proposal kanker mcf-7 baruuuuu
TRANSCRIPT
DAYA HAMBAT FRAKSI ETIL ASETAT DAUN KEMBANG BULAN
(Tithonia diversifolia) TERHADAP PROLIFERASI SEL KANKER
PAYUDARA MCF-7
I LATAR BELAKANG
Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) adalah salah satu tumbuhan yang
jumlahnya sangat banyak di daerah Hulu Sungai Selatan. Kandungan kimia yang
terdapat dalam tumbuhan Kembang Bulan adalah flavonoid, saponin, triterpenoid
dan polifenol (Lingga et al, 2010). Dengan adanya senyawa flavonoid yang
terkandung dalam tumbuhan Kembang Bulan, maka diduga tumbuhan tersebut
juga memiliki kemampuan untuk menghambat proliferasi sel kanker payudara
MCF-7. Karena adanya dugaan tersebut maka dilakukan penelitian secara ilmiah
terhadap daya hambat dari fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia
diversifolia) terhadap proliferasi sel kanker payudara MCF-7.
II RUMUSAN MASALAH
Rumusan masalah yang diangkat pada penelitian ini adalah apakah fraksi
etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) memiliki kemampuan
untuk menghambat proliferasi sel kanker payudara MCF-7?
III TUJUAN PENELITIAN
3.1. Tujuan Umum
Secara umum, penelitian ini dilakukan untuk
3.2. Tujuan Khusus
Penelitian ini secara khusus bertujuan untuk :
1
(1). Mengetahui daya hambat fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia
diversifolia) terhadap proliferasi sel kanker payudara MCF-7.
(2). Membandingkan daya hambat dari beberapa konsentrasi fraksi etil asetat
daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) proliferasi sel kanker payudara
MCF-7.
IV MANFAAT PENELITIAN
Manfaat penelitian ini untuk memberikan informasi mengenai kemampuan
fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) dalam menghamat
proliferasi sel kanker payudara MCF-7 serta dapat digunakan sebagai landasan
untuk penelitian selanjutnya.
V TINJAUAN PUSTAKA
5.1. Tumbuhan Kembang Bulan (Tithonia diversifolia)
5.1.1. Klasifikasi
Klasifikasi tumbuhan Kembang Bulan adalah sebagai berikut:
Domain : Eukaryota
Kingdom : Plantae
Phylum : Tracheophyta
Class : Magnoliopsida
Order : Asterales
Family : Asteraceae
Genus : Tithonia
Specific epithet : diversifolia
2
Botanical name : Tithonia diversifolia
(The BayScience Foundation Inc, 2009).
5.1.2. Deskripsi
Habitus tumbuhan Kembang Bulan berupa perdu dengan tinggi ± 5 m.
Daunnya tegak, bulat, berkayu, dan berwarna hijau. Daun Kembang Bulan berupa
daun tunggal, berseling, panjang 26-32 cm, lebar 15-25 cm, ujung dan pangkal
runcing, pertulangan daun menyirip, dan warnanya hijau. Bunganya majemuk,
terletak di ujung ranting, tangkai bulat, kelopak berbentuk tabung, berbulu halus,
dan berwarna hijau. Mahkota bunga lepas, bentuk pita, halus, kuning. Benang sari
berbentuk bulat, warna kuning, sedangkan putik melengkung dan warnanya
kuning. Buah kotak, bulat, masih muda hijau dan setelah tua menjadi coklat. Biji
bulat, keras, dan warnanya coklat. Akar tumbuhan Kembang Bulan berbentuk
tunggang dengan warnanya putih kotor (Steenis, 2003).
Gambar 1. Tumbuhan Kembang Bulan (The BayScience Foundation Inc, 2009)
5.1.3. Kandungan Kimia dan Khasiat
Tumbuhan Kembang Bulan memiliki kandungan kimia berupa flavonoid,
saponin, triterpenoid dan polifenol (Lingga et al, 2010). Berdasarkan kandungan
kimia tersebut, tumbuhan ini memiliki beberapa khasiat diantaranya sebagai obat
3
sakit perut kembung, peluruh haid, antidiabetes, serta diduga sebagai peluruh batu
ginjal.
5.2. Flavonoid
Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar
ditemukan di alam. Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang
ditemukan dalam bentuk tunggal. Flavonoid merupakan turunan senyawa induk
flavon yang mempunyai sejumlah sifat sama. Pada tumbuhan, aglikon flavonoid
terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Semuanya mengandung atom karbon
dalam inti dasarnya yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin
aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat
membentuk cincin ketiga (Fengel, 1995).
Gambar 2. Struktur kimia flavonoid (Rohyami, 2008)
Flavonoid yang terkandung dalam tumbuhan dapat diekstraksi dengan
berbagai macam pelarut. Pemilihan pelarut biasanya didasarkan atas kepolaran
pelarut yang disesuaikan dengan flavonoid. Flavonoid bersifat polar sehingga
mudah larut dalam pelarut polar misal: air, etanol, aseton, butanol, dan lain-lain
(Robinson, 1995).
5.3. Kanker Payudara
5.3.1. Definisi
5.3.2. Penyebab kanker payudara
4
5.3.3. Penanganan
5.4. Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan
kelarutannya terhadap dua cairan immiscible yang berbeda, biasanya air dan yang
lainnya pelarut organik. Ekstraksi cair-cair merupakan proses yang umum
digunakan, baik itu skala laboratorium maupun skala industri. Tujuan ekstraksi
adalah untuk mengambil sebagian atau seluruh zat tertentu yang ada dalam
tumbuhan, sehingga memudahkan dalam pengaturan bentuk sediaan, dosis yang
tepat, mudah dalam penyimpanan, praktis dalam penyajian dan menjaga keawetan
bahan untuk jangka waktu yang lebih lama (Voigt, 1994).
Gambar 4. Alat soxhlet (Wikimedia Foundation Inc, 2007)
Salah satu metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum
digunakan adalah soxhletasi. Soxhletasi merupakan penarikan komponen kimia
yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia ditempatkan dalam klonsong yang
telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa, cairan penyari dipanaskan dalam labu
alas bulat sehingga menguap dan dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi
molekul-molekul cairan penyari yang jatuh ke klonsong menyari zat aktif dalam
simplisia dan jika cairan penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan
akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi.
5
Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan disifon tidak berwarna, tidak tampak noda
jika di KLT, atau sirkulasi telah mencapai 20-25 kali (Harborne, 1987).
5.5. Fraksinasi
Fraksinasi adalah salah satu usaha yang dilakukan dalam rangka
memperoleh senyawa yang sederhana melalui metode yang tepat. Fraksinasi dapat
dilakukan dengan menggunakan corong pisah, press kolom, KK, ataupun SC.
Tujuan dari dilakukannya fraksinasi adalah melakukan pemisahan senyawa kimia
sesuai dengan tingkat kepolarannya. Pelarut yang ideal adalah pelarut yang
selektif terhadap beberapa senyawa yang diharapkan. Dengan kata lain fraksinasi
adalah suatu proses memisahkan beberapa senyawa sehingga keberadaan senyawa
lebih sederhana. Digunakan pelarut campuran agar senyawa dapat terlarut sesuai
dengan tingkat kepolaran pelarut yang digunakan (Harborne, 1987).
5.6. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran
senyawa menjadi senyawa murninya atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi.
Bahan adsorben sebagai fase diam dalam KLT digunakan silika gel, alumina dan
serbuk selulosa. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai
(Gritter, 1991). Kromatografi lapis tipis memiliki berbagai keunggulan antara lain
sederhana, relatif murah, memungkinkan penggunaan pereaksi agresif, merupakan
satu-satunya teknik yang dapat menganalisa berbagai campuran komponen secara
serempak (Kantasubrata, 1991).
Identifikasi senyawa yang tidak berwarna pada kromatogram dilakukan di
bawah sinar UV (254 & 366 nm), ditandai dengan ada tidaknya fluoresensi untuk
6
menampakkan senyawa yang hampir tidak nampak atau hanya nampak lemah di
bawah lampu UV digunakan bahan penyemprot (Autherhoff & Kovar, 2002).
Menurut Yunas (Wagner & Bladt, 1996) keberadaan flavonoid ditandai dengan
pemadaman pada UV 254 sedangkan di bawah sinar UV 366, flavonoid akan
berfluorosensi kuning, biru atau hijau tergantung dari strukturnya. Flavonoid juga
akan memberikan noda warna kuning yang sangat jelas jika diuapi dengan uap
ammonia. Selain itu dengan pereaksi sitroborat akan memberikan bercak kuning
berfluoresensi di bawah sinar UV 366 nm.
Menurut pengalaman, pemakaian pereaksi semprot yang paling
menguntungkan adalah dalam meningkatkan kepekaan mendeteksi bercak
flavonoid. Ada empat penyemprot yang biasa digunakan untuk tujuan ini adalah
larutan AlCl3 5%, kompleks difenil-asam borat-etanolamin, asam sulfanilat yang
terdiazotasi, dan larutan vanilin 5% dalam etanol dicampur dengan HCl pekat
(Markham, 1988).
VI HIPOTESIS
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang telah dijabarkan maka
dapat dikemukakan suatu hipotesis yaitu fraksi etil asetat daun Kembang Bulan
(Tithonia diversifolia) diduga mempunyai kemampuan dalam menghambat
proliferasi sel kanker payudara MCF-7.
VII METODOLOGI PENELITIAN
7.1. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Variabel bebas adalah
fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) yang diperoleh dari
7
proses fraksinasi terhadap ekstrak etanol daun Kembang Bulan. Variabel
tergantung adalah konsentrasi hambat (IC50) terhadap sel kanker payudara MCF-7,
dan variabel kendali adalah sel kanker payudara MCF-7, media biakan, waktu
inkubasi, dan suhu.
7.2. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2010 sampai bulan
Januari 2011 di Laboratorium Mikrobiologi, Sub Laboratorium Farmasi
Laboratorium Dasar Fakultas MIPA Unlam Banjarbaru.
7.3. Alat dan Bahan Penelitian
7.3.1. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik (Ohauss Explorer Pro dan
GF-3000), vacum rotary evaporator (Ika-Werke), seperangkat alat soxhletasi,
alat-alat gelas (Pyrex Iwaki Glass), waterbath (Memmert), oven (Mammert), box
lampu UV, penjepit kayu, pipet tetes, pipet volume, pengaduk, blender, sendok
tanduk, bejana kromatografi, cawan petri, mikroskop, inkubator, microplate
reader, mikropipet.
7.3.2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah sampel daun Kembang Bulan, serbuk daun
Kembang Bulan, sel MCF-7 koleksi Cancer Chemoprevention Research Center
(CCRC) Fakultas farmasi UGM yang dirawat dan ditumbuhkan pada medium
DMEM (Gibco) dengan 10% FBS (Gibco) dan 1% Penicillin-Streptomycin
(Gibco), aquades (H2O), etanol (C2H5OH) teknis, n-heksana (C6H14) pa, etil asetat
(C4H8O2) pa, plat KLT silika gel GF 254, isopropanol, HCl 4N, MTT [3-(4,5-
8
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida], asam asetat (CH3COOH), n-
butanol (C4H9OH), ammonia (NH3), sitroborat, aluminium foil, kapas dan kertas
label serta tissu gulung.
7.4. Cara Kerja
7.4.1. Pengambilan Bahan
Tumbuhan Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) diambil di desa Hulu
Banyu Kecamatan Loksado Kabupaten Hulu Sungai Selatan Kalimantan Selatan.
Pengambilan bahan dilakukan dengan mengambil tumbuhan secara utuh meliputi
akar, batang dan daun. Kemudian hanya mengambil daunnya sebanyak ± 5 kg.
7.4.2. Determinasi Tumbuhan Kembang Bulan
Determinasi sampel tumbuhan Kembang Bulan (Tithonia diversifolia)
dilakukan di Laboratorium Dasar Fakultas MIPA Universitas Lambung
Mangkurat.
7.4.3. Pengolahan Bahan
Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) yang sudah diambil dicuci
terlebih dahulu untuk membersihkan daun dari kotoran yang melekat. Jika sudah
bersih dilakukan perajangan, kemudian dikeringkan di tempat yang tidak terkena
sinar matahari langsung (hanya diangin-anginkan). Sampel kering disortasi kering
dengan cara dipisahkan dari partikel asing. Sampel yang telah disortasi kering
dinamakan haksel. Haksel selanjutnya dihaluskan menjadi serbuk. Serbuk yang
terbentuk diayak dengan menggunakan ayakan 5/8 agar diperoleh serbuk homogen
yang akan digunakan pada proses ekstraksi.
7.4.4. Identifikasi Fraksi Etil Asetat Daun Kembang Bulan
9
a. Ekstraksi Daun Kembang Bulan
Ekstraksi daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) dilakukan dengan
cara soxhletasi melalui 2 tahap. Tahap pertama dengan menimbang sebanyak 50
gram serbuk daun Kembang Bulan, kemudian dimasukkan dalam wadah soxhlet
dan ditambahkan pelarut n-heksana hingga serbuk terendam. Wadah soxhlet
dihubungkan dengan kondensor. Alat dinyalakan dan diatur agar terjadi 4
sirkulasi/jam dengan suhu 70-80oC. Perendaman dilakukan selama 5 hari yang
berguna untuk menghilangkan lemak serta komponen pengganggu lain (Rohyami,
2008). Ekstrak n-heksana diambil dan residu dikeringkan, kemudian residu
diekstraksi dengan etanol 96%. Proses ekstraksi dilakukan selama 5 hari dengan 4
sirkulasi/jam pada suhu 70-80oC. Ekstrak cair yang diperoleh diuapkan hingga
diperoleh ekstrak kering daun Kembang Bulan.
b. Fraksinasi Ekstrak Daun Kembang Bulan
Ekstrak kering daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) disuspensikan
dengan air, kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah, ditambahkan pelarut
etil asetat sebanyak 50 ml, digojog perlahan sampai uapnya hilang dan didiamkan
selama 30 menit agar terjadi pemisahan. Akan terbentuk lapisan etil asetat dan
lapisan air, kemudian lapisan etil asetat dipisahkan dan ditampung di dalam
wadah. Melakukan proses fraksinasi secara berulang sampai diperoleh sejumlah
fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang didapat diuapkan sampai terbentuk fraksi
kering etil asetat.
c. Identifikasi Flavonoid menggunakan Kromatografi Lapis Tipis
10
Melakukan optimasi eluen yang akan digunakan untuk mendapatkan profil
kromatogram dengan menggunakan plat KLT silika gel GF 254. Eluen yang
digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air (9:2:6) (Rohyami, 2007).
Sebelumnya dilakukan penjenuhan eluen dengan cara memasukkan eluen
ke dalam chumber dengan ketinggian kurang dari 1 cm. Kemudian meletakkan
kertas saring ke dalam chumber, didiamkan selama kurang lebih 15 menit. Elusi
dilakukan setelah chumber KLT penuh dengan uap eluen (jenuh). Setelah itu
dilakukan penotolan bercak dengan cara menotolkan fraksi etil asetat di atas
lempeng KLT hingga terbentuk noda. Lempeng KLT tersebut dimasukkan ke
dalam chumber yang berisi eluen yang telah dijenuhkan. Lempeng KLT hasil
penotolan kemudian dikeluarkan dari chumber setelah eluen naik mendekati garis
batas atas sebesar 0,5 cm. Noda yang terbentuk diamati di bawah sinar UV dengan
panjang gelombang 254 dan 366 nm. Noda pada lempeng KLT kemudian diuapi
dengan uap ammonia (NH3) akan memberikan warna kuning sehingga noda
terlihat jelas. Noda yang terbentuk diamati kembali di bawah sinar UV dengan
panjang gelombang 254 dan 366 nm. Selain itu digunakan pereaksi sitroborat
yang akan memberikan bercak kuning berfluoresensi di bawah sinar UV 366 nm.
Hasil kromatogram didokumentasikan dan kemudian menentukan harga Rf.
7.4.5. Uji Sitotoksik
Sel MCF-7 ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh
kepadatan 5 x 103 sel/sumuran dan diinkubasi selama 48 jam untuk mendapatkan
pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian
ditambahkan fraksi etil asetat pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO
11
(Sigma) dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO2 5% selama 48 jam. Pada
akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS
(Sigma). Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100μL media kultur dan
10μL MTT (Sigma) 5 mg/mL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam
inkubator CO2 5%, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan HCl 4N-isopropanol
(1:100), digoyang di atas shaker selama 10 menit. Serapan dibaca dengan ELISA
reader (Bencmark Bio Rad) pada panjang gelombang 595 nm.
7.4.6. Uji kinetika proliferasi sel
Sel MCF-7 ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh
kepadatan 5 x 103 sel/sumuran dan diinkubasi selama 48 jam. Ekstrak dengan
berbagai seri kadar ditambahkan ke dalam sumuran dan dilakukan sampling pada
jam ke-1, 6, 12, 24, 48 dan 72. Proliferasi sel diamati dengan metode MTT seperti
halnya yang dilakukan pada uji sitotoksik.
7.4.7. Analisis Data
Hasil yang diperoleh dari pengukuran serapan sampel dianalisis statistik
menggunakan SPSS 17.0. Untuk uji distribusi dan homogenitas adalah shapiro
wilk dan Levena. Jika data terdistribusi normal dan homogen dilakukan analisis
one way anova pada tingkat kepercayaan 95%. Jika terdapat perbedaan yang
signifikan dilanjutkan dengan analisis Post Hoc Tukey. Jika data tidak terdistribusi
normal atau tidak homogen maka dilakukan analisis non parametrik dengan uji
Kruskal-Wallis pada tingkat kepercayaan 95%. Jika terdapat perbedaan yang
signifikan dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney.
12
VIII JADWAL PROGRAM KEGIATAN
Penelitian ini direncanakan kurang lebih selama 4 bulan
No Jenis KegiatanBulan Ke-
1 2 3 4
1 Persiapan
a. Administrasi dan perizinan penggunaan laboratorium
b. Pengadaan bahan dan alat
2 Pelaksanaan
a. Pengambilan sampel
b. Pembuatan simplisia
c. Pembuatan fraksi
d. Pelaksanaan penelitian
3 Penyelesaian
a. Analisis data
b. Penyusunan dan penggandaan laporan
c. Seminar Hasil
13