proteine ricombinanti: assorbimento via di somministrazione preferenziale è generalmente...
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PROTEINE RICOMBINANTI:ASSORBIMENTO
Via di somministrazione preferenziale è generalmente parenterale (i.v., i.m., i.p., s.c.)La diversa via parenterale può variare l’attività terapeutica (irrorazione sanguigna, passaggio nel sistema linfatico, ecc.)
PROTEINE RICOMBINANTI:ASSORBIMENTO
Via di somministrazione orale non valida se richiesta una elevata biodisponibilità (degradazione e scarsa permeabilità nel tratto G.I.)Via “accessibile” per vaccini orali (placche del Payer)
PROTEINE RICOMBINANTI:ASSORBIMENTO
Vie alternative di somministrazione: naso, polmoni, retto, cavità orale, pelleProblema scarsa biodisponibilità a cui si tenta di ovviare aumentando l’assorbimento senza dare tossicità
PROTEINE RICOMBINANTI:ASSORBIMENTO
Aumento permeabilità barriere: acidi grassi, sali biliari, saponine; liposomi.Riduzione attività peptidasica: inibitori delle proteasi, modificazione struttura.Aumento tempo di esposizione: nanoparticelle (PEG, liposomi).
Molecola AA Biodisponibilità %
Glucagone
calcitonina
insulina
Effetto del glicocolato su biodisponibilità:
somministrazione nasale
29
32
51
senza con
<1 70-90
<1 15-20
<1 10-30
PROTEINE RICOMBINANTI:BIODISPONIBILITA’
Targeting specifico:particolato colloidale (liposomi, microsfere di albumina, LDL ecc.).Liposomi sono i più usati per bassa tossicità, flessibilità, ampio “core” acquoso)
PROTEINE RICOMBINANTI:BIODISPONIBILITA’
Targeting “passivo”: fegato e milza Targeting “attivo”: veicolazione con ab specifici
Prolungamento emivita: pegilazione (< att. biologica)
PROTEINE RICOMBINANTI:DISTRIBUZIONE
Il volume di distribuzione è generalmente modesto (scarsa penetrazione nel tessuto o specificità di distribuzione tissutale) > è la permanenza nell’organismo, > è la distribuzione, ma non sempre (es. IL2-PEG)
PROTEINE RICOMBINANTI:LEGAME A PROTEINE
Provato per IGF-I, t-PA, hGH, Dnasi Per le molecole tradizionali solo il farmaco libero svolge attività farmacologicaPer proteine ricombinanti, il legame a proteine plasmatiche può favorire l’attività (es IGF-I)
PROTEINE RICOMBINANTI:METABOLISMO-ELIMINAZIONE
Metabolismo non presenta rischio di tossicitàPrincipali organi di eliminazione:rene (via principale per proteine di piccole dimensioni)fegato (endopeptidasi, esopeptidasi)altri
PROTEINE RICOMBINANTI:VARIAZIONI FARMACOCINETICHE
-modificazioni della sequenza
aminoacidica -pegilazione (ridotta vel. di
eliminazione)-variazioni nella glicosilazione
(variano interazioni recettoriali o attacchi enzimatici)
PROTEINE RICOMBINANTI:IMMUNOGENICITA’
Produzione di anticorpi più frequente per proteine estranee all’ospite
Dimostrata per varie prot. ricombinanti (insulina, interferoni, ab monocl., EPO, hGH ecc.).
PROTEINE RICOMBINANTI:IMMUNOGENICITA’ - CAUSE
Fattori associati al prodotto: presenza di impurezze/contaminanti, via di somministrazione, conservazione, variazioni di seq. aacidica/glicosilazioneFattori genetici associati al paziente:delezioni o mutazioni della proteina endogenaaplotipo del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC)
PROTEINE RICOMBINANTI:IMMUNOGENICITA’
Le conseguenze di una prod. anticorpale sono diverse a seconda della regione della proteina a cui si legano:- nessun effetto (hGH) - variazione di parametri farmacocinetici (insulina)- neutralizzazione (NAB) dell’attività biologica (IFN)
PROTEINE RICOMBINANTI:IMMUNOGENICITA’
CASO ERITROPOIETINA (EPREX): - fino al 1998 rari casi di prod. NAB (conseguenza aplasia eritrocitaria)-circa 200 casi dal 1998 al 2003 Dal 1998 HSA sostituita da polisorbato 80, venduta in siringhe pre-riempite (rilascio di sostanze dalla siringa?). Modifiche dei materiali della siringa e di conservazione (riduzione dei casi di NAB)
PROTEINE RICOMBINANTI:“INFUSIONAL REACTION”
Definibile come reazione “anafilattoide”, mima una reazione anafilattica (IgE mediata) ma non ha coinvolg. anticorpaleManifest. frequenti: brividi, instabilità emodinamica, dispneaSi osserva durante la prima infusione o poche ore dopo, rara alle infusioni successiveFattore importante: velocità di infusione
CITOCHINE - FATTORI DI CRESCITA EMATOPOIETICI
Regolano ematopoiesi (proliferazione, differenziazione, maturazione) e attività funzionale di cellule maturesono glicoproteine con ponti disolfuro tra gruppi cisteinici spesso essenziali per l’attività biologica
CITOCHINE - FATTORI DI CRESCITA EMATOPOIETICI
Colony-stimulating factors per granulociti (G-CSF), granulociti-macrofagi (GM-CSF), macrofagi (M-CSF), eritropioetina (EPO), IL-3, ecc.
G-CSF e GM-CSF sono prodotti in forma sia glicosilata (CHO) sia non glicosilata (E. coli), EPO in CHO
CITOCHINE - FATTORI DI CRESCITA EMATOPOIETICI
Impieghi clinici:G-CSF neutropenie, trapianto di midollo, pazienti con HIV in terapia con mielosoppressoriGM-CSF neutropenia, trapianto di midollo, pazienti con HIV in terapia con antiviraliEPO anemia associata a insufficienza renale cronica o chemioterapia
CITOCHINE - FATTORI DI CRESCITA EMATOPOIETICI
Tossicità: G-CSF, GM-CSF perdita di appetito, febbre, mal di testa GM-CSF effetto indesiderato più grave è la capillary-leak syndrome con elevati dosaggi, reazione di prima dose (tachicardia, ipotensione, vomito ecc), prod. di anticorpi EPO ipertensione/trombosi in soggetti predisposti, aplasia eritrocitaria da NAB
CITOCHINE INTERLEUCHINE-INTERFERONI
Sono glicoproteine che svolgono un ruolo di comunicazione tra cellule dei sistemi immunologico, ematologico, neurologico.Interleuchine deriva da inter-leucocitiinterferone dall’abilità di interferire con infezioni virali
CITOCHINE INTERLEUCHINE (IL)
IL-1 mediatore della risposta a infezioni, infiammazioneIL-2 prodotta da cellule TH1 stimola crescita, differenziazione, attivazione di cellule T, B, NKIL-3 fattore di crescita ematopoieticoIL-4 …………..IL-17
CITOCHINE INTERLEUCHINA -2
La proteina ricombinante è disponibile commercialmente come Proleukin, è prodotta in E. coli ed ha due modificazioni aminoacidiche rispetto alla proteina naturaleindicazione terapeutica: cancro renale metastatico, melanoma
CITOCHINE INTERLEUCHINA -2
Tossicologia:la terapia approvata dalla FDA è ad alte dosi; somm. i.v.: tox frequente, spesso seria, a volte fatale; capillary-leak syndrome che causa ipotensione con ridotta perfusione degli organi; effetti cardiaci e cardiovascolari quali aritmia, ischemia (s.c. effetti meno gravi)
CITOCHINE INTERFERONI (IFN)
Identificate tre classi prodotte da vari tipi cellulari (rispettivamente leucociti, fibroblasti, T linfociti)Gli effetti antivirali degli interferoni sono causati da più meccanismi vengono prodotte forme ricombinanti di tutte e tre le classi
CITOCHINE IFN
Identificati 14 sottotipiprodotti singoli sottotipi ricombinanti in E. coli: IFN-2a (Roferon-A), IFN-2b (Intron A) anche pegilati; disponibili miscele purificate da leucociti umani: IFN-n3 (Alfero-N), IFN-ni (Wellferon). Indicazioni terapeutiche: tumori (linfoma non Hodgkin, ter. aggiuntiva cancro rettale, etc.), epatite B e C, infezioni da Papilloma virus
CITOCHINE IFN
Tossicità:sindrome influenza-simile iniziale,alterazioni della visione, diarrea, vomito, affaticamentoanemia, cardiotossicità (aritmia atriale) leucopenia, trombocitopeniaprod. di anticorpi neutralizzanti per i non glicosilati
CITOCHINE IFN
Tre prodotti sul mercato:IFN -1b (Betaseron/Betaferon s.c.) prodotto in E. coli con modificazione aminoacidicaIFN -1a (Avonex i.m. e Rebif s.c.) prodotti nelle CHOindicazioni terapeutiche:sclerosi multipla recidivante-intermittente
CITOCHINE IFN
Tossicità:-sindrome influenza-simile-reazioni in sede di iniezione-confusione, depressione, ansia-anticorpi neutralizzanti con tutti i composti (in particolare con Betaseron)
CITOCHINE IFN
Presenti due forme con la stessa sequenza aminoacidica, ma diversa glicosilazioneProdotto ricombinante: IFN -1b (Actimmune, i.m. e s.c.) in E. coliindicazione terapeutica:granulomatosi cronica
CITOCHINE IFN
Tossicità:- sindrome influenza-simile- leucopenia, ipotensione,
neurotossicità, trombocitopenia- nessuna rilevazione di anticorpi
neutralizzanti
ANTICORPI MONOCLONALI
terapia con immunoglobuline nota da due secoliproduzione anticorpi monoclonali dal ‘751986: OKT3 approvato per prevenire rigetto dopo trapiantovari anticorpi oggi in uso per terapia o diagnostica
ANTICORPI MONOCLONALI
Problema dell’uso di anticorpi monoclonali murini: immunogenicità
sviluppo di anticorpi ricombinanti con regioni variabili murine e costanti umane - chimerici (-xi-)
sviluppo di anticorpi umanizzati (-zu-)
ANTICORPI MONOCLONALI
OKT3 Muromonab CD-3Ab monoclonale murino specifico per CD3 umano su cellule T è un potente immunosoppressoreuso per prevenzione di rigetto dopo trapianto di rene, cuore, fegatounica terapia efficace in casi di rigetto steroidi resistenti
ANTICORPI MONOCLONALI
OKT3 Muromonab CD-3
Effetti indesiderati:immunogenicità (prod. di “versioni” umanizzate, es HuOKT3 1(Ala-Ala))aumento incidenza infezionisindrome da rilascio di citochine
ANTICORPI MONOCLONALI
AbciximabAbciximab (REOPRO) (REOPRO) Anti-integrine (molecole di adesione)Anti-integrine (molecole di adesione) Antiglicoproteina IIb/IIIa - Antiglicoproteina IIb/IIIa - Monoclonale chimerico per la Monoclonale chimerico per la prevenzione della riocclusione prevenzione della riocclusione coronarica dopo angioplasticacoronarica dopo angioplastica
RituximabRituximab monoclonale chimerico che monoclonale chimerico che lega l’antigene CD20 su linfociti normali lega l’antigene CD20 su linfociti normali e maligni, Linfoma NHe maligni, Linfoma NH
ANTICORPI MONOCLONALI
Trastuzumab (Herceptin, Genentech)
anticorpo umanizzato anti HER2 (epidermal growth factor receptor 2)approvato per cancro metastatico alla mammella con sovraespressione di HER2
ANTICORPI MONOCLONALI
Trastuzumab (Herceptin, Genentech)
effetti indesiderati: flu-like syndrome, nausea, vomito, insonnia, suscettibilità ad infezioni; in combinazione con chemioterapici può dare cardiotossicità, leucopenia, anemie
SINDROME DA CITOCHINESINDROME DA CITOCHINECYTOKINE SYNDROMECYTOKINE SYNDROME
Sindrome acuta a Sindrome acuta a carattere febbrile, carattere febbrile, che si verifica dopo che si verifica dopo
una o poche una o poche somministrazioni di somministrazioni di citochine impiegate citochine impiegate
nella terapia di varie nella terapia di varie patologie patologie
CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E MANIFESTAZIONI CLINICHE IMANIFESTAZIONI CLINICHE I
Le citochine agiscono da “superantigene” Le citochine agiscono da “superantigene” attivando una frazione elevata di cellule T attivando una frazione elevata di cellule T perifericheperiferiche
Ondate successive di citochine sono prodotte, Ondate successive di citochine sono prodotte, con un ruolo centrale per TNFcon un ruolo centrale per TNF
Sintomi lievi:Sintomi lievi:a carattere influenzale con leggera febbre nelle a carattere influenzale con leggera febbre nelle prime 2-3 ore dalla somministrazione prime 2-3 ore dalla somministrazione
Di media severità:Di media severità:Lieve broncospasmo e/o ipotensione con Lieve broncospasmo e/o ipotensione con liberazione periferica di citochine (misurabili)liberazione periferica di citochine (misurabili)
Sintomi di elevata gravitàSintomi di elevata gravitàGrave febbre, broncospasmo, collassoGrave febbre, broncospasmo, collasso
Manifestazioni biochimiche Manifestazioni biochimiche aumento di creatinina, azotemia e aumento di creatinina, azotemia e bilirubina, TNF, IL6 e recettori solubili bilirubina, TNF, IL6 e recettori solubili IL-2, CD25, LPB; IL-2, CD25, LPB; Aumento periferico di cellule NK e Aumento periferico di cellule NK e linfocitosilinfocitosi
Nel caso di trattamenti anti-CD3 Nel caso di trattamenti anti-CD3 (muromonab) produzione di anticorpi (muromonab) produzione di anticorpi anti-murinianti-murini
CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E MANIFESTAZIONI CLINICHE IIMANIFESTAZIONI CLINICHE II
SINDROME DA CITOCHINE: ESPRESSIONESINDROME DA CITOCHINE: ESPRESSIONE DIPENDENTE DA T LINFOCITI DIPENDENTE DA T LINFOCITI
Espressione da parte di Espressione da parte di mononucleatimononucleati
Tipo 1 (Th1): Tipo 1 (Th1): aumento di IL-2, TNFaumento di IL-2, TNF--, IFN-, IFN-immunità cellulo-mediata ed immunità cellulo-mediata ed effetti protettivi fagocito-effetti protettivi fagocito-dipendentidipendenti
Tipo 2 (Th2): Tipo 2 (Th2): aumento IL-4,-5,-10,-13: produzione aumento IL-4,-5,-10,-13: produzione di anticorpi, attivazione di di anticorpi, attivazione di eosinofili, inibizione di attività eosinofili, inibizione di attività macrofagica (effetti fagocito-macrofagica (effetti fagocito-indipendenti)indipendenti)
Sindrome da citochine - I meccanismi Sindrome da citochine - I meccanismi
Meccanismo molecolareMeccanismo molecolareAttivazione da parte di IFNAttivazione da parte di IFN + TNF + TNF della iNOsintasi (iNOs) della iNOsintasi (iNOs)Potenziamento di stress ossidativi Potenziamento di stress ossidativi endocellulari, inibizione del endocellulari, inibizione del metabolismo energetico, metabolismo energetico, citotossicità. citotossicità.
In vitro a livello cardiaco iNOs In vitro a livello cardiaco iNOs aumenta liberazione di CPK aumenta liberazione di CPK (creatinfosfochinasi)(creatinfosfochinasi)Aggiunta di L-NMMA al medium di Aggiunta di L-NMMA al medium di cultura blocca iNOS e riduce la cultura blocca iNOS e riduce la tossicità da TNFtossicità da TNF +IFN +IFN
ESPERIENZA CLINICA DI TOSSICITA’ DI CITOCHINA -I
OKT3 umanizzato (hOKT34) (Richards et al, Cancer Res 59: 2096, 1999)
Umanizzazione di muromonab-CD3 impiegato nel rigetto di trapianto(limiti per la formazione di anticorpi)
OKT34 è modificato per Ig4HC e Ig light chain per sede antigenica simile ad OKT3 murino
Fase I: infusione i.v. 10 min Fase I: infusione i.v. 10 min
ogni 2 settimane da 50 a 1600 ogni 2 settimane da 50 a 1600 g g per iniezione, 6 per gruppoper iniezione, 6 per gruppo
Aumento progressivo di febbre, max Aumento progressivo di febbre, max
800-1600 800-1600 ggAumento di recettori solubili Aumento di recettori solubili IL2IL2
(max 1600) e concentrazioni di IL6 (max 1600) e concentrazioni di IL6
(max 1600)(max 1600)
ESPERIENZA CLINICA DI ESPERIENZA CLINICA DI TOSSICITA’ DI CITOCHINA -IITOSSICITA’ DI CITOCHINA -II
CYTOKINE SYNDROME - Increased CYTOKINE SYNDROME - Increased soluble IL-2 R after hOKT3soluble IL-2 R after hOKT344
CYTOKINE SYNDROME - hOKT3CYTOKINE SYNDROME - hOKT3
100 100 g g - leggera febbre e cefalea - leggera febbre e cefalea in un paziente; nessuna tossicitàin un paziente; nessuna tossicità
200-400 200-400 g g - febbre, cefalea, - febbre, cefalea, nausea e rigiditànausea e rigidità
800 800 g g - tutti febbre e nausea - tutti febbre e nausea variabile; 3 rigidità ; 1 dispnea variabile; 3 rigidità ; 1 dispnea con richiesta di O2con richiesta di O2
1600 1600 g g (5 pazienti) - 2 gravi (5 pazienti) - 2 gravi episodi di dispnea, 1 con rigidità episodi di dispnea, 1 con rigidità e grave cefaleae grave cefalea massima dose tollerata 800 massima dose tollerata 800 gg
CYTOKINE SYNDROMECYTOKINE SYNDROMEPOSSIBILITA’ DI TRATTAMENTOPOSSIBILITA’ DI TRATTAMENTO
Sintomatica:Sintomatica:Difenidramina e/o Difenidramina e/o paracetamoloparacetamoloMannitolo, antiossidanteMannitolo, antiossidantePentoxifillina: Pentoxifillina: teofillinico ad azione teofillinico ad azione vasodilatatrice ed vasodilatatrice ed antagonista delle antagonista delle citochine, sopprime citochine, sopprime trascrizione di TNFtrascrizione di TNF
SINDROME DA CITOCHINE DA SINDROME DA CITOCHINE DA PERFUSIONE CON rTNFPERFUSIONE CON rTNF E E
MELFALANMELFALAN
Perfusione di arto con rhTNF-Perfusione di arto con rhTNF- e e melfalan: trattamento di sarcomi melfalan: trattamento di sarcomi
Nel 12-29% dei casi sindrome da Nel 12-29% dei casi sindrome da citochine con ipotensione e citochine con ipotensione e aumento circolante di IL-1, IL-6 aumento circolante di IL-1, IL-6 e lipopolysaccharide binding e lipopolysaccharide binding protein (LPB)protein (LPB)
Protocollo di trattamento Protocollo di trattamento contemporaneo con pentossifillina contemporaneo con pentossifillina 7.5 mg/kg/h7.5 mg/kg/hOhemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003
TRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINATRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINA
Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003
TRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINATRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINA