proizvodnja amilaz -...

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNI�KA FAKULTETA �IVILSKA TEHNOLOGIJA

PROIZVODNJA AMILAZ

Judita KOVAČ, Silva KRANJC, Barbara LENARČIČ, An�e LENČEK

(�tudentje tretjega letnika �tudija �ivilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Pa� (mentorja)

Ljubljana, 2001 *Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Proizvodnja amilaz, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2001 2

POVZETEK Encimi so med najpomembnej�imi produkti mikrobiolo�kega izvora, ki se uporabljajo za potrebe člove�tva. Igrajo pomembno vlogo v različnih biotehnolo�kih produktih in procesih v �ivilski industriji. Amilolitični encimi so ena večjih skupin hidrolaz. Katalizirajo razgradnjo velikih biopolimerov glukoze v manj�e enote. Encimske metode so nadomestile �e nekatere pomembne konvencionalne kemijske metode. Tak primer predstavlja kislinska hidroliza �kroba, ki jo je skoraj povsem nadomestila encimska metoda. Tradicionalne rastlinske in �ivalske amilolitične encime, ki se uporabljajo v �ivilstvu so povečini nadomestili encimi mikrobnega izvora, ker je pridobivanje le teh iz ekonomskega vidika ugodnej�e. SUMMARY Enzymes are among the most important products obtained for human needs through microbial sources. Enzymes play important roles in various biotechnology products and processes in food industry. Amilolytic enzymes are a larger group of hidrolytic enzymes, which catalyze the breakdown of larger biopolymers in smaller units. Enzymatic methods have alredy replaced some conventional chemical processes. Such example can be acid hidrolyse of starch, which was almost completely replaced by enzyme hidrolyse. Microbial enzymes have largely replaced the tradicional plant and animal amilolytic enzymes used in food industry, because this source is favourable from economic view.


KAZALO 1. Uvod........................................................................................................................................4 1.1. Amilolitični encimi � pregled..............................................................................................4 1.2. �krob....................................................................................................................................4 1.2.1. Zgradba �kroba..................................................................................................................4 1.2.2. Pomembne karakteristike �kroba......................................................................................5 2. Zgodovina bioprocesa...........................................................................................................5 2.1. Čas pred na�im �tetjem........................................................................................................5 2.2. Razvoj �krobne industrije v 18. stoletju s kislinsko hidrolizo.............................................5 2.3. Uporaba prvih encimov v 19. stoletju..................................................................................5 2.4. 60' leta..................................................................................................................................6 3. Mikrobiolo�ke osnove bioprocesa........................................................................................6 3.1. Mikrobiolo�ki viri amilolitičnih encimov............................................................................6 3.1.1. Amilaze bakterijskega izvora............................................................................................7 3.1.2. Najpomembnej�i rodovi gliv.............................................................................................8 3.1.2.1. Rod Aspergillus..............................................................................................................8 3.1.2.2. Rod Rhizopus.................................................................................................................8 3.1.3. Najpomembnej�i rodovi kvasovk......................................................................................8 3.1.3.1. Rod Saccharomyces.......................................................................................................9 4. Biokemijske osnove bioprocesa............................................................................................9 4.1. Specifičnost encimov...........................................................................................................9 4.2. Aktivnost in stabilnosti encimov..........................................................................................9 4.2.1. Optimalni pogoji stabilnosti..............................................................................................9 4.2.2. Optimalni pogoji aktivnosti............................................................................................10 4.2.3. Vpliv aktivatorjev na produkcijo α-amilaz med fermentacijo na trdnem substratu.......10 4.2.3.1. Fermentacija na trdnem substratu................................................................................10 4.2.3.2. Povr�inski aktivatorji...................................................................................................11 4.2.3.3. Uporabljen material in metode.....................................................................................11 4.2.3.4. Bioaktivatorji...............................................................................................................13 4.3. Konverzija �kroba do glukoze............................................................................................13 4.4. Osnove industrijske encimologije......................................................................................17 4.4.1. Delitev encimov..............................................................................................................17 4.5. Delitev najpomembnej�ih industrijskih amilolitičnih encimov....��.....17 4.5.1. α-Amilaze.......................................................................................................................17 4.5.2. β-Amilaze........................................................................................................................17 4.5.3. Glukoamilaze..................................................................................................................18 4.5.4. Pululanaze.......................................................................................................................18 5. Bioin�enirske osnove bioprocesa.......................................................................................18 5.1. Uvod...................................................................................................................................18 5.2. Izolacija encimov...............................................................................................................19 5.2.1. Ekstrakcija encimov........................................................................................................20 5.2.1.1. Encimske metode.........................................................................................................20 5.2.1.2. Kemijske metode..........................................................................................................20 5.2.1.3. Fizikalne metode..........................................................................................................20


5.2.1.4. Ekstrakcijski mediji......................................................................................................20 5.2.2. Začetne separacije...........................................................................................................20 5.2.2.1. Centrifugiranje.............................................................................................................20 5.2.2.2. Filtriranje......................................................................................................................21 5.2.3. Či�čenje encimov............................................................................................................21 5.2.3.1. Separacija beljakovin na osnovi različne topnosti.......................................................21 5.2.3.2. Či�čenje z kromatografskimi metodami......................................................................21 5.2.4. Koncentriranje encimov..................................................................................................22 5.2.4.1. Ultrafiltracija................................................................................................................22 5.2.4.2. Liofilizacija..................................................................................................................22 5.2.4.3. Su�enje z razpr�evanjem..............................................................................................22 5.2.5. Kontrola izolacijskega postopka.....................................................................................22 5.3. Oblikovanje in kontrola kvalitete končnega produkta.......................................................22 5.3.1. Elektroforezne metode....................................................................................................23 5.3.1.1. Elektroforeza v prisotnosti Na-dodecil sulfata (SDS) .................................................23 5.3.1.2. Izoelektrično fokusiranje..............................................................................................23 5.3.2. Imobilizirani encimi........................................................................................................23 5.3.2.1. Imobilizacijske tehnike................................................................................................23 6. Ekolo�ki vidik bioprocesa...................................................................................................24 7. Uporaba bioproizvodov v proizvodnji hrane...................................................................24 7.1. Uvod...................................................................................................................................24 7.2. Maltodestrini in koruzni sirupi...........................................................................................24 7.3. Oligosaharidi......................................................................................................................25 7.4. Sladila.................................................................................................................................25 7.4.1. Dekstrozni sirupi.............................................................................................................26 7.4.2. Maltozni sirupi................................................................................................................26 7.4.3. Visoko fruktozni koruzni sirupi......................................................................................28 7.4.4. Ciklodekstrini..................................................................................................................30 7.5. Povzetek.............................................................................................................................32 8. Reference..............................................................................................................................33


1. UVOD Biokemijske spremembe med procesi biolo�ke obogatitve substratov so eden glavnih predmetov raziskav strokovnjakov. Področje �ivilstva je glede na zahtevnost potro�nikov �e posebej izpostavljeno vedno novim trendom in zahtevam potro�nikov po raznoliki in kvalitetni prehrani. 1.1. Amilolitični encimi - pregled Ekstenzivno se amilolitični encimi uporabljajo v �krobni industriji, pivovarstvu, pekarski in tekstilni industriji. Njihova �iroka uporabnost te encime uvr�ča med glavne encimske preparate na tr�i�ču. Velika pestrost v kemijski zgradbi ogljikovih hidratov je paralelna z velikim �tevilom encimov, ki so v uporabi za njihovo hidrolizo. Amilaze so del velike skupine encimov »O-glikozilhidrolaze« (EC 3.2.1.) in hidrolizirajo �krob in podobne α-glukane, kot so pululan in glikogen. α-glukani so med najbolj zastopanimi ogljikovimi hidrati na Zemlji in so pomemben vir energije za ljudi, �ivali, vi�je rastline in mikroorganizme. Amilaze so zato vpleteni v �irok spekter biolo�kih procesov. Po nomenklaturi spadajo k hidrolazam, ki katalizirajo hidrolizo C-N, C-O, C-C in drugih kovalentnih vezi. Eden izmed dveh pomembnej�ih procesov utekočinjanja, v katerem �krobna zrnca dispergirajo ali �elirajo v vodni raztopini in potem delno hidrolizirajo ob delovanju α-amilaz. Drugi proces je saharifikacija, v katerem je substrat z encimi konvertiran v saharide z nizko molekulsko maso. 1.2. �krob Glaven substrat amilolitičnih encimov je �krob, ki je za celulozo glaven ogljikohidrat v rastlinah. Sintetizira se s pomočjo sončne energije v reakcijah fotosinteze. Ta polisaharid je hitro prebavljiv in predstavlja največji dele� vnosa energije v člove�ki prehrani. Najpomembnej�i vire �kroba predstavljajo �itna zrna (vsebujejo od 40 do 90% njihove suhe te�e), stročnice (30 do 70%), gomoljnice (65 do 85%). Skupna svetovna produkcija �kroba je ekstrahirana v glavnem iz koruze (ZDA), krompirja in �it (p�enica, ri�). Veliko �tudij pa je bilo opravljenih tudi na področju izkori�čanja alternativnih virov �kroba: divji ri�, kasava, triticale, amaranth...Visok odstotek pridelanega �kroba gre v prehrambene namene. �krobi nasplo�no izbolj�ajo funkcionalne lastnosti prehrambenih produktov in zagotavljajo vir �tevilnih oligo-, di- in mono-saharidov (Guzman in Lopez,1995) Nekoč so �krob hidrolizirali z mineralnimi kislinami, vendar je biotehnolo�ka uporaba encimov vodila do uporabe amilolitičnih encimov, kot nadomestilo za kemikalije v pridobivanju različnih glukoznih in na glukozi osnovanih produktov. 1.2.1. Zgradba �kroba �krob je sestavljen iz linearnega polimera amiloze in razvejanega polimera amilopektina. Razmerje teh dveh komponent ni enako pri vseh vrstah rastlin.


Amiloza je enostavnej�a komponenta, sestavljena iz glukopiranoznih oz. α-D-glukoznih enot, povezanih z α-D-1,4-vezmi. Amiloza je topna v vroči vodi, pri testu z jodovico, pa daje modro barvo. Molekule amiloze vsebujejo od 200 do 500 glukoznih enot na verigo. Zadnje ugotovitve ka�ejo, da je tudi amiloza deloma razvejan polimer, vendar v takem obsegu, da lastnosti ne odstopajo od linearnosti. Amilopektin v vodi nabrekne in če ga grejemo, formira �krobno pasto (pastozno zmes). Z jodovico daje vijolično-rjavo obarvanje. Tudi amilopektin je poli-α-1,4-D-glukozna molekula (amiloza, glikogen), vendar je razvejan na 1,6 mestih na vsakih 25 glukoznih enot (pribli�no). Poleg tega vsebuje amilopektin �e fosfatne ostanke in magnezijeve in kalcijeve ione. Razvejanost �kroba (�tevilo glukoznih enot v verigi in druge lastnosti) je različna pri različnih virih �kroba (koruza, p�enica, krompir...). 1.2.2. Pomembne karakteristike �kroba �krob uporabljamo v �ivilstvu z namenom, da bi vplival na teksturo in konsistenco �ivil. V glavnem gre za vezavo vode, za zgo�čevanje, za tvorbo gostih past oz. gelov. Vendar ima �krob v nativni obliki omejeno uporabo v �ivilstvu, zaradi te�ke prebavljivosti; zato so bolj uporabni derivatizirani in modificirani �krobi.Pri derivatizaciji se izbolj�ajo funkcionalne lastnosti �kroba; poveča se bistrost raztopin in gelov, vezavo vode, stabilnost pri zmrzovanju in tajanju, zmanj�a se tendenca kristalizacije, zni�a temperaturo �eliranja. 2. ZGODOVINA PROCESA 2.1. Čas pred na�im �tetjem Encimi so produkti �ivih celic, ki ob ugodnih pogojih za delovanje, delujejo tudi neodvisno od celice. Katalizirajo encimske reakcije, v katerih nastopajo posamezno ali kot integralni del rastlinske, �ivalske ali mikrobne celice. Komercialna proizvodnja in uporaba encimov se je začela uporabljati relativno pozno. Nasploh pa je človek �e zelo zgodaj uporabljal določene rastlinske encime. Tako je bil slad uporabljen �e 1000 let pr. n. �t. na Kitajskem. Kitajci so slad poimenovali »Hung Fan«, kar pomeni sladkost �ita. Omeniti je treba, da je bil prvi priznan biokatalizator prav encim, ki je sposoben katalizirati �krob. 2.2. Razvoj �krobne industrije v 18. stoletju s kislinsko hidrolizo Razvoj �krobne industrije (Wet-milling), lahko zasledimo �e v 18. Stoletju, v času Napoleona. Zaradi njegove blokade kontinenta, se je Evropa zna�la brez tradicionalnih virov sladkorja. Zato so razpisali nagrado za metodo, katere produkt bi postal ustrezen nadomestek sladkorju. Med ukvarjanjem s tem problemom, je nem�ki kemik Kirchoff odkril, da �krob kuhan v kislini lahko potem nevtraliziramo in konvertiramo v sladkor. Slabost te metode je tvorba neza�eljenih stranskih produktov, barve in relativno visoka vsebnost soli. Vse te na�tete so posledice kislinske hidrolize, zato encimi dandanes učinkovito dopolnjujejo ta proces.


2.3. Uporaba prvih encimov v 19. stoletju Leta 1833 je bil Francoz Payen uspe�en pri izolaciji aktivnih komponent v sladu. Poimenoval jih je diastaze. Takamine je leta 1894 razvil zamisel o uporabi me�anice encimov, pridobljene iz Aspergillus oryzae, kot pomoč v prebavi azijske populacije, ki je imela te�ave z prebavo ri�a (�kroba). Tako je bilo odkrito, da A. oryzae proizvaja zmes amilaz. Identifikacija in uporaba teh encimov je omogočila uporabo teh sirupov, brez kislin. 2.3. 60' leta Prva večja re�itev, ki je je bila vesela predvsem industrija je pri�la v sredini 1960-ih, z razvojem amiloglukozidaz, ki so omogočile popolno hidrolizo �kroba v glukozo. Dokler ni bila leta 1973 predstavljena visoko termostabilna bakterijska amilaza iz Bacillus licheniformis, ni bil dose�en čist hidrolizat. Uporaba tega encima je omogočila proizvodnjo 98% glukoznega sirupa, ki je idealen substrat za glukoza izomerazo, ki konvertira glukozo do fruktoze. 3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA 3.1. Mikrobiolo�ki viri amilolitičnih encimov Amilolitične encime proizvajajo različne glive, kvasovke, bakterije (vključno z aktinomicetami) in arheje (tabela 1). Večina amilolitičnih mikrobov producira utekočinjajoče, ekstracelularne encime in utekočinjujoče, intracelularne encime (tipične α-glukozidaze).


Tabela 1: Selekcionirani mikrobni viri amilolitičnih encimov (Encyclopedia of Microbiology, 2000)

ENCIM MIKROBIOLO�KI VIR αααα-Amilaza Alteromonas haloplanctis Aspergillus oryzae Bacillus licheniformis Pyrococcus furiosus Saccharomycopsis fibuligera Streotomyces hygroscopicus Thermococcus profundus ββββ-amilaza Aspergillus oryzae Bacillus circulans Clostridium thermocellum Saccharomyces cerevisiae Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes Glukoamilaza Aspergillus awamori Rhizopus niveus Saccharomyces diastaticus Pululanaza Bacillus flavocaldarius Klebisiella pneumoniae Neopululanaza Bacillus stearothermophylus Amilopululalaza Thermoanaerobacter ethanolicus 39E Pyrococcus furiosus Bacillus sp. KSM-1378 Izoamilaza Pseudomonas amyloderamosa CGT-aza Bacillus circulans Klebsiella pneumoniae Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes

EM1 CD-aza Bacillus coagulans Theroanaerobacter ethanolicus 39E Mikroorganizmi posedujejo prete�no α-amilaze. Najbogatej�e z njimi so vrste iz rodov Clostridium (Cl. acetobutylicum), Bacillus (B. macerans) in Aspergillus. 3.1.1. Amilaze bakterijskega izvora � rod Bacillus Večina bakterijskih amilosaharidaz je poznanih pri Gram+ bakterijah. Amilaze proizvajajo vrste Bacillus (B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. licheniformis, B. circulans in B. subtilis). Bacillus vrste producirajo tudi CGT-aze, β-amilaze, pululanaze. Eno izmed najbolj termostabilnih α-amilaz so izolirali iz mezofila B. licheniformis,ki normalno funkcionira pri temperaturah nad 60°C. Najbolj termostabilne amilosaharidaze. Bacillus je najpomembnej�i rod bakterij, ki proizvaja amilolitične encime. Mikroorganizmi tega rodu so aerobi ali fakultativni anaerobi.


Delijo jih na: - mezofilne; - termofilne. Mezofilne vrste so Gram-pozitivne palčke, različnih dol�in in so gibljive. Kolonije so ponavadi nepigmentirane so pa tudi izjeme (npr. B. subtilis tvori rjave (var.atterimus) ali črne (var. niger) kolonije. Najbolje rastejo pri pH 6-8; optimalna temperatura je 30-37°C (nekatere vrste pa tudi pri vi�jih temperaturah). �krob hidrolizirata B. polymixa in B. macerans. Termofilne vrste so sporogene Gram-pozitivne palčke; optimalna temperatura rasti je 45-65°C. Tipičen predstavnik te skupine je Bacillus stearothermophilus. V naravi so Bacillusi zelo raz�irjeni. Najpogosteje se nahajajo v zemlji, zato jih najdemo na/v rastlinah. Pogosto se nahajajo tudi na povr�ini ko�e �ivali. Nekatere vrste niso patogene za ljudi in �ivali, izzovejo pa lahko nepriljubljene spremembe na konzervah (bomba�e), kar je posledica termorezistentnosti njihovih spor. - Bacillus coagulans: oblika: palčke; aerob/fakultativni anaerob; večinoma gibljivi in Gram+, nekateri pa so negibljivi in Gram variabilni. Optimalna T je od 33-45°C, maksimalna pa od 55-60°C. Kolonije na agarju so majhne okrogle. Izoliran je bil iz mleka v prahu in iz paradi�nikovega soka. Hidrolizira �krob (Radojčevič, 1971). - Bacillus stearothermophilus je po morfolo�kih značilnostih podoben zgornjemu; raste na T od 50-65°C, nekateri sevi tudi nad 70°C. 3.1.2. Najpomembnej�i rodovi gliv 3.1.2.1 Rod Aspergillus Rod Aspergillus tvori lepo razvit vegetativni micelij, iz katerega izra�čajo konidiofore. Povr�ina kolonij, zraslih na agarju, daje �ametast izgled. Konidiofore oblikujejo koncentrične kroge. Micelij je bledorumene do rjave barve. Konidiofore izra�čajo iz substratnih hif, mesto izra�čanja (food cell) je pomembno pri determinaciji vrst. Konidiofora se konča z veziklom (apex), ki skupaj s sterigmami (phialides) in konidiosporami tvori konidialno glavico, le-to pa lahko opazimo makroskopsko. Sterigme lahko iz vezikla izra�čajo v eni smeri (komularno), ali sferično na vse strani. Izra�čanje je lahko: - v enem sloju; primarne sterigme (metulae) - v dveh slojih; sekundarne sterigme (phialides) Sekundarne sterigme so ponavadi dalj�e in tanj�e in se radialno nadaljujejo v konidiospore. Posamezne vrste rodov tvorijo tudi spolne oblike spor (cleistothecia). Osnovne identifikacijske razlike med 120 poznanimi vrstami so oblika in barva hif in konidialnih glavic ter omenjene značilnosti sterigme (Kovač 1997). - Aspergillus oryzae:Izredna produkcija ekstracelularnih encimov, nezahtevnost pogojev rasti ter visoka kakovost proteinov daje prednost uporabi Aspergillus oryzae za produkcijo biomase v primerjavi z drugimi plesnimi. V sedmih dneh kultivacije na agarju po Czapeku pri 25°C dose�ejo konidije premer 4-5 cm. Na 4-5 mm dolgih konidioforah zrastejo konidialne glavice, ki so sprva rumenozelene, nato


pa rjave barve. Rjavkaste konidiofore se končujejo z okroglimi vezikli premera 40-80µm. Sterigme so podolgovate primarne, velikosti 10-15 x 3.5 µm in elipsaste sekundarne, velikosti 8-12 x 4-5 µm. Rumene do olivnozelene spore so elipsaste oblike, a s starostjo prehajajo v okroglo obliko premera 4.5-8 µm (Kovač, 1997). 3.1.2.2 Rod Rhizopus Iz sivorjavega micelija izra�čajo sporangiofore in se zaključujejo s sivočrnimi glavicami. Micelij je oblikovan v stolone, le-ti s posameznimi deli tvorijo rizoide, ki so funkcionalno podobni koreninam pri rastlinah. Rod je �iroko raz�irjen v naravi, nekatere vrste so kvarljivci sadja in povzročitelji bolezni ljudi in �ivali. Vrste determiniramo po velikosti, barvi in morfolo�kih razlikah sporangiofor in rizoidov ter tvorbi spolnih klamidospor (Kovač, 1997). 3.1.3. Najpomembnej�i rodovi kvasovk 3.1.3.1. Rod Saccharomyces Kvasovke izkori�čajo ogljikove hidrate kot izvor energije. Saccharomyces cerevisiae in Saccharomyces diastaticus sta najpomembnej�i vrsti kvasovk, ki sodelujeta pri hidrolizi ogljikovih hidratov. 4.BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 4.1. Specifičnost encimov Tridimenzionalna struktura encimov, razporeditev funkcionalnih skupin in prostorska razporeditev funkcionalnih skupin v aktivnem centru determinirajo specifičnost encima za določen substrat. Encimi katalizirajo določen tip reakcije; so torej vrstno specifični (npr. katalizirajo le oksidacijo monosaharidov ali hidrolizo peptidnih vezi v proteinih ali glikozidnih vezi v ogljikovih hidratatov ). Znani pa so tudi encimi, ki katalizirajo samo hidrolizo določene vrste vezi (amilaze hidrolizirajo samo α-1,4-glikozidno vez). Ravno te karakteristične lastnosti encimov pa so osnova klasifikacije in nomenklature encimov, ki jo priporoča posebna komisija mednarodne zveze biokemijskih dru�tev (Strah,1999). 4.2. Aktivnost in stabilnost encimov Za vse encime velja, da so katalitsko aktivni le v določenih optimalnih fizikalnih pogojih. Zelo pomembni za delovanje encimov so torej pogoji v katerih encimi delujejo; to pa so: -koncentracija encima -koncentracija substrata -koncentracija kofaktorjev -prisotnost alosteričnih efektorjev -vrsta in koncentracija inhibitorjev


-ionska jakost -pH -temperatura -začetna hitrost reakcije Encimi so po svoji zgradbi proteini s točno določeno strukturo. Znano je, da pogoji, kot so pH, temperatura, ionska jakost vplivajo na ionizacijo amino kislin kot osnovnih gradbenih elementov proteinov encimov, torej vplivajo tudi na interakcijske sile, ki so odgovorne za proteinsko trodimenzionalno strukturo. Pri katalitskem procesu sodeluje le aktivno mesto encima, kar je relativno majhen del proteinske molekule. Večji del molekule ima le primarno nalogo, da vzpostavi tak�no konformacijo, da je mogoč maksimalen stik encima in substrata in s tem katalitsko reakcijo. Različni fizikalni pogoji torej vplivajo na encim na dveh nivojih; to je na celotni protein in na aktivno mesto encima. Tako se srečujemo s pogoji optimalne aktivnosti in pogoji optimalne stabilnosti nekega encima, ki se med seboj razlikujejo. 4.2.1. Optimalni pogoji stabilnosti Določamo jih s tem, da encim podvr�emo različnim fizikalnim pogojem (temperatura, pH) za določen čas, nastavimo na referenčno vrednost (optimalnih pogojev stabilnosti), ter merimo preostalo encimsko aktivnost. 4.2.2. Optimalni pogoji aktivnosti Določujemo jih z merjenjem začetne hitrosti reakcije pri različnih eksperimentalnih pogojih (konc. encimov, konc. substratov, ionsko jakost, pH, temperatura..) Optimalni pogoji stabilnosti so pogosto v �ir�em območju kot optimalni pogoji aktivnosti encimov. To dejstvo omogoča, da s kemijsko modifikacijo ali z genskim in�eniringom spremenimo strukturo encimskega proteina tako, da na eni strani modificirano območje optimalne stabilnosti in na drugi raz�irimo (ali zo�imo) njegov aktivnostni optimum ali celo spremenimo njegovo substratno specifičnost (slika 1).

Slika 1: Prikaz encimske reakcije (Microsoft Encarta, 1998)


Zanimiv je napredek genskega in�eniringa, kjer prihaja do vzpodbudnih rezultatov. Prav tako so vzpodbudne modifikacije, npr. imobilizacije encimov, kar je zanimivo ravno zato, ker večina v industriji uporabljenih encimov ni udele�ena pri pretvorbi svojih naravnih substratov.

4.2.3. Vpliv aktivatorjev na produkcijo αααα-amilaz med fermentacijo na trdnem substratu 4.2.3.1. Fermentacija na trdnem substratu Fermentacija na trdnem substratu je proces v katerem je substrat vla�na trdna snov. Substrat je v vodi topen ne pa suspendiran. V tem delu seminarske naloge bo povedanega nekaj o vplivu te fermentacije na produkcijo α-amilaz Bacillus subtilis, kjer se kot substrat uporabljajo krompirjevi olupki. Na poseben način pripravljeni ti predstavljajo naravni substrat ki je bogat na �krobu. Fermentacija na trdnem substratu je definirana kot mikrobiolo�ka transformacija med delci trdnega matriksa, kje je voda nujno potrebna za rast celic. Trden substrat je vir ogljika, du�ika, mineralov in rastnih faktorjev. Ima tudi zmo�nost absorbcije vode ta pa je nujno potrebna za mikrobiolo�ko rast. Če omogočimo mikroorganizmom v procesu fermentacije na trdni podlagi podobne pogoje, kot bi jih imeli v njihovem naravnem okolju bodo proizvajali encime in metabolite bolj učinkovito kot pa v fermentaciji pod vodo pri istih pogojih. Na ta način so včasih pridobivali amilolitične encime. Amilolitični encimi so med najpomembnej�imi industrijskimi encimi. Uporabljajo se večinoma v pekarstvu in pri procesih razgradnje �kroba. Amilolitični encimi so se včasih pridobivali v submerznih sistemih, ker pa je bil ta postopek pridobivanja predrag, so si �eleli bolj ekonomično strategijo pridobivanja α-amilaz. Pridobivanje α-amilaz iz bakterijskih kultur s fermentacijo na trdnem substratu je omejena predvsem na rod Bacillus. In ti encimi se uporabljajo v procesu saharifikacije �kroba. 4.2.3.2. Povr�insko aktivne snovi Povr�insko aktivne snovi so substance, ki spreminjajo obstoječe pogoje v umestnih plasteh podlage. Povr�insko aktivna snov je molekula, ki ima hidrofobno ali polarno skupino (sulfati, fosfati, estri ali sladkorji) prav tako pa tudi hidrofobno ali nepolarno skupino. To navadno predstavlja ma�čobna kislina ali kak�en ogljikovodik. Ravno ta lastnost povr�inskih aktivatorjev, da se lahko obna�ajo kot hidrofilne ali pa kot hidrofobne molekule, jim omogoča, da se nahajajo in tako delujejo v umestnih plasteh - hidrofilnih in hidrofobnih. Povr�insko aktivne snovi so lahko pozitivno nabiti in delujejo kot kationi ali pa so negativno nabiti in delujejo kot anioni. Kot kation deluje npr. polioksietilen sorbitol monolaurat. Veliko se uporablja kot emulgatorji pri procesih, ki potekajo pri ni�jih temperaturah. Znan anionski aktivator je natrijev dodecil sulfat (SDS). Tako anionski kot kationski povr�inski aktivatorji so se veliko uporabljali za bolj�o produkcijo encimov kot so: celulaza, β-glukozidaza, α-amilaza, ksilanaza in lignaza. Skoraj vse pvr�insko aktivne snovi, ki so v splo�ni komercialni rabi, izvirajo iz nafte. Poznamo pa tudi naravne povr�insko aktivne snovi. Proizvajajo jih različni mikroorganizmi.


Za razliko od sintetičnih so naravni manj toksični, bolj raznoliki, razgradljivi� Uporabljajo pa se kot stimulatorji pri produkciji encimov. Mikroorganizem Bacillus subtilis proizvaja antibiotični povr�inski aktivator, ki se imenuje surfactin. Deluje kot antibiotik. Razkroji pomembnej�e komponente celičnih membran. Nadalje bo rečenega nekaj o učinkih sintetičnih in naravnih povr�inskih aktivatorjih. Delali so raziskavo o vplivu aktivatorja surfactina na produkcijo α-amilaz v procesu fermentacije na trdni podlagi. 4.2.3.3. Material in metode Testni mikrooganizem je bil Bacillus subtilis, ki je prvič rastel na hranljivem agarju z 1,0 % krompirjevega �kroba. Drugič pa je Bacillus subtilis rastel na agarju obogatenem z mineralnimi solmi. PRIPRAVA GOJI�ČA Prvič je Bacillus subtilis rastel na hranljivem agarju v katerem je bilo 1,0 % krompirjevega �kroba, goveji ekstrakt in pepton (to je snov, ki nastane pri razkrajanju beljakovin). Vse skupaj se je avtoklaviralo 15 minut pri 121°C. Potem so na agar nacepili bakterijske celice. Petrijevko z nacepljenimi celicami so nato inkubirali 72 ur pri 30°C v rotirajočem inkubatorju. Po tem času so na agar aseptično dodali povr�insko aktivne snovi in vse skupaj pustili v rotirajočem inkubatorju �e eno uro. Drugič pa je Bacillus subtilis rastel na agarju v katerem je bila zmes glukoze in mineralnih soli. Predhodno so glukozo sterilizirali in nato zme�ali z mineralno soljo tik preden so na agar nacepili bakterijske celice. Petrijevko so nato inkubirali 72 ur pri 30°C. Pogoji inkubacije so bili pri obeh paralelkah enaki. PRIDOBITEV SURFAKTINA Po 72-ih urah rasti v mediju z glukozo in mineralno soljo, so bakterije proizvedle surfactin. Surfaktin so izolirali tako, da so bakterijsko kulturo centrifugirali 20 minut. Tako so ločili biomaso od tekočega dela brozge, celice so vsebovale surfaktin. ANALIZA SURFAKTINA Surfaktin so analizirali indirektno z merjenjem povr�inske napetosti zmesi prostih celic. Povr�insko napetost so izmerili z tenziometrom (enota povr�inske napetosti je mN/m). Potem ko so surfaktin analizirali, so ga dodali v proces fermentacije na trdnem substratu. PRIPRAVA SUBSTRATA ZA FERMENTACIJO Za pripravo substrata so uporabili krompir vrste Superior. Najprej so ga oprali, olupili in nato olupke zmiksali v me�alniku. Po miksanju so bili ko�čki �iroki 3mm. Tako pripravljeni krompirjevi olupki so se uporabili kot substrat. Sam fermentacijski proces je potekal v nerjavečih posodah. Posode so bile dolge 32,2 cm, �iroke 18,7 cm in globoke 6,4 cm. Na dnu posod so bile tri luknjice katerih premer je bil 4cm, med seboj pa so bile oddaljene za 5 cm. V


vsako luknjico so dali pripravljen krompirjev substrat. To so pokrili z aluminijevo folijo in avtoklavirali eno uro pri 121°C. Po tem času so to ohladili in nato na substrat nacepili bakterijske celice B. subtilis z in brez povr�inskih aktivatorjev. To so potem inkubirali pri temperaturi 30°C in 90% relativni vlagi. V intervalih po 12 ur pa so odvzemali vzorce. ENCIMSKA AKTIVNOST α-AMILAZE Preden so lahko merili encimsko aktivnost α-amilaze so morali le-te najprej ekstrahirati iz fermentacijskega substrata. To so storili s centrifugiranjem. �ele po večkratnem centrifugiranju so dobili čist supernatant, ki je vseboval encimski eksrakt. Za določitev encimske aktivnosti so uporabili kolorimetrično metodo, ki temelji na saharifikacijski aktivnosti. V tej metodi se �krob hidrolizira do maltoze. Reakcijo se ustavi z dodatkom 3,5 dinitrosalicilne kisline. Koncentracijo nastale maltoze so določili s standardno krivuljo. Meritve absorbanc so opravili pri 540 nm. Encimska aktivnost je bila izra�ena v enotah na /g. Ena enota ustreza količini encima, ki je potrebna za nastanek 1,0 mg maltoze iz �kroba v treh minutah pri temperaturi 30°C in pH 6,9. V tej raziskavi so naredili primerjavo treh sintetičnih povr�inskih aktivatorjev, ki so jih dodali encimom v različnih koncentracijah.


a) Sorbitol monolat

Posledica dodanega polioksi etilen sorbitol monolata je bila �estkratno povečanje encimske aktivnosti v primerjavi z kontrolo, medtem ko aktivatorja polioksietilen sorbitol monolaurat in natrijev dodecil sulfat nista bila tako učinkovita. Encimska aktivnost se je povečala le za 4-5-krat v primerjavi s kontrolo. b) Surfaktin Encimom na substratu so dodali različne koncentracije surfaktina: 1. 0,003 % (w/w) 2. 0,007 % (w/w) 3. 0,013 % (w/w) 4. 0,03 % (w/w) Največjo aktivnost so encimi dosegli pri dodatku 0,013 % (w/w) surfaktina. Aktivnost je bila največja po 72 urah poteka fermentacije. Encimska aktivnost je narasla za 10-krat , če jo primerjamo s kontrolo in za 70 %, če jo primerjamo z encimsko aktivnostjo aktivatorja polioksietilen sorbitol monolata. Tudi dodatek ni�je koncentracije surfaktina je imel dober učinek na aktivnost α-amilaz. 4.2.3.4. Bioaktivatorji Bioaktivatorji imajo zanimiv vpliv tudi na glive. Te namreč ne aktivirajo ampak zavirajo pri njihovem delovanju. Bioreaktorji se pogosto kontaminirajo z glivami. To je neza�eleno in predstavlja velik problem. Ugotovili pa so, da pri dodatku surfactina kolonije gliv ne zrastejo. Ker je fermentacijo na trdnem substratu zelo te�ko izvajati pod aseptičnimi pogoji so lahko dodatki �e zelo majhnih količin surfactina re�itev tega problema. Bioaktivatorji so sekundarni metaboliti mikroorganizmov. Nekateri igrajo zelo pomembno vlogo za pre�ivetje in produkcijo mikroorganizmov. Imajo pa �e mnogo drugih funkcij. Npr. pospe�ujejo transport du�ika, delujejo ne celično membrano, vplivajo na substrat-encimsko interakcijo,� Vendar je za pridobivanje industrijskih encimov najpomembnej�i pozitivni vpliv na produkcijo encimov. Sam mehanizem delovanja povr�inskih aktivatorjev �e ni dobro raziskan. Uporaba predvsem bioaktivatorjev predstavlja velike ugodnosti za povečanje pridobivanja encimov iz bakterije Bacillus subtilis v procesu fermentacije na trdnem substratu. (Goes and Sheppard, 1999) Encimi, ki se uporabljajo v industriji se pridobivajo iz bakterij in gliv. Procesi pridobivanja navadno potekajo pod aerobnimi pogoji. Pomembno je da mikroorganizmom zagotovimo optimalne pogoje in hranilne snovi. Za bolj intenzivno produkcijo encimov pa so pomembni tudi aktivatorji. Mikroorganizmi proizvedejo največ encimov med stacionarno fazo. Za �krobno industrijo je najpomembnej�e pridobivanj amilolitičnih encimov. In sicer amiloze in glukoamiloze. Uporabljata se za pridobivanje glukoze iz �kroba. Iz glukoze pa pridobivamo fruktozo, ki je veliko slaj�a od glukoze in saharoze.


4.3. Konverzija �kroba do glukoze Konverzija �krobne molekule do monomernih enot glukoze lahko poteka z: A - Kislinsko hidrolizo B - Encimsko hidrolizo Z biotehnolo�kega vidika je pomembna predvsem encimska hidroliza. Poznamo 3 tipe:

a) Fosforoliza b) Hidroliza c) Transglikozilacija

a) Konverzija �kroba, glikogena in enostavnih polisaharidov do glukoze-1-fosfata je katalizirana z α-1,4-glukan fosforilazo (fosforilaza). Čeprav je reakcija reverzibilna, se odvija le intracelularno v katabolizmu polisaharidov in nima vloge v sintezi. Fosforoliza se začne na prostem, nereducirajočem koncu amilozne verige in sprosti en glukoza-1-fosfat. V amilopektinu se fosforoliza ustavi, ko pride encim do mesta razvejanja in nadaljevati mora amilo-1,6-glukozidaza, ki razcepi mesto razvejanja. Fosforoliza ima pomembno vlogo v mobilizaciji in uporabi intracelularno shranjenih polisaharidov (glukanov), (Schlegel,1995).

b) Hidrolizno delovanje amilaz napade polisaharide ekstracelularno. α-amilaze se nahajajo v rastlinah, �ivalih in MO. α-amilaze hitro utekočinjajo �krob, simultano razgrajujejo 1,4-glikozidne vezi, vključno tiste v sredini verige. Te so splo�no znane kot endoamilaze. Endoamilaze delujejo na polisaharide tako, da dobimo kot razgradne produkte: maltozo, glukozo in oligomere z 3 do 7 glukoznimi ostanki. Zaradi hitre razgradnje makromolekulske strukture, viskoznost in zmo�nost reagiranja z jodom hitro pada. Fermentirajoči sladkorji (glukoza, maltoza, maltobioza) se pojavijo postopoma. Ko so kot dodatek k α-amilazi, dodani encimi, ki delujejo na mesta razvejanja (pullolanaze ali izoamilaze) pride do določene razgradnje dekstrinov (Schlegel, 1995). β-amilaze se nahajajo povečini v rastlinah (ječmen, p�enica), kot tudi v bakterijah. V nasprotju z α-amilazami, β-amilaze (α-D-(1→4)-glukan maltohidrolaza) začnejo delovati na prostih nereducirajočih mestih makromolekul. Njihovo delovanje na �krob ima zato kot posledico hitro akumulacijo sladkorjev, medtem ko se reaktivnost z jodom nadaljuje. Hidroliza se ustavi na mestu razvejanja. Ostanke poznamo pod imenom limitni dekstrin. Če pa so poleg β-amilaz prisotni �e encimi, ki razgradijo mesto razvejanja, potem se hidroliza nadaljuje tako dolgo, da pride do popolne konverzije �kroba v maltozo. Maltozo lahko potem hidroliziramo ekstracelularno z maltazo. Če pa so prisotne primerne permeaze, so lahko maltoza in drugi oligomeri transportirani v celico in cepljeni fosforolitično (Schlegel, 1995). c) Schardingers je odkril, da mediji, ki vsebujejo �krob + Bacillus macerans vsebujejo »kristalinične« komponente. Sestojijo iz zaprtih okroglih verig glukoze, povezane z α-1,4-glikozidno vezjo. Ti α,β ali χ ciklodekstrini vsebujejo 6, 7 ali 8 molekul glukoze v obroču in nastanejo iz �kroba z delovanjem transglikozilaz. χ-amilaze proizvajajo plesni in bakterije. Ti MO imajo pogosto sposobnost razgradnje �kroba z amilolitičnimi eksoamilazami. Amilaze aktivno proizvaja veliko gliv, �ivečih v zemlji. Tehnični preparati amilaz so komercialno pridobljeni z uporabo Aspergillus oryzae, A. niger in A.wenti. Npr. taka-amilaze ali taka-diastaza so neobdelani komercialni preparati kultur A.


oryzae, ki hidrolizirajo �krob do glukoze. Izmed bakterij aktivno proizvajajo α-amilaze rodovi Bacillus: B. macerans, B. polymyxa, rod Pseudomonas in Streptomyces. , B. subtilis. Posebej pomembni za industrijo so termostabilni encimi, pridobljeni iz B. stearothermophilus in B. licheniformis lahko segrejemo do 100°C, brez da bi izgubili na aktivnosti. Nekateri termofili iz rodu Clostridium thermosulfurogenes in C. thermohydrosulfuricum proizvajajo termostabilne α-amilaze in pullolanaze. Ker kvasovke, ki proizvajajo alkohol, ne izločajo amilaz, je hidroliza �kroba v sladkor odvisna od amilaz, ki jih vsebuje slad (v pivovarstvu) ali amilaze, pridobljene iz Aspergillus oryzae (Schlegel, 1995).

Tabela 2: Glavni produkti po delovanju α-amilaze na �krob (Atkinson in Mavituna, 1991)

VIR ENCIMA GLAVNI KONČNI PRODUKT Acinetobacter species G2. G3 Bacillus amyloliquefaciens G6 B. licheniformis G2, G3, G5 B. subtilis G6 Lipomyces kononenkoae G1, G2 Micrococcus halobius G2, G3, G4 Streptomyces hygroscopicus G2 Thermoactinomyces vulgaris G2 Legenda: G1=glukoza G4=maltotetroza G2=maltoza G5=maltopentoza G3=maltotrioza G6=maltoheksoza


Tabela 3: Primerjava lastnosti B.subtillis var. amylosacchariticus (saharificirajoča α-amilaza), B. amyloliquefaciens (utekočinjajoča α-amilaza) in B.licheniformis (razgrajuje �krob).

(Atkinson in Mavituna, 1991)

B.subtilis var. amylosacchariticus

B. amyloliquefaciens B. licheniformis

pH optimum 6.8 5.9 7.70-9.0 T optimum - 70 90 termostabilnost (50% inaktivacija, °C)

68 80 -

omejitev hidrolize topnega �kroba (%)

43 16 -

molska masa 41000 49000 62000 izoelektrična točka - 5.2 5.2 končni produkti G1,G2 G6 G2, G3, G5 adsorpcija na surov �krob

6 88 -

Km (�krob) 2.31mg/ml 6.9 mg/ml 0.8 mg/ml aktivnost po 6-ih urah na 70°C; Ca (5ppm); pomanjkanje substrata (%)

- - 100


Tabela 4: Lastnosti nekaterih amiloglukozidaz (Atkinson in Mativuna, 1991)

ORGANIZEM pH-optimum

T-optimum(°C)

Molska masa

Izoel. točka

Hidroliza topnega �kroba (%)

Prebavljivost surovega �kroba

Asp. awamori 4.5 60 85000 3.7 90 + Asp.nigerΙ 4.5-5.0 99000 3.4 95 ΙΙ 4.5-5,0 112000 4.0 Asp.oryzaeΙ 4.5 60 76000 5.6 + ΙΙ 4.5 50 38000 5.6 0 ΙΙΙ 4.5 40 38000 5.6 0 Asp.saitoi 4.5 90000 3.9 Cephalosporium eichhorniae

4.2 45-62 26850

Lipomyces kononenkoae

4.5 50 81500 6.1 100 +

Mucor rouxianus Ι

4.6 55 59000 8.4 100 +

ΙΙ 5.0 55 49000 8.4 88.5 + Penicillium oxalicum

5.0 60 84000 7.0

Rhizopus delemar

4.5 40 100000 95

Tabela 5: Lastnosti nekaterih mikrobnih β-amilaz (Atkinson in Mavituna; 1991)

ORGANIZEM Molska masa pH-optimum T-optimum (°C)

Inhibicija z sulfhidrilnimi reagenti

Inhibicija z Schardinger dekstrini

B.cereus var.mycoides

35000 7.0 50 +

B. circulans 53000-63000 6.5-7.5 60 - B. megaterium 35000 6.0 50 + + B. polymyxa 59000 6.8 37 + + Pseudomonas sp. BQ 6

37000 6.5-7.5 45-55


Tabela 6: Lastnosti nekaterih PULULANAZ in IZOAMILAZ (Atkinson in Mavituna, 1991)

pH-optimum

T-optimum (°C)

Molska masa Inhibicija z pCMB

Stabilizacija s Ca

PULULANAZE B. cereus var. mycoides

6.0-6.5 50 112000±20000 + +

B. polymyxa 6.0-7.0 45 48000 + + Streptomyces sp.

5.0-6.0 50 -

IZOAMILAZE Cytophaga sp. 5.5 40 120000 - + Escherichia coli 5.6-6.4 45-50 + Saccharomyces cerevisiae

6.0 25 +

4.4. Osnove industrijske encimologije (Strah, 1999) Encimi so proteini, ki jih ustvarjajo �ive celice in jih uporabljamo za katalizo specifičnih biokemijskih reakcij. Njihova biolo�ka funkcija je regulacija metaboličnih procesov v celici. Encimsko katalizirane reakcije imajo kar nekaj prednosti v primerjavi s kemijskimi reakcijami. Te so: - visoka specifičnost ( katalizirajo samo ene reakcijske stopnje ) - delovanje pri visokih hitrostih konverzije in fiziolo�kih pogojih nizkega pritiska, temperature in pH. - mo�nosti večkratne uporabe (imobilizirani encimi) 4.4.1 Delitev encimov Encimi lahko delujejo v celici ali izven nje. Glede na mesto delovanja jih delimo na intracelularne in ekstracelularne.Večina encimov je intracelularnih. Ekstracelularni encimi se izločajo iz celice v okolico, da pripravijo hranilo v primerno obliko za vstop celice, zato so ekstracelularni encimi tisti, ki prehajajo skozi membrano. Imajo kar nekaj prednosti za industrijsko proizvodnjo: - odpade potreba po uporabi tehnik za razbijanje celic, kar vpliva na zmanj�evanje te�av pri či�čenju encima; - iz me�anice izločenih proteinov je la�je izolirati �eljeni encim kot pa z ločevanjem intracelularnih encimov, kjer delujejo moteče nukleinske kisline; - struktura ekstracelularnih encimov je bolj odporna, posledica tega je manj�a občutljivost na denaturacijo. Vse na�tete prednosti ekstracelularnih encimov se pri selekciji mikrobov v industrijski proizvodnji encimov tudi upo�tevajo. Z novimi metodami genskega in�eniringa sku�ajo doseči tudi izbolj�anje pri mikrobih, ki se uporabljajo za proizvodnjo. Te metode se uporabljajo tudi pri vključevanju novih mikrobov, ki ustrezajo zahtevam za industrijsko proizvodnjo encimov.


4.5. Delitev najpomembnej�ih industrijskih amilolitičnih encimov 4.5.1. αααα-Amilaze α(1→4)-D-glukan glukanohidrataza, ki katalizira hidrolizo α(1→4)-vezi v �krobu je zelo raz�irjena med mikrobi. Je endoamilaza, ki hidrolizira poli- in oligosaharidne verige različnih dol�in. α-amilaze so razdeljene v dve skupini, glede na stopnjo hidrolize substrata. Saharificirajoče α-amilaze hidrolizirajo 50-60% in utekočinjajo 30-40% �kroba. Saharificirajoče α-amilaze razgrajujejo prednostno substrate s �tevilom glukoznih ostankov 4 in več, medtem ko utekočinjajoče razgrajujejo prednostno substrate s 15 glukoznimi enotami in več. Specifičnost α-amilaz za α(1→4)-vez ni absolutna. Nekatere α-amilaze so sposobne razgraditi α(1→6)-vezi, vendar je hitrost teh reakcij veliko manj�a, kot hitrost tistih za cepitev α(1→4)-vezi. Napad α-amilaz na α(1→4)-glikozidno vez v �krobu je naključen. Polimer kot je amiloza konvertira v glavnem v glukozo in maltozo in nekaj dekstrinov vi�jih molekulskih te� (Kovač, 1997). 4.5.2. ββββ-Amilaze β-amilaza α(1→4)-D-glukan maltohidrolaza je eksoamilaza, ki katalizira hidrolizo z nereducirajočega konca in sicer predzadnje α(1→4)-vezi v �krobu. Nastanejo maltoza in limitni dekstrini. Z izjemo pri rodu Bacillus je pri mikrobih ne najdemo, zato pa je pogostej�a v rastlinskem svetu, med drugim v kalečem �itu (Kovač, 1997). 4.5.3. Glukoamilaze Glukoamilaza je v industriji eden bolj �iroko uporabljenih encimov. Glukoamilaza α(1→4)-D-glukan glukonohidrolaza je eksoencim, ki cepi α(1→6), α(1→4) in tudi nekatere α(1→3)-glikozidne vezi α-glukanov . Rezultat njenega delovanja je D-glukoza, ki jo odceplja nereducirajočega konca substrata. Glukoamilazo producirajo v glavnem glive (plesni) in le redke bakterije. Ta encim je komercialno precej pomemben v razgradnji �kroba, produkciji glukoze, fruktoznega sirupa in etanola (Kovač, 1997). 4.5.4. Pululanaze Pululanaza (α-dekstrin 6-glukanohidrolaza) hidrolizira α(1→6)-vezi v pululanu in drugih razvejanih oligosaharidih . Pululan hidrolizira popolnoma do maltotrioze; �krob, amilopektin in limitne dekstrine pa hidrolizira do končnih produktov, ki niso več razvejani. Pomembna je lokacija α(1→6)-vezi v substratu, saj vpliva na sposobnost delovanja encimov različnih vrst na različne substrate. Pululanazo najdemo pri zelo majhnem �tevilu mikroorganizmov (Kovač, 1997). 5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE PROCESA 5.1. Uvod Mikrobni encimi igrajo vodilno vlogo pri razgradnji polisaharidov. Izmed vseh polisaharidov, ki so razgradljivi z encimi, igra �krob najpomembnej�o vlogo v industriji. Stopnja razgradnje molekule �kroba je odvisna od izbire encima (α-amilaza, glukoamilaza...) in od procesnih pogojev. Encime pridobivamo iz čistih kultur pod sterilnimi pogoji. Na proizvodnjo encimov vplivajo rastni pogoji (pH vrednost, temperatura) in izbira nitritov. Od


namena uporabe encima pa so odvisni načini separacije, či�čenja in oblikovanja končne oblike encima. V proizvodnji hrane ponuja uporaba encimov veliko prednosti. Encimi imajo zaslu�eno pomembnost zaradi njihove zmo�nosti kataliziranja reakcij v zmernih pogojih. V preteklosti je bilo veliko procesov osnovanih v glavnem na opazovanju in na poskusih brez izčrpnega znanja o biokemičnem ozadju (npr. fermentacija čaja in kave, uporaba slada za varjenje in papaina za mehčanje mesa). S pridobivanjem znanja o encimih in njihovi biokemični aktivnosti je bolj primerno uporabiti le encim in ne organizma - razvila se je proizvodnja encimov za proizvodnjo hrane. Encime lahko izoliramo iz mikroorganizmov, rastlinskih in �ivalskih celic. Na večji donos produkcije mikrobnih encimov lahko vplivamo s kultivacijo in pravilno izbiro organizma, pa tudi tako, da omogočimo najugodnej�e pogoje za rast. Zaradi tega je danes največ encimov, ki se uporabljajo v proizvodnji hrane, pridobljenih iz mikroorganizmov. Mikroorganizme, ki lahko presnavljajo posebne substrate, lahko v večini najdemo v naravi (mikroorganizme za proizvodnjo celulaz-gozdna zemlja). Vzorec zemlje predstavlja me�ano kulturo; po sledečih različnih korakih selekcije, lahko izoliramo in koncentriramo �eljen mikroorganizem v čisti kulturi. Po karakterizaciji in določitvi je organizem testiran na mo�no produkcijo toksičnih metabolitov (posebno bakterije in plesni). Mikroorganizem, uporabljen za produkcijo encimov, mora biti varen v tem pogledu.

Tabela 7: Encimi mikrobnega izvora (Guzman-Maldonado in Paredes Lopez, 1995) TIP IME ENCIMA IZVOR Endoamilaza Bakterijska amilaza

α - amilaza (glive) Bacillus subtilis Aspergillus oryzae

Eksoamilaza Amiloglukozidaza Bakterijska β - amilaza

A. niger Bacillus sp., Clostridium sp.

α - 1,6 amilaza Pullulanaza Izoamilaza

Klebsiella aerogenes Pseudomonas sp.

Ekso-α - amilaza Eksomaltotriohidrolaza Eksomaltotetrahidrolaza Eksomaltopentahidrolaza Eksomaltoheksahidrolaza

Streptomyces griseus B. circulans Pseudomonas sp. B. subtilis

Izomeraza Glukoze izomeraza B. circulans Glukanotransferaza Ciklodekstrinaza B. macerans Endo/eksocelulaza Celulaza (glive) Trichoderma reesei Endoproteaza Bakterijska proteaza B. licheniformis, B. subtilis Iz ekonomskih razlogov je zelo pomembno, da izberemo organizem, ki omogoča velik donos encimov, pri tem pa potrebuje kratek čas fermentacije in cenen substrat. Encim mora


biti izločen v kulturo brez neza�eljenega stranskega delovanja in brez nadaljne produkcije metabolitov. Na lastnosti mikroorganizmov lahko vpliva mutacija ali sprememba hranjenja. Kultura mora vsebovati le čisto linijo, saj lahko neznani organizmi popolnoma izrabijo substrat, oblikujejo druge produkte ali izločajo toksine. Čisto linijo lahko dose�emo z idealnimi pogoji za proizvajalca �eljenega encima in v kolikor je mogoče sledimo zahtevam sterilnega procesa. 5.2. Izolacija encimov Encimi se nahajajo v vseh �ivih celicah in jih pridobivajo iz rastlinskega in �ivalskega tkiva ter celic in iz mikroorganizmov. Iz tehničnih in ekonomskih razlogov so mikroorganizmi danes �e vedno najpomembnej�i vir encimov. Mikroorganizmi proizvajajo encime za svoje metabolične potrebe. Nekateri encimi se nahajajo znotraj mikroorganizmov prosti ali vezani na celične strukture (intracelularni encimi), nekatere pa mikroorganizmi izločajo v rastni medij (ekstracelularni encimi). Večina komercialno pomembnih encimov je ekstracelularnih, v večjih količinah pa so začeli proizvajati tudi intracelularne encime. Izolacijske metode za ekstra- in intracelularne encime so različne, vendar pa so v nekaterih stopnjah precej podobne. 5.2.1. Ekstrakcija encimov Ekstakcija encimov predstavlja spro�čanje encimov iz celice ali delov celice. Mikrobno celico obdaja celična membrana, njo pa �e celična stena, ki ji daje obliko in mehansko trdnost. Celično steno lahko razbijemo z encimi , s kemijskimi ali fizikalnimi metodami. 5.2.1.1. Encimske metode Če za razgradnjo celične stene uporabimo lastne encime mikroorganizma, je to avtoliza. Metoda je primerna za delo v večjem obsegu. Suspenzijo celic dr�imo pri zvi�ani temperaturi in primernem pH več ur. Nato jo ohladimo in celični ekstrakt ločimo od preostankov stene s filtriranjem ali centrifugiranjem. 5.2.1.2. Kemijske metode Z dodatkom alkalij tudi dose�emo razgradnjo bakterijskih celic. Metoda je poceni in uporabna v industriji. Pomembno je le, da so encimi kraj�i čas obstojni v alkalnem mediju (pH 10-12.5). Metoda ima �e to prednost, da pod temi pogoji ne pre�ivi nobena bakterijska celica, kar je pomembno pri proizvodnji encimov za zdravilstvo. 5.2.1.3. Fizikalne metode S hitrim zmrzovanjem, ki mu sledi odtaljevanje goste suspenzije ali paste, dose�emo razbitje mikrobnih celic in sprostitev encimov. Metoda, ki se uporablja v industrijskem obsegu , je �e bolj obse�na, če jo kombiniramo z osmotskim �okom. 5.2.1.4. Ekstrakcijski mediji Po razbitju celic dobimo homogenat, v katerem so spro�čeni encimi. Ti pa so lahko povezani z drugimi celičnimi snovmi, kot so lipidi, nukleinske kisline ali ogljikovi hidrati. Če te komponente niso nujne za katalitično aktivnost encima, jih sku�amo odstraniti. �e posebej


velja to v primerih, ko je encim vezan na netopne delce, ki jih moramo v vsakem primeru odstraniti, Zato ekstrahiramo bodisi vse topne proteine z raztopino soli, v kateri je večina encimov obstojna, ali pa postopoma ekstrahiramo posamezne encime s specifičnimi topili. Če so prisotni tudi proteolitični encimi, dodamo k ekstrakcijskemu mediju inhibitorje proteaz, da preprečimo hidrolizo drugih encimov. V industrijskem obsegu izvajajo te ekstrakcije v reakcijskih posodah. 5.2.2. Začetne separacije Iz celičnega homogenata odstranimo netopni material s centrifugiranjem ali s filtriranjem. 5.2.2.1. Centrifugiranje Centrifugiranje je ena najbolj raz�irjenih metod separacije. Z njim lahko ločimo trdne snovi od tekočin ali dve tekočini, ki se ne me�ata. Pod vplivom centrifugalne sile se delci v raztopini ali suspenziji, ki so te�ji od topila, začnejo veliko hitreje sesedati proti dnu centrifugirke. Temu gibanju delcev ali sedimentaciji nasprotujeta sila vzgona in sila trenja. Sila, ki deluje nanje, je odvisna od hitrosti vrtenja rotorja in od razdalje delca od osi vrtenja, na učinek centrifugiranja pa vpliva tudi viskoznost medija. Po centrifugiranju se netopni material zbere na dnu kot sediment (oborina), nad njim je bistra raztopina, imenovana supernatant, v kateri se nahajajo raztopljeni encimi. 5.2.2.2. Filtriranje Filtriranje je metoda, s katero po razbitju mikrobnih celic z uporabo posebnih filtrov ločimo netopni preostanek in dobimo in dobimo ekstrahirane encime v topnem filtratu. 5.2.3. Či�čenje encimov 5.2.3.1. Separacija beljakovin na osnovi različne topnosti Beljakovine so makromolekule, ki imajo v določenem topilu določeno obliko, velikost in naboj. Naboj je odvisen od aminokislin, iz katerih je zgrajena beljakovina. Nabite skupine reagirajo s topilom in vsaka sprememba v sestavi topila se odra�a v naboju proteina. Če so ioni v topilu prisotni v nizki koncentraciji, preprečujejo, da bi se proteinske molekule pribli�ale druga drugi in bi zaradi nasprotnih nabojev pri�lo do obarjanja. Nizke koncentracije anorganskih ionov torej zvi�ujejo topnost beljakovin (salting-in učinek). Nasprotno pa visoke koncentracije anorganskih soli(amonijev in natrijev sulfat) odvzamejo vodo, ki je okrog beljakovinskih molekul, zato se topnost zni�a in beljakovine se oborijo(salting-out). Ker se različne beljakovine obarjajo pri različnih koncentracijah soli, lahko z njihovim postopnim dodajanjem dose�emo grobo ločitev encima od ostalih beljakovin. Sol je potrebno dodajati počasi med me�anjem in raztopino dr�ati na temperaturi čim bli�je 0°C.


5.2.3.2. Či�čenje z kromatografskimi metodami Z dosedaj na�tetimi metodami dose�emo predvsem sprostitev intracelularnih encimov iz mikroorganizmov in odstranimo netopne snovi ter nebeljakovinske primesi. Za ločevanje in odstranjevanje drugih proteinov, kar naj v končni stopnji privede do čistega encima, pa uporabimo različne kromatografske metode. S kromatografskimi tehnikami ločimo med seboj različne proteine na osnovi razlik v velikosti molekul, naboja in biolo�ke vloge. - adsorpcijska kromatografija: tehnika, s katero ločimo med seboj snovi, ki se različno močno adsorbirajo na kromatografski nosilec. - Gelska kromatografija: tehnika, ki omogoča ločevanje proteinov glede na njihovo velikost. Tako ločitev omogoča kolona, napolnjena s primernim gelom, kot je npr. Sephadex. To je sicer komercialno ime za polisaharid dekstran, katerega molekule so zamre�ene z epiklorohidrinom tako, da nastanejo pore določene velikosti. V te pore lahko vstopajo manj�e molekule topljenca, večje pa ne in tako prve zaostajajo, druge pa tečejo med granulami po koloni naprej. - Ionska izmenjalna kromatografija: loči beljakovine na osnovi razlik v nabojih. - Afinitetna kromatografija: z njo ločujemo molekule, ki imajo določene biolo�ke funkcije, npr. encime, inhibitorje, hormone, protitelesa. Na primeren nosilec kovalentno ve�emo ligand-spojino, ki bo reagirala s snovjo, ki jo �elimo izolirati. 5.2.4. Koncentriranje encimov Tudi koncentriranje encimov je ena izmed metod, ki se uporabljajo pri proizvodnji encimov. Koncentriranje se lahko uporablja �e kot začetna stopnja pri či�čenju ekstracelularnih encimov. Rastni medij, iz katerega smo odstranili mikroorganizme, vsebuje majhno mno�ino encimov v velikem volumnu. Za vsako nadaljnje či�čenje je potrebno ta volumen precej zmanj�ati. Pred koncentriranjem je potrebno odstraniti večino soli, saj bi soli lahko po koncentriranju povzročile obarjanje proteinov. 5.2.4.1. Ultrafiltracija Raztopino, ki jo �elimo koncentrirati s pomočjo ultrafiltracije, pod pritiskom potiskamo čez polpropustno membrano, ki ima pore določene velikosti. Voda in manj�e molekule gredo skozi pore, koncentrirana raztopina proteinov pa ostane na membrani. 5.2.4.2. Liofilizacija S to metodo odvajamo vodo iz raztopine v zmrznjenem stanju pod zni�anim tlakom(sublimacija ledu). Metoda je uporabna za koncentriranje ali su�enje manj�ih volumnov raztopin. 5.2.4.3. Su�enje z razpr�evanjem Ta metoda se uporablja predvsem za su�enje večjih volumnov raztopin encimov, ki morajo biti toplotno čim bolj obstojni. V su�ilniku zgoraj razpr�ujemo encimsko raztopino, nasproti pa pihamo ogret zrak. Osu�en produkt pada na dno posode.


5.2.5. Kontrola izolacijskega postopka Med či�čenjem moramo stalno spremljati količino in aktivnost encima, ki ga �elimo izolirati. Na ta način ugotavljamo izgube encima samega oz. njegovo morebitno inaktivacijo v posameznih stopnjah. Za merjenje encimske aktivnosti moramo izbrati hitro in enostavno metodo, prav tako moramo imeti metodo za določanje mno�ine proteina. 5.3. Oblikovanje in kontrola kvalitete končnega produkta Pred končnim oblikovanjem preverimo prisotnost neza�eljenih stranskih aktivnosti (npr. transglukozidaza v glukoamilazi; proteaza v α-amilazi). Učinkovitost encimskega produkta, t.i. encimska aktivnost, je definirana s količino metaboliziranega posebnega substrata v določenem času pod reprodukcijskimi pogoji. Encimski produkti se nahajajo v tekoči obliki, kot pra�ki, zrnca ali pa so pritrnjeni na nosilcih. �eljeno encimsko aktivnost lahko dose�emo z dodajanjem �kroba, glukoze, maltodekstrinov ali vode (ti dodatki morajo biti dobre kvalitete). Za oblikovanje tekočih produktov pa so lahko ti dodatki nujno potrebni. Običajno kontrola produktov ne pokriva le stabilnosti skladi�čenja, ampak tudi odkrivanje prisotnosti mikotoksinov (aflatoksin) in antibiotične aktivnosti. Ti testi in nadaljne kontrole zagotavljajo varnost encimskih produktov. Končni encimski produkt je okarakteriziran s stopnjo čistosti (homogenosti), katalitične aktivnosti, vsebnosti primesi ter morebitnih stabilizatorjev. Zahteve glede čistosti komercialnih encimov so različne. Med va�nej�e zahteve spada odsotnost �ivih celic produkcijskega organizma ter drugih kontaminant. Za ugotavljanje homogenosti encima ni na voljo univerzalne metode, s katero bi lahko potrdili, da vsebuje encimski preparat res en sam protein. Napogosteje uporabljamo elektroforezne metode. 5.3.1. Elektroforezne metode S temi metodami ločujemo nabite molekule. Večina separacij poteka v električnem polju na nosilcih, ki so nasičeni s pufrom. Najpogosteje uporabljamo kot nosilce za elektroforezo poliakrilamidne (PAGE) in agarozna gele. Pufer je potreben za prevajanje električnega toka. Po separaciji obarvamo proteine na gelu z različnimi barvili in jih tako napravimo vidne. 5.3.1.1. Elektroforeza v prisotnosti Na-dodecil sulfata (SDS) SDS je detergent, ki denaturira beljakovino in se ve�e na polipeptidno verigo v konstantnem ute�nem razmerju. Nastali kompleksi dobijo negativen naboj, hitrost potovanja po gelu pa je odvisna le od velikosti molekul. Z dodatkom 2-merkaptoetanola dose�emo �e razcep disulfidnih vezi. S to metodo določamo molekularne te�e proteinov v primerjavi s proteinskimi standardi. 5.3.1.2. Izoelektrično fokusiranje Po tej metodi ločujemo proteine na gelu, v katerem predhodno napravimo kontinuiran gradient pH s pomočjo nizkomolekularnih amfoternih snovi.


5.3.2. Imobilizirani encimi Z izrazom imobiliziran encim, označujemo encim, ki je pritrjen ali vezan na nevodotopen nosilec, polimeriziran v netopnem gelu ali ujet v netopni mikrokapsuli. Uporaba imobiliziranih encimov ima mnoge prednosti pred uporabo prostih ali vodotopnih encimov, zato vlada veliko zanimanje za njihovo uporabo v industriji. Tako imobiliziran encim lahko ločimo od reakcijske zmesi in ga ponovno uporabimo. Pogosto so imobilizirani encimi tudi stabilnej�i od prostih encimov. 5.3.2.1 Imobilizacijske tehnike Glede na način vezave delimo imobilizacijske tehnike v dve skupini: encim kemijsko ve�emo ali ga fizikalno ujamemo. V prvem primeru ve�emo encim na nek inerten nosilec z adsorbcijo, ionsko ali kovalentno vezjo. Encim lahko imobiliziramo tudi tako, da z bifunkcionalnim reagentom pove�emo več molekul med seboj, s čimer postane nastala velemolekula netopna. Kot nosilce uporabljamo različne anorganske in organske snovi, kot na primer kaolinit, porozno steklo, celulozo, dekstrane, aktivno oglje, �krob. Osnova fizikalnih metod je ujetje encimskih molekul v mre�asto strukturo polimera, ki je dovolj gosta, da prepreči uhajanje encima. Druga mo�nost vezave z ujetjem je uporaba snovi, ki pri polimerizaciji tvorijo mikrokapsule, v katerih se nahaja encimska raztopina. 6. EKOLO�KI VIDIK BIOPROCESA Z ekolo�kega vidika bioproces proizvodnje amilolitičnih encimov ne predstavlja potencialne nevarnosti za okolje. Tudi encimi sami kot končni produkt niso nevarni človekovemu zdravju, mikroorganizme pa v postopkih imobilizacije encima eliminiramo. Morda je edini problem pri tem bioprocesu, ki smo ga zasledili le vpra�anje kam z ostalimi komponentami substrata po končanem procesu. Če bi te ostanke spu�čali z odpadnimi vodami v okolje, bi BPK (biolo�ka potreba po kisiku) zaradi organskih snovi lahko narasel. Menimo, da je tu edina mo�nost ekolo�kega tveganja za okolje v primeru nesreče oziroma nezgode. 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE 7.1. Uvod Proizvodnja amilolitičnih encimov je v velikem razmahu po celem svetu. Razlog za to je, da so amilolitični encimi uporabni znotraj večih industrij. Poslu�ujemo se jih predvsem v �ivilski industriji, prav tako pa so nepogre�ljivi v tekstilni industriji (kot čistilna sredstva), uporabni pa so celo v papirno-predelovalnih obratih. V �ivilski industriji z njiho pomočjo predelujemo �krobne substrate iz različnih virov v maltodekstrine, koruzne sirupe, oligosaharide, predvsem pa jih uporabljamo za proizvodnjo sladil v obliki dekstroznih, maltoznih in visoko fruktoznih sirupov. Tudi proizvodnje ciklodekstrinov ne bi bilo brez njih. V �ivilstvu se ti produkti uporabljajo v pekarstvu, sla�čičarstvu, pivovarstvu, tehnologiji pijač, ...


7.2. Maltodekstrini in koruzni sirupi Maltodekstrini so po FDA (The Food and Drug Administration) definirani kot (C6H12O5) ⋅ H2O, kot nesladki saharidni polimeri, sestavljeni z D-glukoznih enot med seboj povezanih z α-1,4 glikozidnimi vezmi z DE<20. Maltodekstrini so po izgledu pra�kasti ali pa so v obliki raztopine, pridobljene z delno hidrolizo �kroba. Maltodekstrine in koruzne sirupe pogosto pridobivamo iz �kroba z encimsko kontrolirano hidrolizo, t.i. postopkom utekočinjanja. �krobni substrat moramo najprej pripraviti tako, da vsebuje 30 do 40% suhe snovi, z kislinami uravnamo pH na 6.5 ter dodamo encim α-amilazo (npr. iz Bacillus licheniformis) in kalcijeve ione. �krobno brozgo prečrpamo v kuhalnik, kjer jo za 5 do 10 minut izpostavimo na 140 oC. Nato jo prečrpamo v reaktor, kjer bo poteklo utekočinjanje. �elatinozni �krob ohladimo na temperaturo utekočinjanja, ki zna�a okoli 90 oC, dodati pa moramo �e določeno količino encima, ker smo ga del denaturirali v kuhalniku. Nato pustimo da poteka utekočinjanje kaki 2 uri, ko se DE pribli�uje vrednosti 20. Encime nato inaktiviramo tako da ph spustimo na 3.0 do 5.0 in zavremo za 5 minut. Kasneje hidrolizatu na kolonah z granuliranim ogljikom odvzamemo barvila. Sirup nato �e evaporiramo, posu�imo in pakiramo. Preden so se v tej proizvodnji pojavili encimi, so �krob obdelovali z hidroklorovo kislino in povi�ano temperaturo, vendar je bil ta postopek dra�ji in ni dajal tako dobrih rezultatov kot uporaba encimov. Končni proizvod maltodekstrin vsebuje 75 - 96% sladkorje z več kot �tirimi glukoznimi enotami, 2 - 6% malotetraoz, 1 � 11% maltotrioz, 1-6% maltoze in okoli 1% glukoze. Njihove najbolj uporabne funkcionalne lastnosti so nizka higroskopnost, mila aroma, zelo nizka stopnja sladkosti, visoka viskoznost in sposobnost onemogočanja tvorbe kristalov v sladoledih in drugih zmrznjenih izdelkih. Pozitivno prispevajo k �večljivosti, viskoznosti v mehkih bonbonih in povečajo čas skladi�čenja in ohranjajo stopnjo vla�nosti trdih bonbonov. Obnesli so se tudi kot za�čitna sredstva pred oksidacijo arom. Nekateri novi produkti it vrst ogljikovih hidratov lahko slu�ijo kot nadomestki ma�čob in olj, zato so na�li tr�no ni�o pri bolnikih, ki imajo te�ave z srcem in o�iljem. Koruzni sirupi imajo DE>20 in jih pridobivamo podobno kot maltodekstrine z hidrolizo. Vsebujejo 1 - 17% glukoze, 6 � 27% maltoze, 9 - 16 % maltotrioze, 7 - 10% maltotetraoze, ostalo pa so vi�ji sladkorji. Trdni koruzni sirupi so po obliki lahko granulirani, kristalizirani ali pa pra�kaste substance. Uporabljamo jih lahko v nevla�nih produktih, pozročijo trdnej�o strukturo brez kuhanja. So tudi dobri za za�čito arome. 7.3. Oligosaharidi �krobni oligosaharidi so sestavljeni iz α-D-glukopiranozilnih enot povezanih z α-1,4 in/ali α-1,6 vezmi.Splo�ni termin »oligosaharidi« se uporablja za sladkorji z dvema do desetimi glukoznimi enotami. Oligosaharidi z več kot tremi enotami se uporabljajo le kot raziskovalne kemikalije in v medicinske namene. Z odkritjem mikrobnih encimov, ki imajo sposobnost tvorbe specifičnih oligosaharidov (kot so malotrioza, maltotetraoza, maltopentoza in maltoheksoza) lahko proizvajamo sirupe z visoko vsebnostjo na�tetih oligosaharidov. Za


substrat za te sirupe slu�i hidroliziran �krob z DE=3 in uporabo encimov, kot sta pululanaza in izoamilaza. Ti sirupi imajo nizko stopnjo sladkosti, preprečujejo retrogradacijo �krobnih gelov in preprečujejo kristalizacijo saharoze in se uporabljajo kot sladkorno sredstvo pri mleku v prahu in tekočih dietah pri bolnikih. 7.4. Sladila Pričetek izdelave koruznih sladil zasledimo v začetku devetnajstega stoletja, ko je nem�ki kemik Kirchoff odkril sladko substanco, če je �krob segreval z dodatkom kisline. �e na polovici devetnajstega stoletja so to odkritje vpeljali v industrijske obrate. Uporaba in prvi proizvod z uporabo encimov pa se pojavi v �esdesetih letih. Kmalu ta tehnologija zamenja staro, kjer smo morali uporabljati drage na kislino odporne materiale. 7.4.1. Dekstrozni sirupi Proizvodnja dekstroznih sirupov iz �kroba je večstopenjski proces, ki vsebuje termostabilno α-amilazo za utekočinjanje in amiloglukozidazo za nadaljno saharifikacijo. Saharifikacije je proces hidrolize oligosaharidov ali dekstrinov do sladkorjev za majhno specifično te�o, kot so naprimer glukoza, maltoza ali pa njune me�anice. �krobni substrat z pH 6.5 �elatiniziramo s kuhanjem pri visoki temperaturi z α-amilazo. Nato ga utekočinimo, naravnamo ph na 4.5 in spustimo temperaturo na 60 oC. Sledi dodajanje amiloglukozidaze in tako omogočimo nadaljevanje poteka saharifikacije naslednjih 48 do 96 ur v reaktorju z me�anjem, dokler ne dose�emo maksimalno koncentracijo glukoze. Namen saharifikacije je produkcija sirupa z maksimalno vsebnostjo D-glukoze, vendar več kot 94 % glukoze ne moremo doseči. Z HPLC metode so odkrili da je razlog za ta pojav tvorba maltuloze � 4-α-D-glukopiranozil-D-fruktoze. Takoj ko se enkrat stvori ta produkt je donos same glukoze zreduciran, saj na� encim amiloglukozidaza ne more cepiti vezi med glukozo in fruktozo. Če imamo kot substrat utekočinjen �krob z DE>20 nastane več maltuloze kot če uporabljamo takega z DE pod 7. Formacijo maltuloze lahko kot moteči dejavnik eliminiramo če spustimo ph pod 6.0. Po saharifikaciji odstranimo proteine in ma�čobe z filtracijo in čistimo z aktivnim ogljem da odstranimo neza�eljena bravila in topne proteine. Tej operaciji ponavadi sledi �e ionsko-izmenjalni proces za odstranjevanje pepela. Doprinos glukoze lahko povečamo če hkrati simultano uporabljamo pululanazo in izoamilazo z amiloglukozidazo pri saharifikaciji hidroliziranega �kroba. Glukozni sirup navadno vsebuje 95 � 98% glukoze, 1 � 3% maltoze, 0.5% maltotrioz in 1 � 2% vi�jih sladkorjev. Uporabljajo se za različne nekvasne fermentacije (v farmacevtski industriji, za proizvodnjo organskih kislin in vitaminov), za proizvodnjo kristalizirane D-glukoze ali pa kot osnova za nadaljno proizvodnjo fruktoznega sirupa. Glukoza je lahko tudi osnova za fermentacijske reakcije kvasovk, v prisotnosti amino kislin in povečane temperature lahko povzročijo Maillardovo porjavenje in s tem rjavo barvo in aromo izdelka. Glukozo uporabljamo tudi za proizvodnjo poildekstroze, ki je nesladka in ima majhno kalorično vrednost (zanimiva za nizko kalorične izdelke).


7.4.2. Maltozni sirupi Poznamo tri pomembne tipe maltoznih sirupov: - visoko maltozni sirup

- ekstremno visoko maltozni sirup - visoko konverztiran sirup

Splo�ne DE karakteristike teh sirupov in njihovih sestavin je prikazana v naslednji tabeli:

Tabela 8 � Sestava maltoznih sirupov in njihov dekstrozni ekvivalent (DE)

Sladkor Visoko maltozni sirup

Ekstremno visoko fruktozni sirup

Visoko konvertirani sirup

Glukoza 0.5-3.0 1.0-3.0 35.0-43.0 Maltoza 45.0-30.0 70.0-85.0 30.0-47.0 Maltotrioza 6.0-25.0 8.0-21.0 8.0-15.0 Vi�ji saharidi ravnote�je ravnote�je ravnote�je DE 35-50 45-60 60-70

Produkcija različnih maltoznih sirupov iz �krobnih substratov na splo�no vsebuje 2 stopnji. V prvi stopnji �krob utekočinimo, kjer je �krob suspendiran v vodnem mediji in �elatiniziran z vročino in �e delno hidroliziran z uporabo termostabilne α-amilaze. Naslednji korak v pripravi maltoznega sirupa je saharifikacija, pri kateri uporabimo encime ki dajo kot proizvod maltozo. Primera takih encimov sta naprimer mikrobna β-amilaza ali pa α-amilaza iz plesni. V proizvodnji različnih maltoznih sirupov so manj�a razlikovanja v samem procesu. Če bi radi imeli visoko maltozni sirup mora potekati saharifikacija utekočinjenega �kroba z β-amilazo ali α-amilazo iz plesni, pri pH 5.0-5.5 in temperaturo 50 do 55 oC. Končni proizvod ne presega 60% maltoze ker navedena encima ne moreta cepiti α-a,6 vezi. Če bi imeli radi kot proizvod ekstremno visoko maltozni sirup je postopek zelo podoben kot pri visoko maltoznih sirupih le da moramo tu dodati �e pululanazo ali izoamilazo. Pri visoko konvertiranih sirupih pa moramo po končani saharifikaciji pri kateri smo uporabili encim amiloglukozidazo le tega inaktivirati s povi�ano temperaturo, da preprečimo nadaljno konverzijo sladkorjev v glukozo. Shema vseh treh tehnologij:


�KROBNA SUSPENZIJA

(30-40 s.s; ph 6.5; Ca++; α-amilaza)

PARA �ELATINIZACIJA (110-140 oC; 5-10 min)

UTEKOČINJANJE UTEKOČINJANJE DE 5-10 DE 38-40 (α-amilaza; 90-95 oC; (Kislina/α-amilaza) 90-120 min)

SAHARIFIKACIJA SAHARIFIKACIJA SAHARIFIKACIJA DE 30-35 DE 45-60 DE 60-70 (α-amilaza ali β- (α-amilaza ali β- (α-amilaza ali β- amilaza; pH 5.0-5.5; 50-55oC) amilaza; pululanaza ali amilaza; amiloglukozidaza; izoamilaza; pH 6.0; 50-55oC) pH 6.0; 75oC)

ENCIMSKA INAKTIVACIJA (80-85oC; 15 min)

FILTRACIJA FILTRACIJA FILTRACIJA IN ČI�ČENJE IN ČI�ČENJE IN ČI�ČENJE VISOKO MALTOZNI EKSTREMNO VISOKO VISOKO KONVERTIRAN SIRUP MALTOZNI SIRUP SIRUP

Shema 1 � Proizvodnja različnih maltoznih sirupov z uporabo konvencionalnih procesov

V splo�nem se različni maltozni sirupi uporabljajo v pekarstvu, varjenju piva, sadnih pijačah in v sla�čičarstvu. Lahko jih uporabljamo tudi kot sredstva za ohranjevanje vla�nosti in kot stabilizatorje.


Visoko maltozne sirupe lahko okarakteriziramo, da imajo nizko viskoznost, so nizko higroskopični, temperaturno stabilni in srednje sladki. Lahko jih uporabljamo tudi kot hrano za otroke ali pa kot nadomestek zreducirane sposobnosti porjavenja pri nekem izdelku. Ekstremno visoko maltozne sirupe uporabljamo za proizvodnjo čiste kristalizirane maltoze za potrebe farmacevtske industrije. Visoko konvertirani sirupi imajo mo�nost aplikacije v varjenju piva, pekarstvu, sla�čičarstvu, sadnih pijačah,... 7.4.3. Visoko fruktozni koruzni sirupi Navadni sladkor oz. saharoza je sestavljen iz enega mola D-glukoze in enega mola D-fruktoze. Po njem se tudi ravnamo ko gre za vpra�anje sladkosti. Fruktoza sama je slaj�a od saharoze za 1.8 krat, zato je zelo zanimiva kot sladilo. Pri pripravi surovine moramo biti natančni, saj za izomerizacijo potrebujemo kot substrat zelo kakovosten dekstrozni nastavek, saj ne �elimo neza�eljenih barvil in pepela v končnem produktu. Če takega dekstroznega hidrolizata nimamo ga moramo pred postopkom rafinirati, odstraniti proteine in olja in prefiltrirati, da odstranimo barvo. Suho snov naravnamo na 40 do 45% in dodamo magnezijeve ione, ki so aktivatorji encima glukoza izomeraze. Nato sledi izomerizacija z encimom glukoza izomeraza, pri pH 8.5 in 55-65oC pribli�no 4 ure. Tako dobimo 42% visoko fruktozni koruzni sirup. Če ga kasneje obdelamo z kromatografsko frakcionacijo, na ta način izločimo glukozo, ki jo zopet vnesemo v proces izomerizacije, ostane pa nam 90% ekstremno visoko fruktozni sirup. Le tega lahko me�amo z 42% in dobimo �e tretjo mo�nost � 55% visoko fruktozni koruzni sirup. Ena najpomembnej�ih lastnosti visoko fruktoznega koruznega sirupa je njegova sladkost (glej tabelo), ki pa je seveda odvisna od temperature in pH. Uporabljajo se če �elimo v �ivilih zni�ati točko zmrzi�ča in povi�ati temperaturo vreli�ča, preprečujejo tudi kristalizacijo in ojačajo aromo citrusov v sadnih proizvodih. Uporabljamo jo tudi pri peki raznoraznih kolačev kot delni nadomestek sladkorja.

Tabela 9 � Sestava in sladkost visoko fruktoznih koruznih sirupov

42% VFKS 55% VFKS 90% VFKS

Fruktoza [%] 42 55 90 Dekstroza [%] 52 40 9

Vi�ji sladkorji [%] 6 5 1 Suha snov [%] 75 77 80

Sladkost 100 100+ 160-180


VISOKO DEKSTROZNI SIRUP (96 %) FILTRACIJA PRIMARNO ČI�ČENJE; IONSKA IZMENJAVA IN EVAPORACIJA

KEMIČNA OBDELAVA (Mg++) IZOMERIZACIJA (Imobilizirana glukoza izomeraza; ph 8.5; 55-65 oC; 4h) GLUKOZA SEKUNDARNO ČI�ČENJE, IONSKA IZMENJAVA IN EVAPORACIJA KROMATOGRAFSKA

42% VFKS FRAKCIONACIJA H2O ME�ANJE 90% VFKS 55% VFKS

Shema 2 � Potek proizvodnje različnih visoko fruktoznih koruznih sirupov


7.4.4. Ciklodekstrini Ciklodekstrini so, kot �e ime samo pove, kro�no povezane glukozne molekule. Med naravne ciklodekstrine pri�tevamo tri tipe: alfa, beta in gama kompleks. Razlika med njimi je le v �tevilu med seboj z α-(1,4) vezmi ciklično povezanih glukoznih oz. D-glukopiranozilnih enot. Alfa ciklodekstrin je sestavljen iz �estih, beta iz sedmih, gama pa iz osmih. Pridobivamo jih tako, da s pomočjo encima ciklodekstrin glukanotransferaze konvertiramo �krobno molekulo v ciklodekstrine. Encim pridobivamo predvsem iz mikroorganizmov iz rodu Bacillus in Klebsiella. Edina slabost ciklodekstrinov je, da so slabo topni v vodi. Re�itev tega problema je bilo dodajanje različnih funkcionalnih skupin v obroč ciklodekstrina. Ciklodekstrini so zanimivi za aplikacijo v �ivilski industriji zaradi sposobnosti tvorbe kompleksov z raznoraznimi kemijskimi snovmi, kar s pridom uporabljamo tudi v �ivilski industriji. Ciklodekstrini se uporabljajo za bolj�o stabilizacijo produktov, za ohranjanje vla�nosti izdelka, dalj�o obstojnost barve, vonja in okusa izdelka, za izolacijo neza�eljenih vonjev in grenkih okusov in za povečevanje sposobnosti tvorbe emulzije in penjenja.

Slika 2 � Shematski prikaz zgradbe ciklodekstrina, Vir: www.cyclodex.com

Najpomembnej�a lastnost za tvorbo kompleksov ciklodekstrinov s hidrofobnimi molekulami, je prav njihova tridimenzionalna struktura. Tako lahko naprimer alfa-ciklodekstrini tvorijo tipične komplekse z alifatskimi hidrokarbonati pa tudi z plini, kot sta etilen in ogljikov dioksid. Beta-ciklodekstrin tvori komplekse z molekulami kot so naftoli ali steroidi, medtem ko lahko gama-ciklodekstrini sprejmejo kot gostujočo molekulo tudi vitamin D2. Ciklodekstrini lahko tudi stabilizirajo emulzije masti in olj, jih �čitijo pred oksidacijami in �arkostjo. Lahko se uporabljajo tudi za odvzem grenkih komponent v juice-ih � to je zelo pomembna lastnost, saj so včasih namesto da bi odstranili moteče komponente le te prekrivali s kak�nimi drugimi. Tudi pri fermentativnih procesih lahko najdemo zanimive lastnosti ciklodekstrinov, ki jih lahko uporabimo. Prvič, povečajo topnost organskih komponent. Drugič, reducirajo toksičnost, njihova koncentracija se lahko zmanj�a če se ve�ejo v komplekse z organskimi substancami in/ali produkti. Tretjič, so biokompatibilni � dokazano je, da ne povzročajo nobene �kode niti encimom niti mikrobni populaciji.


Za komercialno proizvodnjo ciklodekstrinov poznamo dva postopka: metodo pri akteri delamo z uporabo topila in metodo, pri kateri se topila ne poslu�ujemo. Postopek z uporabo topila usmerja encime, da proizvajajo dominantni produkt � CD. Pri tej metodi v pripravljalnem postopku na� bioreaktor napolnimo z �krobnim substratom, encimom in topilom. Substrat je navadno �e razgrajen �krob v obliki dekstrinov z največ 10 monomernimi enotami. Pri drugi metodi napolnimo bioreaktor samo z �krobnim hidrolizatom ter encimom. Zaradi odsotnosti topila oziroma kemikalij, ki bi preprečevale rast in razmno�evanje mikroorganizmov, moramo pri tem postopku postopati aseptično, da ne pride do kontaminacije predhodno steriliziranega reaktorja. Razmere v bioreaktorju so lahko zelo odvisne od tega kak�en dele� posamezne oblike ciklodekstrinov �elimo v produktu. pH se giblje med 6.0 in 7.0 � le ta je odvisen od tega, katere encime smo dodali v »pomoč« CGT-azam (npr. izoamilaze, amilaze, ...). Temperatura bioprocesa se giblje v temperaturnem območju 15 oC do 25 oC, kar je spet odvisno od pomo�nih encimov in vrste topila. Pri metodi s topilom po končanem procesu dobimo v reaktorju zmes netopnih ciklodekstrinov, ki so se povezali v kompleks s topilom. Naprimer: α-ciklodekstrin in 1-dekanol tvorita netopen kompleks, prav tako tudi β-ciklodekstrin z ciklo-oktanom. Poleg netopnih ciklodekstrinov so v manj�i meri zastopani �e �krobni hidrolizat (kot proizvod transglikolizacijskih in hidrolitskih reakcij) ter nekatere druge stranske proizvode. Pri metodi pri kateri ne uporabljamo topila moramo reakcijo v bioreaktorju končati tako, da CGT-aze inaktiviramo z povi�anjem temperature ali dodatkom kisline. Nato dodamo v reaktor �e α-amilazo, ki razgradi neciklične dekstrine, ciklodekstrinov pa ne more razgraditi. Pri prvi metodi moramo po končani konverziji v bioreaktorju ciklodekstrinski kompleks ločiti od drugih sestavin s centrifugacijo in filtracijo. Ko odstranimo iz kompleksa �e topilo dobimo topen ciklodekstrin, ki ga nato rafiniramo in kristaliziramo ter z njim postopamo kot s katerimkoli drugim �krobnim proizvodom. Kristale nato posu�imo. Zaradi izjemno dobre ločbe imamo v končnem proizvodu zelo malo primesi- pod 1ppm. Pri drugi metodi produkte najprej rafiniramo, nakar sledi evaporacija vode, da na tak način povečamo donos β-ciklodekstrinov, ki pa so najmanj topni a imajo dobro sposobnost kristalizacije, izmed vseh ciklodekstrinov. Kristale izločimo s centrifugiranjem ali z filtracijo, nato pa jih operemo z majhno količino vode in posu�imo. V proizvodnji hrane se ciklodekstrini uporabljajo za bolj�o stabilizacijo produktov, pri katerih je to mogoče, za ohranjanje vla�nosti izdelka, dalj�o obstojnost barve, vonja in okusa izdelka (�večilni gumiji), za izolacijo neza�eljenih vonjev in grenkih okusov (v sadnih sokovih naprimer), za povečevanje sposobnosti tvorbe emulzije in penjenja. 7.5. Povzetek Procesiranje �ivil z uporabo encimov nam ponuja mnoge prednosti. Amilolitični encimi so si prislu�ili pozornost zaradi njihove sposobnosti kataliziranja mnogih reakcij pod zmernimi pogoji, ki jih pri kemičnem procesiranju oziroma nespecifični hidrolizi ne moremo doseči. Tehnike encimske izolacije so uspe�ne, �e posebno pri proizvodnji fruktoznega sirupa. Bile so tudi izbolj�ane po �elji, da bi bila produkcija maltodekstrinov, glukoze ali maltoze bolj ekonomična in da bi dala večji izkoristek.


Maltodekstrini so pomembne sestavine hrane, ki prispevajo �irok rang uporabnosti. Ena od teh je, da so lahko nadomestek za ma�čobe. Finančni izračuni so pokazali, da bi take snovi lahko prina�ale večji dobiček kot pa nadomestki sladkorja. Leta 91 so kar dve tretjini prebivalstva ZDA uporabljale proizvode z nizko ali reducirano količino ma�čob. Poznamo 2 tipa porabnikov takoimenovane lahke hrane: tiste ki pazijo na dieto, ter tiste ki pazijo ali na kalorično vrednost, vsebnost ma�čob ali zdravstveno osve�čenost. Taki porabniki so pomembno tr�i�če. Medtem ko zahteve tr�i�ča po sladilih pridobljenih na �krobni osnovi nara�ča, pa tudi pomembnost visoko maltoznih in visoko fruktoznih sirupov nara�ča, saj so industrijski proizvodi, ki jih lahko uporabljamo kot sestavino v prehrani. Proizvodnja sirupov, ki vsebujejo maltozo nara�ča zadnjih nekaj let na Japonskem in ZDA, pa tudi Evropi napovedujejo podobno rast. Povpra�evanje po fruktoznem sirupu pa je dramatično naraslo v ZDA, predvsem za potrebe izdelave sladkih pijač. Uporaba ciklodekstrinov je vsestranska - od uporabnosti v farmaciji, kjer lahko slu�ijo kot dostavljalne molekule (v ciklodekstrin porinemo zdravilo, in le ta se nato v črevesju počasi absorbira iz ciklodekstrinov), kot povečevalce arome in vonja, odstranjevanje neza�eljenih substanc iz hrane (npr. kafeina). Glede na njihov velik potencial in medtem ko njihove cene padajo, pričakujemo veliko zanimanja in raziskav na tem področju. Pomembno bi bilo, da se bi natančno raziskala struktura CGT-aze, zato, da bi lahko ustvarili bolj specifične alfa in gama CGT-aze ali pa celo CGT-aze, ki bi sintetizirale ciklodekstrine z več kot osmimi glukoznimi ostanki. Medtem ko �ivilska industrija i�če in razvija nove amilolitične encime in nove procese obdelave �kroba, da bi zadostili visokim zahtevam porabnikov, bo prodaja in uporaba teh encimov �e vedno nara�čala. 8. REFERENCE • Abram, V., 1998. Vaje iz biokemije, BF Oddelek za �ivilstvo, Ljubljana, s. 29 � 31. • Atkinson, B./ Mativuna, F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook,

Stockton press, s.552-553. • Encyclopaedia of food science, food technology and nutrition. Vol.1. 1993. Macrae, R.

ed., Robinson, R.K.ed., Sadler, M.J. ed. London, Academic Press, s. 1909-1912. • Encyclopedia of Microbiology. 2nd ed. Editor-in-Chief Joshua Lederberg. ed. London,

Academic Press, s. 225. • Encyclopaedia of Microbiology, Vol.1, 2000, Academic Press, s. 171-178. • Goes, A. P./ Sheppard, J. D., Journal of Chemical Technology and Biotechnology (1999). • Guzman-Maldonado H./ Paredes-Lopez O. 1995. Amylolytic Enzymes and Products

derived from Starch: A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. CRC Press, Inc. s. 35(5): 373-403.


• http://bab.portlandpress.co.uk/bab/026/bab0260051.htm, 26. 12. 2000. • http://goldbridge.com/web/cyclodex.html, 25.12. 2000. • http://www.cyclodex.com, 26. 12. 2000. • http://www.nalusda.gov/ttic/tektran/data/000007/33/0000073334.html, 26. 12. 2000. • http://www.pinsonsfitness.com/cyclodextrin.html, 26. 12. 2000. • Kovač Boris, 1993, Obogatitev mlevskih odpadkov z biomaso plesni Aspergillus oryzae,

s. 5,6. • Kregar, I. 1987. Uporaba imobiliziranih encimov v �ivilski industriji. V: 10. Bitenčevi

�ivilski dnevi 87: Encimi v �ivilstvu, Ljubljana, 19. In 20. November 1987. Ljubljana, BF Oddelek za �ivilstvo, s. 21.

• Kregar, I. 1992. Metode izolacije encimov, Biotehnologija., P. Raspor, 1992, s.325 � 338. • Novo-Nordisk (prospekt) Novo Nordiskovi encimi v industriji �ivalske hrane; Bio-Feed

Alpha. • Radojčevič, M./ Mihajlovič, B./ Tvrdič B. 1971. Mikrobiologija. Zavod za izdavanje

učbenika SRS, Beograd. s. 318-324. • Schlegel, H. G., 1995. General Microbiology. Cambridge University Press, s.455-457. • Schwardt, E., Production and use of enzymes degrading starch and some other

polysaccharides, Food Biotechnology., 4, 337, 1990. • Strah, S. 1999. Uporaba encimov v �ivilstvu.

proizvodnja amilaz -...

Documents