promotori eucariotici rna pol i trascrive rrna rna pol ii trascrive mrna per proteine rna pol iii...
TRANSCRIPT
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Promotori eucariotici
RNA pol I trascrive rRNA
RNA pol II trascrive mRNA per proteine
RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA
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LE RNA POLIMERASI COMERICONOSCONO I PROMOTORI?
Transcribed region
Promotore-contiene sequenzeSpecifiche per il legame dellapolimerasi
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FATTORI DI TRASCRIZIONE
• FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter”
• REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI
- REPRESSORI
Transcribed region
ELEMENTO ENHANCER
ELEMENTO
DEL PROMOTORE PROSSIMALE
Basal factor binding sites
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• Il legame promotore RNA polimerasi
richiede i fattori di trascrizione generali
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Promotori
~200 bp
gene
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Reporter gene
COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
eg CAT, luciferase
ATTIVITA’
100%
Reporter gene 100%
Reporter gene 20%
Reporter gene 1%
Reporter gene 0%
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Reporter gene
eg CAT, luciferase
ATTIVITA’
100%
Reporter gene 100%
Reporter gene 400%
Reporter gene 1%
Reporter gene 0%
COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
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Livello
di tr
asc
rizi
one
basale
attivato
represso
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Transcribed region
Elementi del Core promoter • siti di legame per I fattori di trascrizione generaliChe supportano un livello di trascrizione basale
La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dallaAzione di fattori di trascrizione gene-specifici
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~24bpTATABRE Inr DPE
TATA-box 8 bp elemento ricco in AT
BRE 6 bp elemento ricco in purine
Bound by TFIID
Bound by TFIIB
Inr DPE Bound by TFIID
RNAP II
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TFIIA
TFIIE
TFIIF
TFIIH
RNAP II
TFIIB
TFIID2-3 subunits
2 subunits
1 subunit
10 subunits
2 subunits
12 subunits
9 subunits~40 polipeptidi
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~24bpTATABRE Inr DPE
TATA-box 8 bp AT
BRE 6 bp
lega TFIID
lega TFIIB
Inr DPE lega TFIID
RNAP II
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~24bpTATABRE Inr DPE
TFIIH
TFIIDTFIIATFIIB
TFIIF
RNAP IITFIIE
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TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein
TBP
TFIID
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TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors
—TAFs
-aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendoL’elemento Inr
-legano i fattori di trascrizione gene specifici
-aiutano a decompattare la cromatina
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~24bpTATABRE Inr DPE
TFIID
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~24bpTATABRE Inr DPE
TFIIDTFIIA
-aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA
-interagisce con vari attivatori gene specificiAiutandoli a legarsi ai vari TAF
TFIIA
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~24bpTATABRE Inr DPE
TFIIDTFIIATFIIB
TFIIB
-si lega a TBP e richiama la polimerasi
-Partecipa alla selezione del sito d’inizio eStabilisce la direzione
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~24bpTATABRE Inr DPE
TFIIDTFIIATFIIB
TFIIF
RNAP II
TFIIF
Stabilizza il complesso di preinizio e induceUna torsione nel DNA
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~24bpTATABRE Inr DPE
TFIIDTFIIATFIIB
TFIIF
RNAP IITFIIE
TFIIE
Attira una elicasi ed insieme srotolano ilPromotore.Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH
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~24bpTATABRE Inr DPE
TFIIH
TFIIDTFIIATFIIB
TFIIF
RNAP IITFIIE
TFIIH
Fosforila una delle subunita’ della polimerasidando l’avvio alla trascrizione
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— REGOLATORI GENE SPECIFICI
Transcribed region
SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE
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Regolatori gene specifici
• hanno una struttura modulare
• contengono un dominio che lega il DNA
• contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale
• qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione• qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione
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![Page 30: Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062300/5542eb4f497959361e8be810/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062300/5542eb4f497959361e8be810/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062300/5542eb4f497959361e8be810/html5/thumbnails/32.jpg)
(MADS box)
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NH
H O C
Donatore Accettore
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A D A M A A D M A D A D A A
A A A D A A A A D A
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Transcribed region
Regolatori gene specifici
1) Contengono un dominio che lega il DNA
2) E un dominio di attivazione trascrizionale
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Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte
migliaia di nucleotidi?
DNA loop
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Enhancers- stimolano la trascrizione1. Attivatori si legano ad un sito specifico
2. Il DNA si ripiega
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Enhancers- stimolano la trascrizioneAttivatori si legano
ad un sito specifico
Il DNA si ripiega
Si forma il complesso nel promotore
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Enhancers- stimolano la trascrizioneAttivatori si legano ad un
sito specifico Il DNA si ripiegaSi forma il complesso
nel promotoreSi lega la RNA
polimerasiInizio della trascrizione
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Controllo combinatorialedell’espressione genica
![Page 41: Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062300/5542eb4f497959361e8be810/html5/thumbnails/41.jpg)
Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni
Diverse combinazioni producono fenotipi differenti
![Page 42: Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062300/5542eb4f497959361e8be810/html5/thumbnails/42.jpg)
Heterodimerization of DNA binding proteins can altertheir sequence specificity
![Page 43: Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062300/5542eb4f497959361e8be810/html5/thumbnails/43.jpg)
Enhancer e Repressori
gene
promotoreenhancer
repressore10-50,000 bp
repressore previene il legame dell’enhancer
RNAP
enhancer interagiscono con RNAP
trascrizione
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Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole
idrofobiche• Cambio dell’attivita’• Cambio della localizzazione cellulare
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Recettori nucleari
RGRACANNNTGTYCY
TBP
TAFTAF
TAF
TAF
RNA pol II
Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali
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Nuclear Receptors
GR hsp90hsp90GR
Legame dell’ormone
Dissociazione da hsp90
dimerizzazione
GR GR
Migrazione nel nucleoGR GR
Legame al DNA
TATA
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Regolazione mediante fosforilazione
• Ormoni attivano una chinasi
• La chinasi fosforila un fattore di trascrizione
• Il fattore e’ attivato
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Cascata delle chinasiGF si lega al recettore - protein tyrosine kinase
Il recettore dimerizza
Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase)
MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase
SEK fosforila JNK – una MAP kinase
MEKK
P
MEKKP
SEKSEKP
JNKJNKP
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Cascata delle chinasiJNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN
C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1
AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali
JNKP
nucleo
C-JUN
TRE
C-JUN
P
RNA pol II
C-FOS
P
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Metilazione del DNA• La citosina puo’ essere metilata:
• La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X
• Risulta in una maggiore condensazione della cromatina
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Trascrizione e struttura della cromatina
• Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile
• La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente
• La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni
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Acetilazione degli Istoni
• E’ una modificazione post-traduzionale
• Gruppi acetilici (CH3COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive
• Eliminano le interazioni ioniche con il DNA
• Diminuiscono la condensazione
• Associati con una attiva trascrizione
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– Acetilazione/Deacetilazione
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Attivatori: acetilazione degli Istoni
• Alcuni attivatori attirano delle acetilasi
• Il macchinario di trascrizione puo’ accedere
al DNA meno condensato
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Alcune Istone Acetilasi (HAT)
• p300/CBP
• TAF II 250
• Ambedue sono dei co-attivatori
• SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP
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Repressori: deacetilazione degli Istoni
• Alcuni repressori attirano delle deacetilasi
• Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA
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– Acetilazione/Deacetilazione
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SWI/SNF in Lievito
SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio).
Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA
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Macchinari di Rimodellamento
• Tutti contengono subunita’ simili a swi-2/snf
• NTP-binding proteins
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Regolazione dell’Espressione Genica
Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:
DNA RNAtranscript
mRNA mRNA
inactivemRNA
protein
inactiveprotein
NUCLEUS CYTOSOL
trascrizione Maturazione trasporto traduzione
degradazione
controllo dell’attivita’
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Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o
legati alla membrana dallo stesso gene
• Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’
• Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili
• Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici
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L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-mRNA
Figure 11-39
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• mRNA editing
Nell’intestino
La deaminasi e’ presente solo nell’intestino
Nel fegato
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Metodi per studiare l’espressione dei geni• Northern blot• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-
PCR)• Ibridazione In situ• Trascrizione In vitro• DNA Microarray
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Purificazione dell’RNA
• Procedura – Lisi delle cellule con un reagente
che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi
– Rimozione delle proteine– Precipitazione specifica dell’RNA
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Northern blot
• Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA
• Studi sull’espressione genica
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Northern blot– Elettroforesi dell’RNA in gel
contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare
– Trasferimento dell’RNA su una membrana
– Ibridazione con una sonda marcata
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100V 0,2A
+-
generatore di corrente
gel di agarosio
scatola elettroforetica
tampone elettroforeticoes. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)
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Gel Elettroforesi-
Separa le molecole in base alla dimensione
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Trasferimento su supporto solido
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Trasferimento dal gel alla membrana
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gel
membrana
Dopo il trasferimento
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Preparare la sonda per il Northern Blot
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Ibridazione
• La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare
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Lavaggio
• Rimozione della sonda non legata al supporto solido
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Rivelazione degli ibridi
• Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente
• Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido
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Northern blot
• La rivelazione avviene usando:– DNA marcato con
radioattivo(32P)
– DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore
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Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb
Northern blot
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Svantaggi del Northern Blot
• Richiede grandi quantita’ di RNA
• E’ un processo lungo e laborioso
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Ibridazione dell’RNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro transcription
T7/T3 or SP6 promoter
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Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root
RNA in situ hybridization
Colour substrate:
nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)
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• Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene
• Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’
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Il saggio di “run-on” (o della catena nascente di RNA)
permette di determinare il livello di trascrizione di un gene
1) Purificare i nuclei2) + NTP, 32P GTP3) Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva4) Estrazione dell’RNA5) Ibridazione a cDNA immobilizzato
su filtro
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Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici
analizzata tramite run-on
LodishFigure 10-23
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Northern blottingProbe labeling
pBS-SemaIII
dATP
dGTPdTTP
dCTPRNA isolation
AAAAAA
Gel electophoresis
Blotting
Hybridization
Autoradiography
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reverse Northern blotting
Down-regulation of transcripts
Up-regulation of transcripts
**
labeled (specific) probe
target
Northern
**
specific probes
labeled target
reverse Northern