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DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL

Dirección del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria

Área de Desarrollo y Validación de Protocolos

PROTOCOLO PARA LA DETECCIÓN DE FITOPLASMAS POR PCR

CONVENCIONAL Y PCR CUANTITATIVA (qPCR)

Autorizó:

M.C. José Abel López Buenfil

Director del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria

Revisó:

M.C. José Gustavo Torres Martínez

Subdirector de Diagnóstico Fitosanitario

M.C. José Manuel Cambrón Crisantos

Coordinador del Área de Desarrollo y Validación de Protocolos

Elaboró:

Ing. Karina Araujo Ruiz

Técnico de laboratorio del Área de Desarrollo y

Validación de Protocolos

Diseño y edición:

Ing. José Alejandro Cotoc Roldán

Versión: 0.1

Abril 2017




i

TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE CONTENIDO.........................................................................................................................................I

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................. II

ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................................................. III

JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................................................... 1

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS FITOPLASMAS ...................................................................... 2

SINTOMATOLOGÍA ............................................................................................................................................... 2

VECTORES ................................................................................................................................................................ 3

TÉCNICAS DE DETECCIÓN ................................................................................................................................. 4

FLUJO DE TRABAJO .............................................................................................................................................. 5

PROTOCOLO DE IDENTIFICACIÓN ................................................................................................................. 5

Toma y envÍO de la muestra .......................................................................................................................... 5

Recepción y almacenamiento ....................................................................................................................... 6

TOMA DE MUESTRA PARA EL ANÁLISIS ................................................................................................. 6

Extracción total de DNA .................................................................................................................................. 7

TÉCNICA DE EXTRACCIÓN OPTIMIZADA PARA TEJIDOS RECALCITRANTES CON CTAB. ... 7

Cuantificación y Verificación de la calidad del DNA............................................................................. 8

TÉCNICA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) .............................................. 9

Amplificación de la región 16S rRNA ......................................................................................................... 9

nested - PCR ....................................................................................................................................................... 11

PCR Cuantitativa .............................................................................................................................................. 15

CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS ............................................................................................................... 19




ii

DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA ................................................................................................................... 19

RECOMENDACIONES DE TRABAJO .............................................................................................................. 19

LITERATURA CITADA ........................................................................................................................................ 21

ANEXOS ................................................................................................................................................................... 23

Materiales y equipos necesarios para la extracción con CTAB ...................................................... 23

Preparación de soluciones para la extracción con CTAB 2% Nacl 5M........................................ 24

SOLICITUD DE DIAGNÓSTICO FITOSANITARIO.................................................................................. 25

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Síntomas causados por fitoplasmas A) Enanismo en Maíz (Zea maiz) Fuente:

CIMMYT International Maize and Wheat Improvement Center; B) Enrojecimiento de las

hojas en vid (Vitis vinífera L.) Fuente: USDA. C) Virescencia en fresa (Fragaria L.) Fuente:

USDA. .......................................................................................................................................................................... 2

Figura 2. Proceso infeccioso de fitoplasmas por parte de Hemipteros. ........................................... 3

Figura 3. Modelo típico de un gel de integridad de DNA total. MPM= Marcador de peso

molecular M= muestra .......................................................................................................................................... 9

Figura 4. Gel de agarosa 1.5%. Muestra la amplificación de la región 16Sr RNA (300 pb) M=

Muestra, (-) = Control negativo sin templado (NTC), (+) = Control positivo y MPM= Marcador

de peso molecular1 Kb DNA Ladder Invitrogen ®. ................................................................................... 11

Figura 5. Representación esquemática de la región a amplificar con los oligonucleótidos

P1/P7. ...................................................................................................................................................................... 12

Figura 6 Representación esquemática de la posición de los oligonucleótidos R16F2n/R16R2

en la NESTED – PCR. ........................................................................................................................................... 13

Figura 7. Gel de agarosa 1%. Muestra la amplificación con los oligonucleótidos

R16F2n/R16R2 (1245 pb) M= Muestra, (+) = Control positivo, (-) = Control negativo sin

templado, MPM= Marcador de peso molecular 1 Kb DNA Ladder Invitrogen ®. ............................ 15

../../../../../Documents/Protocolo%20para%20la%20detección%20de%20fitoplasmas_%20CONACOFI.doc#_Toc479671283
















iii

Figura 8. Consumibles empleados en la qPCR A) placas con capacidad para 96 muestras; B)

Tiras de tubos con para 8 muestras. .............................................................................................................. 17

Figura 9. Resultados de la amplificación de una muestra positiva a fitoplasmas mediante

qPCR. ........................................................................................................................................................................ 18

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Secuencias de los oligonucleótidos 16S1/16S2........................................................................ 9

Tabla 2. Concentraciones de reactivos para la mezcla de reacción con los oligos 16S1 /16S2

.................................................................................................................................................................................... 10

Tabla 3. Condiciones de amplificación con los oligonucleótidos 16S1 /16S2 ............................. 10

Tabla 4. Secuencia de los oligonucleótidos P1/P7 ................................................................................. 12

Tabla 5. Concentraciones de reactivos para la mezcla de reacción con los oligos P1/P7 ....... 12

Tabla 6. Condiciones de termociclaje con los oligonucleótidos P1/P7 .......................................... 12

Tabla 7. Secuencia de los oligonucleótidos R16F2n/R16R2 .............................................................. 13

Tabla 8. Concentraciones de reactivos para la mezcla de reacción con los oligos

R16F2n/R16R2. ................................................................................................................................................... 14

Tabla 9. Condiciones de termociclaje con los oligonucleótidos R16F2n/R16R2 ....................... 14

Tabla 10. Secuencias de los oligonucleótidos y sonda para qPCR .................................................... 16

Tabla 11. Concentraciones de reactivos para la qPCR .......................................................................... 16

Tabla 12. Condiciones de amplificación para la qPCR .......................................................................... 17








1

JUSTIFICACIÓN

La apertura comercial en México ha incrementado la importación de un mayor volumen de

mercancías agrícolas, lo cual incrementa también el riesgo de introducción de plagas y

enfermedades exóticas, entre ellas los fitoplasmas. Estos patógenos se encuentran

alrededor del mundo, por ello su infección sobre diversos cultivos se extiende a diversas

áreas geográficas.

Entre las enfermedades económicamente más importantes causadas por fitoplasmas se

encuentran las del tipo de “amarillamiento del áster” [Grupo- 16SrI-Aster yellows] que se

producen en una amplia gama de cultivos como el de la papa, zanahoria, maíz, tomate,

cebolla, chile y ornamentales; en frutales, se encuentran la enfermedad “X” del durazno de

los Estados Unidos, el declinamiento de la manzana, enanismo amarillo del peral y las

enfermedades de la vid como el amarillamiento precoz de las hojas entre otros [Grupo

16SrX-Apple proliferation group]; en gramíneas se encuentra el arroz enano amarillo, la hoja

blanca de la caña de azúcar y el pasto elefante que se producen en el este de África y Asia,

[Grupo 16SrXI- Rice yellow dwarf]. La escoba de bruja de la papa y las enfermedades del

enanismo arbustivo en maíz [Grupo - 16SrI-B Aster yellows] son frecuentes en América

Central y Sudamérica; el amarillamiento letal del cocotero [Grupo - I6SrIV-Coconut lethal

yellows] y otras enfermedades parecidas, se producen en el Caribe, América Central, y a lo

largo de regiones crecientes de África (Dickinson y Hodgetts, 2012).

Aunque en México se tienen reportes de enfermedades producidas por algunos de estos

patógenos, se busca prevenir la introducción, establecimiento y dispersión de fitoplasmas

que pudieran afectar la producción agrícola del país, citados en el listado de plagas

reglamentadas del SENASICA (2013).

Por ello, el presente protocolo pretende servir como una guía técnica a los laboratorios de

diagnóstico fitosanitario en la detección general de fitoplasmas mediante técnicas

moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de

la polimerasa cuantitativa (qPCR).




2

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS FITOPLASMAS

Los fitoplasmas son los procariontes más pequeños capaces de replicación autónoma,

aparentemente se propagan por fisión binaria, gemación o fragmentación. Son organismos

pleomórficos, no poseen pared celular, solo contienen un enrejado fibrilar de hebras que se

supone es DNA y áreas con gránulos semejantes a ribosomas. (Bertaccini et al., 2005). Se

localizan en el floema de las plantas donde tienen la capacidad de pasar a través de los

poros de las células cribosas y colonizar lentamente toda la planta (Whitcomb y Tully,

1989). Ya que no son capaces de sintetizar todos los nutrientes necesarios para su

metabolismo, éstos los adquieren de las células vegetales, las cuales, al obturarse, provocan

diversos desarreglos en la planta infectada.

Hasta la fecha no ha sido posible aislarlos ni cultivarlos en medios artificiales por lo que han

sido clasificados dentro del género “Candidatus”, junto con todos aquellos organismos que

presentan las mismas características (Firrao et al., 2004).

SINTOMATOLOGÍA

Habitan en las células cribosas del floema por lo tanto su infección produce profundos

disturbios en el balance de fitohormonas y en reguladores de crecimiento, provocando con

ello diferentes sintomatologías (Figura 1). La mayoría induce enanismos, amarillamientos,

proliferación de yemas, ramas y hojas (sintomatología conocida como “escoba de bruja”),

virescencia (pétalos florales verdes sin desarrollo), y filodia (conversión de flores a hojas)

(Bertaccini, 2007).

Figura 1. Síntomas causados por fitoplasmas A) Enanismo en Maíz (Zea maiz) Fuente: CIMMYT International Maize and Wheat

Improvement Center; B) Enrojecimiento de las hojas en vid (Vitis vinífera L.) Fuente: USDA. C) Virescencia en fresa (Fragaria L.) Fuente:

USDA.




3

Otros síntomas provocados por fitoplasmas incluyen elongación de hojas, esterilidad de

flores, elongación anormal de entrenudos en las ramas, brotes delgados, acucharamiento de

hojas, enrojecimiento precoz de las hojas y aborto de frutos. Estos síntomas reflejan la

acción de proteínas efectoras producidas por los fitoplasmas que modulan los procesos

celulares en el desarrollo vegetal y que también están involucradas en la defensa de la

planta (Hogenhout y Loria, 2008).

VECTORES

Los insectos vectores de fitoplasmas pertenecen a grupos filogenéticos que se caracterizan

por alimentarse del floema de las plantas. Al introducir su aparato bucal chupador en el

tejido vegetal, absorben los nutrientes junto con los fitoplasmas y al alimentarse de otra

planta van diseminando el patógeno, generando así un ciclo infeccioso (Figura 2).

Se han identificado como principales vectores a los insectos de la familia Fulgoridae,

Cicadellidae, Delphacidae, Derbidae y Flatidae, pertenecientes al orden Hemiptera

(Weintraub y Beanland, 2006). Se cree que existe una especificidad en la adquisición y

transmisión de estos patógenos y su vector.

Figura 2. Proceso infeccioso de fitoplasmas por parte de Hemipteros. Fuente: USDA. Modificado por SENASICA- 2017.




4

TÉCNICAS DE DETECCIÓN

La detección de fitoplasmas se realiza con técnicas moleculares, basadas en la Reacción en

Cadena de la Polimerasa (PCR) que amplifica exponencialmente una secuencia. La

especificidad del método deriva de los oligonucleótidos también conocidos como primers o

iniciadores, que reconocen una secuencia especifica que será amplificada por la enzima Taq

DNA polimerasa.

La PCR anidada conocida como NESTED - PCR es una variante de la PCR convencional que

comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de oligonucleótidos en cada

una, con el fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad en la detección. Primero se

realiza una reacción de PCR con un par de oligonucleótidos externos para amplificar una

región de DNA más extensa que contiene el segmento inicial. Después, este producto de

amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con oligonucleótidos internos para

amplificar la región específica.

Por otra parte, la PCR Cuantitativa (qPCR) es un método más sensible de detección que

permite cuantificar los productos amplificados mientras están siendo generados es decir en

“Tiempo Real”. El principio de la técnica se basa en la PCR convencional, sólo que la forma

de detección y análisis de los productos de la amplificación es diferente. El término tiempo

real se refiere a que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la

reacción. Por su parte, el término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la

cantidad de DNA en la muestra. El producto de amplificación es monitoreado conforme

transcurre la reacción sin que sea necesario recurrir a la electroforesis en un gel de agarosa

para conocer si la reacción fue exitosa como sucede en la PCR convencional.




5

FLUJO DE TRABAJO

El flujo de trabajo para el diagnóstico se muestra a continuación:

PROTOCOLO DE IDENTIFICACIÓN

TOMA Y ENVÍO DE LA MUESTRA

El técnico en campo tomará muestras (hojas, plántulas o planta completa) que presenten

los síntomas asociados a fitoplasmas antes mencionados; dichas muestras serán enviadas

para su diagnóstico al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) o bien a algún

laboratorio aprobado por el Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad

Agroalimentaria (SENASICA) para emitir resultados oficiales. (Puede revisar la lista de

laboratorios aprobados y terceros especialistas autorizados en: www.senasica.gob.mx)

Tenga en cuenta las siguientes consideraciones:

La muestra no deberá lavarse.

Envolver el tejido fresco en papel absorbente o periódico.

Meter cada muestra en una bolsa de polietileno debidamente cerrada, cuidando

sacar el aire para evitar el agua de condensación que se forma al interior y

etiquetarla con los datos de identificación (número de control o clave de registro).

Corroboración del diagnóstico

Termina el diagnóstico

Diagnóstico por:

NESTED – PCR

qPCR Corroboración

mediante secuenciación

Extracción total de DNA

Cuantificación y verificación de la calidad del DNA

Amplificación de la región 16S

Muestra -Material vegetal




6

Conservarlas y transportarlas a baja temperatura (menor de 15°C), en empaques

térmicos de unicel (hieleras) con geles refrigerantes para mantener el tejido fresco.

Las muestras deben estar en buen estado, esto es, que no presenten deshidratación y

que el tejido esté lo más fresco posible; cuando se envía planta completa es

preferible que presente una porción adecuada de sustrato envuelto en polietileno

para evitar la desecación y una bolsa conteniendo el follaje para evitar

contaminación y deshidratación.

Nota: El número de control o clave de registro deberá coincidir con la base de datos que

envíe y con la solicitud de diagnóstico (Ver Anexo).

Si la muestra se compone de más de una variedad o lote, será necesario que esto se señale

en la solicitud de diagnóstico, además de que el material que corresponda a cada uno de

éstos deberá venir identificado y separado.

RECEPCIÓN Y ALMACENAMIENTO

Las muestras que se reciben para diagnóstico serán registradas en una bitácora con el

número de identificación que acompaña a la muestra. Posteriormente, revisar que el

material vegetal se encuentre en buenas condiciones; se debe evitar recibir muestras

deterioradas, en descomposición o colonizadas por organismos saprofitos; si fuera el caso,

solicitar que se haga un nuevo muestreo.

Al finalizar el diagnóstico las muestras deberán ser resguardadas a 4°C hasta por un mes en

caso de que sea necesaria alguna corroboración o algún otro diagnóstico.

TOMA DE MUESTRA PARA EL ANÁLISIS

El tejido que se toma para realizar el diagnóstico debe ser representativo de toda la

muestra, principalmente de áreas donde se observen síntomas causados por fitoplasmas.

Dependiendo del tipo de muestra, se recomienda tomar:

a) Hojas – tomar la nervadura central.

b) Ramas - retirar la corteza y tomar a partir de la albura y el duramen.

c) Raíz - tomar principalmente raíces jóvenes.

En el caso de muestras asintomáticas es necesario realizar dos repeticiones por muestra.




7

EXTRACCIÓN TOTAL DE DNA

Pesar aproximadamente 200 mg de tejido finamente picado de cada muestra o submuestra

y colocar en un tubo estéril rotulado con su respectivo número de identificación; macerar la

muestra en un mortero frio o con ayuda de un disruptor de tejidos. Utilizar un mortero y

una navaja nueva por cada muestra.

La extracción de DNA se puede realizar con la técnica de CTAB o por columnas con algún kit

comercial para tejido vegetal, sin embargo, tenga en cuenta que la calidad del DNA depende

directamente del método empleado para la extracción y del tipo de material del que se está

extrayendo. Por ello, recomendamos seguir la metodología propuesta por Ramírez-Ortega

et al., (2015) con la que se obtiene una calidad adecuada de DNA incluso en tejidos

recalcitrantes.

TÉCNICA DE EXTRACCIÓN OPTIMIZADA PARA TEJIDOS RECALCITRANTES

CON CTAB.

1.- Macerar la muestra en un mortero previamente enfriado a -80° (si es posible con

nitrógeno líquido), hasta que se obtenga un polvo fino. Agregar 1000 µL de Bromuro de

hexadeciltrimetilamonio (CTAB) al 2% con NaCl 5M (10:1 v/v), homogeneizar con el pistilo

y transferir la mezcla a un tubo de 1.5 mL.

Si utiliza un disruptor de tejidos, agregar 1000 µL de CTAB 2% con NaCl 5M

directamente al tubo que contiene el tejido, cerrar bien y macerar en el equipo.

Nota: Cada muestra debe de ir en un tubo rotulado con un número de control.

2.- Incubar la muestra a 95 °C por 5 min para lisar las células. Una vez transcurrido este

tiempo, dejar enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente.

3.- Agregar 0.1 volúmenes (v/v) de SDS al 10%, 0.2 v/v de Cloroformo frio (Precipitantes).

Agitar por inversión y centrifugar a 12000 rpm por 5 min a 4°C. Transferir el sobrenadante

a un tubo nuevo.

4.- Agregar 0.1 v/v de Acetato de Sodio 3M (pH 5.2), 0.25 v/v de Fenol–Cloroformo–Alcohol

isoamílico (25:24:1). Agitar en vórtex por 1 min y centrifugar a 14500 rpm 15 min a 4 °C.

Si el sobrenadante queda turbio agregar 0.25 v/v de fenol–cloroformo–alcohol

isoamílico (25:24:1) agitar y centrifugar a 14500 rpm por 5 min a 4 °C.




8

Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.

5.- Agregar 0.65 v/v de Etanol-Metanol-Ácido Acético (21:3:1). Agitar por inversión y

centrifugar a 13000 rpm por 15 min a 4 °C. Descartar el sobrenadante.

6.- Agregar 135 µL de agua grado biología molecular, agitar hasta disolver la pastilla.

Posteriormente agregar 20 µL de Acetato de Sodio 3M (pH 5.2), 100 µL de Metanol y 500 µL

de Etanol. Agitar y centrifugar a 13000 rpm por 3 min a 12 °C y descartar el sobrenadante.

7.- Lavar la pastilla de DNA con 1000 µL de etanol al 70%, agitar en vórtex hasta despegar

la pastilla del tubo y centrifugar a 13000 rpm por 3 min a 12 °C. Desechar el sobrenadante

cuidando no perder la pastilla.

8.- Dejar secar la pastilla y resuspender con 75 µL de agua grado biología molecular.

Guardar el DNA extraído a 4°C para su uso inmediato o a -20°/-70°C en caso de un

resguardo prolongado.

Nota: Para la preparación de reactivos ver el apartado de Anexos.

CUANTIFICACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD DEL DNA

La cuantificación del DNA total extraído se realiza mediante espectrometría, aceptando la

calidad del DNA cuando las relaciones de absorbancia A260/A280 estén dentro del rango

1.7 - 2.0 según lo establecido por Sambrook y colaboradores (1989).

No debe de haber presencia de RNA, por lo que se recomienda incubar las muestras con 3

µL de la enzima Ribonucleasa pancreática A (RNAsa A) (10 mg/µL) a 37°C de 30 a 60 min,

después de la extracción.

La verificación de la integridad del DNA total extraído puede observarse en un gel de

agarosa al 0.8% teñido con bromuro de etidio o GelRed®, sumergido dentro de una cámara

de electroforesis que contenga buffer TAE 1X. Para ello colocar sobre una tira de parafilm, 5

µL del DNA extraído y 4 µL de buffer de carga, homogeneizar la mezcla antes de colocarla en

el gel.




9

El voltaje aplicado es una constante de 80V por 60 min. Posteriormente observar la imagen

del gel en un transiluminador ultravioleta (UV). En caso de una buena extracción, se debe

observar la amplificación de una banda integra de DNA genómico por encima del marcador

de peso molecular (> 12,000 pb) en todas las muestras (Figura 3).

TÉCNICA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN 16S rRNA

Antes de realizar la NESTED-PCR es necesario confirmar la ausencia de inhibidores en el

DNA, por lo cual se sugiere la amplificación la región 16S rRNA mediante PCR, utilizando los

oligonucleótidos reportados por Trejo-Saavedra (2002) 16S1/16S2 (Tabla 1).

Tabla 1. Secuencias de los oligonucleótidos 16S1/16S2.

Denominación del oligo Secuencia (5´ - 3´) Tamaño del amplicón (pb) 16S1 TGAGAATGGATAAGAGGCTC 315 16S2 TGTTGTTCCCCTCCCAAGGG

Las mezclas de reacción para PCR se realizan a un volumen final de 25 µL en la campana de

flujo laminar, utilizando los reactivos de la Tabla 2. Una vez hecha la mezcla maestra

(Master Mix), homogeneizar los componentes, succionando y expulsando la mezcla con la

micropipeta de 3 a 5 veces, cuidando de no contaminar el pistón o bien agitar en vórtex y

posteriormente dar un spin de centrifuga por 10 segundos.

MPM M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7

Figura 3. Modelo típico de un gel de integridad de DNA total. MPM= Marcador de peso molecular M= muestra




10

En tubos de PCR (0.2 µL), agregar 23 µL de la mezcla más 2µL de DNA de la muestra a

analizar recordando cambiar de punta entre muestras. Colocar los tubos en el

termociclador y programar con las condiciones de la Tabla 3.

Tabla 2. Concentraciones de reactivos para la mezcla de reacción con los oligos 16S1 /16S2.

Reactivo Concentración inicial Volumen 1X Concentración final

Agua grado PCR 17 µL

Buffer 10X 2.5 µL 1 X

MgCl2 50 mM 0.75 µL 1.5 mM

dNTP´s 10 mM 0.5 µL 200 µM

Oligo F - 16S1 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL

Oligo R - 16S2 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL

Taq pol 5 U/ µL 0.25 µL 0.05 U/µL

DNA (30 -100 ng/µL) 2 µL

Volumen final 25 µL

Nota: El término “Volumen 1X” que se presenta en la Tabla 2 es la cantidad de reactivo

necesario para una muestra. Para un número mayor de muestras, multiplicar el volumen de

cada reactivo por el total de muestras que se tenga, siempre considerando por lo menos dos

controles: un control positivo y un control negativo sin templado (NTC), los cuales también

deberán llevar las mismas cantidades de Master Mix, así como una reacción adicional para

contrarrestar el error de pipeteo.

Tabla 3. Condiciones de amplificación con los oligonucleótidos 16S1 /16S2.

Temperatura Tiempo Ciclos

94°C 90 segundos 1

94°C 40 s 35 ciclos

55°C 40 s

72°C 40 s

72°C 40 s 1

4°C ----------

Verificar la amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa. Se sugiere cargar las

muestras de la siguiente manera: sobre una tira de parafilm colocar 10 µL del producto de




11

PCR y agregar 4 µL de buffer de carga, homogeneizar la mezcla antes de colocarla en un gel

de agarosa al 1.5 % teñido con bromuro de etidio 10 mg/ml [agregar 4µL por cada 100ml

de agarosa (0.4 mg/ml)] o GelRed® 10,000X (trabajar a 10X) sumergido en buffer TAE 1X.

El voltaje aplicado es una constante de 90V durante 60 min. Finalmente observar la imagen

del gel en un transiluminador ultra violeta (UV) (Figura 4).

Nota: Debe tener cuidado en el orden en que carga las muestras para su posterior

identificación.

NESTED - PCR

Una vez confirmada la ausencia de inhibidores, realizar la PCR anidada o NESTED-PCR. Para

ello, se inicia con una reacción de PCR con oligonucleótidos que amplifiquen una región

extensa del operón dentro de la cual se encuentra la secuencia de interés, como lo muestra

la Figura 5.

Se recomienda utilizar los oligos P1/P7 (Deng y Hiruki, 1991; Smart et al., 1996) (Tabla 4)

que cumplen con las características antes mencionadas.

Figura 4. Gel de agarosa 1.5%. Muestra la amplificación de la región 16Sr RNA (300 pb) M= Muestra, (-) = Control negativo

sin templado (NTC), (+) = Control positivo y MPM= Marcador de peso molecular1 Kb DNA Ladder Invitrogen ®.

MPM

MPM 1Kb M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 (-) (+) (+) (+) 1Kb

315 pb




12

Las concentraciones de los reactivos y el programa técnico de termociclaje se muestran en

las tablas 5 y 6 respectivamente. Tenga en cuenta las consideraciones antes mencionadas

para la preparación de la Master Mix.

Tabla 4. Secuencia de los oligonucleótidos P1/P7

Oligos Secuencia (5´ - 3´) Tamaño del amplicón (pb)

P1 AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT 1830

P7 CGTCCTTCATCGGCTCTT

Tabla 5. Concentraciones de reactivos para la mezcla de reacción con los oligos P1/P7 Reactivo Concentración inicial Volumen 1X Concentración final

Agua grado PCR 17 µL Buffer 10X 2.5 µL 1 X MgCl2 50 mM 0.75 µL 1.5 mM dNTP´s 10 mM 0.5 µL 200 µM

Oligo F- P1 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL Oligo R- P7 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL

Taq pol 5 U/ µL 0.25 µL 0.05 U/µL DNA (30 -100 ng/µL 2 µL


Tabla 6. Condiciones de termociclaje con los oligonucleótidos P1/P7


94°C 5 min |

94°C 1 min

35 54°C 50 s

72°C 2 min

72°C 5 min 1

4°C ----

16S rRNA tRNA 23S rRNA

P1 P7 1830 pb

Figura 5. Representación esquemática de la región a amplificar con los oligonucleótidos P1/P7.




13

Al finalizar la reacción de PCR, sacar los tubos del termociclador, estos servirán como molde

para la NESTED-PCR. Para ello se deberá realizar una dilución 1:30 de dichos productos,

colocando en tubos estériles 29 µL de agua grado biología molecular y 1 µL del producto de

la PCR de P1/P7 (cada muestra debe de ir en un tubo por separado).

El principio de la PCR anidada es amplificar una región interna del primer producto de PCR

con un nuevo juego de oligonucleótidos que aumenten la sensibilidad del producto

esperado (Figura 6). En este caso se recomienda utilizar los oligonucleótidos R16F2n /

R16R2 (Gundersen y Lee 1996) (Tabla 7) los cuales generan un producto de 1,245 pb a

partir del producto de P1/P7.

Tabla 7. Secuencia de los oligonucleótidos R16F2n/R16R2


R16F2n GAAACGACTGCTAAGACTGG 1245

R16R2 TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCG

Preparar una nueva Master Mix con los oligonucleótidos R16F2n/R16R2. Para ello tomar

como muestra molde 5 µL de la dilución 1:30 de los productos de P1/P7. Las

concentraciones y condiciones para este paso se muestran en las Tablas 8 y 9

respectivamente.

16S rRNA tRNA 23S rRNA

P7 1830 pb

R16F2n R16R2 1245 pb

P1

Figura 6 Representación esquemática de la posición de los oligonucleótidos

R16F2n/R16R2 en la NESTED – PCR.




14

Tabla 8. Concentraciones de reactivos para la mezcla de reacción con los oligos

R16F2n/R16R2.

Reactivo Concentración inicial Volumen 1X Concentración final


Buffer 10X 2.5 µL 1 X

MgCl2 50 mM 0.75 µL 1.5 mM

dNTP´s 10 mM 0.5 µL 200 µM

R16F2n 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL

R16R2 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL

Taq pol 5 U/ µL 0.25 µL 0.05 U/µL

Dilución 1:30 de

P1/P7

5 µL


Tabla 9. Condiciones de termociclaje con los oligonucleótidos R16F2n/R16R2


94°C 2 min 1

94°C 1 min

35 ciclos 55°C 2 min

72°C 2 min

72°C 10 min 1

4°C ----------

Observar los productos de la PCR en un gel de agarosa al 1 % con las condiciones antes

mencionadas, visualizando en la imagen obtenida del transiluminador ultra violeta un

producto de 1,245 pb (Figura 7).

Nota: Tenga en cuenta que el pozo donde se cargó el control negativo nunca debe

presentar banda. En caso de observarse alguna, los resultados quedan descartados y la

técnica debe repetirse. Por el contrario, el control positivo siempre debe de presentar

una banda, sirviendo esta como punto de comparación en caso de muestras positivas.




15

PCR CUANTITATIVA

La técnica de PCR Cuantitativa (qPCR) requiere la utilización de reporteros fluorescentes,

los cuales transfieren energía desde un donador o reportero fluorescente a un aceptor o

“quencher” generando una especificidad muy alta. La detección de fitoplasmas por qPCR se

realiza en un termociclador con cabezal óptico capaz de detectar las longitudes de onda de

sondas Taq Man, las cuales permiten a partir de una sola reacción de amplificación: a)

excitar al reportero, b) capturar la señal de emisión del mismo y c) realizar el análisis

cuantitativo1.

1 El presente protocolo se estandarizo en un termociclador CFX96 de la marca BioRad®.

~1245 pb

Figura 7. Gel de agarosa 1%. Muestra la amplificación con los oligonucleótidos R16F2n/R16R2 (1245 pb) M=

Muestra, (+) = Control positivo, (-) = Control negativo sin templado, MPM= Marcador de peso molecular 1 Kb DNA

Ladder Invitrogen ®.




16

Los consumibles que se utilizan deben ser ópticos o fotosensibles, empleando placas o tiras

de tubos donde las tapas o cubiertas sean de este tipo, debido a la fluorescencia que será

emitida.

La preparación de la Master Mix es muy similar a la de PCR convencional, solo que en este

caso se agrega una sonda (PHYTO-P) que actúa como reportero fluorescente. Los oligos y

sonda utilizados son los reportados por Christensen et al., 2004 (Tabla 10).

Las concentraciones de la reacción de qPCR se muestran en la Tabla 11, es importante

señalar que la alícuota de la sonda debe de estar en un tubo color ámbar ya que es

fotosensible y se degrada con la luz.

Tabla 10. Secuencias de los oligonucleótidos y sonda para qPCR


PHYTO – F CGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGA

75 PHYTO - R TCTTCGAATTAAACAACATGATCCA

Sonda Secuencia (5´ - 3´) Tipo de fluoróforo

PHYTO - P TGACGGGACTCCGCACAAGCG Quasar 705* (λ 690 nm)

Nota: La longitud de onda y el tipo de fluróforo puede variar, dependiendo de las

características solicitadas al momento de ser sintetizados y al termociclador a emplear.

Tabla 11. Concentraciones de reactivos para la qPCR Reactivo Concentración inicial Volumen 1X Concentración final


Buffer 10X 2.5 µL 1 X MgCl2 50 mM 1.5 µL 3 mM dNTP´s 10 mM 0.5 µL 200 µM

PHYTO – F 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL PHYTO – R 10 pmoles/µL 1 µL 0.4 pmoles/µL

Sonda: PHYTO - P 10 pmoles/ µL 1 µL 0.4 pmoles/ µL

Taq DNA Pol 5 U/ µL 0.5 µL 0.1 U/µL DNA (30 -100 ng/µL 2 µL





17

Una vez realizada la Master Mix homogeneizar la mezcla con los reactivos. Colocar 23 µL de

la mezcla en placas o tiras de tubos, según desee (Figura 8) y cargar 2 µL de muestra,

recordando cambiar de punta entre muestra y muestra.

Nota: No olvide colocar su control positivo y negativo en pozos independientes. Se

recomienda colocarlos al final de la placa.

En caso de que se generen burbujas al cargar las muestras con la pipeta, dar un spin de

centrifuga por 10 segundos.

La qPCR es una técnica más sensible en comparación con la PCR convencional ya que

permite la detección cuantitativa de pequeñas cantidades de DNA (hasta 1copia de DNA) en

lapsos de tiempo relativamente cortos.

Las condiciones de termociclaje en qPCR varían respecto a la PCR convencional iniciando

con una incubación corta seguida de una desnaturalización donde son excitados los

fluoróforos lo que permite omitir la extensión. En este caso el programa de termociclaje

dura aproximadamente 1 hr con 30 min (Tabla 12)

Tabla 12. Condiciones de amplificación para la qPCR


50°C 2 min 1

95°C 10 s 1

95°C 15 s

40 ciclos *60°C 1 min

*En este paso indicar al equipo que realice la lectura de la fluorescencia.

A B

Figura 8. Consumibles empleados en la qPCR A) placas con capacidad para 96 muestras; B) Tiras de tubos con para 8 muestras.




18

Una vez que termina dicho programa, no es necesario cargar las muestras en un gel de

agarosa ya que, a diferencia de la PCR convencional, la qPCR genera curvas en las que

podemos observar la relación entre el ciclo de amplificación y la fluorescencia detectada

por el equipo, generando un valor numérico de cuantificación: Cq (cycle of quantification) o

Ct (cicle threshold) (Figura 9).

Para determinar un resultado es indispensable evaluar los controles, por lo tanto, se

tomarán en cuenta las siguientes consideraciones:

a) El control negativo debe tener un valor de Cq = 0.00 (N/A)

b) El control positivo deberá mostrar un valor de Cq < 34.

c) La forma de la curva debe ser adecuada contando con tres fases: basal, exponencial y

platea.

Estos parámetros se establecieron después de evaluar el umbral de amplificación de los

valores de Cq mediante una curva estándar, utilizando una serie de diluciones de un

fragmento clonado de fitoplasma, obtenida del banco de controles del CNRF, permitiendo

establecer los valores para determinar un resultado positivo o negativo.

Figura 9. Resultados de la amplificación de una muestra positiva a fitoplasmas mediante qPCR.

Positivo

Muestra

Negativo Fase: Basal

Fase: Exponencial EExponencial

Fase: Platea




19

Si los controles no presentan los valores Cq requeridos, la prueba no es válida y todas las

muestras deben ser probadas nuevamente. De igual manera, las muestras deben analizarse

nuevamente si las curvas no tienen la forma antes mencionada ya que podría deberse a la

degradación de la sonda.

Todas aquellas muestras que presenten un valor de Cq < 34 se consideraran positivas a

fitoplasmas, mientras que las muestras que arrojen valores de Cq > 34 se consideraran

como negativas a fitoplasmas.

Nota: Es necesario trabajar con muestras que contengan buena calidad de DNA y con

concentraciones homogéneas que oscilen entre los valores recomendados (30 – 100

ng/µL).

Las muestras que resulten positivas, deben ser evaluadas nuevamente para

confirmar los resultados.

CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS

Las muestras que resulten positivas a fitoplasmas deberán ser confirmadas, repitiendo la

técnica o de ser posible mediante secuenciación Sanger para conocer el grupo al que

pertenecen, comparando los resultados obtenidos con BLAST y alineándolos en un banco de

genes, por ejemplo, en GenBank.

DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA

Concluido el diagnóstico, esterilizar las muestras en autoclave a 121 °C durante un tiempo

de 20 – 25 minutos a 15-20 libras/pulgadas2 (psi), antes de ser desechadas o incineradas.

RECOMENDACIONES DE TRABAJO

Limpiar y descontaminar perfectamente su área de trabajo.

Trabajar con guantes de nitrilo.

Siempre trabajar con consumibles (tubos, puntas etc.) estériles.

Cada muestra y submuestra debe de ir en un tubo independiente rotulado con su

respectivo número de identificación.

Las mezclas de reacción (Master Mix) deben realizarse en la campana de flujo

laminar o bien en un gabinete para PCR.




20

Ocupar una punta nueva cada que pipetee una muestra, lo mismo para el caso de los

controles positivos y negativos.

Utilizar las concentraciones de DNA recomendadas para ambas técnicas, si se

requiere deben hacerse diluciones.

Se recomienda adquirir oligonucleótidos grado HPLC si utiliza qPCR.

Descongelar los oligonucleótidos, sonda y demás reactivos a temperatura ambiente

sobre un cooler o sobre hielo, no forzar su descongelamiento con la mano o

aplicando calor.

La alícuota de la sonda debe estar en tubos color ámbar (es fotosensible).

La enzima Taq polimerasa debe almacenarse siempre a -20°C.

Utilizar puntas con filtro para la Master Mix.




21

LITERATURA CITADA

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Bioscience 12: 673-689.

Bertaccini A., Fránová J., Botti S. and Tabanelli D., 2005. Molecular characterization of

phytoplasmas in lilies with fasciation in the Czech Republic. FEMS microbiology

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Christensen N. M., Nicolaisen M., Hansen M. and Schulz A., 2004. Distribution of

phytoplasmas in infected plants as revealed by Real – Time PCR and bioimaging. The

American Phytopathological Society. 17 (11): 1175-1184.

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Dickinson M., Tuffen M. and Hodgetts J. 2012. Phytoplasma: Methods and Protocols. Ed.

Humana Press.

Firrao G., Andersen M., Bertaccini A., Boudon E., Bove J., Daire X., Davis R., Fletcher J.,

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non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects. International Journal

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PCR assays using two universal primer pairs. Phytopathology Mediterrean. 35: 144-

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Ramírez-Ortega F.A., Cambrón C., Cruz J., Araujo R., Galván G., Toscano M., Xoconostle C.,

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Smart C. D., Schneider B., Blomquist C. L., Guerra L. J., Harrison N. A., Ahrens U., Lorenz K. H.,

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22

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Irapuato. Gto. Depto. De Ingeniería Genética. Guanajuato, México. P. 35-51.

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Entomology. 51: 91-111.

Whitcomb R. and Tully E. 1989. The Mycoplasmas Vol. V. San Diego: Academic Press, Inc.

https://www.usda.gov/




23

ANEXOS

MATERIALES Y EQUIPOS NECESARIOS PARA LA EXTRACCIÓN CON CTAB

1. CTAB (Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio)

2. RNAsa A (opcional)

3. Metanol.

4. SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) al 10%

5. Cloroformo.

6. Nitrógeno líquido (opcional).

7. Agua destilada estéril.

8. Acetato de Sódio (3M, pH 5.2).

9. Agua grado biología molecular

10. Etanol-Metanol-Ácido Acético (21:3:1).

11. Etanol absoluto grado biología molecular.

12. Etanol absoluto grado biología molecular al 70%.

13. Fenol–Cloroformo–Alcohol isoamílico (25:24:1).

14. Tubos eppendorf de 1.5 y 2 mL (si utiliza disruptor utilice tubos adecuados).

15. Temomixer o baño maría que alcance 100°C.

16. Micro pipetas y puntas de diferentes volúmenes.

17. Morteros con pistilo.

18. Centrifuga.

19. Gradillas.

20. Guantes de nitrilo.

24

SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD

INOCUIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA

Desarrollo, Validación de Protocolos y Diagnóstico de HLB

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA LA EXTRACCIÓN CON CTAB 2% NaCl

5M

Solución de CTAB al 2% con NaCl 5M, pH = 5.2

Preparación de 1L. Pesar las siguientes sustancias:

Sustancia Masa a pesar (g) Concentración final Peso Molecular (g/mol)

CTAB 20 2% (m/v) 364.48

PVP (40) 5 0.5% (m/v) 40 000 (promedio)

NaCl 292 5 M 58.4

Tris (Base) 2.4228 0.02 M 121.14

EDTA 1.4612 0.005 M 292.24

Mezclar bien las sustancias, para que la PVP quede rodeada de sustancias higroscópicas.

Agregar agua a temperatura ambiente lentamente y al mismo tiempo agitar,

posteriormente agregar agua tibia hasta completar 750 ml aproximadamente. Si aún

permanecen grumos sin disolver, calentar la solución hasta ebullición. Ajustar el pH con

NaOH 10N. Aforar a un litro y esterilizar en la autoclave.

Solución Buffer de Acetato de Sodio 3 Molar, pH = 5.2 (1 L)

Pesar 180.55 g de Acetato de Sodio y disolver en medio litro de agua.

Ajustar el pH agregando lentamente Ácido acético glacial. Aforar a un litro con agua

destilada y esterilizar por filtración o autoclave.

Etanol-Metanol-Ácido Acético (21:3:1)

Medir y mezclar las siguientes soluciones

525 ml de Etanol Absoluto

75 ml de Metanol

25 ml de Ácido acético glacial

25




SOLICITUD DE DIAGNÓSTICO FITOSANITARIO

I. DATOS DE LA MUESTRA

Fecha de registro: No. de registro:

Producto/Hospedante y/o insecto: Parte vegetal enviada: Variedad:

Órgano de donde se colecto: Uso del producto:

Fase fenológica del cultivo:

Fecha de muestreo: Fecha de envió Cantidad:

Frascos

Cepas

Tubos

Sobres

Macerado

RNA/DNA

Suelo

Otro

Nombre del colector:

II. PROCEDENCIA

Campo

Huerto

Coordenadas GPS y anexar croquis Nombre del predio/Invernadero/Huerto:

Bodega Trampa

Invernadero

Otro (Especifique)

No. Lote/Registro:

Localidad o población Municipio y Estado:

III. DATOS DEL INTERESADO

Nombre completo: RFC:

Domicilio completo: Teléfono con lada:

Localidad/Colonia: Correo electrónico:

Micología Bacteriología Virología Nematología Entomología Biología Molecular Malezas

26




Motivo del Diagnóstico

Campaña Vigilancia Sospecha de Corroboración Programa Programa Otros Fitosanitaria Epidemiológica nueva plaga Exportación Emergente

*Todos son datos obligatorios cuando se disponga de ellos.

Recibe

Envía