projec˘oes c~ ortico-corticais do c ortex auditivo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CIENCIAS BIOLOGICAS

CENTRO DE BIOCIENCIAS

BACHARELADO EM BIOLOGIA

Alice Pimenta Gurgel

PROJECOES CORTICO-CORTICAIS DO CORTEXAUDITIVO PRIMARIO DE RATOS MODELO DE

AUTISMO

Natal-RN2019

Alice Pimenta Gurgel

PROJECOES CORTICO-CORTICAIS DO CORTEXAUDITIVO PRIMARIO DE RATOS MODELO DE

AUTISMO

Projeto de pesquisa apresentado ao Curso de Ciencias

Biologicas da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte a ser utilizado como diretriz para manufatura do

Trabalho de Conclusao de Curso.

Orientadora:

Prof. Dra. Renata Figueredo Anomal

Universidade Federal do Rio Grande do Norte — UFRN

Departamento de Morfologia — DMOR

Natal-RN

2019

Gurgel, Alice Pimenta. Projeções córtico-corticais do córtex auditivo primário deratos modelo de autismo / Alice Pimenta Gurgel. - Natal, 2019. 38 f.: il.

Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grandedo Norte. Centro de Biociências. Curso de Ciências Biológicas. Orientadora: Profa. Dra. Renata Figueiredo Anomal.

1. Autismo - Monografia. 2. Período Cítico - Monografia. 3.Projeções córtico-corticais - Monografia. 4. Córtex AuditivoPrimário - Monografia. 5. VPA - Monografia. 6. TEA - Monografia.I. Anomal, Renata Figueiredo. II. Universidade Federal do RioGrande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616.896

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

i

”Tudo deveria se tornar o mais simples possıvel,

mas nao simplificado.”

Albert Einstein.

ii

Resumo

O Perıodo Crıtico (PC) e uma fase pos-natal na qual o desenvolvimento cortical e

altamente suscetıvel a plasticidade induzida pelos estımulos ambientais. Para cada ma-

turacao sensorio, motora, e cognitiva um perıodo-crıtico diferente e promovido. Os eventos

que ocorrem durante o PC tem entao impactos importantes sobre a formacao dos mapas

corticais de processamentos sensoriais, e tambem sobre a percepcao destes pelo indivıduo

durante sua vida. Sabendo disso, algumas desordens do neurodesenvolvimento tais como o

transtorno do espectro autista (TEA), podem apresentar desde alteracoes fenotıpicas, com

padroes faciais tıpicos, a alteracoes sensorio-motoras, o que juntas podem gerar deficits

sociais de diferentes gradacoes no indivıduo afetado. O objetivo do presente estudo foi

entao investigar o Perıodo Crıtico do desenvolvimento pos-natal em ratos modelo de au-

tismo, hipotetizando se este e encontrado alterado ja no nascimento. Sugerimos que: 1) os

deficits de comunicacao e alteracoes sensoriais observadas neste transtorno possam estar

relacionados, em parte, ao de tempo de abertura e/ou fechamento do PC no cortex senso-

rial Auditivo primario (A1), e 2) as alteracoes no desenvolvimento das conexoes aferentes

para este cortex (A1). Para tanto, propomos o estudo de aferencias para A1 em ratos

modelo de autismo e tambem em ratos controle (injecao de solucao salina) no primeiro dia

pos-natal (P0.5), por meio da introducao, post-mortem, de neurotracador retrogrado. Foi

observado com isso que o A1 recebe projecoes axonais de diversas regioes corticais, como a

regiao frontal, motora e ınsula. Sendo assim, foi constatado que nao existe especificidade

nas conexoes cortico-corticais aferentes para A1 no dia P0.5, porem os dados obtidos se

mostram inconclusıveis por nao incluırem o grupo controle na analise.

Palavras-chave: Autismo, TEA, VPA, Perıodo Crıtico, cortex auditivo primario, co-

nexoes cortico-corticais.

iii

Abstract

The Critical Period (CP) is a postnatal time when cortical development is highly

susceptible to plasticity induced by environmental stimuli. For each sensory, motor, and

cognitive maturation, a different critical period is promoted. Events that occur during the

CP then have important impacts on the formation of cortical maps of sensory processing,

as well as on individual perception during their lifetime. Knowing that, some neurodeve-

lopmental disorders such as autism spectrum disorder (ASD), may present from phenoty-

pic alterations, with typical facial patterns, to sensorimotor changes, which together can

generate social deficits of different gradations in the affected individual. The Objective of

the present study was to investigate the CP of post-natal development in autism models

rats by analysing cortico-cortical connections. We suggest that: 1) the communication

deficits and sensory alterations observed in this disorder may be related, in part, to the

opening and/or closing time of the altered CP in the sensory cortex Primary Auditory

(A1), and 2) to changes in the development of afferent connections in this cortex (A1).

Therefore, we propose the study of afferences to A1 in autism model rats and also in con-

trol rats (saline injection) on the first postnatal day (P0.5), by introducing, post-mortem,

retrograde neurotracer. It was observed that A1 receives axonal projections from vari-

ous cortical regions, such as frontal, motor and insula. Accordingly to this findings, it

was found that there is no specificity in the afferent cortical connections to A1 on day

P0.5, but data are shown unfinished because they do not include the control group in the

analysis.

Keywords : Autism, ASD, VPA, Critical Period, primary auditory cortex, cortical-

cortical connections.

iv

Lista de Figuras

1.1 Conexoes corticais de A1 no esquilo (Sciurus carolinensis). . . . . . . . . . 7

1.2 Visao bidimensional demonstrando a projecao topografica de A1 em ma-

caco da noite (Aotus trivirgatus). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

4.1 Esquema de como as marcacoes de neuronios foram feitas em ampliacao.

A: Imagem sem ampliacao, mostrando a localizacao de onde se retirou as

imagens B e C : Amostragem de corpos de neuronios com (B) e sem (C) as

marcacoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.2 Sıtio de injecao de cristal de DiI em caso 2. A esquerda mostra sıtio de

injecao em filtro de Fluoresceına. A direita sıtio de injecao em filtro de

Rodamina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.3 Corte coronal de caso 2. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI

mostrando as demarcacoes do cortex. B e C: Os cortes de cima reve-

lam marcacoes feitas do hemisferio direito. D e E: Marcacoes feitas do

hemisferio esquerdo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.4 Sıtio de injecao de cristal de DiI em caso 3. A esquerda mostra sıtio de

injecao em filtro de Fluoresceına. A direita sıtio de injecao em filtro de

Rodamina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17


mostrando as demarcacoes do cortex. B e C: Os cortes revelam marcacoes

feitas do hemisferio direito. D e E: Marcacoes feitas do hemisferio esquerdo. 18


mostrando as demarcacoes do cortex. B e C: Os cortes de cima revelam

marcacoes feitas do hemisferio direito. D: Marcacoes feitas do hemisferio

esquerdo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18


mostrando as demarcacoes do cortex. B e C: Os cortes revelam marcacoes

feitas do hemisferio direito. D e E: Marcacoes feitas do hemisferio esquerdo. 19

v

Conteudo

Resumo ii

Abstract iii

1 Introducao 1

1.1 AUTISMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 PERIODO CRITICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3 CORTEX AUDITIVO PRIMARIO (A1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.4 MODELO EXPERIMENTAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.5 JUSTIFICATIVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2 Hipoteses e Objetivos 11

2.1 HIPOTESES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2 OBJETIVO GERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.3 OBJETIVO ESPECIFICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3 Materiais e Metodos 12

3.1 INDUCAO AO VPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.2 EUTANASIA, PERFUSAO E

DISSECACAO CORTICAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.3 INJECAO DO NEUROTRACADOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.4 ANALISE DAS CONEXOES CORTICAIS E

SUBCORTICAIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4 Resultados e Discussao 15

5 Conclusao 22

Bibliografia 23

1

Capıtulo 1

Introducao

1.1 AUTISMO

O autismo e uma desordem do neurodesenvolvimento caracterizada por alteracoes

comportamentais, as quais se apresentam majoritariamente em criancas nos primeiros

anos de vida e tem como principais sintomas a dificuldade de interacao social, atraso

no desenvolvimento da linguagem verbal e nao verbal, hiperatividade, padrao restrito de

interesse, de comportamento e/ou de atividade, e dificuldade em perceber e demonstrar

emocoes (Kanner, 1943).

Dados epidemiologicos desde 2012, pelo Centro de Prevencao e Controle de Doencas

dos Estados Unidos, confirmam que uma a cada cinquenta criancas, de idades entre 6

a 17 anos, sao autistas, sendo mais presente no genero masculino que no feminino, em

uma proporcao de quatro para um (Garcia-Penas, 2009). Pesquisas recentes, como as

publicacoes de Fombonne (2005; 2009), consideram que a prevalencia dessa sındrome

esteja entre cinco a dez a cada mil pessoas. No Brasil, os achados mais atuais indicam

uma prevalencia em torno de 0,3% na populacao (Paula et al., 2011). No entanto, nao ha

muita riqueza de dados referentes a frequencia deste transtorno pelo territorio nacional

(Gomes et al., 2015).

Segundo Sousa (2013), os criterios para a classificacao e diagnostico do autismo tem

sido constantemente alterados, pois sua etiologia nao e bem definida. A heterogenei-

dade dos perfis encontrados no autismo, esta relacionada parcialmente a multiplicidade

de fatores etiologicos possivelmente envolvidos nesta desordem, podendo cada indivıduo

apresentar alteracoes em gradacoes diferentes, como um espectro de sintomas. Por isso,

o autismo e referido como transtorno do espectro autista (TEA), sendo o afloramento

clınico no inıcio da infancia um dos principais criterios para seu diagnostico diferencial

(American Psychiatric Association, 2013). Sugere-se, pelas pesquisas promovidas, haver

2

uma forte relacao entre fatores geneticos e ambientais no desencadear deste transtorno

(Chaste e Leboyer, 2012). Ate entao, o TEA foi descrito na ultima edicao do Manual

Estatıstico e Diagnostico de Doencas Mentais de 2013 (DSM-V) como uma unica catego-

ria: o Transtorno do espectro autista (TEA), juntamente com a sındrome de Asperger e o

disturbio generalizado do desenvolvimento nao especıfico, possuindo dentro deste espectro

dos diversos nıveis de comprometimento social.

De acordo com Ameis e Catani (2014), as dificuldades de interacao social sao per-

ceptıveis a partir dos 4 anos, seguidas por duas janelas de alteracoes sensoriais: entre os

4 e 6 anos, e entre os 6 e 8 anos de idade (Starr et al., 2003). Sintomas representados

por menor reconhecimento de faces (Johnson et al., 2005), menor imitacao e interesse

social (Zwaigenbaum et al., 2005) e dificuldades na formacao pessoal da teoria da mente

(Elsabbagh e Johnson, 2007) sao perceptıveis tambem na infancia, podendo haver uma

melhora consideravel na adolescencia (Szatmari et al., 2009). Ainda assim, o desenvolvi-

mento enviesado do cerebro resulta geralmente em um adulto com defices sociais (Howlin

et al., 2004).

Alteracoes no processamento sensorial dos indivıduos com autismo, tais como a res-

posta sensorial aumentada ou diminuıda (Leekam et al., 2007), sao caracterısticas chaves

do reconhecimento clınico deste transtorno, embora exista pouco consenso sobre como

elas se manifestam (Marco et al.; 2011). Sugere-se que alteracoes nos sentidos do tato,

paladar e olfato sejam consequencia da imaturidade de desenvolvimento do sistema ner-

voso (Baranek et al., 2006). As alteracoes nas vias de processamento auditivo e visual sao

as mais bem descritas na literatura (Marco et al.; 2011), como as descritas nos estudos

neurofisiologicos do sistema auditivo, demonstrando atividade neural atıpica no cortex

auditivo primario (Anomal et al., 2013; Bruneau et al., 2003). Estas alteracoes podem

ser causa de desconforto nos indivıduos afetados, que usualmente reagem desproporcio-

nalmente ao escutar sons usualmente inofensivos, alem de apresentarem atraso da fala

(Marco et al.; 2011). Indivıduos com TEA possuem dificuldade na deteccao de formas em

movimento (Jonge et al.,2007) e dificuldade de processamento facial pelos estımulos visu-

ais (Vlamings et al., 2010). Muitas vezes tambem apresentam disturbio de coordenacao

do desenvolvimento (DCD) associado (Piek e Dyck, 2004), que e a falta de controle motor

e integracao dos movimentos. Considera-se entao, que essa percepcao sensorial atıpica

possa gerar uma cascata disruptiva em processamentos corticais mais complexos, como a

socializacao (Marco et al., 2011), falta de empatia (Piek e Dyck, 2004) e dificuldade em

reconhecer emocoes (Marco et al., 2011).

Considerando as variacoes fenotıpicas e de sintomatologia descritas nos TEA (Mueller

et al, 2013), diversos trabalhos vem tentando descrever as caracterısticas morfologicas e

funcionais de causa e efeito. Estudos de imagem por ressonancia magnetica (IRM), como

3

citado nos artigos de Rane e colaboradores (2015) e Courchesne e colaboradores (2007),

descreveram alguns padroes morfologicos tıpicos de pacientes com autismo, tais como

anormalidades na circunferencia e volume da cabeca e do encefalo, que parecem crescer

rapidamente na infancia, se normalizando na vida adulta. Ja estudos anatomicos de co-

nectividade de Bauman e colaboradores (2005) demonstraram alteracoes na amıgdala e

hipocampo apresentando uma circuitaria irregular com lesoes na substancia branca (Mu-

eller et al., 2013; Nair et al., 2013), que podem causar disfuncoes corticais (Stigler et

al., 2011). As lesoes axonais (Ameis e Catanis, 2014), por exemplo, afetariam tanto as

conexoes de curta distancia do cingulado anterior, produzindo um aumento de conectivi-

dade local no cortex pre-frontal, quanto de longa distancia, promovendo uma reducao das

conexoes que fazem a conexao do cingulado anterior e do cortex orbitofrontal a outras

regioes do cortex (Zikopoulos e Barbas, 2010). Tambem, foi verificado a existencia de uma

maior compactacao (densidade) e menor tamanho dos neuronios na amıgdala (Bauman

et al, 2005) e menor numero absoluto de celulas de Purkinje no cerebelo (Ingram et al,

2000), ambos resultados condizentes com a existencia de um desenvolvimento sensorial e

emocional comprometido dos indivıduos dentro do TEA (Ameis e Catanis, 2014).

Com relacao as conexoes, foram encontradas contradicoes nos dados obtidos a par-

tir do uso de imagem por tensor de difusao (ITD), que sao apresentadas no trabalho de

Ameis e Catanis (2014), as quais apontam diferencas microestruturais das projecoes do

fascıculo uncinado e talamicas para o cortex pre-frontal e lobo temporal como ocasiona-

das pelo desenvolvimento alterado na organizacao da substancia branca e mielinizacao

no TEA. Sugere-se adicionalmente que as alteracoes na percepcao sensorial descritas no

autismo podem estar relacionadas devido a um desequilıbrio entre a conectividade neuroal

inibitoria e excitatoria (Le Blanc e Fagiolini, 2011), no entanto foi uma hipotese recen-

temente contestado por Goel e Portera-Cailliau (2019) e necessita, portanto, de mais

evidencias.

O fator genetico no TEA parece estar relacionado a um conjunto de genes que codifi-

cam proteınas da neurogenese, como o observado na Sındrome do X fragil, Sındrome de

Rett, e na Sındrome de Angelman (Munnich et al., 2019). Estudos envolvendo irmaos

gemeos monozigoticos tambem fornecem fortes evidencias de hereditariedade genetica no

TEA (Brkanac et al, 2008), podendo chegar a uma taxa de herdabilidade de cerca de

80% entre gemeos monozigoticos (Geschwind, 2011). Sugere-se ainda que alguns fatores

ambientais possam contribuir para o desenvolvimento do TEA (Arndt et al., 2005), como

o contagio da progenitora por algumas viroses durante a gravidez (ex: rubeola), e ate

mesmo o consumo de algumas drogas e substancias (talidomida e acido valproico) no

primeiro trimestre de gestacao, perıodo onde se ocorre a neurulacao. O acido valproico

(VPA) e um farmaco amplamente utilizado para tratamento de pacientes epilepticos ou

4

com disturbios de humor (Nalivaeva et al., 2009). Seu mecanismo de acao ainda nao e

entendido em sua totalidade, porem sabe-se que ele atua na reducao da atividade neural

bloqueando os canais de sodio e calcio existentes por aumentar os nıveis dos neurotrans-

missores GABA no indivıduo (Kwan and Brodie, 2001). Gestantes que fazem uso deste

medicamento mostram uma taxa alta de filhos com caracterısticas autistas (Christensen

et al., 2013). Ainda, estudos sobre a analise do historico medico de criancas mostram que

a ha uma forte correlacao entre o VPA utilizado na gravidez pela genitora e o nascimento

de criancas autistas (Moore et al., 2000).

5

1.2 PERIODO CRITICO

O perıodo crıtico (PC) e descrito como uma janela de desenvolvimento pos-natal (Be-

gum e Sng, 2017) altamente suscetıvel a plasticidade induzida pela experiencia sensorial

do ambiente. Durante o PC, a atividade eletrica gerada pela experiencia sensorial modula

a organizacao dos mapas corticais, atraves da expansao e retracao das conexoes corticais

e subcorticais (Wiesel et al..,1965; Berardi et al., 2000). O PC esta presente tanto nos

sistemas sensoriais como nos sistemas motores e cognitivos (Knudsen, 2004; Begum e Sng,

2017), e vem sendo bem descrito na literatura na formacao do cortex de barril no cortex

somatossensorial ( Lu et al., 2001), na visao binocular no cortex visual (Hensch, 2005a),

no refinamento do mapa tonotopico auditivo (Hensch, 2005a; Anomal et al., 2015), e no

aperfeicoamento do sistema motor (Hensch, 2005b). O estudo do PC nos cortices senso-

riais possui grande importancia clınica, pois o resultado da experiencia sensorial atıpica

ao longo de um PC tera difıcil reversao no cortex na vida adulta (Knudsen, 2004).

A nıvel celular, sao observados dois tipos de plasticidade cortical durante o PC (Butz

et al., 2009): a plasticidade estrutural e funcional. A primeira e relacionada as mudancas

anatomicas na conectividade dos neuronios, com formacao de novas conexoes sinapticas

e alteracoes do numero de neuronios e de sinapses existentes. Ja a plasticidade funcional

refere-se a “forca” de uma unica ligacao sinaptica e sua capacidade para desempenhar a

atividade dos neuronios existentes, que pode depender de diversos mecanismos, como: a

insercao ou remocao de receptores pos-sinapticos, alteracao da liberacao pre-sinaptica de

transmissores e/ou alteracao da espessura da sinapse (Butz et al., 2009).

Com relacao aos circuitos, a plasticidade dependente de experiencia sensorial do PC

esta diretamente relacionada ao amadurecimento dos circuitos inibitorios (Hensch e Fagi-

olini, 2004), que sao compostos por interneuronios inibitorios que secretam o neurotrans-

missor acido gama aminobutırico (GABA), essenciais para a inibicao lateral dos neuronios

adjacentes e formacao do equilıbrio entre as sinapses inibitorias e excitatorias (Swadlow,

2003). Estes interneuronios inibitorios sao conhecidos, em sua maioria, como celulas

parvalbumino-positivas (Hensch, 2005b). Estudos descrevem que neuronios parvalbumino-

positivos estao diminuıdos no cortex somatossensorial de animais modelos dos TEA (Go-

golla et al., 2009). Devido a essas caracterısticas, sugere-se que a alteracao na producao

e liberacao de GABA seja capaz de contribuir para a sintomatologia autista (Yip et al.,

2007), podendo resultar em um cortex hiperexcitavel (Sousa, 2013).

Diversos estudos tambem tem demonstrado a importancia do fator neurotrofico deri-

vado do cerebro (BDNF) na abertura e duracao do PC, e consequentemente no desenvol-

vimento do cortex e percepcao visual (Cabelli R. et al, 1996), auditiva (Anomal et al.,

2013) e somatossensorial (O’Leary et al., 1994). A expressao de BDNF e influenciada pela

6

atividade neuronal do perıodo pos-natal, que por sua vez, determina o inıcio do amadure-

cimento do circuito inibitorio cortical (Anomal et al., 2013). No cortex auditivo primario

(A1), a BDNF modula a organizacao do mapa tonotopico, promovendo o chamado de

perıodo crıtico do desenvolvimento espectral de A1 (Anomal et al., 2013). O bloqueio

da expressao de BDNF durante o perıodo crıtico prejudica nao so a especializacao dos

neuronios em A1, como tambem reduz a expressao de receptores gabaergicos nesta regiao

(Anomal et al., 2013).

Por este motivo, consideramos que o desenvolvimento adequado das conexoes talamo-

corticais e cortico-corticais para as areas somatossensorial, visual e auditiva primaria

seria importante para a abertura do PC e o desenvolvimento do mapa topografico nestas

regioes. Assim, o presente trabalho considerou por hipotese que os perıodos crıticos das

areas sensoriais primarias estariam alterados nos TEA, contribuindo para as alteracoes

sensoriais e comportamentais nos indivıduos com autismo.

7

1.3 CORTEX AUDITIVO PRIMARIO (A1)

Ja se tem conhecimento que os neuronios do cortex auditivo projetam para as areas

adjacentes no hemisferio ipsilateral, assim como para as areas corticais auditivas do he-

misferio contralateral (Pandya e Sanides, 1973). Em roedores, as conexoes do cortex

auditivo vem sendo estudadas em esquilos adultos (Sciurus carolinensis), como demons-

trado no trabalho de Luethke e colaboradores (1988) por meio da injecao de WGA-HRP

(aglutinina de germen de trigo conjugada com peroxidase de rabano silvestre) em A1.

Foi-se mostrado que esta area esta conectada reciprocamente com o proprio A1, com

a area Rostrodorsal (R), com a regiao Parieto-Rinal (PR), com a area Parieto-Ventral

(PV), com a regiao Temporal Anterior intermediaria (TAi) e Caudoventral (TAcv), alem

de outras regioes proximas de A1 do mesmo hemisferio. A Figura 1.1 resume o padrao

de conexoes aferentes de A1 em esquilos:

Figura 1.1: Conexoes corticais de A1 no esquilo (Sciurus carolinensis). Uma injecao de WGA-HRP

(grande cırculo preto) foi confinada e centrada em A1, definindo-o arquitetonica e fisiologicamente. As

delimitacoes das areas corticais foram desenhadas de acordo com varias seccoes do cerebro e entao so-

brepostas com a marcacao do neurotracador, para formar uma ilustracao composta. Os pontos maiores

indicam a localizacao dos corpos celulares marcados de forma retrograda, enquanto os pontos menores

representam a marcacao anterogrado. Imagem retirada de ( Imagem retirada de Luethke et al., 1988).

Um estudo feito no primata (Figura 1.2) macaco da noite Aotus trivirgatus, demons-

trou que A1 projeta para as areas ipsilaterais relacionadas ao sistema auditivo, tais como

as areas Rostral (R), ntero-Lateral (AL), Postero-Lateral (PL), Rostro-Medial (RM) e

Caudomedial (CM) (Fitzpatrick e Imig, 1980). No hemisferio contralateral, A1 projeta

para as areas RM, R, e ao proprio A1 (Fitzpatrick e Imig, 1980).

8

Figura 1.2: Visao bidimensional demonstrando a projecao topografica de A1 em macaco da noite (Aotus

trivirgatus). As linhas pretas grossas representam os limites citoarquitetonicos de A1 e R. A regiao

preta se corresponde ao sıtio de injecao de tritiado de Prolina 3H (radioativo). As areas pontilhadas

representam regioes do cortex que recebem projecoes da regiao injetada. As setas indicam a localizacao

dos cortes analisados no animal. Cada mapa e orientado com a parte anterior em baixo e medial a

esquerda. Tamanho das barras representam 5mm. (Imagem retirada de Fitzpatrick e Imig, 1980).

9

1.4 MODELO EXPERIMENTAL

Os modelos animais do TEA tentam reproduzir diferentes caracterısticas do autismo

a partir de alteracoes geneticas (Janusonis et al., 2006) ou ambientais (Schneider e Pr-

zew locki, 2005). Um dos modelos mais utilizados atualmente e o modelo de inducao do

TEA por administracao embrionaria de VPA, padronizado primeiramente por Rodier e co-

laboradores (1996). Este modelo em ratos resulta em alteracoes morfologicas, fisiologicas

e comportamentais similares ao autismo, tais como menor numero de neuronios presentes

nos nucleos motores do nervo craniano, anomalias cerebelares, alteracoes imunologicas,

comportamentos repetitivos, deficits na latencia de resposta evocada eletrofisiologica e na

funcionalidade social-emocional (Rodier et al., 1996; Ingram et al., 2000; Bugalho et al.,

2006; Whishaw et al., 2005). Em testes com animais, a exposicao a esta droga diminui

a sensibilidade a dor, promove hiperatividade locomotora e aumenta o comportamento

repetitivo (Schneider e Przew locki, 2005; Chomiak et al., 2013).

Devido as suas caracterısticas multidimensionais morfologicas, anatomicas, funcionais

e fisiologicas, o modelo de autismo induzido pela administracao embrionaria de VPA em

ratos se torna um interessante modelo para esta pesquisa, a fim de se compreender melhor

a circuitaria neural e o desenvolvimento do PC dos sujeitos com TEA.

10

1.5 JUSTIFICATIVA

No presente trabalho investigamos se a questao neurobiologica de conecctividade sub-

jacente a abertura do PC de A1 nos ratos modelos de autismo induzidos por VPA se

encontra alterada. Considerando que o numero de celulas inibitorias nem sempre estao

comprometidas nesta sındrome (Anomal et al., 2015), sugerimos que outros fatores pode-

riam interferir na abertura e duracao do PC. Por exemplo, o padrao alterado das conexoes

aferentes para A1 poderia ocasionar a diminuicao da expressao da proteına BDNF, atra-

sando a maturacao da circuitaria inibitoria cortical (Anomal et al., 2013) e consequente-

mente a formacao do mapa tonotopico (Anomal et al., 2015). Esta informacao e relevante

para a nossa hipotese, pois o estımulo sensorial influencia o desenvolvimento do mapa

cortical por meio de projecoes aferentes vindas da periferia e do cortex cerebral (Budinger

et al., 2006; Kimura et al., 2003).

Atualmente, as drogas disponıveis para o tratamento do autismo se baseiam em con-

tornar os sintomas disfuncionais com o uso de vitaminas e/ou psicotropicos (Posey e

McDougle, 2001), tais quais: antipsicoticos, ansiolıticos, antidepressivos e estabilizado-

res de humor (Leskovec et al., 2008). Novas hipoteses para a neurobiologia do autismo

ou o aprofundamento do conhecimento das alteracoes ja descritas sao importantes para

a melhor compreensao desta desordem, facilitando o desenvolvimento novas formas de

tratamento (Begum e Sng, 2017) que possam trabalhar melhor os fatores centrais que

desencadeiam esse transtorno. Por exemplo, confirmando a nossa hipotese, seria mais

facil desenvolver farmacos voltados a reabertura do perıodo crıtico do desenvolvimento

pos-natal e criar abordagens terapeuticas que envolvam estimulacao sensorial direcionada

para este transtorno.

11

Capıtulo 2

Hipoteses e Objetivos

2.1 HIPOTESES

Em nossa hipotese, sugerimos que havera alteracoes nas conexoes cortico-corticais

para os cortices sensoriais dos ratos modelo de autismo por administracao embrionaria de

VPA. Estas alteracoes poderiam ser um dos fatores contribuintes para falhas no tempo

de abertura e fechamento do perıodo crıtico dos cortices sensoriais.

2.2 OBJETIVO GERAL

Descrever as alteracoes morfologicas relacionadas a um atraso na abertura e no fecha-

mento do perıodo crıtico do desenvolvimento pos-natal de areas sensoriais primarias do

TEA por meio da caracterizacao do padrao de conexoes aferentes destas areas em ratos

modelos de autismo.

2.3 OBJETIVO ESPECIFICO

Descrever as alteracoes das conexoes cortico-corticais de A1 de ratos modelos de au-

tismo e de ratos controles no primeiro dia pos-natal (P0.5).

12

Capıtulo 3

Materiais e Metodos

3.1 INDUCAO AO VPA

O presente trabalho foi aprovado pelo Comite de Etica da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (Protocolo 076/2017). Foi realizado por meio de um estudo experimental

do tipo caso-controle.

Primeiramente, o ciclo estral das ratas femeas foi acompanhado por 5 dias, para iden-

tificacao do estagio do ciclo que ela se encontrava atraves do esfregaco vaginal. Ao iden-

tificarmos o estagio de proestro, as femeas foram colocadas junto a um rato macho na

mesma caixa. O dia em que foram encontrados espermatozoides no esfregaco foi definido

como provavel dia de fecundacao [dia embrionario zero (E 0.5)]. Apos 12 dias, no 12o

dia do perıodo embrionario (E 12.5), foi realizada uma unica injecao intraperitoneal de

500 mg/kg de VPA (concentracao de 250 mg/ml) em uma rata matriz do grupo caso e,

uma injecao de 500 mg/kg de salina a 0,9% na rata matriz do grupo controle. Sendo

entao utilizadas duas ratas femeas no total para os propositos deste trabalho, cada uma

servindo para um grupo de analise. Apos o fim do perıodo gestacional, foram obtidas

duas proles: a prole VPA, a qual nasceram 9 ratos, e a prole controle, a qual nasceram 3

ratos, as quais compunham, respectivamente, o grupo caso e o grupo controle. As femeas

gravidas foram mantidas em caixas separadas no bioterio apos o momento analisado da

fecundacao ate o parto, considerado dia pos-natal 0 (P 0.5).

13

3.2 EUTANASIA, PERFUSAO E

DISSECACAO CORTICAL

No dia P 0.5 (dia do nascimento), os filhotes foram separados da progenitora e re-

ceberam uma injecao anestesica de Tiopental (via i.p.), em dose de 100 mL/kg, sendo

verificados os sinais de inducao anestesica por meio do reflexo doloroso na cauda. Apos

isso, os animais foram perfundidos com 300 ml de solucao salina, seguido de 300 ml de

solucao de Paraformaldeıdo 4%. Depois da dissecacao do encefalo, o restante do corpo do

animal foi descartado respeitando as normas da CEUA.

3.3 INJECAO DO NEUROTRACADOR

As injecoes para analise das conexoes foram efetuadas com neurotracador fluorescente

retrogrado. Tracadores retrogrados sao captados pelos axonios e transportados para o

corpo celular que entao pode transmitir a projecao. A injecao deste tipo de tracador per-

mite identificar a localizacao de neuronios que projetam para a area injetada (aferencias).

Nos animais dos grupos caso e controle (P 0.5), a injecao do neurotracador foi feita

por meio da introducao de cristal de DiI post-mortem a 500 micrometros de profundidade

a partir da superfıcie pial (Molecular Probes, Eugene, OR). Este neurotracador e uma

carbocianina com pouco efeito em encefalo maduros, que tem uma taxa de transporte

post-mortem de 2 mm por mes em temperatura ambiente (Vercelli et al., 2000).

O encefalo desses animais foi retirado do cranio e armazenado para fixacao por uma

semana em solucao de paraformaldeıdo 4% em tampao de PO4 (pH 7,4) (Azevedo et

al., 1997). Os cristais de DiI foram inseridos de acordo com a area de interesse e por

meio de coordenadas estereotaxicas do “Atlas of the Developing Rat Nervous System”

(Paxinos et al., 1994). Em seguida, foram mantidos no mesmo fixador em temperatura

ambiente por 4 a 6 meses (Azevedo et al., 1997). A microtomia foi realizada por meio de

um vibratomo Leica VT1000 S, com os encefalos emblocados por agarose 3%, cortando-se

seccoes coronais de 100-200 micrometros. Todas as seccoes foram imersas em uma solucao

de 4’6-diamidina-2-fenilindol (DAPI) a 0.1 Molar para a caracterizacao arquitetonica das

camadas corticais e areas cerebrais.

14

3.4 ANALISE DAS CONEXOES CORTICAIS E

SUBCORTICAIS

Cortes coronais alternados do encefalo, exceto tronco encefalico e cerebelo, foram mon-

tados para fluorescencia e DAPI. Em seguida, foram analisados em um microscopio (Nikon

C-HGFI) dotado de uma fonte de epifluorescencia e filtros adequados para a observacao

dos sıtios de injecao e das celulas marcadas retrogradamente pelo tracador. Foram realiza-

das fotomicrografias de todos os cortes marcados por DiI usando o software NIS-Elements

AR 64-bit. As imagens foram obtidas a partir das objetivas de 2x, 4x e 10x.

Apos a microfotografia das celulas fluorescentes e da arquitetura cortical por DAPI,

a posicao das celulas marcadas retrogradamente no cortex foram plotadas por meio do

programa CANVAS 12 (ACDsee) de forma qualitativa pelas alunas de iniciacao cientıfica

e posteriormente analisadas pela orientadora. Adicionalmente, neste programa foram

demarcados digitalmente o contorno dos cortes e sıtios de injecao observados.

15

Capıtulo 4

Resultados e Discussao

Ate o momento foram processados e analisados tres animais modelos de autismo inje-

tados com DiI, (caso 2 a 4). Todos os animais analisados ate o momento possuem VPA,

nao tendo portanto, um animal controle. Dois animais VPA tiveram DiI introduzido em

A1, no hemisferio esquerdo (caso 2) e no hemisferio direito (caso 3). Em um animal VPA,

o DiI foi introduzido no hemisferio direito somatossensorial (caso 4).

Para as marcacoes de corpos de neuronios marcados retrogradamente pelo cristal de

DiI, utilizamos as delimitacoes ja conhecidas na literatura sobre o formato caracterıstico

triangular de seu corpo, fazendo uma classificacao qualitativa, como mostrado abaixo

(Figura 4.1) e segundo trabalho proposto por Vercelli e colaboradores (2000).

Figura 4.1: Esquema de como as marcacoes de neuronios foram feitas em ampliacao. A: Imagem sem

ampliacao, mostrando a localizacao de onde se retirou as imagens B e C: Amostragem de corpos de

neuronios com (B) e sem (C) as marcacoes. As setas indicam a localizacao dos corpos celulares. O tra-

cejado azul indica marcacoes anterogradas feitas pelo cristal de DiI e que nao serao analisadas. Aumento

de 10x em todas as imagens.

No Caso 2, com injecao no hemisferio esquerdo de A1 (Figura 4.2), foi possıvel ob-

servar as areas corticais contendo celulas retrogradamente marcadas no Cortex cingulado

16

(Cg) no Cortex Frontal (Fr), um pouco na Area Anterior do Cortex (FL), e principalmente

na Area 1 do Cortex Parietal (Par1) e no Cortex Insular (Ins) em ambos os hemisferios

(Figura 4.3: A, B, C, D e E). Para verificarmos que os sıtios de injecao se encontra-

vam devidamente no Cortex Auditivo, comparamos as regioes Pos-natais com as regioes

encontradas em adultos. Conseguimos averiguar com isso que, na Figura 4, o sıtio de

injecao se encontra onde seria o Cortex Auditivo Primario (Au1), e um pouco do Cortex

Auditivo Secundario dorsal (AuD).

Figura 4.2: Sıtio de injecao de cristal de DiI em caso 2. A esquerda mostra sıtio de injecao em filtro de

Fluoresceına. A direita sıtio de injecao em filtro de Rodamina. O corte se assemelha a aproximadamente

a imagem P0-34 da segunda edicao de “Atlas do Desenvolvimento do Sistema Nervoso de Ratos” de

Paxinos et al. (1994), e a figura 84 da sexta edicao de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de

Paxinos e Watson (2007), fazendo uma ligacao ao cerebro adulto. Aumento de 10x em ambas as imagens.

Figura 4.3: Corte coronal de caso 2. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI mostrando as

demarcacoes do cortex. Se assemelha a aproximadamente a imagem P0-12 da segunda edicao de “Atlas

do Desenvolvimento do Sistema Nervoso de Ratos” de Paxinos et al. (1994). B e C: Os cortes de

cima revelam marcacoes feitas do hemisferio direito. D e E: Marcacoes feitas do hemisferio esquerdo.

O pontilhado verde representa marcacoes de corpos de neuronios e os tracos azuis indicam axonios que

foram marcados anterogradamente. Aumento de 2x em A e de 10x em B-E.

17

No Caso 3, a injecao do cristal de DiI foi feita em A1, no hemisferio direito (Figura

4.4). Como resultado das analises, foram observadas celulas nas areas corticais Frontal

(Fr), na Placa Cortical (CxP), e da Area 1 do Cortex Parietal (Par1) nos dois hemisferios

(Figura 4.5: A, B, C, D, E). Na Figura 4.4, o sıtio de injecao se encontra proximo do

que seria o Au1, Cortex Auditivo Secundario Ventral (AuV) e tambem o Cortex Entorrinal

(Ect).

Figura 4.4: Sıtio de injecao de cristal de DiI em caso 3. A esquerda mostra sıtio de injecao em filtro de

Fluoresceına. A direita e o sıtio de injecao em filtro de Rodamina. O corte se assemelha a aproximada-

mente a imagem P0-31 da segunda edicao de “Atlas do Desenvolvimento do Sistema Nervoso de Ratos”

de Paxinos et al. (1994), e a figura 65 da sexta edicao de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”

de Paxinos e Watson (2007), fazendo uma ligacao ao cerebro adulto . Aumento de 10x em ambas as

imagens.

18







No Caso 4, a injecao do cristal de DiI foi feita em S1, no hemisferio direito. Como

resultado das analises, foi possıvel observar celulas nas areas corticais Fr, no Cortex Agra-

nular Insular (AI), na Placa Cortical (CxP) e na Par1 em ambos os hemisferios (Fig 4.6:

A, B, C, D e Fig 4.7: A, B, C, D, E).







19







Essas marcacoes, feitas no presente trabalho, indicam que o neutrocador foi transpor-

tado da sua area de injecao ate as areas acima citadas, e que no nascimento, A1 e S1 ja

recebem projecoes de diversas areas corticais, muitas delas presentes em ratos adultos. A

partir de estudos sobre as aferencias talamicas do cortex somatossensorial feito por Jo-

nes (1981) e Erzurumlu e Jhaveri (1990), ja sao observaveis um padrao de neuronios nos

ultimos dias embrionarios e primeiros dias pos-natal, demonstrando certo desenvolvimento

ja presente nesses cortices.

Como ja citado anteriormente, o diagnostico clınico dos TEA e promovido em criancas

a partir dos 4 anos de idade e permanecendo no indivıduo adulto. Sendo nossas analises

promovidas em modelos animais recem nascidos (P0.5), fizemos aqui a comparacao com

as areas encefalicas presentes nos adultos para que, dessa comparacao, possamos verificar

se ha alguma anomalia ja presente na circuitaria primaria destes animais.

No caso 2, fizemos a comparacao do corte apresentado (Figura 4.3) com a figura

14 da sexta edicao de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson

(2007). No corte as areas apresentadas como o Cortex cingulado (Cg), Cortex Frontal

(Fr), a Area Anterior do Cortex (FL), e a Area 1 do Cortex Parietal (Par1) e o Cortex

Insular (Ins). No adulto sao denominadas como a Area 1 do Cortex Cingulado (Cg1), o

Cortex Motor Secundario (M2), o Cortex Motor primario (M1), a Area Somatossensorial

Primaria (S1ULp), Cortex Agranular Insular (GI), Cortex Insular Desgranular (DI), e o

Cortex Insular Agranular Dorsal (AID) e ventral (AIV), respectivamente. Aparenta-se

com isto que, no neonato, o Par1 se desenvolve em S1ULp e a Insula em GI, DI, AID e

20

AIV nessa regiao encefalica analisada.

No caso 3, fizemos a comparacao do corte apresentado (Figura 4.5) com a figura 13 da

sexta edicao de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007).

No corte as areas apresentadas como o Cortex Frontal (Fr), a Placa Cortical (CxP), e

a Area 1 do Cortex Parietal (Par1). No adulto sao denominadas como Cortex Motor

Secundario (M2), o Cortex Motor primario (M1), as Areas Somatossensoriais Primaria

(S1FL), (S1DZ) e (S1J), respectivamente. Aparenta-se com isto que, no neonato, o Par1

se desenvolve em S1FL, S1DZ e S1 nessa regiao encefalica.

No caso 4, fizemos a comparacao do corte (Figura 4.6) apresentado com a figura 6 da

sexta edicao de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007).

No corte as areas apresentadas como Fr (Fig. 4.6: B e C), e Cortex Agranular Insular

(AI) (Fig. 4.6: D). No adulto sao denominadas como o Cortex Motor Secundario (M2)

e o Cortex Orbital Dorsolateral (DLO), respectivamente. Aparenta-se com isto que, no

neonato, o Fr se desenvolve em M2 e o AI em DLO nessa regiao encefalica.

Ainda no caso 4, fizemos a comparacao do corte (Figura 4.7) apresentado com a

figura 15 da sexta edicao de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e

Watson (2007). No corte as areas apresentadas como CxP, Par1 e Ins. No adulto sao

denominadas como (S1FL), (S1DZ), (S1J), (S1DZO), S1ULp, e Cortex Agranular Insular

(GI), Cortex Insular Desgranular (DI), e o Cortex Agranular Dorsal (AID) e ventral

(AIV), respectivamente. Aparenta-se com isto que, no neonato,a CxP se desenvolve nas

Areas Somatossensoriais primarias S1FL e S1DZ, o Par1 se desenvolve em nas Areas

Somatossensoriais primarias S1J, S1DZO e S1ULp e a Insula em GI, DI, AID e AIV.

E importante ressaltar que se foi utilizado as analises do Cortex Somatossensorial neste

trabalho por ja ser uma area muito bem conceituada na literatura, e tivemos o intuito de

analisar, com isso, se as projecoes estimadas possuem certo grau de confiabilidade.

A exposicao ao VPA no embriao causa mudancas e prejuızos a longo prazo na tra-

jetoria do neurodesenvolvimento do indivıduo, como ja mencionado anteriormente. Par-

ticularmente, um estudo in vivo em camundongos mostrou coloracao de Nissl reduzida

em neuronios corticais e reducao da neurogenese em cortex pre-frontal e somatossenso-

rial apos exposicao in vivo ao VPA (500 mg / kg i.p.) em E12.5 (Kataoka et al., 2011).

Essas mudancas pos-natais provindas da neurogenese foram associadas com um possıvel

aumento da apoptose e reducao da proliferacao celular em celulas embrionarias (Kataoka

et al., 2011).

Rodier e colaboradores (1996) fizeram um trabalho comparando caracterısticas neu-

roanatomicas de ratos expostos a VPA e cerebros humanos de autistas post-mortem, e

conclui que o impacto do VPA estava relacionado com o tempo de fechamento do tubo

neural. Algumas anormalidade anatomicas incluem mudancas na densidade e numero de

21

neuronios em varias regioes do cerebro (Frisch et al., 2009).

Como em nosso trabalho observamos as conexoes cortico-corticais no neo-cortex, e im-

portante estabelecer que a exposicao ao VPA altera a morfologia e os circuitos neurais de

uma maneira complexa: a excitabilidade neural e alterada (Anomal et al., 2015), existem

mudancas pre e pos-sinapticas sugeridas pelos dados de estudos anteriores, entre outros. E

difıcil identificar, contudo, quais alteracoes sao primarias e quais sao secundarias. Nessas

alteracoes, alguns trabalhos apontam aumento da complexidade de arborizacao dendrıtica

no cortex motor, alem do aumento da conectividade com celulas vizinhas nos cortex soma-

tossensorial e pre-frontal medial. Em ambos os casos, o aumento do numero de conexoes

acompanha a diminuicao da forca dessas conexoes e pode sustentar uma hiperreatividade

da circuitaria (Rinaldi et al., 2008a, 2008b).

Em nosso estudo, apesar dos resultados ainda iniciais, observamos diversas conexoes

cortico-corticais por meio da marcacao do DiI, as quais se ve necessario a adicao da

analise do grupo controle e mais analises de animais de ambos os grupos para determinar

se existem, de fato, alteracoes nas conexoes e como elas afetam no fenotipo do indivıduo

autista. No entanto, conseguimos observar que diversas areas cerebrais se comunicam

com o cortices auditivos primario, como a regiao frontal, motora e ınsula. Sendo verifi-

cado, com isto, apenas as projecoes cortico-corticais para o A1 e S1, e nao suas possıveis

alteracoes. Tal como Rinaldi e colaboradores (2008b), demonstraram em seu estudos ci-

tados anteriormente e que podem ser os causadores das respostas exacerbadas do sujeito

enquadrado nos TEA.

22

Capıtulo 5

Conclusao

Ao longo do tempo, diversas anormalidades vem sendo descritas em decorrencia do uso

do VPA no perıodo embrionario. Recentemente, um interesse maior vem se direcionando

para a inducao do TEA em indivıduos expostos a este medicamento durante a gestacao.

Esses efeitos sofrem influencia da dose, sexo, data de inducao e da frequencia de exposicao,

ate onde se tem dados.

Em nosso estudo usamos a dose de 500 mg/kg, que e suficiente para induzir o quadro

do autismo em modelos animais, e observamos projecoes corticais similares tanto para o

cortex auditivo primario (A1) quanto para o somatossensorial primario (S1) durante as

analises.

Concluımos que nao existe especificidade nas conexoes cortico-corticais aferentes para

o A1 no dia do nascimento, mas que a hipotese inicial nao pode vir a ser corroborada por

nao ter entrado, no presente trabalho, os dados referentes a analise do grupo controle. O

impacto deste trabalho esta em poder demonstrar os procedimentos feitos e as fotografias

analisadas em cortices de possıvel A1 e S1 de ratos modelos de autismo logo apos o

nascimento, feito que nao ha muito conhecimento na literatura atual. No entanto, nossos

resultados se demonstram inconclusivos, pois os dados ainda estao em processo de analise,

no sentido de aumentar a amostra e incluir mais animais do grupo controle, e obter assim

mais respostas a pergunta deste trabalho.

23

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