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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE LEITE E DERIVADOS
GISELE BOMBARDI FREITAS BARONE GASPARINI
Londrina 2018
PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU: EFEITO NA
QUALIDADE DO QUEIJO TIPO PROVOLONE
GISELE BOMBARDI FREITAS BARONE GASPARINI
Cidade ano
AUTOR
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados. Orientadora: Profa. Dra. Elsa Helena Walter de Santana
Londrina
2018
PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU: EFEITO NA QUALIDADE DO QUEIJO TIPO PROVOLONE
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação na publicação (CIP) Universidade Pitágoras Unopar
Biblioteca CCBS/CCECA PIZA
Setor de Tratamento da Informação
Gasparini, Gisele Bombardi Freitas Barone
G249p Psicrotróficos em leite cru: efeito na qualidade do queijo
tipo provolone. / Gisele Bombardi Freitas Barone Gasparini.
Londrina: [s.n], 2018.
54 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e
Derivados). Universidade Pitágoras Unopar.
Orientadora: Profa. Dra. Elsa Helena Walter de Santana.
1- Leite - Dissertação - UNOPAR 2- Termodúricos 3-
Proteólise 4- Qualidade do queijo - provolone 5-
Psicrotróficos em leite 6- Vida útil - queijo I- Santana, Elsa
Helena Walter de; orient. II- Universidade Pitágoras Unopar.
CDD 637 Andressa Fernanda Matos Bonfim - CRB 9/1643
GISELE BOMBARDI FREITAS BARONE GASPARINI
PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU: EFEITO NA QUALIDADE DO QUEIJO TIPO PROVOLONE
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite
e Derivados, área e concentração em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados como
requisito parcial para a obtenção do título de Mestre conferido pela Banca
Examinadora composta pelos seguintes membros:
_________________________________________ Profa. Dra. Elsa Helena Walter de Santana
(Universidade Norte do Paraná)
_________________________________________ Prof. Dr. Rafael Fagnani
(Universidade Norte do Paraná)
_________________________________________ Dr. Ronaldo Tamanini
(Universidade Estadual de Londrina)
Londrina, 28 de fevereiro de 2018.
Dedico este trabalho à minha família pelo apoio
e amor incondicional, meu esposo e filhos
amados.
AGRADECIMENTOS
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo apoio financeiro através da concessão da taxa PROSUP;
À Deus nosso Pai e Jesus nosso mestre por toda uma existência de
apoio, incentivo e proteção para que tivesse a oportunidade e força para realizar esse
grande sonho de voltar aos bancos escolares depois de muitos anos e concretizar o
mestrado;
À minha orientadora e grande mestre Dra. Elsa Helena Walter de
Santana, que com sua habilidade intelectual me conduziu e orientou com muita
disciplina todos os caminhos a serem percorridos;
Ao professor Dr. Rafael Fagnani pela orientação e ajuda na estatística
do trabalho desenvolvido;
Ao meu esposo Ricardo e filhos Maria Luiza e Ricardo, por serem tão
importantes na minha vida. Sempre ao meu lado, me incentivando e fazendo transpor
meus medos, limites e sempre acreditando no meu sonho;
Aos colegas da turma 11 do Mestrado em Ciências e Tecnologia de
Leite e Derivados da UNOPAR, Angélica, Bruno, Emely, Érika, Flávia, Liliane,
Paulyne, Rafael, Rogério, Rosana, Silvia e Vitória, pela amizade, incentivo, apoio,
ensinamentos e parceria;
À todos os professores e funcionários do programa de mestrado por
contribuirem com seus ensinamentos;
Aos colegas de laboratório, os técnicos Flávia, Sabrina e Samuel que
me socorreram nos momentos mais difíceis e cooperaram no término desse trabalho,
muito obrigada pela dedicação;
À minha querida estagiária Franciany, um anjo que entrou na minha
vida, me trazendo calma, presteza, dedicação e muita amizade, sem você todos os
dias no laboratórios teriam sido muito difícies;
Às minhas amigas de uma vida inteira Vitória e Silvia, por partilharem
anos de amizade, profissão e estudos com muito amor e carinho;
Às minhas eternas amigas Liliane e Rosana por percorrerem comigo
parte do mestrado com matérias difíceis e pesadas, me incentivando a nunca desistir
e por todas as tardes, noites e madrugadas de estudo;
Ao colega Bruno, pela paciência e por ter compartlhado seus vastos
conhecimentos;
À Indústria de laticínios Kollac e seus gestores que foram meus
grandes incentivadores, André, Laércio, Gabriel, Marcos, Kelly e tantos outros
colaboradores por todo apoio, paciência e interesse em melhorias na qualidade meus
eternos agradecimentos;
Aos gestores Lilian, Milton, Andréia, Vanderléia, Adriano, Adalto,
Flávio, Jorge, Fabiana e muitos outros por compreenderam minha ausência e por todo
o incentivo nas pesquisas;
Aos meus pais, por todo amor e por sempre me fazerem acreditar que
o trabalho honesto e os estudos com afinco são as melhores escolas da vida.
"Para ter algo que você nunca teve, é preciso fazer algo que você nunca fez!" Chico Xavier
GASPARINI, Gisele Bombardi Freitas Barone. Psicrotróficos em leite cru: efeito na qualidade do queijo tipo provolone. 2018. 54. f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) - Unidade Piza, Universidade Pitágoras Unopar, Londrina, 2018.
RESUMO
A implantação da refrigeração do leite na propriedade, o transporte a granel e a ineficiência da implantação das boas práticas de ordenha favoreceram o desenvolvimento dos psicrotróficos. Essas bactérias, a partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas lipolíticas e proteolíticas termo resistentes suficientes para promover alterações físicas e sensoriais que comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados. Este estudo teve o objetivo avaliar a influência da população de psicrotróficos do leite cru refrigerado nas características microbiológicas, físico químicas, índice de proteólise e textura do queijo tipo provolone ao longo da maturação de 60 dias. Foram selecionados dois tipos de matéria prima para produção de 2 lotes (20 unidades/lote) de queijo tipo provolone: tratamento 1 utilizando leite cru refrigerado com populações de 3 log UFC.mL-1 de psicrotróficos/mL, e o segundo tratamento, leite com contagens de 7 log UFC.mL-1. As análises físico químicas de gordura e umidade foram realizadas pelo método de Gerber para queijos e determinação da umidade por equipamento MB25. As mudanças proteolíticas ocorridas durante a maturação do queijo foram estudadas usando eletroforese UREA-PAGE alcalina (SDS-PAGE), determinação de Kjeldahl das frações solúveis em nitrogênio total, nitrogênio não caseico (NNC) e nitrogênio não proteico (NNP), utilizando os índices de proteólise primária e secundária. A textura foi determinada por equipamento texturômetro. Os resultados da textura do queijo produzido com matéria prima com 7 log UFC.mL-1 nos parâmetros dureza, gomosidade e mastigabilidade foram influenciados pela qualidade microbiológica do leite (p<0,01). Em relação à composição centesimal, a qualidade microbiológica do leite teve influência apenas na quantidade de gordura dos queijos, observando-se uma relação linear e negativa (p<0,01). A maior população de micro-organismos psicotrópicos influenciou nas frações αs1 e β-caseína e o tempo de maturação nas frações αs1 e γ caseína. As frações αs1-I, αs1-II não se relacionaram (p>0,05) com a qualidade do leite ou com o tempo de maturação devido o estudo realizado ser feito com queijos de até 60 dias de maturação. Conclui-se que a qualidade microbiológica da matéria prima influênciou na qualidade do queijo tipo provolone aumentando a dureza, reduzindo o teor de gordura e promovendo maior degradação das frações αs1 e β-caseína. Palavras-chave: Proteólise. Termodúricos. Vida útil.
GASPARINI, Gisele Bombardi Freitas Barone. Psicrotróficos em leite cru: efeito na qualidade do queijo tipo provolone. 2018. 54. f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) - Unidade Piza, Universidade Pitágoras Unopar, Londrina, 2018.
ABSTRACT
With the implementation of milk refrigeration on the property, the transportation in bulk and the inefficiency of the implantation of the good practices of milking favored the development of the psychrotrophic. These bacteria, from populations of 105 - 106 UFC/ mL, produce thermally resistant lipolytic and proteolytic enzymes sufficient to promote physical and sensory infections that compromise milk quality, and especially of the derivatives.The objective of this study was to evaluate the influence of the psicrotrophic population of refrigerated raw milk on the microbiological, physical, chemical, proteolytic and provolone type texture characteristics during a 60 days maturation period. Two types of raw material were selected for the production of 2 lots (20 units/lot) of provolone cheese: treatment 1 using refrigerated raw milk with populations of 3 log UFC.mL-1 of psychrotrophic/mL, and the second treatment, milk with counts of 7 log UFC.mL-1. The physical and chemical analyzes of fat and moisture were performed using the Gerber method for cheeses and moisture determination by MB25 equipment. Proteolytic changes during cheese maturation were studied using alkaline UREA-PAGE electrophoresis (SDS-PAGE), Kjeldahl determination of soluble fractions in total nitrogen, non-casein nitrogen (NNC) and non-protein nitrogen (NNP), using the primary and secondary proteolytic indicators. The texture was determined by texturometer equipment. The results of the cheese texture produced with raw material with 7 log CFU.mL-1 in the parameters of hardness, guminess and chewing were influenced by the microbiological quality of the milk (p<0.01). In relation to the centesimal composition, the microbiological quality of the milk influenced only in the amount of fat in the cheeses, with a negative linear relation (p<0.01). The largest population of psychotropic microorganisms had a influence on the αs1 and β-casein and the maturation time in the fractions αs1 and γ casein. αs1-I, αs1-II , were not related (p>0.05) to milk quality or time of maturation due to the study had been carried out with cheeses with up to 60 days of maturation. It is concluded that the microbiological quality of the raw material influences the quality of the provolone type cheese product, increasing the hardness, reducing the fat content and promoting greater degradation of the αs1 and β-casein fractions.
Key words: Proteolysis. Thermodurics. Lifespan.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 10
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...................................................................... 11
2.1 MICRO–ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS .............................................. 11
2.1.1 Psicrotróficos Termodúricos ....................................................................... 13
2.2 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS ........................................................................ 14
2.3 PERFIL ELETROFORÉTICO ........................................................................ 16
2.4 FRAÇÕES PROTEICAS ............................................................................... 17
2.5 PROTEÓLISE PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA ................................................. 18
2.6 QUEIJO TIPO PROVOLONE ........................................................................ 19
2.7 TEXTURA ..................................................................................................... 20
3. OBJETIVOS .................................................................................................... 22
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 22
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 22
REFERÊNCIAS .................................................................................................. 23
4. ARTIGO .......................................................................................................... 28
5. CONCLUSÃO GERAL .................................................................................... 51
ANEXO I ............................................................................................................. 52
ANEXO II ............................................................................................................ 53
ANEXO III ........................................................................................................... 54
10
1. INTRODUÇÃO
Entre 2006 e 2013, o mercado brasileiro de queijos cresceu em
volume 9,4% ao ano, e em faturamento total 7,7% ao ano (CARVALHO; VENTURINI;
GALAN, 2015). A meta da Associação Brasileira das Indústrias de queijo (Abiq) é que
até 2020 o consumo seja de 7,5 quilos per capita, projetando para o ano de 2030
atingir a marca de 9,6 quilos de queijo por habitante, o que representa uma evolução
de 46% frente a quantidade atual de 5 quilos por pessoa em todo pais (ABIQ, 2017).
Um dos queijos mais produzidos foi o queijo tipo provolone,
caracterizado por ser de massa filada, semiduro, de textura fechada ou com poucas
olhaduras, cuja origem é a região sul da Itália (FAVATI; GALGANO; PACE, 2007).
O Brasil, apesar de ser um dos maiores produtores de leite do mundo
(FAO, 2013), apresenta excessiva contaminação do leite cru por micro-organismos
deteriorantes, que comprometem rapidamente a qualidade e o tempo de vida de
prateleira dos produtos lácteos (TAMANINI, 2012).
Com a implantação da refrigeração do leite na propriedade e o
transporte a granel (BRASIL, 2011) favoreceu o desenvolvimento dos psicrotróficos.
Essas bactérias, a partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas
lipolíticas e proteolíticas termo resistentes suficientes para promover alterações físicas
e sensoriais que comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados
(MU; DU; BAI, 2009; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Outro grupo de
deteriorantes importante são os microrganismos termodúricos, que são capazes de
resistir à pasteurização (FRANCO, LANDGRAF, 2003). No leite cru refrigerado, esses
microrganismos também podem ser psicrotróficos proteolíticos e/ou lipolíticos
(RIBEIRO JÚNIOR et al., 2014).
Desta forma, a avaliação da influência da microbiota psicrotróficas do
leite cru na qualidade microbiológica e físico-química do queijo tipo provolone é de
fundamental importância para as características sensoriais, índice de proteólise e vida
de prateleira do produto. Esses dados podem ser úteis para as indústrias, órgãos
regulamentadores conhecerem e selecionaram a matéria prima a ser beneficiada para
a fabricação dos produtos lácteos e consequentemente diminuir perdas financeiras e
tecnológicas.
11
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A legislação brasileira através da Instrução Normativa n. 62, de 29 de
dezembro de 2011, aprovou o regulamento técnico de identidade e qualidade do leite
cru refrigerado, fixando limites físico-químicos e microbiológicos que este produto
deve atender. Visando a melhoria da qualidade do leite, a referida normativa
estabelece, que o leite deve ser resfriado em tanques de refrigeração por expansão
direta (temperatura igual ou inferior a 4oC) ou em tanques de imersão (temperatura
igual ou inferior a 7oC), devendo ser recolhido e transportado em caminhões
isotérmicos para o laticínio em até 48 horas (BRASIL, 2011).
A principal microbiota deteriorante do leite e de produtos lácteos antes
da introdução da refrigeração, era constituída de bactérias mesófilas fermentadoras
da lactose, que causam rápida acidificação em leite não refrigerado. Com o uso da
refrigeração, associado a períodos mais longos de armazenamento, selecionou-se um
outro tipo de microbiota deterioradora, denominada psicrotrófica (ARCURI, 2003;
COUSIN, 1982; FAGUNDES et al., 2006; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Este
grupo de bactérias sintetiza enzimas termo resistentes e são capazes de se multiplicar
a temperaturas de 7oC ou menos, independentemente de sua temperatura ótima de
crescimento (FRANK et al., 1992).
Outro grupo importante de micro-organismos deteriorantes são os
micro-organismos termodúricos que podem ser psicrotróficos proteolíticos e/ou
lipolíticos, deteriorando o leite pasteurizado (RIBEIRO JÚNIOR et al., 2014). A
definição para os termodúricos de acordo com Franco e Landgraf (2003) são micro-
organismos na forma vegetativa ou na forma de esporos que sobrevivem ao processo
de pasteurização, podendo sobreviver a exposição de temperaturas consideráveis
altas. As espécies de bactérias termodúricas isoladas no leite usualmente incluem os
micrococos, grupo dos corineformes, bacilos e clostridios (APHA, 2004).
2.1 MICRO–ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS
A maioria dos micro-organismos psicrotróficos presentes no leite cru
e produtos lácteos geralmente vem do solo, água e vegetação (SANTANA et al.,
2001). De acordo com Vallin et al. (2009) a implantação das boas práticas de ordenha
na propriedade, como sanitização adequada de equipamentos e utensílios, desprezo
12
dos três primeiros jatos de leite e eliminação da água residual dos utensílios de
ordenha são fundamentais para minimizar os riscos de contaminação durante a
produção. Esses procedimentos são capazes de reduzir a contaminação microbiana
e/ou física do leite.
Podem ser representados tanto por Gram negativos como os gêneros
Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium
e Flavobacterium como por Gram positivos como Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus e Microbacterium. Devido aos
procedimentos usuais de manutenção e coleta do leite refrigerado, em dois a três dias
eles predominam na microbiota do leite cru (CROMIE, 1992; SORHAUG;
STEPANIAK, 1997).
Arcuri et al. (2008) realizaram um estudo que demonstrou que o grupo
psicrotrófico inclui uma grande variedade de gêneros bacterianos, com predominância
do gênero Pseudomonas (43%), sendo Pseudomonas fluorescens a espécie
predominante (37,6%). A frequência do gênero Pseudomonas spp. e da espécie P.
fluorescens em leite cru refrigerado foi analisada por Almeida (2014) como indicador
de qualidade e da aplicação correta de boas práticas de ordenha. Os resultados foram
contrários aos estudos até então apresentados, a porcentagem de Pseudomonas spp.
foi de 17,93%, sendo a espécie P. fluorescens apenas 3,42% deste total, não
constituindo assim a espécie predominante nas amostras analisadas. Provavelmente
existam outros psicrotróficos envolvidos na deterioração do leite cru refrigerado de
acordo com os resultados analisados.
O Ministério da Agricultura não estipula um padrão de identidade e
qualidade do leite, para a enumeração dos psicrotróficos (BRASIL, 2011). Porém
quando em condições sanitárias adequadas, os psicrotróficos presentes no leite cru,
representam menos de 10% da microbiota total, porém os micro-organismos
psicrotróficos podem ultrapassar 75% em condições higiênicas não satisfatórias
(NIELSEN, 2002).
A população de psicrotróficos no leite cru refrigerado varia com o
binômio tempo/temperatura e sua estocagem por períodos prolongados reflete
negativamente na qualidade do produto final. É desaconselhável a fabricação de
produtos a partir do leite cru refrigerado com contagem de psicrotróficos superiores a
106 UFC/mL, pois é grande a possibilidade da presença de enzimas extracelulares
termo resistentes como proteases e lipases (COUSIN; BRAMLEY, 1981; PINTO;
13
MARTINS; VANETTI, 2006).
Walstra, Wouters e Geurts (2005) afirmaram que os defeitos de sabor
começam a aparecer em quantidades superiores a 5x107 psicrotróficos por mililitro de
leite. Lipases e proteases secretadas por esses organismos são conhecidas por
provocarem alterações sensoriais no leite e derivados lácteos, causando rancidez
(IZIDORO, 2013), sabor de sabão e, ocasionalmente, sabores amargos indesejáveis
(ARCURI et al., 2008; COUSIN, 1982; JONGUE et al., 2010). Estas alterações
ocorrem devido à degradação da gordura e proteínas do leite, respectivamente
(WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2005).
2.1.1 Psicrotróficos Termodúricos
Alguns micro-organismos psicrotróficos, podem ser termodúricos,
produzindo enzimas extracelulares termoestáveis que comprometem a qualidade e o
tempo de vida útil do leite pasteurizado; sua enumeração é uma ferramenta muito
importante no controle da qualidade da matéria prima e beneficiamento dos produtos
acabados (REIS et al., 2013).
Os psicrotróficos termodúricos são representados pelos gêneros
Arthrobacter, Microbacterium, Streptococcus, Corynebacterium, Clostridium e
principalmente pelo gênero Bacillus (COLLINS, 1981). Os que resistem à
pasteurização do leite com alta taxa de sobrevivência pertencem aos gêneros Bacillus,
Paenibacillus, Micrococcus e Mycobacterium e, com baixa taxa de sobrevivência
alguns Enterococcus, Streptococcus e Lactobacilluse (JAY, 2005). Ribeiro Júnior et
al. (2014) avaliaram 20 amostras de leite cru refrigerado na região norte do estado do
Paraná e encontraram média de 3,5x 103 UFC/mL de termodúricos psicrotróficos,
podendo estes micro-organismos estar diretamente relacionados à redução da vida
útil desse leite e seus derivados.
São consideradas importantes sob o ponto de vista tecnológico as
alterações associadas às contaminações de produtos lácteos com B. cereus, uma vez
que provocam uma redução do prazo de validade e o desenvolvimento de atributos
sensoriais indesejáveis (ALMEIDA; SANTOS; CARVALHO, 2000; CHEN;
COOLBEAR; DANIEL, 2004; FROMM; BOOR, 2004; REZENDE-LAGO et al., 2007;
DE JONGHE et al., 2010). Várias enzimas, como proteases, lipases e fosfolipases são
sintetizadas pelas espécies do gênero Bacillus podendo ser intra ou extracelulares
14
(CHEN; COOLBEAR; DANIEL, 2004). Nos Estados Unidos, de acordo com Meer et
al. (1991), 20% a 25% dos problemas reportados na Califórnia na primavera, de prazo
de validade dos produtos lácteos comercializados, foram relacionados com a
presença de enzimas produzidas por B. cereus e B. mycoides psicrotróficos. Existe
uma carência na literatura de dados mais atualizados referentes às perdas
econômicas causadas por B. cereus em produtos lácteos.
2.2 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS
Segundo Muir (1996) a proteólise em leite pode ser causada por
proteases naturais deste alimento (plasmina) ou por enzimas produzidas por micro-
organismos psicrotróficos durante a estocagem sob refrigeração. Estes dois tipos de
enzimas diferem entre si pela especificidade nas proteínas do leite.
A plasmina é a principal enzima proteolítica natural do leite fresco com
baixa contagem de células somáticas e baixa contagem bacteriana e tem o
aminoácido serina como sítio ativo (NIELSEN, 2002). Em casos de leite mastítico
verifica-se um aumento na concentração de plasmina. Esta enzima é derivada do seu
precursor inativo, o plasminogênio. O leite tem quatro vezes mais plasminogênio do
que plasmina e ambos são associados à micela de caseína. Qualquer fator que
converta plasminogênio a plasmina pode ter uma influência sobre a proteína do leite,
uma vez que esta hidrolisa prontamente αs- e β-caseínas (FOX; MCSWEENEY,
1998).
No leite, as proteases liberadas pelas bactérias psicrotróficas são, em
maioria metalo-proteases, com a presença de Ca e Zn. Grande parte apresenta baixo
peso molecular, com resíduos de glicina e alanina, concentrações mínimas de
metionina, ausência de cistina e presença da alanina no grupo terminal N. Entre as
cadeias de aminoácidos, a ausência de pontes dissulfeto promove uma maior
flexibilidade na estrutura primária da enzima, conferindo grande estabilidade térmica
a estas enzimas (MITCHELL; EWINGS, 1986). Na estrutura das proteases, a
presença de Ca2+ e de Zn2+ também contribui na estabilidade destas enzimas ao calor,
com resistência à temperatura de 149ºC/7seg, similar ao tratamento UHT (BARACH;
ANAMS; SPECK, 1976).
A produção de proteases pelas bactérias é influenciada pelas
condições do ambiente. A produção de proteases por unidade de peso seco aumenta
15
com a diminuição da temperatura, enquanto que a multiplicação celular, abaixo de
20ºC, reduz com a diminuição da temperatura. Este fato suporta a hipótese de que as
bactérias psicrotróficas sintetizam maiores quantidades de enzimas a baixas
temperaturas, a fim de compensar a redução da atividade enzimática e manter sua
taxa de multiplicação celular (FAIRBAIRN; LAW, 1986).
Contagens de bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru
refrigerado foram isoladas e quantificadas por Arcuri et al. (2008), esses
microrganismos nas amostras coletadas variaram entre 102 e 107 (UFC) mL, sendo
verificada a predominância de bactérias psicrotróficas Gram-negativas em 81,2% das
amostras. Nos resultados deste estudo foi verificado que a maioria dos isolados
bacterianos apresentou atividade lipolítica e/ou proteolítica em temperaturas de
refrigeração, deixando evidente que estas enzimas possuem um alto potencial de
deterioração sobre leite e produtos lácteos. A deterioração do leite cru por
psicrotróficos, assim como a atividade lipolítica e proteolítica destes micro-organismos
foram avaliadas por Kumaresan, Annalvilli e Sivakumar (2007) concluindo que a
temperatura de 2°C, houve menor multiplicação bacteriana e menores atividades
lipolítica e proteolítica quando comparado ao armazenamento a 4 e 7°C, determinando
assim a temperatura de 2°C como protetora contra a multiplicação psicrotróficos.
A redução do rendimento de queijos ocorre devido as ações das
proteases que degradam as micelas de caseína, com liberação de componentes
solúveis, como polipeptídios e aminoácidos, os quais são perdidos no soro
(CARDOSO, 2006). A formação de gosto amargo por proteases ocorre mais
acentuadamente em queijos maturados uma vez que atuam durante todo o período
de maturação, representando um grande problema de qualidade nestes produtos. A
presença de proteases em leite destinado a fabricação de queijos pode causar uma
degradação parcial das β e қ-caseínas, liberando peptídeos e nitrogênio não proteico
no soro, causando uma queda no rendimento nos queijos em até 5%. Além disso,
durante a maturação de queijos macios e semiduros, estas proteases podem liberar
peptídeos de baixo peso molecular que podem causar gosto amargo nestes queijos
(FURTADO, 2005).
A ação das proteases, principalmente do gênero Pseudomonas, é
similar à da quimosina, enzima empregada na coagulação enzimática para obtenção
de queijos (PICARD et al., 1994). Segundo Sorhaug e Stepaniak (1997) queijos duros
produzidos com leite com população de psicrotróficos de 6,5- 7,5log UFC/mL podem
16
apresentar defeitos como rancidez enquanto populações entre 7,5 a 8,3 log UFC/mL,
causaram rancidez, sabor de sabão e redução de rendimento.
2.3 PERFIL ELETROFORÉTICO
Um fenômeno importante que ocorre durante a fabricação do queijo
é a proteólise, devido à ação de enzimas endógenas do leite, bem como do coalho e
de enzimas microbianas. Em queijo fresco, como mussarela, a proteólise primária é
esperada. Portanto, fragmentação de proteína enzimática pode ser uma maneira
eficaz de controlar o estado de conservação dos produtos lácteos, porque a qualidade
do produto pode ser medida a partir dos níveis de proteólise e a formação de frações
específicas (FOX, 1989; MCSWEENEY et al., 1993; GAIASCHI et al., 2000).
As proteínas da maioria dos queijos são alteradas primeiramente pela
ação de enzimas do coalho que degradam as αs1 caseína, deixando β-caseína em
grande parte inalterada (LEDFORD; O’SULLIVAN; NATH, 1966).
A análise eletroforética das caseínas na fabricação do queijo Cheddar
a partir de leite pasteurizado, indica diferenças definidas no padrão eletroforético nos
componentes de caseína. Foi observado o desaparecimento quase por completo da
fração αs1 caseína após 55 dias de maturação e a β-caseína aparece em grande parte
afetada (LEDFORD; O’SULLIVAN; NATH, 1966). Frações de αs-caseínas (αs1-CN e
αs2-CN) em queijos frescos e curados foram registradas com uma única banda,
enquanto β-CN foi detectada com duas bandas sobrepostas. A análise de SDS-PAGE
de queijos claramente mostrou que ambas as caseínas foram significativamente
degradadas durante todo o período de amadurecimento. Durante 50 dias de
maturação, as αs-caseínas residuais foram degradadas extensivamente até 15,42%
do conteúdo inicial. Simultaneamente, β-CN teve uma degradação progressiva muito
mais lenta e o nível não hidrolisado foi de 76,88% (BARAC et al., 2016).
Segundo Mayer, Rockenbauer e Mlcak (1998) as alterações em
proteínas insolúveis têm sido estudadas utilizando técnicas eletroforética, onde foi
demonstrado que β-caseína é hidrolisada muito rapidamente durante os primeiros
meses de cura, desaparecendo depois de aproximadamente um ano.
Consequentemente as Y2 e Y3-caseínas continuam a aumentar, e Y1-caseína tende a
diminuir concomitantemente, o que confirma o importante papel da plasmina na
maturação.
17
É evidente a presença das caseinas α, β e do peptído para-k-
caseínas, nas amostras de queijo, sendo este peptídeo característico em decorrência
da hidrólise da k-caseína pela ação da quimosina que hidrolisa esta proteína da região
Phe105-Met106 (EGITO et al. 2007).
Fragmentos αS1-NC foram encontrados, sugerindo uma atividade
proteolítica intensa provavelmente relacionado com as diferentes idades das coalhada
usados para a produção das amostras analisadas: quanto maior for a idade da
coalhada, maior será a presença de produtos de proteólise, como também tem sido
relatado para coalhada bovina (FACCIA et al., 2014).
2.4 FRAÇÕES PROTEICAS
As micelas de caseína no leite são altamente hidratadas (3,7 g ou 4,4
mL de água) por grama de caseína. Apresentam peso molecular da ordem de 2,5 x
108 daltons e medem de 500 a 3.000 angstroms de diâmetro, são formadas de 93%
(p/p) de caseínas em que αs1, αs2, β e κ estão nas proporções 3:1: 3:1. Os restantes
7% do peso das micelas constam de cálcio inorgânico (2,87%), fosfato (2,89%), citrato
(0,4%) e pequenas quantidades de magnésio, sódio e potássio (SCHMIDT, 1980;
ROLLEMA, 1992). As caseínas são classificadas em quatro sub-grupos: caseínas α,
β, κ e γ. As caseínas α formam uma família de proteínas com características diferentes
(αS0 a αs5). Dentro de cada grupo de caseínas aparecem ainda variantes genéticas,
como ilustra a Tabela 1 (SGARBIERI, 1996).
Tabela 1 (adaptada): Principais características físico-químicas das
caseínas do leite de vaca
Fração proteica Porcentagem no leite desnatado Peso molecular*
Caseína αS1 (αS0, αs2, αs3, αS4, αS5)
45 – 55 23.613
Caseína β 25 – 35 24.000
Caseína κ 8 – 15 19.000 Caseína - γ
γ1 γ2 γ3
3 – 7 21.000 20.500 11.800 11.500
*Peso molecular em daltons. Fonte: SGARBIERI, 1996.
18
2.5 PROTEÓLISE PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA
Os agentes proteolíticos principais envolvidos na maturação de
queijos são:
Coagulante residual;
Enzimas naturais do leite (plasmina);
Bactérias do fermento láctico (cultivo iniciador) e suas enzimas
liberadas após lise celular;
Bactérias contaminantes, que não são do fermento láctico,
representadas pelos organismos que sobreviveram a
pasteurização do leite ou que tiveram acesso ao leite
pasteurizado ou ao coágulo durante a fabricação do queijo que
com a morte celular liberam enzimas.
Os produtos liberados após ação dos agentes proteolíticos podem ser
usados como índices de proteólise, pois a presença deles no queijo indica ação
enzimática (FOX,1989).
Desta forma têm-se os índices de extensão de maturação, conhecida
como proteólise primária e índice de profundidade da maturação chamada de
proteólise secundária.
A proteólise primária é representada pela presença de peptídeos de
peso molecular alto/intermediário que foram produzidos devido à ação do coagulante
residual, proteases do fermento e da plasmina sobre a caseína, estes peptídeos são
solúveis em pH 4,6, denominado nitrogênio não caseico (NNC), e está relacionado
com o conteúdo de nitrogênio total (NT) (WOLFSCHOON-POMBO, 1983).
A proteólise secundária é representada pela presença de peptídeos
de baixo peso molecular e aminoácidos livres que foram produzidos devido à ação de
peptidases do fermento láctico e da microbiota contaminante sobre os peptídeos de
massa molecular alta/intermediária, acumuladas durante todo processo. Esses
peptídeos menores e os aminoácidos livres são solúveis em TCA 12%, ácido que
precipita proteínas e se diferenciam dos peptídeos maiores, que são insolúveis. Assim
o índice de profundidade de maturação é medido pela dosagem de nitrogênio dos
compostos solúveis após precipitação com TCA 12%, denominado nitrogênio não
19
proteico (NNP), e está relacionado com o conteúdo de nitrogênio total (NT)
(WOLFSCHOON-POMBO, 1983).
2.6 QUEIJO TIPO PROVOLONE
O queijo tipo provolone é um dos queijos de massa filada consumidos
no Brasil, caraterizado como um queijo semiduro, de textura fechada ou com poucas
olhaduras, cuja origem é a região sul da Itália (FAVATI; GALGANO; PACE, 2007).
O experimento foi realizado com queijo tipo provolone devido ao
crescimento do consumo no Brasil, a necessidade da indústria em melhorias na
qualidade e rendimento do produto.
De acordo com o Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de
Produtos de Origem Animal - RIISPOA em seu artigo 627.
Queijo tipo "Provolone curado" é o produto obtido de leite cru ou pasteurizado, enformado ou não, não prensado e devidamente maturado pelo espaço mínimo de 2 (dois) meses. Deve apresentar: Formato tendente ao esférico ou oval; Peso: 1 a 8 kg (um a oito quilogramas); Crosta: firme, lisa, resistente, destacável, cor amarelo-parda, preferentemente revestida de parafina; Consistência: dura, não elástica, quebradiça, untada, semi-seca; Textura: fechada ou apresentando poucos olhos em formato de cabeça de alfinete; Cor: branco creme, homogênea; Odor e sabor: próprios, fortes e picantes (BRASIL, 1952).
Esse decreto foi revogado em 29 de março de 2017 pelo Decreto n°
9.013, e no seu artigo 383, confere as seguintes atribuições.
Queijo provolone é o queijo obtido por meio da coagulação do leite pasteurizado com coalho ou com outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não pela ação de bactérias lácticas específicas, com a obtenção de uma massa filada, não prensada, que pode ser fresco ou maturado. O queijo provolone fresco pode apresentar pequena quantidade de manteiga na sua massa, dando lugar à variedade denominada butirro. O queijo de que se trata o caput, pode ser defumado e devem ser atendidas as características sensoriais adquiridas nesse processo. O queijo de que se trata o caput pode ser denominado caccio-cavalo, fresco ou curado, quando apresentar formato ovalado ou piriforme (BRASIL, 2017).
As etapas do processo de fabricação e as propriedades do leite
determinam o rendimento da fabricação e a composição centesimal do queijo. A
grande maioria dos queijos coagulados enzimaticamente com uso de coalhos ou
coagulantes são maturados ou curados por um período de tempo que varia de três
semanas até dois anos ou mais. Com numerosas modificações microbiológicas,
bioquímicas, físicas e químicas a maturação é uma etapa em que o queijo é mantido
20
sob determinadas condições de temperatura e umidade relativa controladas (FOX;
MCSWEENEY, 1998; FOX et al., 2004).
2.7 TEXTURA
A textura do queijo é importante porque é essa propriedade pela qual
o consumidor primeiro identifica e julga a variedade específica (LAWRENCE;
CREAMER; GILLES, 1987).
As características de textura dos queijos são determinadas pelas
propriedades estruturais combinadas da matriz proteica e dos glóbulos de gordura
presentes no meio (LOBATO-CALLEROS et al., 2007).
Segundo Szczesniak (2002), a definição de textura evoluiu a partir
dos esforços de um número de pesquisadores que afirmaram que "a textura é a
sensoriação e manifestação funcional do estrutural, através de propriedades
mecânicas e superficiais dos alimentos detectados através dos sentidos de visão,
audição, toque e cinestésica''.
A Análise Instrumental do Perfil de Textura (TPA) é aplicada com
eficiência em muitas análises de alimentos (PONS; FISZMAN, 1996). O teste simula
a ação de compressão e corte dos dentes durante a mastigação, consistindo em
aplicações sucessivas de forças (deformantes) ao corpo de prova, sendo possível,
com base neste procedimento, gerar uma curva força versus tempo, de onde são
extraídos os parâmetros texturais como dureza, coesividade, elasticidade,
mastigabilidade e gomosidade como ilustra a Tabela 2 (SZCZESNIAK, 2002).
21
Tabela 2 (adaptada): Definições de parâmetros físicos e sensoriais
para textura.
Parâmetros Físicos Sensoriais
Dureza Força necessária para
produzir certa deformação
Força necessária para
comprimir uma substância
entre os dentes
Coesividade Medida que um material pode
ser deformado antes que ele
se rompa
Grau em que uma substância é
comprimida entre os dentes
antes que ele quebre
Elasticidade Taxa em que o material
deformado volta para sua
condição não deformada
quando a força é removida
Grau em que o produto retorna
a sua forma original
Mastigabilidade Energia necessária para
mastigar um alimento sólido
para um estado de
deglutição. Um produto de
dureza, coesão e flexibilidade
Taxa constante de aplicação de
força para reduzir a
consistência adequada para
deglutir
Gomosidade Energia necessária para
desintegrar um alimento semi
sólido, para um estado pronto
para deglutir. Um produto de
baixo grau de dureza e alto
grau de coesão
Densidade que persiste em
toda a mastigação , energia
necessária para desintegrar um
alimento semi sólido a um
estado pronto para deglutir
Fonte: SZCZESNIAK, 2002.
22
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência da população de psicrotróficos do leite cru
refrigerado nas características físico-químicas, sensoriais e índice de proteólise do
queijo tipo provolone ao longo da maturação.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a população de micro-organismos psicrotróficos,
termodúricos e proteolíticos em leite cru refrigerado enviado para produção do queijo
tipo provolone maturado;
Avaliação dos parâmetros físico-químicos, e índice de proteólise do
queijo tipo provolone durante 60 dias de maturação e correlacionar com a microbiota
da matéria prima utilizada.
23
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28
4. ARTIGO
PSICROTRÓFICOS NO LEITE CRU: EFEITO NA QUALIDADE DO QUEIJO TIPO
PROVOLONE
RESUMO
A implantação da refrigeração do leite na propriedade, o transporte a granel e a ineficiência da implantação das boas práticas de ordenha favoreceram o desenvolvimento dos psicrotróficos. Essas bactérias, a partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas lipolíticas e proteolíticas termo resistentes suficientes para promover alterações físicas e sensoriais que comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados. Este estudo teve o objetivo avaliar a influência da população de psicrotróficos do leite cru refrigerado nas características microbiológicas, físico químicas, índice de proteólise e textura do queijo tipo provolone ao longo da maturação de 60 dias. Foram selecionados dois tipos de matéria prima para produção de 2 lotes (20 unidades/lote) de queijo tipo provolone: tratamento 1 utilizando leite cru refrigerado com populações de 3 log UFC.mL-1 de psicrotróficos/mL, e o segundo tratamento, leite com contagens de 7 log UFC.mL-1. As análises físico químicas de gordura e umidade foram realizadas pelo método de Gerber para queijos e determinação da umidade por equipamento MB25. As mudanças proteolíticas ocorridas durante a maturação do queijo foram estudadas usando eletroforese UREA-PAGE alcalina (SDS-PAGE), determinação de Kjeldahl das frações solúveis em nitrogênio total, nitrogênio não caseico (NNC) e nitrogênio não proteico (NNP), utilizando os índices de proteólise primária e secundária. A textura foi determinada por equipamento texturômetro. Os resultados da textura do queijo produzido com matéria prima com 7 log UFC.mL-1 nos parâmetros dureza, gomosidade e mastigabilidade foram influenciados pela qualidade microbiológica do leite (p<0,01). Em relação à composição centesimal, a qualidade microbiológica do leite teve influência apenas na quantidade de gordura dos queijos, observando-se uma relação linear e negativa (p<0,01). A maior população de micro-organismos psicotrópicos influenciou nas frações αs1 e β-caseína e o tempo de maturação nas frações αs1 e γ caseína. As frações αs1-I, αs1-II não se relacionaram (p>0,05) com a qualidade do leite ou com o tempo de maturação devido o estudo realizado ser feito com queijos de até 60 dias de maturação. Conclui-se que a qualidade microbiológica da matéria prima influênciou na qualidade do queijo tipo provolone aumentando a dureza, reduzindo o teor de gordura e promovendo maior degradação das frações αs1 e β-caseína. Palavras-chave: Proteólise. Termodúricos. Vida útil.
29
ABSTRACT With the implementation of milk refrigeration on the property, the transportation in bulk and the inefficiency of the implantation of the good practices of milking favored the development of the psychrotrophic. These bacteria, from populations of 105 - 106 UFC/ mL, produce thermally resistant lipolytic and proteolytic enzymes sufficient to promote physical and sensory infections that compromise milk quality, and especially of the derivatives.The objective of this study was to evaluate the influence of the psicrotrophic population of refrigerated raw milk on the microbiological, physical, chemical, proteolytic and provolone type texture characteristics during a 60 days maturation period. Two types of raw material were selected for the production of 2 lots (20 units/lot) of provolone cheese: treatment 1 using refrigerated raw milk with populations of 3 log UFC.mL-1 of psychrotrophic/mL, and the second treatment, milk with counts of 7 log UFC.mL-1. The physical and chemical analyzes of fat and moisture were performed using the Gerber method for cheeses and moisture determination by MB25 equipment. Proteolytic changes during cheese maturation were studied using alkaline UREA-PAGE electrophoresis (SDS-PAGE), Kjeldahl determination of soluble fractions in total nitrogen, non-casein nitrogen (NNC) and non-protein nitrogen (NNP), using the primary and secondary proteolytic indicators. The texture was determined by texturometer equipment. The results of the cheese texture produced with raw material with 7 log CFU.mL-1 in the parameters of hardness, guminess and chewing were influenced by the microbiological quality of the milk (p<0.01). In relation to the centesimal composition, the microbiological quality of the milk influenced only in the amount of fat in the cheeses, with a negative linear relation (p<0.01). The largest population of psychotropic microorganisms had a influence on the αs1 and β-casein and the maturation time in the fractions αs1 and γ casein. αs1-I, αs1-II , were not related (p>0.05) to milk quality or time of maturation due to the study had been carried out with cheeses with up to 60 days of maturation. It is concluded that the microbiological quality of the raw material influences the quality of the provolone type cheese product, increasing the hardness, reducing the fat content and promoting greater degradation of the αs1 and β-casein fractions.
Key words: Proteolysis. Thermodurics. Lifespan.
30
1. INTRODUÇÃO
Entre 2006 e 2013, o mercado brasileiro de queijos cresceu em
volume 9,4% ao ano, e em faturamento total 7,7% ao ano (CARVALHO; VENTURINI;
GALAN, 2015). A meta da Associação Brasileira das Indústrias de queijo (Abiq) é que
até 2020 o consumo seja de 7,5 quilos per capita, projetando para o ano de 2030
atingir a marca de 9,6 quilos de queijo por habitante, o que representa uma evolução
de 46% frente a quantidade atual de 5 quilos por pessoa em todo pais (ABIQ, 2017).
O queijo tipo provolone é um dos queijos de massa filada consumidos
no Brasil, caracterizado como um queijo semiduro, de textura fechada ou com poucas
olhaduras, cuja origem é a região sul da Itália (FAVATI; GALGANO; PACE, 2007).
O Brasil, apesar de ser um dos maiores produtores de leite do mundo
(FAO, 2013) apresenta excessiva contaminação do leite cru por micro-organismos
deteriorantes, que comprometem rapidamente a qualidade e o tempo de vida de
prateleira dos produtos lácteos (TAMANINI, 2012).
Com a implantação da refrigeração do leite na propriedade, o
transporte a granel e a ineficiência da implantação das boas práticas de ordenha
(BRASIL, 2011) favoreceu o desenvolvimento dos psicrotróficos. Essas bactérias, a
partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas lipolíticas e proteolíticas
termo resistentes suficientes para promover alterações físicas e sensoriais que
comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados (MU; DU; BAI,
2009; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Outro grupo de deteriorantes importante
são os microrganismos termodúricos, que são capazes de resistir à pasteurização
(FRANCO; LANDGRAF, 2003). No leite cru refrigerado, esses microrganismos
também podem ser psicrotróficos proteolíticos e/ou lipolíticos (RIBEIRO JÚNIOR et
al., 2014). Os principais microrganismos responsáveis pela deterioração e
instabilidade de queijos Mussarela são os coliformes totais e termotolerantes
(CANTONI et al., 2006) e psicrotróficos proteolíticos (BARUZZI et al., 2012). A
excessiva ação proteolítica resulta em problemas de fatiamento e perda progressiva
da elasticidade (KINDSTEDT et al., 1993). A textura do queijo é influenciada pela
composição química inicial do queijo e pelas condições de processamento utilizadas
durante a fabricação (REN et al., 2013). Um controle adequado dos parâmetros que
afetam a textura é muito importante, pois, além de influenciar diretamente na
qualidade e satisfação do consumidor, esses parâmetros podem influenciar na
31
produção desde queijos mais macios até queijos mais duros para diferentes tipos de
consumos e de mercados consumidores (PIAZZON-GOMES et al., 2010).
Desta forma, a avaliação da influência da microbiota psicrotrófica do
leite cru na qualidade microbiológica e físico química do queijo tipo provolone é de
fundamental importância para as características sensoriais, índice de proteólise e vida
de prateleira do produto. Esses dados podem ser úteis para as indústrias e órgãos
regulamentadores conhecerem e selecionaram a matéria prima a ser beneficiada para
a fabricação dos produtos lácteos e consequentemente diminuir perdas financeiras e
tecnológicas.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Obtenção da matéria prima
Os queijos tipo provolone foram produzidos em condições industriais
a partir de dois tipos de matéria prima: (tratamento 1) leite cru refrigerado com
população de psicrotróficos de 3 log UFC.mL-1, (tratamento 2) contagens de 7 log
UFC.mL-1 de psicrotrófico/mL. Para cada tratamento foram produzidas 20 unidades
de queijo de 500 gramas a partir de aproximadamente 200 litros de leite cru
refrigerado. Para cada tratamento foram produzidas 20 unidades de queijo de 500
gramas a partir de aproximadamente 200 litros de leite cru refrigerado
As análises físico químicas de rotina da matéria prima de acordo com
a IN 62/2011 (BRASIL, 2011), foram: Temperatura, Alizarol, Acidez Dornic,
Crioscopia, Densidade a 15ºC, % de Gordura, Extrato Seco Total e Desengordurado,
Proteína, Resíduos de Antibiótico, CMT, Redutase, Amido, Neutralizantes da Acidez,
Cloretos, Urina, Peróxido de Hidrogênio, Álcool Etílico, Hipoclorito, Sacarose e
Formol. Uma alíquota de cada tratamento (200 mL) foi encaminhada para análises
microbiológicas ao laboratório de Mestrado de Ciência e Tecnologia de Leite e
Derivados, Universidade Norte do Paraná. Todo o ensaio foi repetido três vezes.
32
2.2 Análises microbiológicas
Do leite cru refrigerado utilizado para produção dos queijos, foi
pesquisada a população de bactérias psicrotróficas, psicrotróficas proteolíticas,
psicrotróficas termodúricas e mesófilas. As análises microbiológicas foram realizadas
em duplicata, diluídas a partir de alíquotas de 25 mL de cada amostra em recipiente
estéril contendo 225 mL de solução salina a 0,85%, seguido de posterior
homogeneização e diluições decimais, com o mesmo diluente (BRASIL, 2003). As
diluições foram inoculadas em meio de cultura Ágar Contagem Padrão (PCA) e em
Ágar Leite a 10% (Himedia, Mumbai, Índia). Os resultados foram expressos em
Unidade Formadoras de Colônia (UFC/mL).
2.2.1 Avaliação da População de Psicrotróficos
O meio de cultura Ágar Contagem Padrão (PCA) (Himedia, Mumbai,
Índia) foi usado para a contagem total de micro-organismos psicrotróficos. Nas placas
com o meio, foram adicionados 100 µL das diluições de cada amostra seguida de
semeadura em superfície e incubação em BOD na temperatura de 21°C por 25 horas
(OLIVEIRA; PARMELLE, 1976).
2.2.2 Avaliação da População dos Psicrotróficos Proteolíticos
Foi determinada a população proteolítica, através da semeadura de
100 µL das diluições selecionadas em Ágar Leite a 10% (Himedia, Mumbai, Índia). AS
colônias positivas apresentaram ao seu redor um halo transparente, as amostras
foram incubadas a 21ºC ± 1ºC por 72 horas (LAIRD et al., 2004).
2.2.3 Avaliação da População dos Psicrotróficos Termodúricos
Para enumeração dos micro-organismos termodúricos 5 mL de cada
amostra de leite cru foram adicionadas a um tubo de ensaio estéril com tampa de
rosca para o tratamento térmico (62,8 ± 0,5ºC) em banho-maria por 30 minutos, que
foram contados a partir do momento em que um tubo controle com um termômetro
atingiu a temperatura preconizada. Imediatamente após o tratamento térmico, os
33
tubos foram imersos em banho de gelo até atingirem a temperatura de 10ºC (FRANK;
YOUSSEF, 2004). Para pesquisa de psicrotróficos termodúricos, foi semeado 100 µL
das diluições selecionadas em PCA a 21°C por 25 horas (OLIVEIRA; PARMELLE,
1976)
2.2.4 Avaliação da População dos Mesófilos
Para enumeração dos micro-organismos mesófilos foi utilizado
(PetrifilmTM AC) incubando as amostras a 35° C/48 h
2.3 Produção de queijo tipo provolone
A partir da matéria prima com diferentes populações de psicrotróficos,
foram utilizados 200 litros de leite padrozinado (3% gordura ± 0,2%) para cada
tratamento, clarificado e pasteurizado a 72°C-75°C/15 a 20 segundos, o leite foi
posteriormente resfriado a 33-35°C e enviado para os tanques de fabricação de queijo.
Foi adicionado ao leite os seguintes ingredientes: cultura
Streptococcus thermophilus STO86 (Sacco, Campinas, Brasil) na proporção de 5
gramas para 2 litros de leite pasteurizado, aquecido a 35°C, cloreto de cálcio (30
mL/100 litros) diluído em 2 litros de água, coagulante líquido (5 mL/100 litros) e corante
natural urucum (1 mL/100 litros de leite). A coalhada foi cortada, dessorada e após
atingir o ponto de filagem, medido por pHmetro, pH: 4,9, a massa foi picada, filada,
moldada em equipamento filadeira e moldadeira (Medinox, Medianeira, Brasil), por
vapor indireto com água a 65° a 70°C e moldagem em blocos cilíndricos cônicos. As
peças (500 gramas) foram enformadas manualmente e levadas para a câmara fria (5-
7°C) de salga (22%), tratadas com clorexidina por imersão durante 8 horas. Depois
da salga, as peças foram penduradas para secar em câmara fria (4°C) com umidade
de 60% e embaladas em redes plásticas por 24 horas. A defumação foi realizada com
fumaça de cedrilho de eucalipto por 2 horas, com temperatura máxima de 50°C. Após
a defumação as peças foram lavadas com água potável, as redes plásticas foram
retiradas e as peças embaladas em sacos plásticos termoencolhíveis e mantidas a
4°C em câmara de estocagem até o momento de sua análise (Anexo I).
34
2.4 Análises físico químicas e microbiológicas do queijo
As análises físico-químicas foram realizadas em triplicata após a
produção (tempo zero), com 30 e 60 dias de maturação. Para determinação do teor
de gordura utilizou-se o método de Gerber para queijos (BRASIL, 2006) e para
umidade, o equipamento termogravimétrico MB25 (OHAUS, NJ, USA), conforme
orientação do fabricante.
Para confirmação da inocuidade dos queijos, foram pesquisados
coliformes totais e Escherichia coli em duplicata com 60 dias de maturação. As
amostras foram inoculadas em placas PetrifilmTM EC (3M, MINNESOTA, USA)
incubando as amostras a 35°C/48 horas com os resultados de contagem expressos
em UFC/g da amostra.
2.5 Proteólise
A proteólise dos queijos foi monitorada no tempo zero após a
produção; com 30 e 60 dias de maturação, através da determinação dos teores de
nitrogênio total, pelo método micro Kjeldahl (AOAC, 1995). O NNP foi avaliado a partir
do filtrado após precipitação do queijo pela adição de ácido tricloroacético (TCA 24 %)
e o NNC foi avaliado a partir do filtrado após precipitação do queijo ao ponto isoelétrico
da caseína (pH 4,6) com utilização do método macro Kjeldahl (AOAC, 1995).
O índice de proteólise primária foi determinado a partir da relação
NNC (Nitrogênio não caseico) /NT (Nitrogênio Total) e o de proteólise secundária pelo
NNP (Nitrogênio não proteico) /NT.
Foram utilizadas as seguintes equações:
1) %NNC = 1,4007 x (Va - Vb) x N x fc x 2 x 0,994 / pa
Onde:
Va= volume de titulante gasto p/ titular a amostra
Vb= volume de titulante gasto p/ titular o branco
N = normalidade do HCl fc = fator de correção do HCl utilizado
pa= peso de amostra, em gramas
0,994 = correção do volume de precipitado, considerando leite
integral.
Proteólise primária = NNC/NT x 100
35
2) %NNP = V.N.Fc. 1,4008x20 / pa. Pb
Onde:
V, fc, N = HCl utilizado na titulação.
pa e pb = peso das alíquotas, em g.
20 = diluição
Proteólise secundária = NNP/NT x 100
As análises foram realizadas em triplicata, de acordo com Bynum e
Barbano (1985).
2.6 Análise de perfil de textura
O perfil de textura foi obtido por teste de dupla compressão das
amostras de queijo, processado em analisador de textura, Texture Analyser CT3
(Brookfield Engineering Labs, Middleboro, EUA) e probe cilíndrico com largura (25
mm) comprimento (40 mm) e profundidade (10 mm). As condições utilizadas nos
ensaios foram: Análise do Perfil de Textura (TPA); velocidade de pré teste, teste e pós
teste de 2, 1 ,4,5 mm/s, respectivamente. Cada peça foi cortada em cubos com
dimensões de 1,5 x 2,0 x 2,5 (altura x largura x comprimento) e avaliou-se em
quintuplicata. Os parâmetros determinados foram dureza, coesividade, gomosidade,
elasticidade e mastigabilidade. Os dados foram coletados através de software Texture
CT V1 4 BUILD 17 (Brookfield Engineering Labs).
2.7 Tratamento das amostras para Aplicação em Eletroforese em queijo pelo método
Urea – Page Alcalino, adaptado de CREAMER (1991)
As amostras de queijo ralado (0,20 g) foram pesadas, adicionados
10,0 mL de solução tampão, pH 8,4, homogeneizados e centrifugadas por 10 minutos
a 10.000 G. Em casos de queijos com elevado teor de gordura, recomenda-se aquecer
o tubo em banho-maria 35 – 40ºC por 3 minutos antes da centrifugação (LEDFORD
et al., 1966). Foi coletado 1000 μl da fase líquida, adicionado 60 μl de solução de azul
de bromofenol 0,1% e 50 μl de 2-mercaptoetanol. Após a desnaturação, 10 μL foram
pipetados individualmente com aplicação no gel de acrilamida conforme instruções do
fabricante. Procedeu-se, então, à migração molecular pelo método UREA-PAGE
adaptado de CREAMER (1991). Os géis de empilhamento (pH 8,8) e de separação
36
(pH 8,8) foram preparados com concentrações de 4% e 12% de acrilamida,
respectivamente. Estabeleceram-se ainda, as medidas de 5,5 cm de altura para o gel
de separação por 0,1 cm de espessura. Com o intuito de se obter melhor
polimerização e nivelamento, adicionou-se 500 μL de água ultra-pura sobre o gel de
separação. Ambos os géis obtiveram polimerização completa quando incubados a 37
ºC por 45 min. Além das amostras, 10 μL de um padrão para proteínas (Precision Plus
Protein Unstained, Bio-Rad), cujos valores conhecidos de pesos moleculares (250,
150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 e 10 kDa), foram pipetados em ambas as 24
extremidades de cada gel. Para delimitar precisamente o peso molecular da α-LA e
da ASB, utilizou-se a diluição destas proteínas comerciais (Sigma-Altrich).
Em cuba vertical para eletroforese e fonte de tensão PowerPacTM
Basic Power Supply (Bio-Rad laboratories inc., USA), procedeu-se a migração das
moléculas em tampão para migração (pH 8,8) a tensão de 150 Volts (V) e corrente de
20 MiliAmperes (mA), compreendendo o tempo médio de migração de 100 minutos.
Com o término da migração molecular, o gel foi enxaguado em água
ultra-pura e imerso em solução corante: Comassie Brilliant Blue R-250, Álcool Metílico
40% (v/v), Ácido Ácético 7% (v/v) e água ultra-pura. A etapa de coloração foi feita sob
agitação (45 rpm) pelo tempo de 4h. Após a coloração, o gel foi enxaguado com água
mili-Q e imerso em solução descorante contendo Álcool Metílico 40% (v/v), Ácido
Acético 7% (v/v) e água ultra-pura e submetido à 60 rpm por 30 min. A etapa de
descoloração foi concluída transferindo-se o gel para outra solução contendo Álcool
Metílico 5% (v/v), Ácido Acético 7% (v/v) e água mili-Q pelo período de 12h. Os géis
eram armazenados nessa mesma solução, adicionada de 1 % de glicerol. A
fotodocumentação dos géis foi feita com equipamento Transiluminator (Loccus
biotecnologia) e o processamento das imagens foi realizado pelo software L-PIX
IMAGE HE Release 1.4 (Loccus biotecnologia). A avaliação qualitativa foi determinada
com a utilização do software BioNumerics 7.5 (APLIED MATHS, Belgium). A
quantificação das frações proteicas foi processada pelo software LabImage 1D 4.1
(Kapeplan).
2.8 Cálculo de sólidos totais
O cálculo de sólidos totais dos queijos utilizou a metodologia descrita
por Furtado (2005), de acordo com a seguinte equação:
37
R (g ST/L) = P x ST x 100 V
Onde:
R: rendimento
L: litros de leite
P: quilos de queijos obtidos
ST: porcentagem de extrato seco total dos queijos
V: volume do leite utilizado
Extrato seco total= (100 - Umidade)
2.9 Cálculo de rentabilidade
O rendimento dos queijos foi calculado utilizando a fórmula:
R = L
P
Onde:
R: rendimento
L: litros de leite
P: quilos de queijos obtidos
2.10 Análise estatística
Para avaliar a influência da qualidade do leite sobre a textura do queijo
provolone, os resultados foram avaliados por regressão múltipla em um desenho
experimental 22 em função da dureza, da coesividade, da elasticidade, da gomosidade
e da mastigabilidade. Os fatores independentes foram a carga microbiológica, com
dois níveis (3 log UFC.mL-1 e 7 log UFC.mL-1); e o tempo de maturação, com dois
níveis (30 e 60 dias). Como as análises foram feitas em quintuplicata, o desenho
totalizou 120 corridas para cada variável da textura.
Para avaliar a influência da qualidade do leite sobre a composição
centesimal do queijo provolone e proteólise, os resultados também foram avaliados
por regressão múltipla, porém em um desenho experimental 2x3 em função da
umidade, porcentagem de gordura, nitrogênio total, proteólise primária e secundária.
Os fatores independentes foram a carga microbiológica, com (3 log UFC.mL-1 e 7 log
38
UFC.mL-1); e o tempo de maturação, com três níveis (0, 30 e 60 dias). Como as
análises foram feitas em triplicata, o desenho totalizou 108 corridas para cada variável
centesimal.
Em ambos delineamentos o efeito dos fatores foi avaliado por ANOVA
com significância de 5% no programa Statistica 13.0 (Statsoft).
Para avaliar a influência da qualidade do leite sobre as frações
proteicas do queijo tipo provolone os resultados foram avaliados por regressão
múltipla em um desenho experimental 2x3 em função das porcentagens das gama-
caseínas, β -caseínas, αs1-caseínas, αs1-caseínas I e αs1-caseínas II. Os fatores
independentes foram a carga microbiológica de micro-organismos psicrotróficos, com
dois níveis (3 log UFC.mL-1 e 7 log UFC.mL-1); e o tempo de maturação, com três
níveis (0, 30 e 60 dias). O desenho totalizou 18 corridas para cada fração proteica
avaliada.
O efeito dos fatores foi avaliado por ANOVA com significância de 5%
no programa Statistica 13.0 (Statsoft).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados das análises físico químicas e das contagens de micro-
organismos indicadores de qualidade pesquisados nas amostras de leite enviadas
para produção dos queijos, obtidos no tratamento 1 e 2, são apresentados na Tabela
1 e 2.
39
Tabela 1: Resultados das análises físico químicas das amostras de
leite enviadas para produção de queijo tipo provolone das três produções
(agosto/setembro/outubro) 2017.
Análises Físico Químicas Média*
Tratamento 1 Tratamento 2
Temperatura C° 4°C 4°C
Allizarol 78 º GL Estável Estável
Acidez Dornic g, ácido lático /100 ml 15°D 15°D
Índice Crioscópico Hortvet (ºH) 0,535 0,537
Densidade relativa a 15/15ºC g/mL 1,3130 1,3220
Gordura(%) 3,42 3,69
Extrato Seco Total(%) 12,08 12,62
Extrato Seco Des.g/100 g 8,66 8,93
Proteína g/100 g 3,41 3,51
Resíduos de antibiótico Negativo Negativo
CMT Negativo Negativo
Redutase 240 minutos 30 minutos
Amido Negativo Negativo
Neutralizantes da Acidez Negativo Negativo
Cloretos Negativo Negativo
Urina Negativo Negativo
Peróxido de Hidrogênio Negativo Negativo
Álcool Etílico Negativo Negativo
Hipoclorito Negativo Negativo
Sacarose Negativo Negativo
Formol Negativo Negativo
*Média 3 produções.
40
Tabela 2: Média (log) de micro-organismos indicadores de qualidade
em amostras de leite enviadas para produção de queijo tipo provolone das três
produções (agosto/setembro/outubro) 2017.
Micro-organismos Média* (log UFC.mL-1)
Tratamento 1 Tratamento 2
Psicrotróficos 3,12 7,16 Psicrotróficos Proteolíticos 2,73 6,95 PsicrotróficosTermodúricos 4,00 4,50 Mesófilos 3,38 6,78
*Média 3 produções.
O leite utilizado no tratamento 1 para produção de queijo provolone
apresentou qualidade satisfatória, diferentemente do leite utilizado no tratamento 2
com contagens de 7 log UFC.mL-1 para psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos. O
número de psicrotróficos superou o de mesófilos, sendo os psicrotróficos os
indicadores de contaminação no leite cru refrigerado. Deve-se evitar a incidência e
incorporação deste grupo de micro-organismos no leite cru, pois a refrigeração a 4 °C
não inibe o crescimento, havendo necessidade da implementação das boas práticas
em todo o processo produtivo (SANTOS et al., 2013).
Quanto ao perfil de textura do queijo produzido com matéria prima
com 7 log UFC.mL-1, a dureza, a gomosidade e a mastigabilidade foram influenciadas
pela qualidade microbiológica do leite (p<0,01). Dessa forma, notou-se uma relação
linear e positiva entre a carga microbiológica e essas três variáveis, ou seja, quanto
maior a quantidade de micro-organismos, maiores os valores de dureza, gomosidade
e mastigabilidade.
Apesar da qualidade do leite ser suficiente por si só para influenciar
esses parâmetros de textura, também foi detectado interação (p<0,02) entre a
qualidade do leite e o tempo de maturação (Figura 2). Dessa forma aos 60 dias de
maturação as alterações na textura foram mais intensas nos queijos feitos com leite
com maior população de psicrotróficos (7 log UFC.mL-1) (Tabela 2). Porém, a
maturação sozinha não foi suficiente para aumentar os valores de dureza,
gomosidade e de mastigabilidade.
Mais da metade das variações na gomosidade foram associadas à
qualidade microbiológica do leite e à maturação (R2=0,51) e essas duas variáveis
juntas também foram responsáveis por cerca de 30% nas variações da dureza
(R2=0,37) e da mastigabilidade (R2=0,28) (Anexo II). As diferenças na textura podem
41
ser encontradas entre queijos de um mesmo lote, particularmente em queijos moles.
A textura de queijos, embora seja reconhecida como um atributo sensorial que exerce
influência sobre a aceitação pelos consumidores, não tem sido extensivamente
estudada. Isto se deve ao fato dos queijos apresentarem-se como um produto
heterogêneo, que difere na composição, condições empregadas na fabricação,
armazenamento, características sensoriais e atributos físicos (ADDA; GRIPON;
VASSAL, 1982; MACFIE, 1990).
Os queijos do tratamento 1, apresentaram no parâmetro dureza, uma
média de 27,31% na maturação de 30 dias e 25,32% com 60 dias, em decorrência do
enfraquecimento da matriz proteica do queijo pela ação do coagulante residual e de
enzimas de origem microbiana, provocando aumento da proteólise (AYYASH; SHAH,
2011). Os queijos do tratamento 2, apresentaram no parâmetro dureza alteração
significativa com médias 37,8% na maturação de 30 dias e 44,93% com 60 dias
(Anexo II). Segundo Do Valle et al. (2004) em seus estudos com queijo mussarela, no
teste de perfil de textura, observou que à medida que houve diminuição do teor de
gordura, houve um aumento no parâmetro de dureza. Esta evolução na diminuição da
gordura pode ser relacionada à proliferação das bactérias psicrotróficas lipolíticas, as
quais produzem enzimas lipolíticas responsáveis em hidrolisar triacilgliceróis com
liberação de ácidos graxos livres e glicerol (HOLLAND, et al. 2005).
A gomosidade, foi alterada no tratamento 2 ao longo de 60 dias, com
médias de 23,9% para 30 dias de maturação e 29,01% com 60 dias de maturação,
assim como a mastigabilidade. Ambas estão relacionadas com a dureza, Do Valle et
al. (2004) e Banks (2004), citam que a coesividade, gomosidade e mastigabilidade no
queijo mussarela, aumentaram em função da diminuição da gordura e o queijo
cheddar com baixo teor de gordura foi percebido como sendo seco, excessivamente
firme e difícil de mastigar.
A coesividade e a elasticidade não tiveram influência da população
dos micro-organismos e do tempo de maturação. Nos dias 30 e 60, os valores não
diferiram significativamente entre os tratamentos. Furtado (2016) estudando o queijo
mussarela, calcula que o ponto ideal de proteólise, cerca de 8% a 10% de nitrogênio
total do queijo estivesse sob forma de nitrogênio solúvel em solução citrada com pH
4,6; é fundamental para manter as propriedades funcionais do queijo, como
elasticidade e derretibilidade, valores, acima de 20% de nitrogênio solúvel agravariam
os problemas de elasticidade e separação de gordura. No presente estudo os valores
42
encontrados nos 2 tratamentos, foram de até 10% de nitrogênio solúvel em solução
citrada com pH 4,6, confirmando o não comprometimento da elasticidade no queijo.
O queijo provolone não mostrou redução significativa (p<0,05) na
elasticidade com o passar do tempo, e com a carga microbiológica nos dois
tratamentos.
Figura 1: Dureza, gomosidade e mastigabilidade de queijo provolone
em função da qualidade microbiológica do leite e do tempo de maturação.
Em relação à composição centesimal, a qualidade microbiológica do
leite teve influência apenas na quantidade de gordura dos queijos, observando-se uma
relação linear e negativa (p<0,01). Dessa forma, queijos fabricados com matéria prima
com 7 log UFC.mL-1 leite foram associados a menores porcentagens de gordura.
Apesar dessa condição ser significativa, a força de associação entre essas variáveis
foi considerada fraca (R2=0,18), sendo que menos de 20% das variações ocorridas na
gordura foram associadas à qualidade do leite durante a maturação. Em média,
queijos feitos com leite com alta carga microbiológica tiveram 2% menos de gordura.
Stofer e Hicks (1983) e Cromie (1992) relatam que o rendimento de queijos pode ser
reduzido em função da atividade de enzimas lipolíticas sobre os triacilglicerídeos com
consequente liberação de ácidos graxos no soro e aumento das perdas de gorduras.
Hicks et al. (1982) concluíram que a redução no rendimento resultou tanto na
degradação lipolítica como proteolítica do leite cru e estas corresponderam a 45% e
55% da perda de matéria seca, respectivamente.
A rentabilidade dos queijos produzidos com matéria prima com 3 log
UFC.mL-1 e 7 log UFC.mL-1 foi de 9,66 litros e 9,96 litros de leite para cada kg de
queijo. De acordo com Furtado (2016), a rentabilidade é muito difícil de ser medida
43
com precisão, depende de muitos fatores como gordura, caseína, tipo de coalho, teor
de umidade, processo de filagem utilizado na indústria e determinação do peso exato
dos queijos antes da salga, cita que um rendimento na faixa de 9,5 a 10,5 litros de
leite por kg de queijo deve ser considerado normal.
Por sua vez, a maturação por si só influenciou a umidade (p<0,01), a
porcentagem de gordura (p=0,01), o nitrogênio total (p<0,01) e a proteólise secundária
(p<0,01) (Anexo III).
Ao analisar a proteólise primária e secundária, a população de
psicrotróficos não influenciou os índices de nitrogênio não proteico (NNP) e nitrogênio
não caseico (NNC). O índice de extensão proteolítica (IEP), proteólise primária está
relacionado com as proteinases naturais do leite e do agente coagulante, que
degradam as proteínas em peptídeos de alto peso molecular, grandes micelas de
caseína são clivadas em peptídeos, solubilizando a caseína. Quanto maior a
proteólise primária, mais peptídeos solúveis serão liberados da caseína, sendo para-
κ-caseína e glicomacropeptideos os mais importantes (FOX, 1989).
No decorrer da maturação a média do índice de profundidade
proteolítica (IPP), proteólise secundária teve o nível mais elevado estatisticamente no
último dia de análise, pelo acúmulo de aminoácidos provenientes da hidrólise de
peptídeos pelas proteases de origem microbiana (FURTADO, 2005) (Anexo III)
(Figura 2).
Figura 2: Valores médios e desvio padrão da composição centesimal
de queijos provolones aos 0, 30 e 60 dias de maturação.
44
Porém, ao analisarmos o perfil eletroforético, a maior população de
micro-organismos influenciou estatisticamente nas frações αs1 e β-caseína e o tempo
de maturação nas frações αs1 e γ- caseínas.
A fração αs1 caseína foi influenciada tanto pela qualidade
microbiológica do leite quanto pelo tempo de maturação (p<0,01). Esses dois fatores
não dependem um do outro para exercerem seus efeitos nas quantidades de αs1-
caseínas, observando-se uma relação linear para ambos. Porém, positiva para a
qualidade do leite e negativa para o tempo de maturação. Assim, quanto maior as
contagens microbiológicas do leite, maiores as quantidades de αs1-caseínas;
enquanto maior o tempo de maturação, menor a quantidade dessa fração proteica
(Figura 3c). Segundo Mayer; Rockembauer; Mlcak (1998), αs1-caseína é a principal
proteína a sofrer proteólise nos primeiros estágios de maturação decorrentes da
adição das culturas lácteas, formando as frações de αs1-I-caseína e αs1-II-caseína.
Barac et al. (2016), registraram frações de αs -caseínas (αs1- e αs2-caseínas) em
queijos frescos e curados com uma única banda, enquanto β-caseínas foi detectada
com duas bandas sobrepostas. Durante 50 dias de maturação, as αs-caseínas
residuais foram degradadas extensivamente até 15,42% do conteúdo inicial.
Simultaneamente, β-caseínas teve uma degradação progressiva muito mais lenta
(BARAC et al., 2016).
A quantidade de β- caseína foi influenciada (p<0,05) pela qualidade
microbiológica do leite, observando-se uma relação linear e negativa
independentemente do tempo de maturação do queijo provolone (Figura 3b). As
caseínas β representam 30-35% do total das caseínas e é constituída de um membro
principal com no mínimo sete variantes genéticas (SGARBIERI, 2005). Alguns
trabalhos citam que a proteólise primária é medida pelo aparecimento das frações αs1
e β-caseinas, respectivamente, a cadeia de αs1-caseínas tem muitas regiões
susceptíveis à ação da quimosina (CREAMER; RICHARDSON, 1974). Ledford et al.
(1966), indicaram diferenças definidas no padrão eletroforético nos componentes de
caseína na análise eletroforética na fabricação do queijo Cheddar. Foi observado o
desaparecimento quase por completo da fração αs1-caseína após 55 dias de
maturação e a β-caseína aparece em grande parte afetada, αs1 –caseína é o maior
componente encontado no leite de vaca e as mudança de textura do queijo, ocorre
devido a degradação do restante da αs1- caseinas , durante um grande período de
maturação (CREAMER; OLSON,1982).
45
No estudo realizado a γ- caseína foi influenciada (p<0,05) pelo tempo
de maturação, observando-se uma relação linear e positiva independentemente da
qualidade microbiológica do leite utilizado, quanto maior o tempo de maturação, maior
a quantidade dessa fração proteica (Figura 3a).
As γ-caseínas são os principais produtos da hidrólise da β-caseína
pela ação da protease plasmina, naturalmente contida no leite integral, ou seja, haverá
um decréscimo na intensidade da banda de β-caseína e consequente aumento nas
bandas de γ-caseínas, conforme se aumenta o período de maturação (MAYER;
ROCKEMBAUER, 1998).
As frações αs1-I, e αs1-II, não se relacionaram (p>0,05) com a
qualidade do leite ou com o tempo de maturação devido o estudo realizado ser feito
com queijos de até 60 dias de maturação.
Figura 3: Frações proteicas de queijo provolone em função da
qualidade microbiológica do leite e do tempo de maturação.
Para a produção dos queijos utilizou-se a cultura Streptococcus
thermophilus, que apresenta baixa atividade proteolítica (HASSAN; FRANK, 2001),
com baixa degradação da matriz caseínica, não influenciando na proteólise observada
nesse estudo. Segundo Furtado (2016) é importante utilizar um bom coagulante e
controlar bem os parâmetros de temperatura na filagem, para que na massa fiquem
resíduos suficientes de suas enzimas, que atuam na necessária degradação da
massa e melhoria das propriedades funcionais do queijo. Silva et al. (2006) avaliaram
o efeito da adição de Streptococcus thermophilus como cultura adjunta e verificaram
que os índices de profundidade e extensão da maturação foram menores,
confirmando que as alterações do queijo foram pequenas durante o armazenamento
46
quando comparadas com os demais estudos, mantendo as características desejáveis
por maior período de maturação.
Os queijos produzidos foram analisados quanto a população de
coliformes totais e termo tolerantes, com resultados < 10 UFC/g, atendendo aos
parâmetros determinados pela Portaria n° 146 do MAPA (BRASIL, 1996).
Figura 4: Eletroforese UREA-PAGE do queijo tipo provolone em
função da qualidade microbiológica do leite e do tempo de maturação.
Fonte: Dados da pesquisa (2017). *T1 (Tratamento 1): 0, 30 e 60 dias de maturação, **T2 (Tratamento 2): 0, 30 e 60 dias de maturação.
4. CONCLUSÃO
A maior população dos micro-organismos psicrotróficos contribuiu
para o aumento do parâmetro da dureza dos queijos, reduziu o teor de gordura e
aumentou a degradação das frações αs1 e β-caseína
O tempo de maturação foi associado a menor degradação da fração
αs1-caseína e maior degradação da fração γ-caseína, influenciou a umidade, a
porcentagem de gordura, o nitrogênio total e a proteólise secundária.
A qualidade microbiológica da matéria prima influencia na qualidade
do produto queijo tipo provolone.
47
REFERÊNCIAS
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51
5. CONCLUSÃO GERAL
A maior população dos micro-organismos psicrotróficos contribuiu
para o aumento do parâmetro da dureza dos queijos, reduziu o teor de gordura e
aumentou a degradação das frações αs1 e β-caseína
O tempo de maturação foi associado a menor degradação da fração
αs1-caseína e maior degradação da fração γ-caseína, influenciou a umidade, a
porcentagem de gordura, o nitrogênio total e a proteólise secundária.
A qualidade microbiológica da matéria prima influencia na qualidade
do produto queijo tipo provolone
52
ANEXO I
Fluxograma de produção do queijo tipo provolone maturado
(Diagrama operacional).
Fonte: Dados da pesquisa (2017).
53
ANEXO II
Valores médios e desvio padrão da textura de queijos provolones
agrupados conforme a qualidade do leite usado na sua fabricação, aos 30 e 60 dias
de maturação.
Tratamento 1 Tratamento 2
30 dias 60 dias 30 dias 60 dias
Dureza (N) 27,31±8,14 25,32±14,93 37,81±8,33 44,93±9,35
Coesividade 9,36±4,49 7,90±0,42 8,79±2,55 9,19±4,34 Elasticidade(mm) 0,88±1,36 0,62±0,07 0,64±0,03 0,64±0,04 Gomosidade(N) 16,6±6,11 14,3±7,32 23,9±4,87 29,1±5,04 Mastigabilidade(mJ) 159±89 114±59 199±39 263±128
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.
54
ANEXO III
Valores médios e desvio padrão composição centesimal de queijos
provolones agrupados conforme a qualidade microbiológica do leite usado na sua
fabricação, aos 0, 30 e 60 dias de maturação.
Tratamento 1 Tratamento 2
0 dias 30 dias 60 dias 0 dias 30 dias 60 dias
Umidade (%) 42,88± 1,71
42,26± 0,71
42,77± 0,81
42,74± 0,85
42,53± 1,02
43,46± 0,82
Gordura (%) 29,83± 2,28
29,00± 2,79
31,78± 3,62
42,74± 0,85
27,00± 1,02
28,56± 0,82
N total (%) 3,57± 0,24
3,55± 0,25
4,47± 1,28
3,90± 0,17
3,74± 0,09
4,61± 3,97
Proteólise 1ª (%) 13,18± 14,71
12,83± 12,32
10,27± 7,97
12,55± 12,88
12,24± 11,27
9,72± 8,46
Proteólise 2ª (%) 4,58± 4,53
6,10± 7,77
9,96± 6,76
3,15± 3,27
6,93± 8,45
8,86± 6,40
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.