ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Bioinsecticidas: Bacillus sp. como larvicida de Anopheles sp.

ASIGNATURA :

Microbiología Industrial

DOCENTE :

MSc. Carmen Carreño Farfán

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - I

Lambayeque, setiembre de 2007.

INDICE

I. Introducción:..........................................................................................................2

II. Generalidades sobre la producción de bioinsecticidas............................3

a. El problema: Enfermedades transmitidas por mosquitos al hombre..........3

b. Las posibles soluciones.....................................................................................4

i. El control químico...........................................................................................4

ii. Control biológico.............................................................................................5

III. Bacilos productores de bioinsecticidas: Bacillus thuringiensis var

israelensis......................................................................................................................6

a. Generalidades.....................................................................................................6

b. Ecología de B. thuringiensis.............................................................................7

c. Toxinas y mecanismos de acción de B. thuringiensis..................................7

IV. Aplicaciones y producción industrial de B. thuringiensis....................8

a. B. thuringiensis como bioinsecticida................................................................8

Ventajas...................................................................................................................8

Desventajas............................................................................................................9

b. B. thuringiensis como gen transgénico en plantas........................................9

c. Producción Industrial de B. thuringiensis var. israelensis para la

producción de bioinsecticidas...................................................................................9

V. Desarrollo de la parte práctica:......................................................................12

a. Objetivos:..........................................................................................................12

b. Procedimiento:................................................................................................12

c. Resultados:......................................................................................................13

d. Conclusiones:.....................................................................................................15

VI. Referencias:.....................................................................................................16

VII. Anexos:.............................................................................................................17

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Bioinsecticidas: Bacillus sp. como larvicida de Anopheles sp.

I. Introducción:

En culturas antiguas se conocían enfermedades que afectaban a los insectos de interés económico, como el gusano de seda (Bómbix mori L.), a la abeja (Apis mellifera L.). Con el descubrimiento del microscopio se detectaron algunas de las bacterias responsables.

La sintomatología en los insectos enfermos indujo a pensar que los agentes etiológicos eran bacterias. Pasteur en 1870 describió una de esas bacterias llamada Vibrion anoyac, luego reclasificada como Bacillus bombycus. En 1902 Ishiwata aisló de larvas enfermas del mismo gusano una bacteria que denomino Bacillus soto. Berliner en 1915 en Turingen, Alemania, aisló de larvas enfermas de la palomilla del Mediterráneo Anagosta kuehniella L), hoy conocido como Bacillus thuringiensis o Bt, que produce cristales con actividad insecticida, desde 1954 se estableció la relación entre la ingestión de los cristales de la bacteria y la parálisis intestinal del insecto, porque éstos no tienen toxicidad por otra vía en humanos y/o animales. Un análisis de 161 aislados de Bt propusieron una clasificación con base a sus antígenos flagelares H, a pruebas bioquímicas para establecer 24 serotipos H y 33 variedades de la bacteria.

En 1977 en la región de Neveg en Israel, se asiló la variedad de Bt con rápida actividad larvicida sobre mosquitos de los géneros Anopheles, Uranotaenia, Culex y Aedes, los aislados de Bti tienen actividad toxica contra larvas de mosquitos, en función del medio de cultivo, la condición de crecimiento, sin asociación entre la cantidad de espora y la toxicidad de los cristales, en la actualidad se busca mejorar la producción y toxicidad de los cristales de Bt.

Estos y otros descubrimientos llevaron al desarrollo y aplicación de diversos “bioinsecticidas” a base de estos tipos de microorganismos, para el control de mosquitos vectores transmisores de enfermedades en el hombre. El orden Diptera corresponde a los mosquitos de importancia médica, porque algunas de sus géneros y especies son vectores de enfermedades como: paludismo, fiebre amarilla y dengue, además son responsables del elevado costo económico de las campañas para su erradicación, en zonas endémicas del mundo (sobre todo en Sudamérica), así como por el valor económico a largo plazo del tratamiento médico de los enfermos.

Desde 1950 se realizan campañas de control vectorial de estos insectos en países como México, ya que con la aspersión de pesticidas: DDT, metoxicloro, y organofosforados como: el abate, el malatión, el paratión,el feniton etc., estos fueron al principio efectivos, pero su uso indiscriminado provoca deterioro ambiental e inducen resistencia en insectos-plaga.

En la actualidad 500 especies de estos son resistentes a uno o más pesticidas, el número se duplica en un periodo de 6 años, son imprescindibles, aunque existe la tendencia a minimizarlos.

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Una alternativa para el control de dípteros es el biológico como: los peces larvívoros del género Gambusia affinis; los nemátodos del tipo Rabdítidos y Mermítodos, así como los protozoarios parásitos de los géneros: Epystilis, Vorticella y Terahymena; hongos entomapatógenos: Beauverya, Entomophora, Metarrhizium y Coelelomyces spp; de los, virus parásitos de insectos como: la poliedrosis nuclear, iridiscentes, etc. Entre las bacterias se reportó: Bacillus popilliae B. sphaericus y B. thuringiensis (Bt), cada una controla plagas con oportunidades de explotación y uso depende de sus propiedades específicas, por ejemplo B. popilliae requiere insectos vivos para su reproducción. En contraste Bacillus thuringiensis var israliensis (Bti) es específico para dípteros una alternativa en el control biológico.

II. Generalidades sobre la producción de bioinsecticidas.

a. El problema: Enfermedades transmitidas por mosquitos al hombre.

- Paludismo: Enfermedad llamada también Malaria es una de las más antiguas de la humanidad, citada en documentos chinos y papiro egipcios desde el siglo I A.C. Los romanos Marco Terencio Varrón y Columela asociaron su propagación con la existencia de mosquitos. En 1631 Juan de Vega usó la infusión de la corteza de la quina para su curación. En 1880 Lavoran descubrió que Plasmodium vivax como el agente etiológico. En 1897 Ross identificó su vector, el díptero del género Anopheles. Esta enfermedad fue introducida en México en 1519 por los conquistadores españoles, en la época precolombina existían anofelinos sin paludismo, no obstante P. vivax se adaptó a estos y les usa hoy como vectores para iniciar epidemias con elevada mortalidad en los pobladores de este país. En la actualidad el paludismo es un problema grave de salud pública; en los últimos 10 años ha sido una de las principales causa de mortalidad a nivel nacional. En los 50 fue la enfermedad más extendida en el mundo, afectó millones de personas, y provoco la muerte de otros millones. El trasmisor del paludismo es la hembra de mosquito del género Anopheles, con sus especies más comunes: A. quadramaculatus, A. pseudopunctipennnis y A. alimanus. Para el control y erradicación de los vectores de la enfermedad se aplican: DDT (Diclaro-difenil-tricoloro etano), hexacloro-benceno, clordano, dadas las consecuencias negativas al ambiente se propone nuevas alternativas de control, como Bti para eliminar las larvas de estos insectos vectores.

- Dengue: Es una virosis humana causada por uno de los cuatro serotipos de flavovirus, es endémico en áreas tropicales y subtropicales del mundo, su existencia esta condiciona a la del mosquito Aedes aegypti, por lo cual la población humana potencialmente afectada es de 1,500 millones en 61 países sin incluir las áreas donde se registra dengue hemorrágico, con 350 millones. A. aegypti es un eficaz vector, ya que con un solo mosquito entre 100 es suficiente para iniciar una epidemia, este insecto es antropófilo estricto y su poca capacidad de vuelo horizontal como vertical, favorece su adaptación en zonas urbanas, lo que explica el aumento del dengue en América en los

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últimos 25 años, es el resultado del incremento de sus dispersión. La reciente introducción de Aedes albopictus en América agrava esa situación, pues es un vector accesorio del dengue Asia, además se le identifica en Brasil y Estados Unidos. El dengue hemorrágico ó serotipo es la forma más patógena, alcanza un 40% de mortalidad infantil, en México y el Caribe en donde existen las condiciones ambientales para que aparezca en el futuro. El control más que la erradicación de dengue se intenta con campañas contra el vector o con nuevas vacunas, los intentos por controlar a A. aegypti han tenido poco éxito ya que lo que favorece su propagación es el desecho de cantidades ilimitadas de recipientes en la formación de incubadores para sus larvas, el alto costo de aspersión de insecticidas, al igual que el impacto negativo en los ecosistemas. Lo anterior apoya la nuevas alternativas de control, como el biológico como B. sphaericus y Bti para la solución de este problema.

- Fiebre amarilla: Esta enfermedad es causada por un serotipo de flavivirus. La fiebre amarilla (FA) es una forma selvática que existe entre los primates de África, Centro y Sudamérica, se trasmitió por mosquitos de bosques o matorrales a la forma urbana. El vector es A. aegypti. Este insecto trasmite el virus hasta 168 días después de ingerido de sangre de un enfermo con FA, se reporta un período de incubación de 3 a 6 días con un inicio rápido de la enfermedad, los síntomas ligeros de una semana, se manifiestan por fiebre, cefalea, dolor muscular, vómito y fiebre alta con síntomas hemorrágicos; la FA se distribuye en los trópicos húmedos de África, Centro y Sudamérica.

b. Las posibles soluciones

i. El control químico.

Antes de la Segunda Guerra Mundial, los insecticidas disponibles eran compuestos inorgánicos: arsenato de plomo, derivados del petróleo e insecticidas naturales como los piretroides; durante los años 30, se diseñaron los orgánicos sintéticos, con la guerra al disminuir el suministro de derris y el pelitre de los trópicos. La empresa suiza Geigy descubrió las propiedades del DDT en Alemania se descubrieron los órgano-fosforados e hidrocarburos clorados, una fuente efectiva de insecticidas, en los primeros años de su empleo fueron ideales en el control de plagas agrícolas y de salud pública como el paludismo en el mundo. Desde la década de los 50 y 60 surgieron problemas de tipo: resistencia artrópodos en promedio de 200 especies lo hacen a uno o más, brotes secundarios de plagas distintas a las originales de aquellas contra las que se dirigió el control inicial, el rápido resurgimiento de las plagas tratadas en los 80 y finales de los 90, que requieren mayor número de aplicaciones, con alta residualidad tóxica a humanos, ganado y la vida silvestre, que causan la contaminación del agua, suelo, aire, riesgo en la manipulación de insecticidas, y el costo creciente en su producción y aplicación.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) inició en 1951 en México un programa de erradicación de paludismo, con el DDT como el

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principal agente de control en las campañas antiaedes y antipalúdicas, en los sitios inaccesibles se aplicó Dieldrin una vez al año, desde 1959, se detectó resistencia de Anopheles albimanus y A. pseudopunctipennis al Dieldrin, en 1963 la tolerancia de los anofelinos al DDT, pero se declaró erradicado A. aegypti de México, regreso en la década de los 70 por el sureste, con resistencia a organoclorados y organofosforados. En la actualidad hay resistencia a por lo menos un insecticida en 20 especies de Aedes, 15 de Culex y 5 de Culiseta. El comité de expertos en resistencia de especies de anofelinos de la OMS reconoce más de 51 especies.

Por lo anterior se infiere que el control de insectos no debe basarse solo en el uso de insecticidas químicos, además en 1991 se publicó la prohibición y restricción de 40 plaguicidas tipos distintos de plaguicidas, la Asamblea Mundial de Salud, recomendó un nuevo método de lucha antivectorial y el interés por el control biológico, las investigaciones sobre enemigos naturales de los vectores, los candidatos se clasificaron en 5 grupos, en función de las investigaciones de bajo, mediano, o alto potencial; con prioridad 1 y posibilidad de aplicación: el pez y larvívoro Gambusia affinis y Bti.

ii. Control biológico.

El uso de bioplaguicidas (bioinsecticidas) resultó como una alternativa a las cada vez mas notorias desventajas del control químico empezado por varios países alrededor de la década del 50’. Los descubrimientos realizados de bacterias tanto productoras de toxinas como bacterias parásitas con elevado potencial para uso como controladores biológicos de insectos plaga a abierto una gran expectativa tanto en el campo científico como industrial.

Las bacterias utilizadas como controladores biológicos se dividen en cuatro grupos con base en su efecto sobre el insecto-plaga:

Patógenos obligados: Bacillus popillae y B. larvae, este grupo es específico para un hospedero y no crecen en medio de cultivo artificial. Bacillus formadores de esporas y cristales: como B. sphaericus y B. thuringuiensis var. israelensis. Su principal característica es la síntesis de toxinas de naturaleza proteica con acción tóxica intestinal contra larvas de dípteros (mosquitos).Patógenos facultativos: Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter spp y Serratina mercences. Tienen uno o varios hospederos de la misma especie de insecto al que infectan. Su capacidad potencial como patógeno en humanos los excluye como una alternativa segura.

La OMS desde 1984 seleccionó B. sphaericus y B. thuringuiensis var. israelensis (Bti H-14), por su eficacia en la eliminación de larvas de mosquitos, Bti es diferente a otros agentes de control por su alto grado de especificidad, seguridad ambiental y compatibilidad con otras formas químicas o biológicas de control, propiedad del mejor bioinsecticida, su manejo exige un cuidado especial pues es un producto biológico, es necesario conocer la biología de las especies de

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insectos que se combaten al igual que reducen su eficacia; actualmente existen productos en el mercado mundial elaborados con base a otros microorganismos, aunque ninguna de las formulaciones es efectiva en baja concentración; se recomienda antes de usar pruebas de susceptibilidad que determinen el grado de respuesta, se sugieren análisis locales, regionales e incluso nacionales, para el seguimiento de estos productos.

III. Bacilos productores de bioinsecticidas: Bacillus thuringiensis var israelensis

a. Generalidades.

Según su ubicación taxonómica (de acuerdo al manual de Bacteriología Sistemática de Bergy), B. thuringuiensis se clasifica en:

Reino : ProcarioteDivisión II : FirmicutesClase I : FirmibacteriaOrden : EubacteriasFamilia : BacillaceaeGénero : Bacillus

Especie :Bacillus thuringiensis var. israelensis

B. thuringiensis es una bacteria Gram positiva, aeróbica, esporógena, heterótrofa y con la propiedad distintiva de sintetizar uno o más cristales con actividad insecticida, su ciclo de vida tiene dos fases: la vegetativa y la de resistencia (generan esporas). La primera es la bacteria, tiene una forma bacilar con un tamaño promedio de 2-5 micras de largo por 1 micra de ancho, la división celular es por fisión binaria. La fase de resistencia (esporulación) se induce por condiciones adversas del medio de cultivo como: baja concentración de nutrientes, pH ácido, disminución de la humedad, reducción del nivel de O2; la composición química de la cubierta de la espora le confiere termorresistencia, le protege contra la desecación. En un ambiente adecuado la espora germina y da lugar a la fase vegetativa. Simultáneamente a la formación de esporas, se producen cristales proteicos, que varían en su composición, según la variedad (población de organismos de una misma especie, que se pueden diferenciar por su comportamiento, pruebas bioquímicas, etc.) y pueden alcanzar hasta el 30% del peso seco de la célula vegetativa. Los cristales ó delta-endotoxina, tienen propiedades insecticidas para larvas de lepidópteros, coleópteros y dípteros. Los genes responsables de la formación de los cristales se encuentran codificados en plásmidos. Los antígenos flagelares de Bti denominados H y algunas pruebas bioquímicas como: hidrólisis de caseína, producción de la catalasa, reducción de nitratos, se emplean para su

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determinación taxómica y clasificación.En la actualidad se consideran 24 serotipos caracterización

bacteriana con base en la respuesta antígeno-anticuerpo y 33 variedades.

b. Ecología de B. thuringiensis

La bacteria es parte de diversos ecosistemas como: bosques, selvas y sabanas y desiertos. La espora de B. thuringiensis supervive por varios años, germina se multiplica como células vegetativas en ambientes naturales, su existencia está relacionada con lugares de elevadas densidades de insectos, el número de esporas de la bacteria en graneros es alta en relación a otros hábitat de acuerdo con ciertas condiciones ambientales: como la temperatura y la humedad constante, mientras que la ausencia de radiación solar permite que permanezcan viables. En relación a los hábitats naturales y los artificiales como los graneros, existe controversia en su distribución, investigación en el agrosistema del Bajío Guanajuatense (Guanajuato, México para determinar la existencia y supervivencia de esporas de Bt en algunas malezas, en hojas de cultivos agrícolas como el fríjol y maís, en insectos saprobios y en el suelo, revelaron la existencia de esporas en el filoplano de esas malezas y en el suelo cultivado con maíz, pero no en las hojas de las plantas cultivadas, ni en los insectos y/anélidos del suelo con los que se asocian, las esporas viables de Bti, se detectaron hasta 4 días después de su aplicación (34 ), lo que explica porque solo en los graneros se reportan epizootias con miles de insectos muertos por los cristales de Bti.

c. Toxinas y mecanismos de acción de B. thuringiensis

La investigación sobre la bioquímica de B. thuringiensis reporta que el cristal no es tóxico en su totalidad; está dividido en regiones o subunidades de proteína, las cuales tienen actividad enzimática proteolítica similar a la tripsina del insecto. La ingestión de cristales y esporas por el insecto revela una interacción entre el cristal y el intestino del hospedero. Cuando un insecto susceptible los ingiere sus enzimas digestivas los hidrolizan en el ambiente alcalino de su intestino, lo que se causa daño en las células epiteliales de la pared intestinal. Las células expuestas no responden uniformemente, las de tipo cuboide o columnas se deterioran en estructura en las microvellosidades y en la membrana celular, dilatación de la cisterna del retículo endoplásmico rugoso y dispersión de los ribosomas, los núcleos no se afectan, sin embargo las mitocondrias se hinchan, los cambios fisiológicos son insuficientes para el transporte de iones y permeabilidad, se agota el ATP disponible, con cambios patológicos como: vacuolización celular, hinchamiento y lisis, así el insecto muere en menos de una hora o en varios días, depende de la dosis ingerida. Cuando una larva consume cristales sin espora ocurre una secuencia idéntica de estos eventos, en consecuencia la parálisis y muerte del insecto, en donde las esporas son pasivas hasta que el pH disminuye a 7, lo que estimula su germinación,

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ya que las esporas superviven en casos específico, como en graneros lo cual provoca epizootia por la invasión masiva de Bt en el insecto.

IV. Aplicaciones y producción industrial de B. thuringiensis

a. B. thuringiensis como bioinsecticida

Hasta 1978 no se había producido ningún insecticida microbiano para combatir plagas de insectos de valor médico y veterinario, pero a partir del descubrimiento de B. thuringiensis, se empezaron a elaborar a escala industrial. La preparación del bioinsecticida es una mezcla de esporas y de cristales, que causan la muerte en poco tiempo de que larvas de culícidos y simúlidos que se intoxican y no por septicemia. El modo de acción del complejo espora-cristal de B. thuringiensis tiene semejanza con insecticidas convencionales, con la diferencia de que en los químicos se especifica el control de calidad del ingrediente activo y sus propiedades físicas y químicas, mientras que un insecticida de B. thuringiensis H-14 no específica con precisión la concentración de ingredientes activos, en general se realiza un bioensayo para comparar la toxicidad de una preparación conocida de B. thuringiensis var kurstaki, contra la formulación de B. thuringiensis H-14 de potencial conocido, la bacteria se maneja para evitar que pierda toxicidad en el almacenamiento, de acuerdo con sus propiedades se vende para suspensión acuosa, emulsión en polvo humectable y gránulos, ya que los ingredientes espora/cristal son insolubles, pero los cristales si, se aprovecha que las larvas de mosquitos vectores de enfermedades infecciosas son insectos filtradores cuando ingieren alimento en ambientes naturales.

El uso de un microorganismo o sus metabolitos en cantidades industriales para eliminar un insecto blanco no debe tener riesgo para el ambiente y/o humanos.

La OMS diseñó un esquema de 5 fases que evalúa la efectividad y la seguridad de productos biológicos aplicados en el control de plagas agrícolas, forestales, urbanas, etc., el esquema considera lo siguiente:

1) No causar infección al hombre, mamíferos y otros animales2) No ser tóxico3) No provocar alergias 4) Ningún tipo de caracinogénesis 5) Ningún tipo de infecciones orales, respiratorias, parentales

Además, B. thuringiensis H-14 no es tóxico para mamíferos u otros animales no blancos excepto el mosquito.

Entre las ventajas y desventajas del uso B. thuringiensis como agente de control biológico tenemos:

Ventajas.- Alta especificidad para controlar larvas de las

familias: Culicidae, Simulade y Psichodidae. - Seguridad ambiental, no daña mamíferos u otros

organismos no blanco, a excepción del culícido Toxorhynchites spp

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depredador de larvas de mosquitos. - Alta virulencia solo para el insecto vectores, tiene un

efecto tóxico relativamente rápido contra mosquitos. - B. thuringiensis es compatible con otras formas de

control físico, químico y biológico de mosquitos, sin evidencia de que induzca inmunidad humoral o celular, tampoco heredabilidad en el insecto-plaga.

Desventajas- No tiene efecto residual, pero si alta especificidad por ello pocas

compañías se interesan en su manufactura, lo que limita su espectro de control de insectos-plagas, exclusivamente a mosquitos.

- Elevado costo producción con lo que un mínimo de gobiernos se interesan en su producción masiva y la necesidad de investigación para reducir los costos de producción.

- Formulaciones de eficacia variable contra mosquitos en ambientes naturales, por que se trata de un ser vivo sujeto a las condiciones en los que se cultiva.

b. B. thuringiensis como gen transgénico en plantas.

La ingeniería genética se ha utilizado para la introducción de genes de B. thuringiensis en cultivos afín de conferir resistencia a insectos-plaga. La primera planta-Bt se desarrolló hacia 1987 con tabaco (Nicotiana tabacum) para controlar larvas de primer instar de Manduca sexta. Perlack en 1990 produjo algodón resistente a plagas de insectos donde la secuencia codificante para las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac fue modificada para aumentar los niveles de expresión hasta alcanzar porcentajes entre 0.05 a 0.1% del total de proteína soluble. Fujimoto en 1993 transformaron arroz con el gen cry1Ab. Desde allí las δ-endotoxinas han sido transferidas y expresadas en por lo menos 26 diferentes especies de plantas.

Estos cultivos presentaron una disminución importante en uso de plaguicidas químicos dejando ganancias promedio de 60 millones de dólares para algodón, entre 19 y 190 millones para maíz. Todas las plantas transgénicas a base de Bt son comercializadas por el sector privado. De las patentes con relación a Bt, más de la mitad son de Norte América, 30% de organizaciones europeas y rusas y el 18% principalmente de compañías japonesas. El 57% de las patentes en plantas transgénicas con Bt han sido registradas e implementadas por unas pocas compañías siendo algunas de ellas Monsanto, Micogen, Novartis, AgrEvo, Pioneer, Hi-Bred Internacional, DeKalb Genetics Corporation. Los productos más avanzados incluyen algodón, maíz, maíz dulce, papa, tomate, aceite de semilla de canola (Cerón, 2004).

c. Producción Industrial de B. thuringiensis var. israelensis para la producción de bioinsecticidas.

La selección de un aislado silvestre de B. thuringiensis var.

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israelensis (Bti) y su capacidad efectiva para producir cristales tóxicos y posible manipulación genética para mejorarla, al igual que sus requerimientos nutricionales, son aspectos fundamentales en la producción del bioinsecticida a base de esta bacteria una etapa clave en el proceso de escalonamiento masivo para la producción de la delta-endotoxina, y su posterior formulación y aplicación a nivel de campo. Es necesario el diseño de un medio de cultivo (o de fermentación) adecuado, apto para el crecimiento, esporulación y formación de los cristales de Bti, pues de ello depende la calidad tóxica del cristal; en ese sentido el medio de fermentación debe contener una fuente de carbono, de nitrógeno orgánico y sales minerales que en balance estimulen el crecimiento, la esporulación y la producción de cristales altamente tóxicos. En términos del tipo de constituyentes, las fuentes de carbono más empleadas son: la glucosa, el almidón y sacarosa, reconocidas como esenciales para la síntesis de cristales, aunque se pueden utilizar como fuente de carbono materias primas baratas, como productos de maíz hidrolizado (almidón y dextrinas), al igual que jugo de agave y melaza de caña (fructosa), con excelentes resultados sobre la esporulación y calidad tóxica del cristal. Cabe mencionar que la melaza de caña se considera una materia prima adecuada como fuente de carbono, de bajo costo con efectos positivos sobre la toxicidad de la delta-endotoxina. Es claro que la ausencia de una fuente adecuada de C para Bti, causa una disminución en la producción de esporas y en la formación y calidad de la deltaendotoxina.

En el caso de fuentes de Nitrógeno se ha reportado que Bti requiere de aminoácidos esenciales y otras formas orgánicas de nitrógeno durante su fase de crecimiento y durante la esporulación. En general en los medios de cultivo comerciales se han empleado proteínas de semilla y/o agua de cocimiento de maíz, otras alternativas más baratas han sido obtenidas de fuentes naturales como la harina de pescado, de la semilla de algodón, o de leguminosas como la soya, el garbanzo, la haba, el cacahuate y las lentejas, o bien de líquido de remojo de maíz; de residuos de levadura, de sangre de res, del suero de queso y productos secundarios de la industria láctea, esta clase de materia prima estimula la biosíntesis de la delta-endotoxina con alta actividad insecticida. Para los minerales se ha señalado al Mn+2, K+1, Ca+2 y Zn+2 como elementos componentes necesarios en el medio de fermentación para la producción de la delta-endotoxina. También se reportó el aislamiento de un Bti en un medio que contenía dextrosa, extracto de levadura K2HPO4 y KH2PO4 y presentó los mejores niveles en la producción de la delta-endotoxina y se recomendó el uso de substratos baratos como harina de semilla de algodón y harina de soya. Se describió un medio de fermentación con glucosa, peptona de soya, extracto de levadura y líquido de remojo de maíz y sales minerales del tipo: KCl, (NH4)2SO4, HPO4 , MgSO4 , CuCl2 , FeSO4, ZnSO4 y MnSO4 , con el que se logró un alto rendimiento en la esporulación y cristales tóxicos de excelente calidad. Por lo tanto, los medios de cultivo para Bti deben contener sales minerales para la síntesis de energía, estimular el crecimiento y la esporulación, y

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factores de crecimiento como: extracto de levadura (como una fuente de vitaminas del complejo B), pues su omisión retarda la esporulación y reduce la formación de cristales y en consecuencia la toxicidad del complejo espora/cristal. Para Bti, la combinación de factores nutricionales orgánicos e inorgánicos es esencial en la síntesis de la delta-endotoxina de alta toxicidad, así que el uso de materiales de bajo costo como componentes del medio de cultivo, es básico en la optimización del proceso de producción bioinsecticidas a base de Bti. En consecuencia para el diseño de medios de cultivo o fermentación sugiere:

1) Que sus componentes sean fácil de manejar o que no requieran pretratamiento 2) Que permitan optimizar el crecimiento de la bacteria sin afectar negativamente la calidad de la delta-endotoxina 3) Que sean baratos y abundantes 4) Que sean de fácil adquisición en la localidad.

Es importante señalar que una formula basada en la combinación de nutrientes para una variedad de Bti, no necesariamente es adecuada para otra variedad, por lo que la calidad de la delta-endotoxina depende tanto del medio de cultivo como del aislado de Bti utilizado. Aunque obviamente, el diseño del medio y la bacteria no son los únicos aspectos involucrados en la producción del bioinsecticida, existen otras variables que deben considerarse en el proceso de la fermentación como: la temperatura óptima de crecimiento de Bti oscila entre los 28 y 32ºC; la cantidad de oxigeno suministrado a la bacteria, la velocidad de agitación para asegurar un suministro de oxigeno adecuado en el medio de cultivo y evitar la acumulación del calor y evitar la inhibición o reducción de la calidad tóxica de los cristales; así como el pH inicial óptimo de entre 6.8-7.2, ya que al oxidar los carbohidratos produce ácidos orgánicos, lo que se soluciona con neutralización con álcali.

Para la producción del bioinsecticida a escala industrial es necesario un proceso de escalonamiento. El escalonamiento se define como el conjunto de técnicas y métodos empleados para transferir a una escala mayor (escalamiento ascendente) o menor (escalamiento descendente) un microorganismo o un producto biológico como la deltaendotoxina y, determinar su factibilidad económica en un proceso industrial. En el escalamiento se requiere el uso combinado e integrado de métodos y principios de ingeniería química, bioquímica, microbiología y genética. Los estudios de laboratorio y de planta piloto son útiles para definir las operaciones unitarias de mayor importancia en el proceso de escalamiento, como en el caso del bioinsecticida a base de Bti, en donde el diseño del medio de cultivo es esencial en la optimización de la producción del complejo espora-cristal, también es necesario un diseño experimental a nivel de fermentador, el cual en función de su capacidad, el equipo instalado y los recursos disponibles, hará posibles la obtención de altamente cristales tóxicos de Bti.

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Shock térmico80 °C/ enfriar

Sembrar

Agar Nutritivo28°C/48h

V. Desarrollo de la parte práctica:

a. Objetivos:

- Aislar Bacillus sp.- Seleccionar Bacillus sp. en base a su potencial

biocida a larvas de Anopheles sp.- Identificar la especie de Bacillus.- Conservar la cepa de Bacillus sp. controladoras de

Anopheles sp.

b. Procedimiento:

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Muestra 10-210-1 10-3

Tinción Gram(Bacillus esporulados)

Repicar

SuspensiónN° 06 Nefel.

Control Químico Cepa Bacillus Control Absoluto

Cepa Bacillus

c. Resultados:

Tabla 01: Número de larvas muertas

y vivas de Anopheles sp. frente a aislamiento de Bacillus sp., y control químico

(insecticida químico)

HORASControl absoluto

Cepa Bacillus

Control químico

Muertos Muertos Muertos0 h 0 0 024 h 0 1 248 h 1 2 372 h 1 2 1

TOTAL 2 5 6

13

10 ml

Tabla 02: Porcentaje de mortalidad de

larvas de Anopheles sp. a las 24, 48 y 72 horas, luego de aplicados los tratamientos.

Porcentaje de mortalidad corregida para cepa de Bacillus sp.

Porcentaje de mortalidad corregida para control químico

HORASControl absoluto

Cepa Bacillus

Control químico

% Muertos % Muertos % Muertos0 h 0 0 024 h 0 20 3348 h 50 40 5072 h 50 40 17

TOTAL 100 100 100

% Corregido =71 - 29

x 100100 - 29

% Corregido = 59.15 %

% Corregido =86 - 29

x 100100 - 29

% Corregido = 80.28 %

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Fig. 01: Número de larvas muertas de Anopheles sp. por día

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 h 24 h 48 h 72 h

Tiempo de evaluación (h)

Nº de larvas

muertas

Control absoluto

Cepa Bacillus

Control químico

d. jsjaksja

d. Conclusiones:

- A partir de la suelo se obtuvo dos aislamientos de Bacillus sp. - De los dos aislamientos de Bacillus sp. evaluados, se mostró un efecto

biocida de 59.15% sobre las larvas de Anopheles sp. hasta las 72 horas de iniciado el bioensayo.

- La mortalidad corregida a las 72 horas del control químico fue de 80.28%.

- La cepa aislada de Bacillus sp. mostró una efectividad biocida moderada, muy parecida a la del control químico.

15

59.15

80.28

0

20

40

60

80

100

Porcentaje

% Mortalidad controlquímico

% Mortalidad cepaBacillus sp

Fig. 02: Comparación del porcentaje de mortalidad corregida entre control químico y

Bacillus sp.

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VI. Referencias:

- E. LEUCONA, Roberto (2002) Situación actual y perspectivas de uso de bioplaguicidas en Latinoamérica. Conferencia “Producción y uso de agentes microbianos para el control de plagas”. Buenos Aires.

- SOBERON, M. y A., BRAVO (2003) Bacillus thuringiensis y sus toxinas. Deparatamento de Microbiología Molecular. Universidad Autónoma de México. Mexico D.F.

- FERNANDEZ, C. y R. JUNCOSA (2002) Biopesticidas: ¿la agricultura del futuro? FuturEco SL. Barcelona.

- E. FLORES, A. y colbs. (2001). Resistencia a insecticidas en insectos vectores de enfermedades con énfasis en mosquitos. Laboratorio de Entomología Médica. Universidad Autónoma de Nuevo León. España.

- SANCHEZ YAÑEZ, Juan M. (2001). Producción de bioinsecticida a base de Bacillus thuringiensis: Minirevisión. Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. México.

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VII. Anexos:

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Lista de serotipos de Bacillus thuringiensis usados en el control biológico de plagas agrícolas urbanas y forestales.

No. Serotipo Variedad

1 H 1 thuringiensis

2 H 2 finitimus

3 H 3ª alesti

4 H 3a, 3b kurstaki

5 H 4a, 4b sotto

6 H 4a, 4b dendrolimus

7 H 4a, 4c kenyae

8 H 5a, 5b galleriae

9 H 5a, 5c canadensis

10 H 6 subtoxicus

11 H6 entomocidus

12 H 7 aizawai

13 H 8a, 8b morrizoni

14 H 8a, 8c ostrinidae

15 H 8b,8d nigeriensis

16 H 9 tolworthi

17 H 10 darmstadiensis

18 H 11a, 11b toumanoffi

19 H 11a, 11c kyussshuensis

20 H 12 thompsoni

21 H 13 pakistani

22 H 14 israelensis

23 H 15 dakota

24 H 16 indiara

25 H 17 tohokuensis

26 H 18 kumanotoensis

27 H 19 tochigiensis

28 H 20a, 20b yunnanensis

29 H 20a, 20C pondicheriensis

30 H 21 colmeri

31 H 22 shandongiensis

32 H 23 leonensis

33 H 24 japonensis

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Insecticidas microbianos y virales para el control de mosquitos vectores de enfermedades humanas, disponibles en el mercado.

Grupo Organismo Producto País

VirusVirus de la

Poliedrosis Nuclear

Elcar E.U

Gypchek E.U

Manestrin Bulgaria

Monisarmio-virua Finlandia

TM-Buocontrol E.U

Virox Inglaterra

Menestrin* Francia

Spodeterin* Francia

VPN 80 Guatemala

VPN 82 Guatemala

Virus de la Poliedrosis Citoplasmática

Hifantrin Bulgaria

VPC Japón

Bacterias

Bacillus popillae  

Doon E.U

Japademic E.U

Milky Spore E.U

Bacillus spahericus

ABG-6185 E.U

2362* Bélgica

   Bacillus thuringiensis            

Dipel E.U

Javelin E.U

Thuricide E.U

Bactospeine Bélgica

Bathurin Checoslovaquia

Bacillan Polonia

Thuridán Polonia

Thurindhgin Rumania

Kturintoks Rumania

Biotrol E.U

Backtutal Bosinia

M-1 E.U

Foil E.U

Larvo-Bt. E.U

Biobit Dinamarca

Bactimos E.U

Teknar E.U

Vectobac E.U

MoskiturRepublica Checa

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