation and complete amino acid sequence of an aeroallergenic protein from rapeseed fl our. Clin. Exp. Allergy 27: 833-841

Fig. 4 Courbes de fusion de l’essai HRM-PCR avec la paire d’amorces Bju HRM-F1/R1 (203 bp) spécifi que à B. juncea. Les

diff érents groupes de résultats ou de “classes” qui sont diff érenciés dans la HRM sont indiqués à droite.

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Monsalve R. I., Gonzalez De La Peña M. A., Menéndez-Arias L., Lopez-Otin C., Villalba M., Rodriguez R. (1993) Charac-terization of a new oriental-mustard (Brassica juncea) allergen, Bra j IE: detection of an allergenic epitope. Biochem. J. 293: 625-632

Mustorp S., Engdahl-Axelsson C., Svensson U., Holck A. (2008) Detection of celery (Apium graveolens), mustard (Sinapis alba, Brassica juncea, Brassica nigra) and sesame (Sesamum indicum) in food by real-time PCR. Eur. Food Res. and Technol. 226: 771–778

Palle-Reisch M., Wolny M., Cichna-Markl M., Hochegger R. (2013) Development and validation of a real-time PCR method for the simultaneous detection of black mustard (Brassica nigra) and brown mustard (Brassica juncea) in food. Food Chem. 138: 348-355

Poikonen S., Rancé F, Pjuumalainen T.J., Le Manach G., Reunala T., Turjanmaa K. (2008) Sensitization and allergy to turnip rape: a comparison between the Finnish and French children with atopic dermatitis. Acta Paediatrica 98: 310-315

isabel.taverniers@ilvo.vlaanderen.be

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Migration de photo-initiateurs depuis les emballages en carton

Kathy Van Den Houwe, Els Van Hoeck, Caroline Evrard, Joris Van Loco, Fabien Bolle Institut scientifique de Santé publique, rue J. Wytsman 14, 1050 Bruxelles, Belgique

Photo-initiateurs & migration

Des mélanges de photo-initiateurs sont souvent ajoutés aux encres UV (utilisées dans l’impression d’emballages en carton destinés à entrer en contact avec des denrées alimentaires) car ils accélèrent sensiblement le séchage via un processus de polymérisation radicalaire. Des photo-initiateurs n’ayant pas pris part à la polymérisation sont alors susceptibles de migrer du matériau d’emballage vers l’aliment. Par ailleurs, on retrouve souvent des photo-initiateurs dans les cartons recyclés, suite au processus de recyclage [1]. Des résidus de ces photo-initiateurs peuvent par conséquent migrer de l’emballage en carton et ainsi contaminer l’aliment.

En 2005, 30 millions de litres de lait pour nourrissons ont été retirés du marché italien en raison de la présence du photo-initiateur 2-isopropylthioxanthone [2]. Depuis lors, de nombreux autres photo-initiateurs ont également été découverts dans des aliments, tels que la 4-méthylbenzophénone dans des céréales pour petit-déjeuner (2009) [3].

Photo-initiateurs & législation

Malgré le problème potentiel de présence de photo-initiateurs dans notre alimentation, il n’existe toujours pas de législation européenne spécifique concernant l’utilisation des encres UV destinées à l’impression des matériaux de contact. Dans ce cadre, les autorités suisses ont publié une ordonnance à propos des matériaux destinés à entrer en contact avec des aliments [4]. L’annexe 6 comporte une liste des limites de migration spécifiques (LMS) pour les composants évalués et impose une LMS de 0,01 mg/kg pour les composants non évalués.

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Photo-initiateurs & méthode d’analyse

Avant même le conditionnement, les emballages en carton qui sont destinés à contenir des aliments secs sont soumis à des études de migration. Au cours de ces études, la migration de photo-initiateurs à partir des embal-lages en carton est simulée en mettant le carton en contact avec le simulant pour aliment sec, à savoir une résine polymérique d’oxyde de 2,6-diphénylène, connu sous le nom commercial de Tenax®. Ce contact est maintenu à une température de 60°C pendant 10 jours, de manière à simuler un contact de longue durée à température ambiante [5].

Dans ce cadre, une méthode a été développée pour la détermination quantitative de 15 photo-initiateurs dans le Tenax®.

Au cours de l’expérience de migration, le contact entre l’emballage en carton et le simulant (Tenax®) est réalisé dans une boîte de Petri fermée (Figure 1). La face non imprimée de l’échantillon de carton est mis en contact avec 1 gramme de Tenax® dans une boîte de Petri fermée et enveloppée dans de l’aluminium. Une fois l’expérience de migration terminée (10 jours à 60°C), on utilise de l’acétonitrile pour extraire le Tenax® et les extraits sont ensuite analysés par chromatographie ultra haute performance combinée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS).

Figure 1. Illustration de la détermination de la migration de photo-initiateurs depuis des emballages en carton vers le

simulant Tenax®.

Photo-initiateurs et marché belge

La méthode développée a ensuite été appliquée à 15 échantillons de carton destiné au conditionnement de denrées sèches, telles que riz, pâtes, céréales pour petit déjeuner, chapelure, ... Dans pratiquement la moitié des échantillons analysés, une migration de benzophénone et/ou de 4-diméthylaminobenzoate d’éthyle vers le Te-nax® a été observée. La migration de 2,4-diéthyl-9H-thioxanthène-9-one, de 2,2-diméthoxy-2-phénylacétophéno-ne, de 4-phénylbenzophénone et de méthylbenzophénone a également été confirmée dans certains échantillons de carton. Toutefois, il s’agissait à chaque fois d’une migration limitée et tous les échantillons ont été déclarés conformes.

Extraction du Tenax® Analyse par UPLC-MS/MS Expérience de migration (10 jours à 60°C)

Répartition homogène du Tenax® sur le carton

+ Tenax® Face imprimée du carton vers le bas

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Références:

[1] Van Hoeck E, De Schaetzen T, Pacquet C, Bolle F, Boxus L, Van Loco J. 2010. Analysis of benzophenone and 4-methylbenzophenone in breakfast cereals using ultrasonic extraction in combination with gas chromatograp-hy-tandem mass spectrometry (GC-MSn). Anal chimacta. 663:55-59

[2] International Baby Food Action Network. 2005. Chronology of Withdrawal of Nestlé and Other Liquid Milks. Available from: http://www.ibfan.org/art/416-1.doc

[3] European Food Safety Authority. 2009. EFSA statement on the presence of 4-methylbenzophenone found in breakfast cereals. The EFSA Journal. RN-243:1-19. Available from: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/243r.htm

[4] Département fédéral de l’intérieur. 2005. Ordonnance du DFI du 23 novembre 2005 sur les objets et maté-riaux (RS 817.023.21) – Annexe 6 Listes des substances admises au 1er mai 2011 pour la fabrication des encres d’emballage et exigences y relatives.

[5] Règlement (UE) N° 10/2011 du 14 janvier 2011 concernant les matériaux et objets en matière plastique desti-nés à entrer en contact avec des denrées alimentaires. JO L 12, 15.1.2011, p. 1-89.

Kathy.VandenHouwe@wiv-isp.be

Article publié sous le titre:“Evaluation of the migration of 15 photoinitiators from cardboard packaging into Tenax® using ultra performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)”K. Van Den Houwe, S. Van de Velde, C. Evrard, E. Van Hoeck, J. Van Loco & F. Bolle.Food Add. Contam A. DOI:10.1080/19440049.2014.886340

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Test inter-laboratoires du LNR-OGM belge au sujet du système CoSYPS (combinatory sybr®green pcr screening)Nina Papazova, Sylvia Broeders, Nancy Roosens Institut Scientifique de santé Publique (WIV-ISP), Plateforme Biotechnologie et Biologie moléculaire (PBB), rue J. Wytsman 14, 1050 Bruxelles, Belgique

Eric Janssen, Gilbert BerbenCentre wallon de Recherches agronomiques (CRA-W), Unité Authentification et traçabilité, bâtiment Henseval, 24 Chaussée de Namur, 5030 Gembloux, Belgique

Isabel Taverniers, Marc De LooseInstituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO), Eenheid Technologie & Voeding (T&V), Burg. Van Gansbergh-elaan 115, 9820 Merelbeke, Belgique

Ronny Martens, Ingrid De VuyssereAgence Fédérale pour la Sécurité de la Chaine Alimentaire (AFSCA), FLVVM, Brusselsesteenweg 370A, 9090 Melle, Belgique

Introduction

L’analyse en routine de détection des organismes génétiquement modifiés (OGM) par qPCR (‘polymerase chain reaction’ en temps réel) est un processus comprenant plusieurs étapes. Elle démarre par le criblage des échantil-lons, étape consistant en la recherche d’éléments génétiques communs tels que des promoteurs, terminateurs, régions codantes ou autres séquences qui se retrouvent dans différents OGM. Le but est de réduire le spectre des candidats à identifier lors d’une seconde étape via une méthode spécifique à l’événement OGM. Vu le nombre sans cesse croissant de nouveaux événements transgéniques (1), il est indispensable de mettre en œuvre des méthodes de criblage sensibles avec un bon rapport coût-efficience.

A cet effet, une série de méthodes de criblage d’OGM par qPCR dans le format SYBR®Green a été développée à l’Institut Scientifique de Santé Publique (WIV-ISP). Ce set comprend les méthodes suivantes: 1/ quatre méthodes spécifiques à des traits (CP4-EPSPS, CryIAb/Ac, pat, bar) (2); 2/ deux méthodes de détection d’éléments fréquem-ment employés dans les constructions transgéniques (p35S et tNOS) (3); 3/ trois méthodes spécifiques aux taxons ciblant la lectine de soja (lec) , l’alcool déshydrogénase de maïs (adh) et la cruciférine (cru) du colza de façon à déceler ces espèces végétales dans l’échantillon. En outre, une méthode permettant la détection d’un marqueur universel de plantes est repris dans le set. Ce marqueur développé initialement au CRA-W (5) se fonde sur une séquence d’un gène chloroplastique (rbcL). Enfin, un marqueur spécifique à la transcriptase inverse (CRT2) du virus

de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) a également été intégré. Ce dernier permet de vérifier qu’un signal positif pour le marqueur p35S ne provient pas de son donneur naturel, le CaMV.

La combinaison de ces méthodes qPCR assure un criblage efficace pour déceler d’éventuels OGM en un seul « run ». L’interprétation des résultats obtenus pour chacun des tests se fait par un système d’aide à la décision (SAD) mis au point à l’ISP. Il recourt à un algorithme employant des nombres premiers pour déterminer quels éventuels OGM sont susceptibles de se retrouver dans l’échantillon. Cette approche matricielle de recherche des OGM végé-taux est dénommée « Combinatory SYBR®Green PCR Screening » ou « CoSYPS » (6).

3332

Le système CoSYPS a été validé par une étude collaborative à laquelle 13 laboratoires officiels de l’UE ont parti-cipé. Dans ce qui suit nous décrivons la conception de cette étude inter-laboratoires à petite échelle organisée en 2010 par le Laboratoire National de Référence Belge pour les Organismes Génétiquement Modifiés (LNR-OGM) ainsi que les résultats auxquels cela a abouti.

But du test interlaboratoire belge CoSYPS

Le but était d’évaluer l’applicabilité et la praticabilité du système CoSYPS au sein du LNR-OGM belge. Dans cette perspective, des problèmes mis en évidence lors d’un test circulaire antérieur lui aussi organisé au niveau euro-péen (7) ont été éliminés ou largement atténués: 1/ tous les participants ont reçu une formation théorique et pratique avant la mise en œuvre de l’essai; 2/ les échantillons ont été produits selon le Guide ISO 43 par le Labora-toire de Référence de l’Union Européenne sur les OGM (EU-RL GMFF ; 8). La réalisation du test était couplée au test comparatif ILC-CRL-GMFF-CT02/10 organisé par l’EU-RL GMFF en septembre 2010.

Echantillons du test et analyse qPCR

Deux farines de maïs à des teneurs différentes en maïs transgéniques de l’événement MON 810 (0,8% et 3,8% en fraction massique) ont été utilisées. Par échantillon, trois extractions d’ADN ont été réalisées au moyen d’un proto-cole propre à chaque laboratoire participant à l’étude. Seuls deux de ces extraits ont subi le reste de l’analyse.

Un seul ‘run’ de qPCR a permis de traiter dans chacun des laboratoires participant les deux échantillons et de les soumettre aux 11 tests qPCR en format SYBR®Green. Selon des conditions préalablement décrites (2). Les thermo-cycleurs employés étaient ceux disponibles dans les laboratoires participants.

Cinq laboratoires ont participé à cet exercice. Etaient mis à la disposition des participants: le protocole CoSYPS complet, les amorces, les témoins positifs, le master Mix universel en SYBR®Green ainsi que le SAD CoSYPS en usage en routine à l’ISP au moment de l’étude (6).

Analyse des données

L’évaluation des résultats s’est faite par teneur en OGM (n=2), par méthode qPCR (n=11) et par événement trans-génique (n=1). Vingt résultats étaient générés au total par marqueur (2 teneurs x 2 extraits x 5 laboratoires). Des données brutes de la qPCR, deux paramètres ont été encodés dans le SAD CoSYPS: le Ct et le Tm. Un extrait est considéré comme positif pour le marqueur testé si la valeur du Ct n’excède pas 35 et pour autant que sa tempé-rature de dissociation se situe dans l’intervalle défini par le Tm du témoin positif à 1°C près. Cet intervalle a été étendu à 2°C pour le test Cry1Ab/Ac de façon à pouvoir couvrir les deux différentes séquences de cette cible dans les constructions transgéniques.

Les résultats des laboratoires participants ont été comparés aux résultats attendus en terme de présence/ ab-sence pour un marqueur spécifique. La sensibilité, la spécificité ainsi que les taux en résultats faux positifs ou faux négatifs ont été calculés pour toutes les méthodes et tous les échantillons avec en parallèle les valeurs prédictives positives ou négatives (http://www.cebm.net/index.aspx?o=1042).

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Résultats

Quatre des marqueurs envisagés (rbcL, adh, p35S et CryIAb/Ac) devaient ne fournir que des résultats positifs dans les deux échantillons. Toutefois, les résultats ont montré qu’un résultat sur 20 s’est avéré négatif pour les mar-queurs p35S et Cry1Ab /Ac (Tableau 1). Une réponse négative était attendue pour les autres marqueurs. Néan-moins, un résultat faux positif a été constaté pour le marqueur pat (Tableau 1).

La sensibilité des marqueurs positifs était de 100% pour rbcL et adh. Elle était moindre pour p35S et Cry1Ab/Ac, soit respectivement 95% et 94.7% (Tableau 1). La spécificité des marqueurs négatifs était de 100% sauf pour pat (95%, Tableau 1).

Tableau 1. Résultats du test inter-laboratoires. Les marqueurs pour lesquels une réponse positive est attendue sont repris

en vert tandis que ceux pour lesquels la réponse attendue est négative sont en rouge.

rbcL lec adh cru p35S tNOSCP4-

EPSPS

Cry-1Ab /

Acpat bar CRT2

# résultats positifs 20 0 20 0 19 0 0 18 1 0 0

# résultats négatifs 0 20 0 20 1 20 20 1 19 20 20

Sensibilité (%) 100 100 95 94.7

Specificité (%) 100 100 100 100 95 100 100

Au cours de ce test inter-laboratoires, la sensibilité et la spécificité sur l’ensemble ont très bien donné (99%). Les valeurs prédictives positives et négatives atteignent des valeurs élevées de respectivement 97 et 99% (Tableau 2) avec des taux de résultats faux positifs et faux négatifs bas (<5%).

Tableau 2. Données de sensibilité et de spécificité sur l’ensemble et valeurs prédictives positive et négative

Positifs mesurés Négatifs mesurés

Positifs attendus 77 2 97% Valeur prédictive positive

Négatifs attendus 1 139 99% Valeur predictive négative

99% 99%

sensibilité spécificité

Conclusions

De manière générale, les résultats obtenus lors du test inter-laboratoire LNR-OGM démontrent que les méthodes qPCR en format SYBR®Green ont permis une détection correcte des marqueurs présents dans les deux échantil-lons: le marqueur spécifique au maïs, les marqueurs de constructions transgéniques (p35S et Cry1Ab/Ac) ainsi que le marqueur universelle plante (rbcL). Il faut en conclure que le SAD CoSYPS est applicable pour le criblage des OGM dans de tels échantillons.

3534

Par ailleurs, tous les laboratoires participants ont pu effectuer le côté expérimental du protocole qPCR sans aucun problème. En outre, il était possible d’analyser tous les échantillons et tous les marqueurs en un seul « run ». D’autre part, aucun besoin spécifique n’est nécessaire concernant l’infrastructure et les instruments qPCR puisque chaque laboratoire a pu utiliser son propre instrument. Ceci démontre la praticabilité des méthodes SYBR®Green utilisées et la configuration combinée comme appliqué dans le système CoSYPS. Il est toutefois utile de fournir une courte formation théorique aux futurs utilisateurs concernant le fonctionnement du SAD et comment s’en servir.

Prenant en compte à la fois les résultats de l’étude de validation européenne (7) et de l’étude interlaboratoires du LNR-OGM présentée ici, il peut être affirmé que le SAD CoSYPS est un outil fiable et efficace dans le criblage des OGM dans les denrées alimentaires et en alimentation animale.

Perspectives

Les méthodes SYBR®Green ont entre-temps été complètement validées (7). Elles seront dès lors reprises dans la banque de données européenne des méthodes de référence pour l’analyse des OGM (9) (http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/). Enfin signalons que l’approche de criblage des OGM présentée peut toujours être étendue à de nouvelles méthodes (10) de façon à accroître la couverture et le pouvoir discriminant du SAD.

Références

1. James (2013). Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2013. ISAAA: Brief 46.2. Barbau-Piednoir et al. (2012). Four new SYBR®Green qPCR screening methods for the detection of Roundup

Ready®, LibertyLink®and CryIAb traits in genetically modified products. Eur Food Res Technol 234:13–23.3. Barbau-Piednoir et al. (2010). SYBR®Green qPCR screening methods for the presence of ‘‘35S promoter’’ and

‘‘NOS terminator’’ elements in food and feed products. Eur Food Res Technol 230:383–393. 4. Mbongolo Mbella et al. (2011). SYBR®Green qPCR methods for detection of endogenous reference genes in

commodity crops: a step ahead in combinatory screening of genetically modified crops in food and feed products. Eur Food Res Technol 232:485-496.

5. Debode et al. (2012). DNA Detection by Conventional and Real-Time PCR After Extraction from Vegetable Oils. J AOCS 89 (7), 1249-1257.

6. Van den Bulcke et al. (2010). A theoretical introduction to “Combinatory SYBR®Green qPCR Screening”, a matrix-based approach for the detection of materials derived from genetically modified plants. Anal Bioanal Chem 396:2113–2123.

7. Barbau-Piednoir et al. (2014). Inter-laboratory Testing of GMO Detection by Combinatory SYBR®Green PCR Screening (CoSYPS). Food Anal Methods, DOI 10.1007/s12161-014-9837-3

8. Charels et al. (2010). Comparative Testing Report on the Detection and Quantification of Maize Event MON 810. EUR 25028 EN – 2011.

9. Bonfini et al. (2012). GMOMETHODS: The European Union Database of Reference Methods for GMO Analysis. J AOAC Int 95 (6): 1713 – 1719.

10. Broeders et al. (2013). New SYBR®Green methods targeting promoter sequences used for screening of several GM events pending for authorisation in Europe. Eur Food Res Technol 236:537–547.

nina.papazova@wiv-isp.be

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Les formations, destinées aux laboratoires agréés, organisées par l’AFSCA en collaboration avec les laboratoires nationaux de référence se trouvent sur le site web de l’AFSCA

(www.afsca.be > Secteurs professionnels > Laboratoires > Séminaires & workshop).

Ce tableau est régulièrement actualisé, veuillez donc régulièrement consulter le site web.

D’autres workshops et symposia intéressants sont mentionnés ci-dessous.

Workshops & Symposia

Date Sujet Lieu Plus d’info (site web)

31.08-05.09.2014

The 34th International Sym-posium on Halogenated Persistent Organic Pollutants – Dioxin 2014

Madrid, Spain http://www.dioxin2014.org/

1-4.09.201424th International ICFMH con-ference, FOOD MICRO 2014

Nantes, France http://www.foodmicro2014.org/

7-10.09.2014 128th AOAC Annual Meeting & Exposition

Boca Raton Resort & Club501 East Camino RealBoca Raton, Florida 33432 USA

http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC/Meetings___Events/14AM_An-nual_Meeting/AOAC_Member/Meetings___Events/14AM/Annual_Meeting.aspx?hkey=4cd073ff-a131-49e4-8e19-97230bbb0d82

10-11.09.2014

14th International Fresenius Conference“The Biocidal Products Regu-lation”

Mainz (near Frankfurt/Ger-many)

http://www.akademie-fresenius.de/konferenz/output.php?kurs=449

18-19.09.201419th Conference on Food Microbiology

Brussels, BelgiumOrganized by the Belgian Society for Food Microbiology vzw/aslb (BSFM)www.bsfm.be

29.09-1.10.20143rd International Conference on Responsible Use of Antibio-tic in Animals

Amsterdam, the Netherlands

http://www.bastiaanse-communicati-on.com/html/upcoming.htmlhttp://www.bastiaanse-communicati-on.com/rua2014/

09.10.2014 to 10.10.2014

4th International Fresenius Conference FEEDRe-evaluation – Labelling – Claims – Dietetic Feed

Cologne/Germanyhttp://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/output.php?thema=3&kurs=445

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Date Sujet Lieu Plus d’info (site web)

31.08-05.09.2014

The 34th International Sym-posium on Halogenated Persistent Organic Pollutants – Dioxin 2014

Madrid, Spain http://www.dioxin2014.org/

1-4.09.201424th International ICFMH con-ference, FOOD MICRO 2014

Nantes, France http://www.foodmicro2014.org/

7-10.09.2014 128th AOAC Annual Meeting & Exposition

Boca Raton Resort & Club501 East Camino RealBoca Raton, Florida 33432 USA

http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC/Meetings___Events/14AM_An-nual_Meeting/AOAC_Member/Meetings___Events/14AM/Annual_Meeting.aspx?hkey=4cd073ff-a131-49e4-8e19-97230bbb0d82

10-11.09.2014

14th International Fresenius Conference“The Biocidal Products Regu-lation”

Mainz (near Frankfurt/Ger-many)

http://www.akademie-fresenius.de/konferenz/output.php?kurs=449

18-19.09.201419th Conference on Food Microbiology

Brussels, BelgiumOrganized by the Belgian Society for Food Microbiology vzw/aslb (BSFM)www.bsfm.be

29.09-1.10.20143rd International Conference on Responsible Use of Antibio-tic in Animals

Amsterdam, the Netherlands

http://www.bastiaanse-communicati-on.com/html/upcoming.htmlhttp://www.bastiaanse-communicati-on.com/rua2014/

09.10.2014 to 10.10.2014

4th International Fresenius Conference FEEDRe-evaluation – Labelling – Claims – Dietetic Feed

Cologne/Germanyhttp://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/output.php?thema=3&kurs=445

20-21/10/2014

Development & Potential of qPCR&dPCR as a tool for progressive molecular biology research

London, UK http://www.globalengage.co.uk/qpcr.html

27-31.10.2014 IDF World Dairy Summit 2014 Tel Aviv, Israel http://www.idfwds2014.com/

29-30.10.2014 Food Analysis Congress Barcelona, Spainhttp://www.microbiologyconference.com/

29-30.10.40145th International Fresenius ConferenceEndocrine Disruptors

Cologne, Germanyhttp://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/output.php?thema=3&kurs=462

3-7.11.2014Management of Microbiolo-gical Hazards in Foods (15th edition)

Wageningen, The Netherlands

Organised in cooperation with: Euro-pean Chair in Food Safety Microbio-logyhttp://www.vlaggraduateschool.nl/eduvlco.html

10-12.11.2014The World Mycotoxin Forum8th Conference

Vienna, Austriahttp://www.bastiaanse-communicati-on.com/html/upcoming.html

10.11.2014 The Plant Toxin Forum Vienna, Austriahttp://www.bastiaanse-communicati-on.com/html/upcoming.html

20/11/2014 Food Contact Materials Brussels, Belgiumhttp://www.kvcv.be/index.php/nl/start-voeding

28.11.201410th Symposium of the Scien-tific Committee of the Belgian Food Safety Agency

Brussels, Belgium s5.pccb@favv-afsca.be

16-18.03.2015

4th Beneficial Microbes ConferenceInternational conference on the health impact and future potential of beneficial microbes

The Hague, the Netherlandshttp://www.bastiaanse-communicati-on.com/bm2015/

21-22.05.2015

AOAC Europe – NMKL – Nord-Val International Symposium 2015:“Food Labs in Crystal Ball; Future Challenges in Food Analysis”

Stockholm, SwedenJointly organised by AOAC Europe, NMKL and NordVal International.http://www.aoaceurope.com/

June 2015Global Forum on Genetically Modified Wheat Information will follow soon

http://www.bastiaanse-communicati-on.com/html/upcoming.html

LNRN A T I O N A L ER E F E R E N T I ELABORATORIA

L A B O R ATO I R E SN A T I O N A U XD E R E F E R E N C ENRLN A T I O N A L

R E F E R E N C ELABORATORIESNRL