Melissa Yepes HernandezMateo Zuluaga GómezMolecular BiologyMedicine SchoolUPB 2011

Cancer genetics-guided discovery of serum biomarker

signatures for diagnosis and prognosis ofprostate cancer

Igor Cima et all

INTRODUCTION

INTRODUCTION

CANCER

•It is the uncontrolled growth of abnormal cells in the body

•Causes

•Cancer is a disease of abnormal gene function

http://www.elconfidencial.com/

INTRODUCTION

PROTO-ONCOGE

NES

ONCOGENES

TUMOR SUPPRESSOR GENES

INTRODUCTION

BIOMARKER

• It is a substance introduced into an organism as a means to examine organ function or other aspects of health (Medicine)

• It is a DNA sequence that causes disease or is associated with susceptibility to disease (Genetic)

INTRODUCTION

PROSTATE CANCER

• The prostate is a gland located in front of the rectum and underneath the urinary bladder.

• It is found only in men

• It produces the fluid that protects sperm cells in semen

http://www.techjackal.net/

INTRODUCTION

PROSTATE CANCER

• Adenocarcinoma cancer that starts in gland cells

• Sarcomas• Small cell carcinomas• Transitional cell carcinomas

• Prostatic intraepithelial neoplasia (PIN)

www.noticiassalud.com

INTRODUCTION

PROSTATE CANCER

• Prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) It appears at 20 years old like a pre-cancerous condition and then at 50 years old become in an active cancer

Prostate Adenocarcinoma

INTRODUCTION

STAGES

Inside the prostate without overgrowth

The cancer has diffused all over the prostate

Neighboring tissues

Metastasis

STAGE 1

STAGE 2

STAGE 3

STAGE 4

INTRODUCTION

DIAGNOSIS

• Prostate-specific antigen (PSA) blood testSubstance made by cells in the prostate glandLevel 4 ng/ml

•Digital rectal exam (DRE)Bumps or hard areas on the prostate that might be cancer

INTRODUCTION

•  Transrectal ultrasound (TRUS)It uses sound waves to make an image of the prostate on a video screen.

• Acid phosphatase It is produced by glandular epithelial cells

• Prostate biopsy

INTRODUCTION

FORECAST

• Disease stage

• The life expectancy

• EZH2 gene expression

• Agehttp://www.lavozdelsandinismo.com

INTRODUCTION

FORECAST

• PSA

• p53 mutation

• Black race

• Oncogenes AND

proto-oncogeneshttp://redconcienciaplanetaria.blogspot.com

Prostate

Cancer

ProstateCancer

BiomarkerPSA

DiagnosisAnd

Prognosis

GENERAL OBJECTIVE

Identify Cancer genetics-guided of serum

biomarker signatures for diagnosis and prognosis

of prostate cancer

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

• Cepa utilizada 129/BALB/c

• Los ratones fueron anestesiados

• Extracción de sangre y almacenamiento a -80°C

• Tejido prostático congelado y pulverizado para

posterior tinción

RATONES

MATERIALES Y MÉTODOS

• Fueron oxidadas con peryodato de sodio y se conjugó con resina

• Se agrega tripsina para digerir las glicoproteínas en estado solido

• Este sirve para cuantificar la PSA

profeblog.es

GLICOPROTEINAS

MATERIALES Y MÉTODOS

• Análisis de muestras en un espectrómetro de masas para medir concentraciones

•Separación cromatografía de los péptidos se realizó en un Agilent 1100 micro sistema HPL

ESPECTOMETRIA DE MASA

MATERIALES Y MÉTODOS

• Gen prostático con radio mayor a 10 se considera específico para pCA

 

CUANTIFICACIÓN DEL PÉPTIDO

MATERIALES Y MÉTODOS

•Separación de proteínas celulares por electroforesis en gel según su tamaño (SDS)

•Transferencia de proteínas a un filtro que se incuban con anticuerpos que reaccionan con la proteína estudiada

SDS/PAGE y Western Blot

MATERIALES Y MÉTODOS

• Determinación de proteínas, drogas y hormonas

• Unión del anticuerpo a molécula de fluorocromo

• Emiten luz a una longitud de onda mayor de 400 a 700nm.

Inmunofluorescencia/Fluoroinmunoensayo

MATERIALES Y MÉTODOS

Flurocromos comunes:• Isotiocianato de Fluiresceína•Rodamina

didatconsulting.com

Inmunofluorescencia/Fluoroinmunoensayo

MATERIALES Y MÉTODOS

• Desnaturalización del DNA para dar hebras sencillas

•Hibridar hebra sencilla con un oligonucleótido (Primer)

•Replicación de la hebra sencilla por DNA polimerasa a partir del oligonucleótido

PCR

MATERIALES Y MÉTODOS

• Criterios de inclusión: Pacientes con Pca y BPH(Hiperplasia Prostática Benigna)

• Criterios de exclusión: Pacientes con Pca avanzado

mundo.in.rs

Pacientes

MATERIALES Y MÉTODOS

• Extracción de 8 ml de sangre en tubos coagulantes

• Inversión 8 veces, centrifugación 4 h después de recogida a 4°C por 10 min

Pacientes

MATERIALES Y MÉTODOS

• División del suero en 5 partes y almacenamiento a -60°C

• Extracción de glicoproteína

Pacientes

MATERIALES Y MÉTODOS

•Identificación de un tejido (in situ) por medio de una interacción entre antígeno-anticuerpo, el cual ya ha sido marcado.

•Por medio de la tinción de la célula se demuestra la presencia y la localización celular de una molécula interés.

Inmunohistoquimica

MATERIALES Y MÉTODOS

• Identificación de un anticuerpo o antigeno utilizando un antígeno o un anticuerpo absorbido a una superficie solida

• La reacción Ag-Ac se usa un conjugado anti gamaglobulina humana unido a una enzima

ELISA

MATERIALES Y MÉTODOS

• La enzima actúa sobre un sustrato coloreando la solución

• Intensidad de color Cantidad de Ag o Ac

• Medición de marcadores de la investigación

ELISA

RESULTADOS

RESULTADOS

GLICOPROTEINAS

Biomarcadores específicos para el cáncer de próstata a través de glicoproteínas

• Glicoproteínas del tejido prostático• Glicoproteínas del suero

RESULTADOS

Inmunotransferencia e Inmunoflorescencia

• Se determinó que el PTEN tiene un papel importante en la diferenciación y homeostasis de las células madre

• Al no estar presente no hay quien suprima el tumor

RESULTADOS

Inmunotransferencia e Inmunoflorescencia

• En ausencia del gen en estudio, las glicoproteínas

que generalmente están dentro de la membrana

celular de las células prostáticas, se liberan y

migran al suero sirviendo como biomarcadores

RESULTADOS

PACIENTES

• Pacientes 143• En un grupo de 70 pacientes se confirma el Pca

localizado histológicamente• Grupo control BPH• Se evalúa el PTEN en FISH

RESULTADOS

ELISA y Cuantificación del Péptido

• Por medio de estas dos pruebas se buscaba medir la cantidad de proteínas en plasma que estuvieran en relación con el Pca.

• La concentración media de varias proteínas se midió en el rango de concentración de antígeno prostático específico (PSA)

RESULTADOS

• Los resultados sugieren que la reducción del número de copias del gen PTEN en la próstatael cáncer llevó a una perturbación de proteínas de suero.

• La pérdida de PTEN está causalmente asociada con el aceleramiento de Pca y la agresividad

RESULTADOS

• Se encontraron 5 proteínas que pueden ser biomarcadores para pacientes:

GalNAc transferasa 4 (GALNTL4) Fibronectina (FN) Zinc-α-2-glycoproteina(AZGP1) Biglycan (BGN) Proteina de matriz extracelular 1(ECM1)

RESULTADOS

PCR

• PCR y recuento de leucocitos para evitar variables de confusión

Figure 2.c

DISCUSSION

DISCUSSION

AUTHOR WHAT HE SAYS YES or NOT

Rifai N

“In the past the discovery of serum biomarkers has been technically challenging because of the enormous complexity of the serum proteome and the lack of sensitivediscovery-driven measurement technologies”

Yes

Schröder FH

“However, the effectiveness of systematic PCa screening with PSA testing remains controversial, in part because a lack ofsensitivity and specificity results in considerable overdiagnosis and overtreatment”

Yes

DISCUSSION

AUTHOR WHAT HE SAYS YES or NOT

Engelman JA

“In this regard, an increasing armamentarium of targeting agents that inhibit keycomponents of the PI3K pathway exists, and many of these inhibitors already are in clinical testin”

Yes

Bastian PJ

“There are several definitions of insignificant prostate cancer; most definitions exclude patients with any Gleason pattern 4 prostate cancer”

Yes

CONCLUSION

• This study has a great Importance as an academic Exercise, because we used databases, literature in the area of medicine and learn about some Pathologies

• Molecular biology opens new areas to medical research because of the contributions that develop an approach to the cell as a foundation for life

CONCLUSION

• Logical approaches for diagnosis and treatment require the natural history and biological behavior of the ways in which the disease occurs

• These studies can make a prognosis in an earlier stage of the disease, reducing the aggressiveness of the disease

MAPAS CONCEPTUALES

Mateo Zuluaga G

Melissa Yepes H

BIBLIOGRAPHY

MARTINEZ S, Lina María. Biología molecular. 3 ed. Medellín: UPB. Fac. de Medicina

AMERICAN CANCER SOCIETYhttp://www.cancer.org/Cancer/ProstateCancer/DetailedGuide/prostate-cancer-new-research

MEDLINEPLUS http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/001289.htm

SEMINARIOhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21300890

GRACIAS