produção experimental de inoculantes a base de azospirillum para fbn

LUANA RISSI SILVA

Produção experimental de inoculantes agrícolas á

base de Azospirillum spp. para Fixação Biológica

de Nitrogênio em gramíneas e Forrageiras

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia

USP/IPT/I.BUTANTAN para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia

Área de concentração

Biotecnologia

Orientador Dr. José Geraldo da Cruz Pradella

São Paulo 2006

AGRADECIMENTOS

Ao professor Doutor José Geraldo da Cruz Pradella pela orientação, aprendizado e

amizade ao longo destes anos.

Á memória do Professor Luiz Carlos Urenha, pelo estímulo e críticas.

Aos pesquisadores do Centro de Biotecnologia Industrial pela assitência e amizade.

Aos funcionários do Laboratório de Fermentação Industrial (LFI) pelo auxílio e

colaboração, em especial, ao Régis Norberto de Carvalho e Walter de Oliveira.

Á mestre Marilda pelas sugestões e críticas que muito me influenciaram.

A professora Doutora Vera Lúcia Baldani pelo fornecimento das cepas de

Azospirillum e o insentivo para realização dos ensaios.

A ajuda paciente da minha mãe que agüentou folhas de rascunho espalhadas pela

casa, arengas sobre canetas que tinham sumido, e as numerosas vezes que me apossei

do computador.

Ao Bruno pelo carinho, amor e paciência nos momentos difíceis.

Em especial a Cristina, Vinícius, Marcelo, Cecília, Fernanda Matias e as colegas da

salinha, Tatiana Strelec, Sra, Caulkins e Cristiane Ottoni. pela amizade, carinho e

imprescindível colaboração para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT), pelo suporte

técnico e físico.

À Secretaria de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia

USP/IPT/I.BUTANTAN pelo auxílio prestado no decorrer do mestrado.

Ao Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo

auxílio concedido.

A Todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização deste trabalho.

SUMÁRIO

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Resumo

Abstract

1 Introdução 1

2 Revisão Bibliográfica 4

2.1 Bactérias associadas às plantas 4

2.2 Dinâmica do Nitrogênio em Sistemas Agrícolas 6

2.3 A Revolução Verde 9

2.4 Fixação Biológica de Nitrogênio 11

2.5 Diazotrofos associativos 14

2.5.1 Endofíticos facultativos 15

2.5.2 A associação do gênero Azospirillum com as gramíneas 16

2.5.3 Resposta da planta à inoculação de Azospirillum spp 18

2.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio 23

3 Produção de Inoculantes para a FBN à base de Azospirillum 37

3.1 Fontes de Carbono 28

3.2 Fontes de Nitrogênio 34

4 Objetivos 42

5 Materiais e métodos 43

5.1 Microrganismo 43

5.2 Meios de cultura 43

5.2.1 Soluções-estoque 43

5.2.2 Solução salina 44

5.2.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo 45

5.2.4 Meios de cultura sólidos para preparo do inóculo 46

5.2.5 Meios de cultura líquido 46

5.3 Ensaios em incubador rotativo 47

5.3.1 Equipamento 47

5.3.2 Preparo do Pré-inóculo 48

5.3.3 Preparo do inóculo 48

5.3.4 Inoculação dos frascos 48

5.3.5 Inoculação e amostras 48

5.3.6 Determinações efetuadas 49

5.4 Ensaios em fermentador, processo descontínuo 49

5.4.1 Equipamento 49

5.4.2 Preparo do inóculo 50

5.4.3 Inoculação do fermentador 50

5.4.4 Amostragens 50

5.4.5 Determinações efetuadas 50

5.5 Métodos de análises 51

5.5.1 Determinação de Absorbância (A) 51

5.5.2 Concentração Celular Mássica (X) 52

5.5.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas 52

5.5.4 Concentração de Frutose, Sacarose, Etanol, Glicerol e Lactato (S) 52

5.5.5 Avaliação da concentração de Nitrogênio Amoniacal 54

5.5.6 Avaliação da concentração de Fósforo 55

5.6 Cálculo dos Parâmetros Cinéticos 57

5.7 Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios 58

6 Resultados e discussão 60

6.1 Meios sólidos 60

6.2 Fontes de nitrogênio 60

6.3 Ensaios em incubador rotativo 61

6.3.1 Frutose 62

6.3.2 Glicerol 63

6.3.3 Sacarose 63

6.3.4 Lactato 64

6.3.5 Etanol 65

6.4 Observações gerais 71

6.5 Ensaios em biorreator 74

6.5.1 Glicerol 76

6.5.2 Frutose 79

6.5.3 Sacarose 81

6.5.4 Etanol 83

6.6 Comparação entre os ensaios (biorreator) 85

6.7 Cultivo em alta densidade celular (ADC) 89

6.7.1 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A. lipoferum 91

6.7.2 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A. brasilense 95

7 Conclusões 100

8 Referências Bibliográficas 104

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 Ciclo do nitrogênio na natureza (modificado de Kerbauy, 2004) 7

Figura 2.2 Produção mundial de grãos em milhões de toneladas a partir de 1950 e

projeções do Banco Mumdial e da FAO

(modificado de Mann, 1997) 10

Figura 2.3 Esquema cinético do complexo nitrogenase (modificado de Nelson &

Cox, 2000) 13

Figura 3.1 Metabolismo central do carbono em Azospirillum 33

Figura 5.1 Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das ams 51

Figura 6.1 Evolução das concentrações de Biomassa, Frutose, Nitrogênio

Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a

(♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador

rotativo 66

Figura 6.2 Evolução das concentrações de Biomassa, Glicerol, Nitrogênio



rotativo 67

Figura 6.3 Evolução das concentrações de Biomassa, Sacarose, Nitrogênio



rotativo 68

Figura 6.4 Evolução das concentrações de Biomassa, Lactato, Nitrogênio



rotativo 69

Figura 6.5 Evolução das concentrações de Biomassa, Etanol, Nitrogênio Amoniacal

e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e

Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitadorrotativo 70

Figura 6.6 Evolução das concentrações de biomassa (□); Glicerol (◊); Absorbância

( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em

fermentador 78

Figura 6.7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os

ensaios com Glicerol 79

Figura 6.8 Evolução das concentrações de biomassa (□); frutose (◊); Absorbância


fermentador 80

Figura 6.9 Evolução das concentrações de biomassa (□); sacarose (◊); Absorbância


fermentador 82

Figura 6.10 Evolução das concentrações de frutose, glicose e sacarose em

Azlp01 82

Figura 6.11 Evolução das concentrações de biomassa (□); etanol (◊); Absorbância


fermentador 84

Figura 6.12 Correlação obtida entre os valores de concentração celular (X) e

absorbância para os ensaios em fermentador 87

Figura 6.13 Crescimento de A. lipoferum BR 17 em batelada, ensaio Azlp02 92

Figura 6.14 Resultados do protocolo a ADC para A lipoferum Br 17 94

Figura 6.15 Crescimento de A. brasilense em batelada, ensaio Azbr05 96 Figura 6.16 Resultados do protocolo de cultivo a ADC de A brasilense Sp 7 98

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp –

experimentos desenvolvidos em diversos países 20

Tabela 2.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países 24

Tabela 2.4 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para

fixação biológica de nitrogênio 26

Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp 29

Tabela 3.2 Fatores de conversão para alguns microrganismos com diferentes

fontes de N 35

Tabela 5.1 Concentração de glicerol em g/L na amostras 53

Tabelas 5.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A.

brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada

experimento 59

Tabela 6.1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados 60

Tabela 6.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de

cultivo) 61

Tabela 6.3 Dados experimentais obtidos nos ensaios com A. brasilense Sp7 e A.

lipoferum Br 17 em incubador rotativo (200 rpm, 30ºC) 73

Tabela 6.4 Etapas preliminares dos ensaios em fermentador 75

Tabela 6.5 Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de células (Xo,

Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf) para os diferentes ensaios,

em função da composição do meio de cultura 85

Tabela 6.6 Comparação do custo de produção de biomassa de Azospirillin em

biorreator em relação ao custo do substrato 88

Tabela 6.7 Composição do meio de cultura alimentado durante a fase

descontínua-alimentada à vazão constante do protocolo de ADC para

cultivo de A. lipoferum BR 17 e A. brasilense Sp 7 91

Tabela 6.8 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A lipoferum

BR 17 95

Tabela 6.9 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A brasilense Sp

7 99

RESUMO

Este trabalho objetiva o estudo do cultivo de bactérias do gênero Azospirillum spp.

para o estabelecimento da produção de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em

gramíneas e forrageiras. Alternativas ao meio NFb usado em laboratório são necessárias para

processamento industrial, pois os constituintes ácido málico e vitaminas encareceriam

demasiadamente o custo de produção. Foi efetuado screening de fontes de carbono e

nitrogênio, de baixo custo, capazes de garantir altas concentrações celulares e de propiciar

formulação de meio de cultura reprodutível. A. brasilense Sp7 e A. lipoferum BR 17, cedidas

pela EMBRAPA-CNPAB, foram cultivadas em um meio básico composto de micronutrientes

(Mo, Mn, B, Cu, Zn) e extrato de levedura (1,0 g/L), variando-se as fontes de carbono frutose,

etanol, glicerol, sacarose e lactato (5g/L) e as fonte de Nitrogênio NH4Cl e (NH4)2HPO4

suplementado com K2HPO4. Os ensaios foram realizados em incubador rotativo (200 rpm;

30ºC; pH 6,8) durante 5 dias. Para A. brasilense Sp7 foram escolhidas as fontes de C frutose,

glicerol e etanol obtendo-se, respectivamente, 2,8; 2,1 e 1,8 g/L de biomassa ao final do

ensaio. Para A. lipoferum BR17 foram escolhidas as fontes de C sacarose e glicerol obtendo-

se, respectivamente, 2,2; e 1,4 g/L ao final do ensaio. (NH4)2HPO4 foi a fonte de N escolhida

para estas linhagens. A cinética do processo foi estudada em biorreator (pH = 6,8 e 30oC,

pO2>20%) obtendo-se os parâmetros descritos a seguir. A. brasilense: frutose (µm= 0,20 h-1;

YX/S = 0,60 g/g, YX/N = 12,61 g/g e PX = 0,17 g/L.h), glicerol (µm= 0,09 h-1; YX/S = 0,69 g/g,

YX/N = 9,06 g/g e PX = 0,07 g/L.h) e etanol (µm= 0,08 h-1, YX/S = 0,62 g/g, YX/N = 7,81 g/g e

PX = 0,07 g/L.h). A. lipoferum: sacarose (µm=0,35 h-1; YX/S = 0,41 g/g, YX/N = 1,35 g/g e PX =

0,24 g/L.h) e glicerol (µm=0,28 h-1; YX/S = 0,48 g/g, YX/N = 4,49 g/g e PX = 0,21 g/L.h).

Baseados nos resultados, um protocolo a alta densidade celular através do processo

descontínuo-alimentado, obteve cerca de 25g/L para ambas as linhagens.

Title: Experimental production of Azospirillum spp. Inoculant for Biological Nitrogen

Fixation in non-leguminous crops.

Author: Silva, Luana Rissi

Abstract The subject of the present work was to study the growth of Azospirillum spp. aiming the production of

inoculants for Biological Nitrogen Fixation in non-leguminous crops. A screening of low cost carbon and

nitrogen sources, capable of producing high cell concentration with a reproducible culture medium was

performed. A. brasiliense Sp7 and A. lipoferum BR 17 were cultivated in a medium containing micronutrients,

yeast extract, and K2HPO4, varying the Carbon (fructose, sucrose, glycerin, lactate, ethanol) and Nitrogen sources

(NH4Cl and (NH4)2HPO4).The experiments took place at 30oC and pH 6.8. For A. brasiliense Sp7, fructose,

glycerin and ethanol were the best carbon sources attained, respectively, 2,8, 4,0 and 3,0 g/L of biomass in

bioreactor experiments. For A. lipoferum BR17, sucrose and glycerin carbon sources were chosen and the results

were, respectively, 2,0 and 2,6 g/L. (NH4)2 HPO4 was the best nitrogen source. Based on these results, high cell

density protocol using a fed-batch procedure was developed attained c.a. 25 g/L for both strains.

1 Introdução 1

1. INTRODUÇÃO

As bactérias diazotróficas utilizam como fonte de nitrogênio para seu

metabolismo o enorme reservatório de nitrogênio gasoso (N2) da atmosfera (>79%).

O nitrogênio é pouco reativo e somente um grupo seleto de seres vivos, algumas

espécies de microrganismos procarióticos, bactérias e actinomicetos, possuem o

complexo enzimático chamado nitrogenase, necessário para transformá-lo em

amônia que é subseqüentemente assimilada em aminoácidos e proteínas. Esse

processo é chamado de fixação biológica de nitrogênio (FBN).

O N é um nutriente essencial para a vida e, em regiões tropicais, é

freqüentemente limitante da produção agrícola. São muitos os processos envolvidos

na ciclagem desse elemento: desnitrificação, volatilização da amônia e queimadas

(processos que retornam o N à forma gasosa) e lixiviação de nitratos para as camadas

profundas do solo, conduzindo à perda do N nos ecossistemas. Além disso, o N dos

solos agrícolas é exportado para as cidades, através da comercialização dos produtos.

Como conseqüência, a maioria dos solos das regiões tropicais é deficiente em N,

causando graves limitações à produção de alimentos. Somente os fertilizantes

nitrogenados ou a FBN podem retornar o N perdido aos solos agrícolas. Estima-se

que os fertilizantes nitrogenados representem 40% do custo total da produção da

1 Introdução 2

cultura. Além disso, os fertilizantes nitrogenados são a maior fonte de poluição

ambiental dos sistemas agrícolas (Machado & Magnavaca, 1991). Já a fixação

biológica de nitrogênio é um importante fator de competitividade do setor agrícola

brasileiro. Uma grande variedade de genótipos de plantas de importância agrícola,

como a soja, foi melhorada para que fosse possível uma diminuição no uso deste tipo

de fertilizante. Deste processo de melhoramento obteve-se variedades selecionadas

com maior habilidade de produção em solos pobres, e capazes de se associar com

microrganismos diazotróficos existentes no solo ou na rizosfera, no caso o rizóbio,

para obtenção de nitrogênio.

O mercado de inoculantes agrícolas produzidos com bactérias fixadoras de

nitrogênio para plantas leguminosas movimenta cerca de US$ 8,5 milhões/ano no

país. Cinco empresas brasileiras e algumas argentinas e uruguaias suprem este

mercado, que comercializa cerca de 14 milhões de doses destes inoculantes no Brasil

(IBGE, 2005).

Existe um mercado promissor através da geração de um novo produto, um

inoculante contendo bactérias diazotróficas que pode ser utilizado para gramíneas,

forrageiras e grãos. A associação entre as bactérias do gênero Azospirillum e estas

plantas já foi demonstrada nas décadas de 70 e 80. Entretanto os resultados de

inoculação obtidos até hoje mostraram-se muito variáveis, o que se tornou uma

barreira para o lançamento no mercado brasileiro de inoculantes agrícolas obtidos a

partir desta bactéria. Com o avanço do conhecimento na seleção de estirpes e dos

1 Introdução 3

genótipos das plantas, novos experimentos de inoculação tornam-se necessários.

Bem como o estudo sistematizado para que se estabeleça uma tecnologia de

produção deste tipo de inoculante em larga escala.


2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Bactérias associadas às plantas

Bactérias são habitantes comuns da superfície e do interior dos vegetais,

podendo apresentar relações neutras, simbióticas e de patogenia com a planta

hospedeira. As bactérias associadas às plantas são chamadas de bactérias endofíticas

quando vivem no interior das plantas, habitando, de modo geral, suas partes aéreas,

como folhas, caules e raízes, sem causar aparentemente nenhum dano a seus

hospedeiros (Petrini, 1991; Hallman et al., 1997b; Azevedo, 1998a, Sturz et al.,

2000) e de bactérias epíficas, que vivem na superfície dos órgãos e tecidos vegetais

(Rizoplano) (Petrini, 1991; Jacques & Morris, 1995; Reinhold-Hurek & Hurek,

1998b; Andrews & Harris, 2000). Evidentemente, essas distinções têm finalidades

apenas didáticas, não existindo um claro limite entre grupos e sim um gradiente entre

eles, visto que existem algumas populações bacterianas que podem ficar entre a

colonização endofítica e epífica (Hallmann et al., 1997b), havendo sobreposição

entre esses grupos de microrganismos. Assim, dependendo das condições do

ambiente e do próprio estado fisiológico do hospedeiro, um endófito pode ser

considerado um patógeno latente (Azevedo, 1998a; Azevedo et al., 2000b; Andrews

& Harris, 2000). Este aspecto pode ser melhor entendido com o trabalho de

Whitesides & Spotts (1991) que compararam características fenotípicas de isolados

endofíticos e epíficos de bactéria Pseudomonas syringae e relataram a capacidade de

um mesmo isolado de se estabelecer dentro e fora do hospedeiro.

A origem, forma de penetração, colonização e transmissão de bactérias

endofíticas ainda são muito discutidas. Elas podem ser provenientes de sementes, da

rizosfera e de material propagado vegetativamente (Mclnroy & Klopper, 1995a;

Hallmann et al., 1997b. Reinhold-Hurek & Hurek, 1998). Sua penetração pode

ocorrer pelas aberturas naturais e feridas. Uma das portas de entrada mais utilizadas

pelos endófitos são as raízes; a emergência de raízes secundárias laterais sempre é


acompanhada por uma “ferida”, que serve de entrada para os microrganismos. O

próprio crescimento das raízes, penetrando no solo, gera abrasões que facilitam a

entrada de germes que podem produzir enzimas hidrolíticas capazes de degradar a

parede celular dos vegetais, sendo este um possível mecanismo de penetração (Di

Fiore & Dell Gallo, 1995; Quadt-Hallmann et al., 1997a; Shishido et al., 1999,

Andrews & Harris, 2000). E adentram também pelas entradas naturais, como

estômatos e hidatódios, aberturas causadas por insetos e até por estruturas de fungos

patogênicos, como os apressórios. Eles podem também ser encontrados dentro de

estruturas fúngicas. Esse é o caso constatado por Paula et al. (1991), que

identificaram um fungo micorrízico, o Glomus clarum, contendo a bactéria

endofítica Acetobacter diazotrophicus no seu interior. Especialmente em plantas

perenes, podem ser causadas feridas como as que fatalmente ocorrem, por exemplo,

na época da colheita de frutos. Elas constituem pontos de penetração de endófitos. A

colonização e distribuição de bactérias endofíticas e epíficas no hospedeiro pode ser

influencia da por interações com outros microrganismos associados à planta,

nematóides parasitas e por características próprias de seu hospedeiro (Lindow &

Anderson, 1996; Quadt-Hallmann et al., 1997b; Hirano & Hupper, 2000). Desta

forma, o habitat associado à planta é um ambiente dinâmico, no qual diversos fatores

podem influenciar a estrutura e composição da comunidade bacteriana associada ao

vegetal.

As bactérias endofíticas têm sido isoladas de raiz, nódulos, caule, folhas e

frutos em uma extensa variedade de plantas, incluindo muitas de interesse agrícola,

tais como cana-de-açúcar (Cavalcanti & Döbereiner, 1988), milho (Fisher et al.,

1992; Mclnroy & Kloepper, 1995b; Araújo et al., 2000), videira (Bell et al., 1995),

algodão (Quadt-Hallmann et al., 1997a); arroz (Stolzfus et al., 1997), tomate (Pillay

& Nowak, 1997), citros (Araújo et al., 2001; Marcon, 2002), batata (Reiter et al.,

2002), trigo e sorgo (Zinniel et al., 2002), entre outras.


Os microrganismos endofíticos foram mencionados pela primeira vez no

início do século XIX, mas foi Bary (1866) quem primeiro delineou uma possível

distinção entre eles e patógenos de plantas, e foi citado por Azevedo (1998a) e

Peixoto-Neto (2002). Definidos como assintomáticos, não produzindo, portanto,

efeitos benéficos ou prejudiciais aos seus hospedeiros, permaneceram praticamente

esquecidos até o final dos anos 70, quando, por uma série de motivos, foi verificado

que estas bactérias possuíam propriedades de interesse, como por exemplo: i)

conferir proteção contra insetos-pragas, outros microrganismos patogênicos e

inclusive contra herbívoros (Azevedo et al., 2000a; Sturz et al, 2000); ii) podem

também ser utilizados como promotores de crescimento vegetal, produzindo

fitohormônios, fixando N2 ou por outros mecanismos (Sturz et al., 2000); iii)

endófitos podem ser utilizados como vetores para a expressão de genes heterólogos

nas planta hospedeira (Murray et al., 1992, Downing et al., 2000); iv) endófitos

podem ser combinados em processo de fitorremediação de contaminantes orgânicos

e metais pesados (Siciliano et al., 2001; Lodewyckx et al., 2002); iv) atualmente,

sabe-se que endófitos podem produzir toxinas, antibióticos e outros fármacos, fatores

de crescimento e muitos produtos de interesse biotecnológico (Azevedo et al., 2000b;

Peixoto Neto et al., 2002; Marcon, 2002).

2.2 Dinâmica do Nitrogênio em Sistemas Agrícolas

O ciclo do nitrogênio (N) na natureza é um dos que mais afeta as variadas

formas de vida na Terra (Figura 2.1). O nitrogênio é um importante constituinte das

chuvas, afeta o clima global e influencia as reações de síntese e o balanço de

decomposição do ozônio na estratosfera. Na biosfera e na litosfera o nitrogênio é

essencial para a nutrição de plantas e animais, contudo, sua excessiva concentração

em solos e águas pode acarretar problemas de eutrofização e intoxicação de

organismos (Van Lonn & Duffy, 2001).


Esse nutriente é essencial para a manutenção e acumulação de proteínas em

plantas, alcançando até 4,77% da matéria seca de parte aérea de arroz aos 19 dias

após o plantio (Breseguello & Stone, 1998). Sua absorção por parte dos vegetais

superiores pode ser tanto na forma nítrica (NO3-) quanto na amoniacal (NH4

+) (Britto

et al., 2001). Entretanto, a assimilação de nitrogênio somente ocorre na forma

reduzida.

Entre os gases que formam nossa atmosfera, N2 apresenta uma posição

privilegiada no que diz respeito à quantidade: 78%. Devido à grande estabilidade

dessa molécula, em virtude de seu baixo potencial de ionização e alta energia de

dissociação, só é observado seu carreamento para o solo pelo arraste através da

chuva dos óxidos de nitrogênio produzidos por descargas elétricas (Fernandes,

1978).

Figura 2.1 Ciclo do nitrogênio na natureza (modificado de Kerbauy, 2004).


O amônio tem sido subestimado como fonte de nitrogênio para as plantas, no

entanto, em muitas áreas agricultáveis este cátion aparece em níveis milimolares na

solução do solo, alcançando uma relação de 56 de NH4+ para 1 de NO3

-, podendo ser

a única fonte de nitrogênio mineral para as plantas em certos solos (Britto et al.,

2001). O NH4+ do solo surge da protonação da amônia oriunda das desaminações da

matéria orgânica em decomposição no solo (amonificação).

O NH4+ é oxidado a NO3

-, em pequeno grau na faixa de pH normalmente

encontrada nos solos (Britto et al., 2001). Entretanto, NH4+ pode ser acumulado onde

houver inibição da nitrificação, como nos solos com excesso de Al, pH baixo ou no

uso de inibidores de nitrificação (Fernandes, 1990). Já a forma nítrica é facilmente

lixiviada do solo, principalmente em regiões de alta precipitação e temperaturas de

solo elevadas, como é o caso do Trópico Úmido. De maneira diferente, as perdas da

forma amoniacal baseia-se na acentuada volatilização, mesmo após absorvida pelos

vegetais, quando o NH3 atmosférico estiver abaixo do ponto de compensação de

amônio da planta (Trivelin et al., 2002).

O N é indispensável para a vida e principalmente para a produtividade de

culturas agrícolas, mas se perde do solo facilmente por lixiviação, volatilização e

desnitrificação, se fazendo-se necessário o uso adequado da adubação tanto do ponto

de vista agronômico e ecológico, como econômico.

Indiscutivelmente, depois de carbono, oxigênio e hidrogênio, o nitrogênio é

quantitativamente o mais importante elemento requerido por plantas e animais para o

crescimento tanto na água como na terra, alcançando cerca de 1,5% do peso seco de

inúmeras culturas agrícolas (Van Loon & Duffy, 2001). Dessa forma, este foi um dos

nutrientes que mais contribuiu para a chamada Revolução Verde. Devido seu uso

indiscriminado trouxe consigo problemas ambientais (Bouchard et al., 1992). Ainda

hoje novas metodologias para sua utilização são intensamente estudadas. A busca da

maior eficiência no uso de N (EUN), através do reconhecimento das vias

bioquímicas e moleculares de absorção e assimilação em plantas, bem como, de


metodologias agroecológicas, como a fixação biológica do nitrogênio (FBN), são

propostas para permitir o uso sustentável deste elemento sem a perda da produção

(Traore & Maranville, 1999; Pradella et al., 2001).

2.3 A Revolução Verde

Entre os anos de 1950 e 1984, a produção mundial de grãos cresceu 2,6 vezes.

Este fato incrementou a produção per capita em 40%, alcançando 80% na China e

130% na Europa Ocidental (Corson, 2002). Estas três décadas de crescimento são

devidas a vários fatores. Dentre eles, destaca-se a expansão de terras cultivadas, o

aumento da irrigação e do uso de agentes químicos agrícolas, o cultivo simultâneo de

várias culturas e as melhorias nas técnicas de produção (Corson, 2002).

Entretanto, já em meados dos anos de 1970, o uso indiscriminado de energia

na produção agrícola trazia preocupações. A agricultura tecnológica desenvolvida na

Europa Ocidental e nos Estados Unidos era totalmente inviável para os trópicos. Para

a produção de 8,2 x 106 Kcal de milho no meio-oeste americano, necessitavam-se 2,9

x 106 Kcal de energia fóssil e mais 2,043 x 106 Kcal de energia solar. Com isso o

balanço energético da produção mostrava-se bastante desfavorável e levaria, em

apenas 13 anos, ao extermínio de todas as reservas de petróleo conhecidas na época

(Pimentel, 1975).

A agricultura de alta tecnologia implantada com a Revolução Verde havia escolhido

a proposta de aumentar a produção pelo aumento da oferta de nutrientes no solo.

Assim, os problemas não demoraram a aparecer. Alguns ganhos obtidos nas décadas

que se seguiram à Revolução Verde foram perdidos juntamente com milhares de

hectares de terras, erodidos pela intensa aragem. Além disso, notou-se o esgotamento

do lençol freático, devido à irrigação excessiva e à salinização e contaminação dos

corpos d’água e do solo promovida pelos insumos químicos utilizados

agressivamente. O problema tornou-se tão flagrante que no início dos anos


de 1980 o órgão da Organização das Nações Unidas para a Alimentação e

Agricultura (FAO), publicou um relatório mostrando que o potencial do solo em

produzir alimentos encontrava-se limitado em 117 países em desenvolvimento

(Corson, 2002).

A partir de 1984 o milagre parecia ter chegado ao fim (Corson, 2002). A

produção per capita de grãos iniciou uma onda de quedas, mantendo-se longe

daquela projetada pela FAO e pelo Banco Mundial, como mostra a Figura 2.2

(Mann, 1997; Corson, 2002). Várias são as explicações para o declínio da Revolução

Verde. Talvez o problema esteja no fato de que a população não parou de crescer,

além disso, o aumento no consumo de carne levou ao direcionamento de grande

quantidade de grãos para a alimentação animal (Mann, 1997).

Outro fator importante apontado por cientistas, seria o alcance dos limites

físicos da planta. O índice de colheita, isto é, a fração da massa da planta recuperada

em seus grãos, variava em torno de 0,25, no início do século passado. Hoje, alcança-

se 0,5 e acredita-se que se pode chegar no máximo a 0,6 ou 0,65 do peso em grãos.

Assim, o paradigma da Revolução Verde: cultivar pequenas plantas com mais grãos

por pé às custas de muito fertilizante não se torna sustentável (Mann, 1997).

Figura 2.2 Produção mundial de grãos em milhões de toneladas a partir de 1950 e projeções do Banco mundial e da FAO (modificado de Mann, 1997).


É ponto factível que nos próximos 30 anos as necessidades globais de grãos

irão crescer e, ainda, que a expansão da produção de cereais tornou-se limitada pelas

necessidades de preservar os ecossistemas, bem como pela perda de terras aráveis

para cidades, indústrias e recreação (Mann, 1997). Com isso, a Revolução Verde tem

dado lugar a uma agricultura sustentável que leva em consideração métodos precisos

para otimizar cada etapa da produção do plantio à colheita. Além disso, tem-se

selecionado novos tipos de plantas mais resistentes à doenças, a solos ácidos ou

capazes de utilizar mais eficientemente a nutrição e cada vez mais estimulado o uso

de inoculantes agrícolas baseados na fixação biológica de nitrogênio (Mann, 1997;

Pradella et al.,2001).

2.4 Fixação Biológica de Nitrogênio

O nitrogênio é o quarto elemento mais abundante nas plantas. É constituinte

essencial de aminoácidos, proteínas, bases nitrogenadas, ácidos nucléicos, hormônios

e clorofila, entre outras moléculas (Kim & Rees, 1994).

A forma molecular do nitrogênio acessa continuamente as plantas através dos

processos de trocas gasosas. No entanto, os vegetais são incapazes de assimilar o

dinitrogênio. Para que o N2 seja convertido em uma forma assimilável, amônia, se

faz necessário o gasto de 33,5 KJ. mol -1 (Nelson & Cox, 2000).

Uma possibilidade para tornar o N atmosférico disponível para as culturas

agrícolas é a fixação biológica (FBN). Apenas alguns organismos procariontes

possuidores do complexo enzimático denominado nitrogenase são capazes de efetuar

este processo. Em virtude do sistema enzimático, torna-se possível realizar tal

processo à temperatura biológica e a 0,8 atm de N2 (Kerbauy, 2004). A equação geral

da FBN é descrita a seguir:

N2 + 16ATP + 8e- + 8H+ → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

(onde e- simboliza elétron e Pi simboliza o fosfato inorgânico).


Ainda que a fixação biológica de nitrogênio seja conhecida há mais de um

século, apenas a partir da década de 60 do século XX foi possível ter uma

compreensão aproximada do processo. A primeira bactéria fixadora de nitrogênio foi

isolada por Sergei Winogradsky na última década do século XIX e foi o anaeróbio

Clostridium pasteurianum. Em 1901, Martinus Beijerinck isolou o Azotobacter

chroococcum, outro fixador de nitrogênio. Possivelmente devido à facilidade de

cultivo de aeróbios, a maioria do trabalho bioquímico foi efetuado em Azotobacter

durante muitos anos. O problema mais importante em qualquer intento de estudar a

bioquímica de um processo é obter um sistema de enzimas ativas livres do resto da

célula. Todos os intentos para obter este sistema livre de células que pudesse fixar

nitrogênio não tiveram êxito e ainda muito tempo depois, quando já se conheciam as

vias de metabolismo do carbono, não se conhecia praticamente nada acerca da via

mediante a qual o N2 era convertido em aminoácido. A incapacidade de preparar

extratos ativos livres de células se devia com toda a segurança à extrema

sensibilidade ao O2 da nitrogenase, mesmo de aeróbios como o Azotobacter, de

forma que a enzima se inativava ainda antes que se pudesse fazer alguma prova. A

resolução do problema se obteve em 1960 quando um grupo na empresa E. I. DuPont

desenvolveu um sistema livre de células trabalhando com Clostridium pasteurianum.

(Brock. et al., 1984).

Como o processo de fixação se baseia na redução do N2 a NH4+ se faz

necessária uma cadeia de moléculas transportadoras de elétrons capazes de catalisar

também a redução de outras moléculas como o acetileno e o etileno (Figura 2.3).

Esta última reação pode ser utilizada como estimativa da taxa de fixação (Nelson &

Cox, 2000). Na verdade, a enzima nitrogenase é formada por um complexo protéico

altamente conservado constituído essencialmente por duas enzimas: dinitrogenase

redutase e dinitrogenase. A dinitrogenase redutase é formada por um dímero com

subunidades idênticas (Fe-proteína). Nesta proteína, observa-se um centro redox de

4Fe-4S, que pode ser oxidado e reduzido por 1e-. Possui também dois sítios de

ligação de ATP/ADP. Já a dinitrogenase é um tetrâmero com duas cópias de duas

tetrâmero. Metade do Fe e do S está presente em dois pares de sítios 4Fe-4S,


chamados cluster P. O restante dos metais faz parte de um cofator Fe-Mo. Uma

forma de Nitrogenase contém Vanádio (V) ao invés de Molibdênio (Mo). Porém, as

bactérias que expressam esta enzima também expressam Fe-Mo. Dessa forma, a

enzima V-Fe teria função em certas condições ambientais limitantes (Nelson & Cox,

2000).

Figura 2.3 Esquema cinético do complexo nitrogenase (modificado de Nelson & Cox, 2000).


Durante a reação, o complexo Nitrogenase recebe o auxílio de uma

ferredoxina no transporte de e-. A ferredoxina reduzida transfere um elétron para a

enzima dinitrogenase redutase. Esta unidade, por sua vez, se oxida, reduzindo a Fe-

Mo-proteína. A dinitrogenase acumula 8e-, que são utilizados na redução de N2 a

NH3. O NH3 fixado dá origem no meio aquoso do citoplasma bacterióide ao NH4 +

que é direcionado para o citoplasma vegetal, onde será assimilado pelas vias de

redução até aminoácidos. Para cada elétron transferido, são utilizados dois ATP.

Assim, no balanço da reação são utilizados 16 ATP para cada N2 reduzido.

Concomitantemente, é produzida uma molécula de H2, que utiliza parte dos e-. A

eficiência da FBN é aumentada em certos organismos que possuem uma hidrogenase

capaz de oxidar o H2, restabelecendo ATP e H2O.

As pesquisas sobre FBN estão trazendo novas perspectivas a cada dia. Entre

as diversas espécies de bactérias diazotóficas pode-se destacar: os gêneros

Azorhizobium, Bradrhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium e Rhizobium,

associando-se com leguminosas; os gêneros Azospirillum, Azotobacter, Beijirinckia,

Bacillus, Herbaspirillum e Gluconacetobacter, associando-se às culturas de milho,

arroz, trigo, grama batatais e cana-de-açúcar (Vargas & Hungria, 1997; Resende et

al., 2003a; Kerbauy, 2004). Além disso, alguns organismos de vida livre também são

capazes de fazer FBN. São exemplos de microrganismos autotróficos: Thiobacillus

ferrooxidans, Rhodospirillum rubrum, Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema,

Anabaena e Nostoc. E. ainda microrganismos heterotróficos como Clostridium

pasteurianum, Klebisiella pneumoniae e Azotobacter vinelandi (Fixação

Biológica...2000).

2.5 Diazotrofos associativos

Dentro deste grupo podemos dividir os diazotrofos em dois grupos de acordo

com a proposição de Baldani et al. (1997a): endofíticos facultativos (podem


colonizar tanto a rizosfera como o interior das raízes) e os endofíticos obrigatórios

(colonizam o interior das raízes).

2.5.1. Endofíticos Facultativos

Somente após a redescoberta do gênero Azospirillum por Döbereiner & Day

(1975), os cientistas no mundo todo mostraram interesse na associação dos

diazotrofos com as gramíneas (Döbereiner & Baldani, 1982). O isolamento das

espécies de Azospirillum como fixadores de nitrogênio se deveu a introdução de

meios semi-sólidos sem N. O desenvolvimento do meio semi-sólido foi um fato

muito importante para o isolamento de diazotrofos com carácter microaerofílico. No

caso de Azospirillum e outros diazotrofos, o crescimento dependente de fixação de

N2 ocorre em regiões do meio de cultura onde a taxa de difusão de O2 está em

equilíbrio com a taxa de respiração das bactérias e, posteriormente, a película

formada vai se deslocando até a superfície do gradiente de oxigênio, graças ao

fenômeno de aerotaxia (Döbereiner et al., 1995). Os microrganismos desse gênero

colonizam tanto o interior quanto a superfície das raízes de várias gramíneas

forrageiras e cereais, sendo então chamado de diazotrofo endofítico facultativo

(Döbereiner & Baldani, 1982).

A distribuição ecológica de Azospirillum spp. é extremamente ampla podendo

ser considerada uma bactéria universal encontrada colonizando plantas crescidas em

diferentes habitats (Döbereiner et al., 1976; Döbereiner & Pedrosa, 1987). Estirpes

têm sido encontradas em associação com plantas monocotiledôneas, incluindo milho,

arroz, cana-de-açúcar, sorgo, gramíneas forrageiras como Digitaria e “Kallar grass”

(Döbereiner et al., 1976; Haahtela et al., 1981; Reinhold et al., 1986; Rennie, 1980;

Wong & Stemberg, 1979) e com as dicotiledôneas (Rao & Vankateswarlu, 1982). O

gênero foi definido por Tarrand et al. em 1978 e hoje compreende seis espécies,

caracterizadas com base fenotípica, análise do DNA:DNA e sequência 16S rRNA: A.


brasilense e A. lipoferum (Tarrand et al., 1978), A. amazonense (Magalhães et al.,

1983), A. halopraeferens (Reinhold et al, 1987), A. irakense (Khammas et al., 1989)

e A. largimobile (Sly & Stackebrandt, 1999). Após análises fisiológica e

filogenética, muitos destes isolados foram designados para o gênero Herbaspirillum,

constituindo assim uma nova espécie (Kirchhof et al., 2001) e o gênero Azospirllum,

denominado como Azospirillum dobereinense. Sua identificação e detecção foi

através da hibridização fluorescente in situ (Eckert & Hartman, 2001).

Segundo Baldani et al. (1997a), embora várias características ecológicas e

fisiológicas estejam sendo desvendadas, ainda falta conhecimento sobre o

mecanismo envolvido na interação bactéria-planta e como ele contribui para o

nitrogênio acumulado nas plantas. Apesar das diferentes formas de interação, estes

diazotrofos, quando estão em associação com gramíneas, garantem aumentos de 5 a

30% na produção (Baldani et al., 1983; Okon & Labandera-Gonzalez, 1994).

2.5.2 A associação do gênero Azospirillum com as gramíneas

Os estudos sobre o processo de fixação biológica de nitrogênio em gramíneas

iniciaram-se na década dos cinqüenta (Döbereiner & Ruschel, 1958). Esses estudos

avançaram bastante no Brasil na década dos setenta, durante a chamada “revolução

verde”. Enquanto a maioria dos países industrializados procurava auto-suficiência de

alimentos mediante o uso intensivo de fertilizantes na agricultura, países como o

Brasil continuaram a apoiar pesquisas em fontes alternativas de nitrogênio,

buscando, assim, diminuir a sua dependência dos adubos nitrogenados, uma vez que

a crise energética havia elevado seus custos e que não eram subsidiados no Brasil.

Nesse contexto, a associação de bactérias fixadoras de nitrogênio com gramíneas

ganhou uma importância enorme, principalmente com a descoberta de que bactérias

fixadoras de nitrogênio do gênero Azospirillum. Estas colonizavam os espaços

intercelulares das células da epiderme e do córtex radicular na zona de elongamento

e formação de pêlos radiculares, ou seja, a parte interna das raízes, os quais muitas


vezes não apresentam nenhum sinal de ruptura, indicando que sua interação com a

planta poderia resultar em uma associação com maior potencial de exploração

agrícola do que as associações de várias bactérias diazotróficas com a rizosfera dessa

plantas (Döbereiner & Day, 1975; Patriquin & Döbereiner, 1978). Assim, dois tipos

de associações radiculares têm sido descritas: uma, ao nível de superfície, e outra,

interna. No primeiro caso, a bactéria coloniza indinstintamente toda a superfície

radicular, formando pequenos agregados, algumas vezes embebida no mucigel, e

raramente coloniza a superfície dos pêlos radiculares (Patriquin & Döbereiner, 1978;

Umali-Garcia et al., 1980). O modo de adesão do Azospirillum à planta se dá

mediante ataque apolar (raramente polar), onde podem estar envolvidas estruturas

fibrilares que realizam o ancoramento da bactéria á célula vegetal, estabelecendo

deste modo a ligação entre células (Levanony et al., 1989). A partir desse

conhecimento, diversos grupos mundiais de pesquisa se interessaram pela associação

gramíneas/bactérias diazotróficas, o que culminou com a identificação de seis

espécies de Azospirillum nos últimos vinte anos. Mas há no meio científico, muita

discussão quanto á classificação das bactérias do gênero Azospirillum como bactérias

endofíticas facultativas ou rizosféricas. As dúvidas emergem, em parte da capacidade

de algumas estirpes em colonizarem o interior das raízes, enquanto outras colonizam

apenas a superfície delas. Estudos, trabalhando em condições de campo com plantas

de trigo inoculadas com diferentes estirpes de Azospirillum e utilizando técnicas

diferentes, concluíram que a utilização de estirpe homóloga (refere-se à estirpe

isolada da espécie de planta à qual está sendo inoculada) Sp 245 colonizam o interior

de raízes de trigo enquanto que a estirpe heteróloga (refere-se à oriunda de outras

espécies) foi incapaz de colonizar o interior das mesmas raízes (Baldani et al., 1987;

Schloter et al., 1994, Assmus et al., 1995). Contudo, foram gerados conhecimentos

sobre ecologia, fisiologia e genética, assim como sobre o processo de infecção e

colonização de cereais, principalmente pelas espécies A. brasilense e A. lipoferum

(Baldani et al., 1997a).

A espécie Spirillum lipoferum foi redescoberta no Brasil como bactéria

diazotrófica associada à rizosfera e raízes de várias gramíneas (Döbereiner & Day,


1976) e, logo depois, reclassificada como gênero novo Azospirillum (Tarrand et al.,

1978).

Pouco se sabe, porém sobre sobrevivência do Azospirillum no solo na

ausência da planta hospedeira, mas tem sido demonstrado que a bactéria apresenta

vários mecanismos fisiológicos de proteção (formação de cistos, produção de

melanina, de poli-β-hidroxibutirato e de polissacarídeos), que podem facilitar a

sobrevivência em condições desfavoráveis (Del Gallo & Fendrik, 1994).

O padrão de colonização das raízes das gramíneas pelas espécies de

Azospirillum mostra uma tendência de especificidade entre grupos de plantas e as

bactérias: A. lipoferum ocorre preferencialmente no córtex de milho, sorgo e de

diversas outras gramíneas com a via fotossintética C4, mas foi também observada em

uma espécie ciperácea (Döbereiner, 1982a), enquanto A. brasilense ocorre

preferencialmente associado a trigo, cevada, aveia, arroz, centeio e gramíneas com

via C3 (Döbereiner & De-Polli, 1980; Rocha et al., 1981). A. halopraeferans é mais

específica, tendo sido isolada apenas de uma espécie de gramínea, o ‘kallargrass`

(Leptochloa fusca), planta nativa do Paquistão, altamente tolerante a solos salinos

(Reinhold et al., 1987). Já a espécie A. irakense, tem sido apenas isolada de raízes de

arroz (Khalmmas et al., 1989).

2.5.3 Resposta da planta á inoculação de Azospirillum spp

O uso de várias técnicas para a quantificação do N em culturas, como:

abundância natural de 15N, balanço de N total, diluição isotópica de 15N, uso do gás 15N2 e redução de acetileno em raízes, tem mostrado que 60% das necessidades de

nitrogênio da cana-de-açúcar são equacionadas pela FBN (Resende et al., 2003a). A

introdução da FBN nesta cultura torna-se ainda mais importante quando se avalia o

balanço energético da cultura. Dois terços desta cultura são utilizados para a

produção de álcool combustível no Brasil (Resende et al., 2003a). Conquistas como


esta fizeram com que o Brasil se tornasse o menor usuário de adubos nitrogenados do

mundo. Enquanto países como a Índia ainda seguem os paradigmas da Revolução

Verde (Döbereiner, 1997). Entre as leguminosas, um exemplo de cultura que pode

ser significativamente otimizada pela FBN é o feijoeiro (Vargas & Hungria, 1997).

Este grão corresponde entre 20 e 28% das proteínas ingeridas no Brasil. Apesar da

vasta área plantada, a produtividade ainda é muito baixa, com médias de 505 kg.ha-1,

muito limitada pelo fornecimento de N e P. O N necessário à cultura poderia ser

fornecido via FBN. Esta tecnologia de baixo custo reverteria a queda na

produtividade sem o uso de adubos nitrogenados, além de contribuir para a

preservação da fertilidade do solo. Entretanto, estimativas das taxas de FBN obtidas

em campos experimentais na América Latina e África não ultrapassam 40% de N

fixado no feijoeiro, o que pode ser otimizado com condições ambientais favoráveis,

ciclos culturais longos e uso de estirpes e cultivares selecionados, permitindo que o

feijoeiro nodulado alcance produtividade de até 2500 kg.ha-1 em solos pobres em N,

compatível às plantas que recebem N mineral (Vargas & Hungria, 1997).

Durante os últimos anos, tem-se perguntado muito sobre os benefícios da

inoculação com as bactérias fixadoras de nitrogênio do gênero Azospirillum. Nesse

processo, porém, existe o problema de transferência do N fixado para a planta que,

segundo Rao et al, (1986), ocorre muito lentamente e apenas pequena parte se torna

disponível para o vegetal. A alternativa para melhorar a transferência do nitrogênio

fixado para a planta seria o uso de mutantes excretores de NH4+ (Machado et al.,

1991) e cuja viabilidade foi demonstrada por Cristiansen-Weniger & Van Veen

(1991). Já a Tabela 2.1 enfatizam que a inoculação pôde ser otimizada através das

condições ambientais favoráveis quando comparados os diversos países que utilizam

a técnica de FBN. A utilização de ciclos culturais longos, como mostra os resultados

obtidos nos cultivos de milho e sorgo no Brasil e na França alcançaram 100% de

resposta no aumento de N na planta.


Tabela 2.1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp – experimentos

desenvolvidos em diversos países (Baldani et al., 1999). Aumento

País

Duração dos experimentos Cultura Inóculo

N total na planta Referência

(Semana) (%) EUA 3 Sorgo A. brasilense Cd 11 - 24 Tien et al., 1979

Índia 1 Sorgo Inoculante comercial 19 Rao, 1986

Índia 1 Milheto e Sorgo Inoculante comercial 20 - 30 Wani, 1990

Israel 7 Sorgo A. brasilense Cd 15 - 20 Okon et al., 1988

Israel 7 Milho A. brasilense Cd 20 - 30 Okon et al., 1988

França 6 Milho A. lipoferum CRT-1 100 Fages, 1994

Argentina 3 Milho A. brasilense Az-5 37 Barrios et al., 1994

Argentina 7 Trigo Isolados locais 15 - 30 Citado por Okon &Lanbadera., 1994

México 2 Milho A. brasilense UAP-55 23 - 63 Caballero-Mellado et al., 1992

Brasil 3 Trigo A. BrasilenseJA04 + 15kg de N.ha-1 53 Didonet et al., 1996

Brasil 5 Trigo A. brasilense Sp 245+ 15kg de N.ha-1 78,9 Baldani et al., 1987

Brasil 6 Arroz A. lipoferum 58,9 Mirza et al., 2000

Brasil 5 Sorgo A. lipoferum S82 e S65 17-60 Pereira et al., 1989

Brasil 6 Sorgo A. amazonense S 91 90,2 Pereira et al., 1989

Por outro lado, bactérias do gênero Azospirillum são conhecidas pela sua

capacidade de produzir hormônios de crescimento, tais como auxinas, geberelinas e

citoquininas “in vitro” (Hartmann & Zimmer, 1994). A produção pela planta de

substâncias de crescimento em resposta à colonização radicular também tem sido

sugerida como uma possibilidade alternativa para os aumentos de massa seca

observados em plantas inoculadas com Azospirillum (Fallik et al., 1988). Tem-se

verificado que ocorre um aumento da densidade de pêlos radiculares, de taxa de

aparecimento de raízes secundárias e da superfície radicular quando as plantas são

colonizadas por essas bactérias. Tal incremento resulta num aumento da absorção de

água e nutrientes, elevando a capacidade da planta de produzir e suportar estresses

ambientais, até mesmo de resistência a geadas (Baldani et al., 1983; Lin et al., 1983;

Kapulnik et al., 1985, 1987).


O uso de estirpes e genótipo da planta selecionadas podem influenciar os

resultados de inoculação como mostra a Tabela 2.1. O experimentos realizados com

sorgo no Brasil utilizando A. lipoferum S82 E S85 no inóculo que conseguiu

aumentar o acumulo de até 60% de N na planta, sendo muito favorável, quando se

comparado aos resultados obtidos nos experimentos efetuados nos EUA, índia e

Israel. E com a cultura de milho pode-se efetuar comparações semelhantes, pois os

resultados obtidos para os experimentos na França utilizando A. lipoferum CRT-1

como inóculo obtiveram aumento de 100% de acúmulo de Nitrogênio na planta.

Embora o termo especificidade hospedeira seja usado para caracterizar essas

associações, tem-se demonstrado que existe certa afinidade entre estirpes e cultivares

(Patriquin et al., 1983; Wani et al., 1985) ou entre a bactéria e espécies de plantas

(Baldani & Döbereiner, 1980; Penot et al., 1992). Alguns autores sugerem que

estirpes isoladas do interior das raízes (após a esterilização superficial) são mais

eficientes e que se devem utilizar estirpes homólogas, isto é, isoladas do mesmo tipo

de planta que se deseja inocular, especialmente, quando a população nativa está

presente (Favilli et al., 1987; Boddey & Döbereiner, 1988; Summer, 1990; Wani,

1990). Estudos prévios de seleção de estirpes mostraram que o uso das homólogas

pode promover aumentos de produção, porém esse conceito não tem sido aplicado

com muita freqüência nos trabalhos de inoculação de gramíneas em campo.

Em relação ao estágio fisiológico, estudos foram feitos no sentido de

multiplicar células de forma a melhorar a sobrevivência da bactéria nos inoculantes.

Bactérias do gênero Azospirillum são capazes de acumular poli-β-hidroxibutirato

(PHB), um material de reserva que lhes permite resistir a condições de estresse

ambiental (Tal & Okon, 1985). Fages (1992) relata estudos comparativos de

inoculação de culturas jovens e daquelas mantidas sob crescimento por mais de dez

dias, visando aumentar a sobrevivência da bactéria no inoculante, já que as células

com maior acúmulo de PHB podem resistir por mais tempo a condições adversas.

Vale ressaltar que a competitividade com outras estirpes ou mesmo outros

componentes da microbiologia do solo pode prevenir a colonização radicular por

bactérias do gênero Azospirillum (Döbereiner & Pedrosa, 1987; Fallik et al., 1988b).


Outra possibilidade de uso da FBN é sua utilização indireta através de adubos

verdes. Este adubo é produzido por uma cultura que fixa nitrogênio anteriormente ou

concomitante à cultura de interesse. No primeiro caso, a cultura fixadora

corretamente manejada, serve de base para o plantio da outra cultura que se beneficia

com a mineralização do nitrogênio. Entretanto, em condições tropicais de alta

temperatura e pluviosidade a mineralização é acelerada produzindo perdas

significantes do adubo. Já o consórcio possibilita a utilização direta pela excreção de

compostos nitrogenados ou decomposição de nódulos radiculares, e ainda, pelo corte

da parte aérea do adubo que irá se decompor concomitante à assimilação pela cultura

de interesse. Adubos verdes podem contribuir com até 150 kg de N.ha-1.ano-1 para as

culturas (Resende et al., 2003b). A inoculação de Azospirillum na presença de

pequenas doses de fertilizantes nitrogenados tem mostrado maior eficiência para o

sistema planta-bactéria quando comparado com o uso isolado da bactéria (Tabela

2.1). Baldani et al., (1987) obtiveram uma incremento de 28% na produção de grãos

de trigo em relação à testemunha crescida com o equivalente a 100 kg/ha de N

quando inocularam a estirpe Sp 245 de A. brasilense e suplementaram as plantas com

15 kg/ha de N (Tabela 2.1). Já Didonet et al, (1996) observaram que a produção de

grãos de trigo inoculado com a estirpe JA04 de A. brasilense e complementada com

15 kg/ha de N, diferiu estatisticamente do tratamento-controle, que recebeu adubação

equivalente a 45 kg/ha e aumentou em até 53% de N em cobertura (Tabela 2.1).

Fages (1994) relata que os aumentos observados na produção de grãos de sete

experimentos de inoculação de milho na presença de pequenas doses de N, se devem

a um melhor desenvolvimento do sistema radicular da planta devido aos

fitohormônios produzidos.

O veículo de inoculação (sólido e líquido) é outro aspecto que se deve

considerar nos experimentos em gramíneas. O substrato sólido mais usado é a turfa

estéril neutralizada, dado o know how já adquirido com o inoculante desenvolvido

para rizóbio e também o seu baixo custo. Ela pode ser empregada pura, na forma de

pó ou granulada e em mistura com argilas (vermiculita) ou carvão. No caso dos

inoculantes líquidos, tem-se feito uso de óleo mineral e de polímero como, por


exemplo, o alginato e a goma xantana que promovem o encapsulamento das células e

só as liberam após a degradação do polímero e, assim, previnem as células de

estresses ambientais (Jung et al, 1982). Esse processo tem, como desvantagem, a

necessidade de mão-de-obra especializada e, conseqüentemente, o custo elevado.

Fallik & Okon (1996), por exemplo, obtiveram um aumento de 15% na

produção de grãos de milho quando fizeram uso da turfa granulada em comparação

com a pulverização no sulco e semente peletizada, que aumentaram 11 e 3%

respectivamente. Já a pulverização pós-emergência das sementes teve um efeito

negativo de 2% na produção de grãos. Baldani et al., (1983) também obtiveram

maior aumento na produção grãos de trigo usando turfa granulada (35%) em

comparação com inoculante oleoso (19%).

Estudos de inoculação de cereais com bactérias diazotróficas têm mostrado

que as endofíticas têm um maior potencial de contribuição da FBN e que o genótipo

da planta influencia na associação da planta/bactéria. Os avanços alcançados

apontam para uma maior exploração e entendimento desta associação endofítica. Os

programas de sequenciamento do genoma: RIOGENE e GENOPAR mostram a

importância da FBN no Brasil e devem permitir que o país continue na fronteira do

conhecimento em relação ao processo de FBN em gramíneas (Baldani et al, 2005).

2.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio

A agricultura brasileira tradicionalmente usa menos nitrogênio mineral nas

aplicações de fertilizantes, quando comparada com a de outros países. A Tabela 2.2

dá um quadro da quantidade de nitrogênio aplicada como fertilizante em diversos

países:


Tabela 2.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países (Dobereiner, 1997)

País

N (kg/ha)

Países da Europa 172

China 87

USA 58

México 36

Índia 27

Brasil 10

O alto custo do fertilizante nitrogenado no Brasil leva a um processo de

seleção de genótipos de plantas que fornecem altos rendimentos com baixo uso deste

fertilizante. O baixo uso de N mineral faz a agricultura mais lucrativa e gera menor

poluição dos lençóis freáticos. A seleção de genótipos da soja plantada no país foi

feita levando-se em consideração a não aplicação de N mineral. Hoje, toda a soja

plantada no país é feita sem aplicação de N mineral. O rendimento médio desta

cultura é maior que 2 ton/ha. Com um conteúdo médio de 6% de N, praticamente

vindo totalmente da fixação biológica, isto corresponde a cerca de 120 kg/ha de N,

proveniente da ação bacteriana. Estima-se que a economia total pelo não uso de

fertilizantes nitrogenados na soja é de cerca de US$ 3,2 bilhões. No feijão, esta

economia poderia chegar a US$ 375 milhões com o uso de inoculação bacteriana e

seleção de melhores genótipos. Na última década ficou demonstrado que parte do

nitrogênio utilizado por cereais e forrageiras advém da associação destas plantas com

bactérias diazotróficas como Herbaspirillum spp, Burkholderia spp e Azospirillum

spp. Estas bactérias colonizam raízes, troncos e folhas de milho, arroz e trigo. Dentre

todas as não leguminosas, a cana-de-açúcar é provavelmente a que recebe maior

contribuição da fixação biológica de nitrogênio. Cerca de 150 kg N/ha são obtidos

por fixação biológica na cana-de-açúcar (Döbereiner, 1997).


2.7 O Mercado Brasileiro de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio

Apesar de ter sido largamente demonstrada a fixação biológica de nitrogênio

pela associação entre Azospirillum spp. e gramíneas, não existe ainda um produto

comercial para tal fim.

Em contraste, existe um mercado completamente desenvolvido para a

produção e uso do inoculante para fixação biológica de nitrogênio em leguminosas.

Este mercado é regulado pelo Ministério da Agricultura e conta com associações de

produtores e de pesquisadores, como a Associação Nacional de Produtores e

Importadores de Inoculantes (ANPII) e a Rede de Laboratórios para Recomendação,

Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbiológicos de Interesse

Agrícola (RELARE). A associação entre produtores, pesquisadores e agentes

governamentais gerou uma bem sucedida comunidade, que conta inclusive com um

fundo de pesquisas financiado pelas empresas, à razão de R$ 0,01 por dose de

inoculante vendida.

O mercado brasileiro de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em

leguminosas, fundamentalmente a soja, foi de cerca de 14 milhões de doses em 2001.

Destas, cerca de 10 milhões foram produzidas no país e o restante importado da

Argentina e, em escala bem menor, do Uruguai1. Os produtores estrangeiros são

igualmente membros participantes da RELARE e os importadores, da ANPII.

A dose de inoculante é vendida, em média, a US$ 0,60, o que permite estimar

o mercado em cerca de US$ 8,5 milhões1, totalmente suprido por indústrias de

pequeno e médio porte.

1 - Laura Machado Ramos. Relatório apresentado durante a XI-RELARE, reunião da Rede de Laboratórios para Recomendação, Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbiológicos de Interesse Agrícola, ocorrida no Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo, entre 18 e 20 de junho de 2002.


Para as empresas, a abertura de um mercado de inoculantes para fixação

biológica de nitrogênio em não-leguminosas permitiria uma imensa ampliação de

escala de produção. A Tabela 2.3 mostra as áreas plantadas de soja, feijão, cana-de-

açúcar, milho, arroz e trigo no país (IBGE, 2005). A uma razão de aplicação de uma

dose por hectare, a mesma que é recomendada para leguminosas, apenas o mercado

potencial brasileiro total saltaria de 14 milhões para 42 milhões de doses. Com

redirecionamento de parte dos investimentos de marketing das empresas para os

países da América Latina, o mercado poderia ser ainda maior.

Tabela 2.3 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para

fixação biológica de nitrogênio (IBGE, 2005).

ÁREA PLANTADA (ha) CULTURA

Brasil Argentina

Soja 16.314.162 10.280.000

Feijão 3.468.000 257.000

Cana-de-açúcar 5.623.422 265.000

Arroz 3.147.000 151.000

Milho 12.355.000 2.745.000

Trigo 1.702.000 7.000.000

TOTAL 42.009.162 20.698.000

Os benefícios econômicos, sociais e ambientais da abertura deste mercado são

evidentes: (1) menor uso de fertilizante nitrogenado mineral; (2) maior lucratividade

das culturas; (3) menor poluição ambiental; (4) economia da energia empregada na

fabricação de N mineral; (5) geração de empregos nas indústrias.

3 Fontes de Carbono 27

3. Produção de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio à Base de

Azospirillum

A extensão da FBN para plantas não leguminosas, principalmente gramíneas

e cereais, se tornou um dos maiores desafios dos últimos 20 anos. Inicialmente,

pensava-se que havia somente bactérias diazotróficas na rizosfera, já que certas

gramíneas como a grama batatais (Paspalum notatum) crescem bem em solos ácidos,

sem adubo nitrogenado. Nos anos seguintes, foram isoladas de cana-de-açúcar e

cereais como milho, arroz e sorgo três novas espécies de Azospirillum que não

somente colonizam a rizosfera, como também contêm certas estirpes que são capazes

de infectar a planta, e, assim, fornecer o nitrogênio de forma mais eficiente. Baldani

& Döbereiner, em 1980, utilizaram o meio NFB líquido para o cultivo dependente da

fixação de nitrogênio de A. brasilense e A. lipoferum para o cultivo não dependente

da fixação de nitrogênio, o meio NFB era suplementado com 0,53g de NH4Cl

(Baldani & Döbereiner, 1980).

Pensando-se em termos industriais, entretanto, devem-se procurar alternativas

ao meio NFB, pois a sua principal fonte de carbono (ácido málico) é uma substância

de difícil obtenção somente possível de utilização em trabalhos de laboratório.

Também a formulação incluindo micronutrientes e vitaminas talvez não seja

adequada pelo alto custo e dificuldade de preparo.

Assim, procurou-se a seguir efetuar um levantamento das fontes de carbono,

nitrogênio e fósforo utilizáveis no processo de produção de A. brasilense e A.

lipoferum.


3.1 Fontes de Carbono

Existe uma importante relação em Azospirillum, entre a fixação de nitrogênio

e a escolha correta da fonte de carbono e o suprimento de açúcar na natureza por

hospedeiros em gramíneas (Westby and Vigil, 1983). Alguns compostos estimulam

a atividade da nitrogenase (Okon and Burris, 1976).

Tanto A. lipoferum como A. brasilense utilizam malato como fonte de

carbono, mas somente a primeira consegue utilizar glicose (Baldani et al., 1997a). O

gênero Azospirillum também tem a habilidade para produzir fitohormônios como

AIA (ácido indol acético) (Thuler et al, 2003). Os genes para a biossíntese desse

fitohormônio foram encontrados também em A. amazonense, mas não em A. irakense

(Vandebroek & Vanderleyden, 1995). O ótimo crescimento com relação à

temperatura, está entre 32 e 37ºC, sendo que A. halopraeferens tem um crescimento

ótimo a 41ºC e possui tolerância à condições salinas. A. irakense hidrolisa pectina e

também tolera altas concentrações de sais (Baldani et al., 1997).

Westby et al (1983) estudou o metabolismo do carbono em Azospirillum para

checar a resposta ao crescimento deste organismo usando diversas fontes de carbono

e energia. Utilizou-se A. brasilense e A. lipoferum, estirpes selvagens de Sp7, BR17 e

de dois mutantes, CW-1 e CW-2 nos experimentos de crescimento em meio sólido. A

Tabela 3.1 mostra que os resultados obtidos assemelham-se aos achados por Albrecht

& Okon, 1980; Okon et al., 1976; Tarrand et al., 1978 e confirma o crescimento de

Azospirillum utilizando açúcares ou ácidos orgânicos como fonte de carbono. (Tabela

3.1). Os resultados indicaram que essa fixadora de nitrogênio utiliza a via Entner-

Doudoroff para a dissimilação de gliconato (Figura 3.1). A partir da descoberta da

presença desta via metabólica, pôde-se traçar outras para a utilização de outras fontes

de carbono.


Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp.

Fontes de Carbono A. brasilense Sp7 A. lipoferum Br17

Sacarose - - - - - -

D-gliconato +++ +++

Arabinose ++ ++

Frutose +++ +++

Etanol ++ ++

Glicerol ++ ++

Fumarato ++/+++ ++/+++

Glicose - - - +++

Malato +++ +++

Lactato +++ +++

Ceto-gliconato +++ +++ As fontes de carbono utilizadas estão presentes no meio sólido Dobereiner-Day-NH4Cl (DDN) em

concentração de 5 g/L. Os ácidos estão incorporados nos sais de sódio ou potássio. As bactérias foram

incubadas a 32ºC por 3 ou 4 dias, obtendo-se os seguintes resultados de crescimento em agar:

+ + +, Excelente crescimento; + +, bom crescimento; e ---, nenhum crescimento

As fontes de carbono (Acetato, Galactose, glicose, glicerato, manitol, manose, ribose e

xilose) permitiram pouco crescimento ou nenhum crescimento para Sp 7 (resultados não

apresentados).

A habilidade para utilizar sacarose é a principal característica de A.

amazonense e A. irakense, embora somente a primeira espécie seja hábil para crescer

em vários pHs, sendo que para as demais espécies é requerido um pH perto do

neutro. Supõe-se que para utilização de sacarose, em Azospirillum lipoferum,

necessita-se de uma enzima que hidrolisa as ligações α, β (1→2) da sacarose em

glicose e frutose. Através da glicólise, a glicose é convertida em piruvato. O piruvato

é transformado em acetil CoA que é totalmente oxidado no ciclo do ácido cítrico

com a formação de duas moléculas de CO2. Os elétrons oriundos da reoxidação do

NADH


em NAD+ em condições aeróbicas, são transferidos para o oxigênio molecular para a

síntese de ATP pela fosforilação oxidativa. Já a frutose pode entrar na via “EMP

anabólica”, pois a existência da via ED e a ausência da atividade de 6-

fosfofrutoquinase indica ausência da via EMP. Por outro lado, existe a frutose-

bisfosfato e o ciclo de Krebs que são responsáveis pela formação dos sete

precursores biossintéticos, a saber: gliceraldeído-3-fosfato, ácido-3-fosfoglicérico,

ácido fosfoenolpirúvico, ácido pirúvico, acetil-coenzima A, ácido oxaloacético, ácido

α-cetoglutárico (Dawes, 1982; Hurek & Niemann, 1987; Stanier & Painter, 1986).

Quatro precursores restantes são obtidos pela parte não oxidativa das vias das

pentoses, a saber: eritrose 4P, ribose 5-P, frutose 6-P e glicose 6-P. No caso de A.

brasilense, glicose-6-fosfato é produzida por isomeração da frutose-1-fosfato

(Martinez-Drets & Burris, 1984).

Dependendo da espécie bacteriana (e em muitos casos, das condições de

cultivo também) pode-se obter um máximo de 26 moles de ATP por mol de frutose

completamente oxidado a CO2 e H2O, contra por exemplo, 38 moles formados em

levedura pela mesma oxidação (Gottschalk, 1979; Nagai, 1979; Stouthamer, 1977).

Glicerol foi uma das fontes de carbono utilizadas por Tarrand et al (1978)

para a caracterização do gênero Azospirillum com 100% de respostas positivas para o

crescimento nesta substância, para todas as cepas de ambas as espécies, A. brasilense

e A. lipoferum.

O glicerol, em Azospirillum, é catabolizado através da segunda etapa da via

glicolítica, após transformação em gliceraldeído-3-fosfato (GAP) a partir da

desidrogenação e subsequente fosforilação ou invertendo a ordem com a fosforilação

seguida pela desidrogenação com a subseqüente ativação do ciclo dos ácidos

tricarboxílicos (Weatby & Vigil, 1983). Pode-se afirmar com certeza, que a entrada

da substância nas células acorre por difusão facilitada, pois esse é o mecanismo

universal de transporte do glicerol por microrganismo (Hunter, 1985; Lin, 1976).


Na maior parte dos microrganismos, apenas uma das rotas de transformação

de glicerol em gliceraldeído-3-fosfato atua de cada vez. Em Klebsiela pneumoniae,

entretanto, determinou-se a existência da glicerol desidrogenase em conjunto com a

gliceralquinase. Nesses microrganismos, verificou-se que a atividade da glicerol

desidrogenase era fortemente influenciada pelo oxigênio dissolvido no meio de

cultura: quanto maior a pressão parcial de O2, menor a atividade específica da

enzima. Em função disso, e de outras indicações, foi postulado que a gliceralquinase

opera principalmente para a dissimilação oxidativa do glicerol, enquanto a glicerol

desidrogenase é mais importante no crescimento anaeróbio (Lin, 1976). Como

salientado por esse último autor, a possibilidade da ocorrência simultânea das duas

enzimas aumenta quando o cultivo, embora aeróbio, vai se tornando limitado em

oxigênio, conforme aumenta a concentração celular, caso bastante comum em

culturas em incubador rotativo.

Para glicerol não há gasto de energia no transporte (difusão facilitada)

(Hunter, 1985), mas a formação da di-hidroxiacetona-3-fosfato requer 1 mol de ATP,

qualquer que seja o caminho (figura 3.1). Para a formação de frutose-6-fosfato são

necessárias duas trioses fosforiladas (2 moles de ATP) e na posterior transformação a

frutose-6-fosfato, um mol de ATP é regenerado, com um balanço total de 1 mol de

ATP gasto por mol G6P formado.

O crescimento de bactérias a partir do glicerol, (bem como a partir de outros

compostos de 3 ou 4 carbonos, como ácidos láticos, pirúvico, málico e succinato)

depende da produção de frutose-1-6-bisfosfato, e sua transformação em glicose-6-

fosfato (G6P) (Dawes, 1982; Stainer & Painter, 1986).

Não existe descrição na literatura de uma via metabólica de assimilação de

lactaoto para Azospirillum. Segundo Poole and Ingledew, (1987), para assimilação de

lacato em E. coli há produção de quatro tipos de lactato desidrogenase, duas das

quais não associadas ao NADH. Para esta bactéria, na dissimilação do lactato, tanto

as formas D e L são convertidas em piruvato, e por sua vez oxidado a Acetil CoA.


Sabe-se que um número de bactérias gram-negativas sintetizam enzimas com

pirroloquinolina quinona (PQQ) como cofator quando crescidas em glicose ou vários

álcoois. As PQQ-dependente aldolase quinoproteína e álcool desidrogenase são

localizadas no periplasma (Kretzschmar and Gorish, 2002).

A degradação do etanol começa na álcool desidrogenase transformando-o em

acetaldeído que é oxidado mais adiante a acetato pela enzima aldeido desidrogenase.

O acetato é então convertido a acetil- CoA sintetase em uma reação dependente de

ATP. A produção de acetil CoA constitui a ligação entre a utilização do etanol como

fonte de carbono e o matebolismo central (Figura 3.1)

É importante destacar que não há nenhum estudo sistematizado com o

objetivo de seleção destas fontes com a finalidade de se promover o cultivo em

biorreator.


Figura 3.1 Metabolismo central do carbono em Azospirillum. As enzimas estão enumeradas da seguinte manerira: 1 - glicoquinase; 2 - gliconato 2-desidrogenase; 3 – fosfogliconato desidratase; 4 - fosfo-2-keto-3-deoxigluconato aldolase; 5 - fosfogluconato desidrogenase; 6 - glicose-6-fosfato desidrogenase; 7 - gliceraldeído-fosfato desidrogenase (NAD+); 8 - gliceraldeído-fosfato desidrogenase (NADP+); 9 - fosfoglicerato quinase; 10 - fosfoglicerato mutase; 11 – enolase; 12 – piruvato quinase; 13 - frutose-bisfosfato aldolase; 14 - frutose bifosfatase; 15 - 6-fosfofrutoquinase; 16 - glicose-fosfato isomerase; 17 – glicoquinase; 18 - glicose desidrogenase; 19 - glicerolquinase; 20 - lactato desidrogenase; 21 - malato desidrogenase; 22 – álcool desidrogenase; 23 – acetaldeído desidrogenase. As linhas pontilhadas correspondem às reações que não aparecem em A. brasilense ou não são importantes, tornado-se inutilizáveis pela bactéria. (Baseado em Westby et al., 1983).

3 Fontes de Nitrogênio 34

3.2 Fontes de Nitrogênio

A princípio, poder-se-ia empregar amônia, nitrato, aminoácidos, e até mesmo

nitrogênio gasoso como fontes desse elemento para o crescimento microbiano

(Döbereiner & Pedrosa, 1987).

Para iniciar a discussão a respeito de quais fontes poderiam ser

industrialmente viáveis, deve-se levar em consideração os critérios já citados

(Stanbury & Whitaker, 1984), principalmente os que se referem à velocidade da

produção, aos fatores de conversão, e à facilidade de compatibilização da etapa de

crescimento celular com as demais etapas do processo.

Já foi demonstrado para muitas espécies bacterianas que os fatores de

conversão e as velocidades de crescimento para culturas que utilizam nitrogênio

combinado (amônia, nitrato, aminoácidos) são bem maiores do que para culturas que

se desenvolvem às custas da fixação de nitrogênio (ver tabela 3.2). Para A.

Lipoferum, foi determinado que os tempos de geração para cultivo em meio líquido

eram de 1 a 2 horas com amônia, e de 5,5 a 7 h em condições de fixação de

nitrogênio atmosférico (Okon & Burris, 1977).


Tabela 3.2 - Fatores de conversão para alguns microrganismos com diferentes fontes

de N.

Microrganismo Fonte de Velocidade Fator de Conversão

Carbono específica de Molar segundo fonte de N2

Crescimento (g/mol fonte de carbono)

(h-1) Amônia Nitrato N2

Crescimento aeróbio

Aerobacter aerogenes glicose 0,67 48,2 - -

A. aerogenes glicose 0,39 - 24,5 -

A. aerogenes glicose - 72,7 52,0 -

Azotobacter chroococcum manitol 0,05 58,3 - 8,5

Az chroococcum manitol 0,14 60,0 - 38,2

Az chroococcum manitol 0,25 55,8 - 45,3

sacarose Azotobacter vinelandii

(3 g/L) 0,15 150,0 - 30,0

sacarose Az vinelandii (15g/L)

0,15 80,0 - 22,0

Crescimento anaeróbio

Clostridium pasteurianum sacarose 0,22 70,2 - 39,4

C. pasteurianum sacarose 0,39 69,5 - 43,3

Desulfovibro desulfuricans lactato 0,05 9,2 - 3,9

D. desulfuricans lactato 0,10 9,2 - 5,6

Klebsiella pneumoniae glicose 0,13 29,3 - 11,7

K. pneumoniae glicose 0,20 32,7 - 12,1

Fonte: Sthouthamer, (1977); Post et al , (1983)

Outro incoveniente para o uso do nitrogênio gasoso na produção de

microrganismos seria a necessidade de obtenção da baixas pressões de oxigênio

(Nelson & Knowles, 1978; Okon & Tal, 1987; Volpon & Döbereiner, 1981), o que

obrigaria a trabalhar com nitrogênio e oxigênio puros, em mistura, ou, à reciclagem

dos gases efluentes do fermentador com ajuste da concentração através de sensores e

controladores automáticos. Qualquer dos dois sistemas é bastante complexo (e caro)


e pode, evidentemente, ser evitado no caso de se utilizar nitrogênio combinado, em

cultivo aeróbio, cuja tecnologia é conhecida e barata.

Algumas fontes de nitrogênio foram estudadas para o crescimento de

Azospirillum. Das e Mishra, 1982 demonstraram que A. brasilense pôde

desenvolver-se adequadamente com NH4Cl, (NH4)2SO4 ou uréia, mas com a

utilização de nitrato para as cepas A, brasilense sp7 e A. lipoferum sp 59 b houve

aparecimento de intensa floculação, particularmente quando usou-se frutose (de 1,5 a

18 g/L) como fonte de carbono. Dos nitratos testados KNO3 foi o que induziu maior

floculação, em ambas as cepas. Nesse mesmo caso verificou-se que NH4Cl e

glutamato também levaram a formulação de flocos, quando frutose era usada a 1,5

g/L, mas com intensidades bem menor que a obtida com os nitratos.

Fontes de nitrogênio orgânico também foram estudadas (Das & Mishra,

1982): aminoácidos, peptona e extrato de levedura. Diferentes comportamentos

foram obtidos no tocante ao estímulo e repressão da nitrogenase e ao crescimento de

A. brasilense e A. lipoferum. Para diversos aminoácidos (glutamina, asparagina,

leucina, lisina, alanina, ácido aspartico, ácido glutâmico, tirosina, treonina, valina,

prolina, serina, histidina), a velocidade de crescimento aumentou com o aumento da

concentração do aminoácido entre 2 e 8 mM (que foi a faixa estudada);glicina e

cistina, entretanto, causaram efeitos inibitórios ao crescimento na concentração de 8

mM; glutamina foi o aminoácido individualmente consumido com maior rapidez,

seguido por asparagina lisina, alanina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Essa maior

velocidade no consumo de glutamina como fonte de nitrogênio está de acordo com o

que se conhece acerca da assimilação de NH4+ e de aminoácidos por Azospirillum,

como será visto no item seguinte, e está de acordo também com os resultados

apresentados por Shawky, (1990).

As outras fontes de nitrogênio orgânico (ácidos casaminados, peptona e

extrato de levedura, testados em concentrações entre 0,05 e 5 g/L) estimularam o


crescimento, devendo-se salientar também que concentrações dessas fontes entre

0,05 e 0,50 g/L não reprimiram a atividade da nitrogenase (Das & Mishra, 1982).

Com as informações expostas, pode-se concluir que para o processo de

produção de Azospirillum deve-se preferir amônio (evitando o nitrato) como fonte de

nitrogênio, uma vez que essa substância conduz os maiores fatores de conversão e

velocidades específicas de crescimento.

Para facilitar alguns aspectos da discussão dos resultados, principalmente no

tocante aos efeitos do nitrogênio presentes no extrato de levedura sobre o

crescimento Azospirillum spp é importante descrever as formas de assimilação de

amônia e aminoácidos em bactérias (Brown, 1980; Stanier & Painter,1986; Tibelius

& Knowles, 1983).

A primeira etapa de assimilação de amônia (e de aminoácidos) é o seu

transporte ativo através da membrana celular. Embora não se conheçam exatamente

os mecanismos e gasto energéticos desse transporte sabe-se que a concentração

interna de amônia quando ela mesma é usada como única fonte de nitrogênio varia,

para diferentes microrganismos, de 1,4 a 10,8 nM (Cordts & Gibson ,1987; Gordon

& Moore, 1981; Schreier & Bernlohr, 1982). Também já foi demonstrada a

existência de um sistema ativo de transporte de amônia, repressível e dependente de

energia (Hartmann & Kleiner, 1982), sem entretanto se determinar as concentrações

internas ou dos gradientes máximos.

Após o transporte, a amônia entra no metabolismo bacteriano através de três

reações, para formar glutamato e glutamina, com o envolvimento das seguintes rotas

de assimilação de NH4+: a) GDH – glutamato desidrogenase; b) GS-GOGAT –

Glutamina sintase e glutamina-cetoglutarato amino transferase. Ambas as vias levam

a incorporação do N fixado no grupo amida do aminoácido glutamato. A via GDH


opera quando a concentração de NH4+ está acima de 1,5 mM e a via GS-GOGAT é

ativada quando esta concentração é mais baixa de 1,5 mM. Uma possível explicação

se fundamenta na energia gasta para esta assimilação, pois a via GDH opera com o

gasto de 1 NADPH2, enquanto a via GS opera com gasto de 1NADH + 2 ATP/ mol

glutamato formado, sendo, dessa maneira, mais onerosa para a célula. As reações

principais de assimilação estão ilustradas na figura 3.2 abaixo.

Figura 3.2 - Esquema de assimilação de amonia em bactérias.

Enzimas envolvidas 1 – GLUTAMATO DESIDROGENASE (GDH)

2 – GLUTAMINA SINTETASE (GS)

3 – GLUTAMATO SINTASE (GOGAT)

4 – TRANSAMINASES


Não se conhece ainda exatamente qual sistema enzimático (GDH ou GS-

GOGAT) seria o predominante em Azospirillum para a produção do glutamato, mas

Westby & Meeks, 1987, afirmam que a via pode ser determinado de acordo com a

concentração de amônia disponível, ou seja, quando baixa (como na fixação de

nitrogênio) o sistema principal em atuação seria o GS-GOGAT e quanto mais

elevada, passaria a predominar a catálise pela GDH. E essa questão é relevente do

ponto de vista bioenergético e de processo, pois quando GDH atua não há gasto de

ATP e pode-se obter, no máximo, 28,8 g cel/mol de ATP gerado pela fonte de

carbono e quando GS-GOGAT é o sistema atuante há um gasto de 1 mol de ATP por

mol de NH4+ incorporado e o valor máximo de YATP que se pode esperar é de 23,1 g

cel por mol de ATP (Stouthamer, 1978).

Em relação à produção de aminoácido a partir amônia como fonte de

nitrogênio, as etapas iniciais são melhor conhecidas: o metabolismo passa pela

formação de glutamato , quer pela degradação direta do aminoácido através das rotas

bioquímicas já conhecidas (Lehninger, 2004) ou por reações de transaminação, pela

adição de grupo amino ao ácido α - cetoglutarato, numa reação exatamente inversa à

de nº 4 da figura 3.2.

Quando os aminoácidos são usados não só como fonte de nitrogênio, mas

também como fonte de carbono e energia, há necessidade de formação ou ativação

de sistemas enzimáticos específicos que nem sempre estão presentes quando as

fontes de carbono e energia são açúcares ou ácidos orgânicos (Tyler, 1978; Castillo

and Mora, 2000) e isto pode atrasar o anabolismo, introduzindo “lags” no

crescimento celular.

Deve-se mencionar ainda que no caso de ocorrer suprimento de misturas de

aminoácidos, alguns deles poderão ser usados diretamente pelo anabolismo,

enquanto outros entrarão nas reações de transaminação para formação de glutamato

(e glutamina). Os aminoácidos que são usados diretamente dispensam a ativação dos

sistemas enzimáticos específicos e isto, além de acelerar o metabolismo, ainda


aumenta o aproveitamento dos compostos e da energia disponível, o que torna

potencialmente interessante a utilização de extrato de levedura e outros suplementos

protéicos.

3 Cultivo descontínuo alimentado 41

3.3 Cultivo descontínuo alimentado

Os cultivos descontínuo-alimentado são empregados quando se pretende

obter determinadas concentrações celulares (ou de algum metabólito) que demandam

quantidades de substratos que provocariam inibição do crescimento num cultivo

descontínuo comum (“batch”).

O processo consiste em começar o cultivo no fermentador como se fosse um

processo descontínuo comum. A partir do momento em que um ou mais substratos

atinjam concentrações que limitem o crescimento celular (ou produção de um

metabólito), inicia-se a suplementação destes substratos (previamente preparados e

esterilizados) ao meio. A alimentação é feita através de uma ou mais bombas, que

podem ter vazão constante ou, preferencialmente, vazão variável que acompanhe a

velocidade de demanda dos substratos pelo microrganismo. O processo é

interrompido quando se atinge a capacidade volumétrica máxima do fermentador, ou

antes, se o resultado esperado foi alcançado (Schimidel et al, 2001).

Neste processo, a concentração dos subtratos limitantes no fermentador deve

ser mantida sempre num valor baixo, que não provoque limitação. É a adição

contínua que vai garantir o suprimento constante de substrato, necessário ao bom

desempenho microbiano (Yamane & Shimizu, 1984). Através deste processo,

podem-se atingir concentrações celulares elevadas, impossíveis de ser obtidas nos

cultivos descontínuos comuns.

4 Objetivos 42

4. Objetivos

Este trabalho tem por objetivo geral o estudo do cultivo de A. brasilense e A.

lipoferum no sentido de se contribuir para o estabelecimento das bases tecnológicas

para a produção industrial de inoculantes, através da escolha das fontes de carbono e

nitrogênio mais promissoras do ponto de vista industrial e fornecer subsídios para o

estabelecimento de protocolos de produção de biomassa destas bactérias a alta

densidade celular.


5. Materiais e métodos

5.1 Microrganismo

Foram utilizadas as linhagens de Azospirillum brasilense Sp7 e Azospirillum

lipoferum Br 17 gentilmente cedidas pela Dra. Vera Lúcia Baldani do Centro

Nacional de Pesquisas em Agrobiologia, da Embrapa, em Seropédica, RJ. As

linhagens eram mantidas na coleção de microrganismos do IPT por liofilização e/ou

criopreservação em freezer a -80ºC e em meio sólido NFB que continha L-malato e

NH4Cl como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente.

5.2 Meios de Cultura

5.2.1 Soluções-estoque

Para o preparo de diferentes meios de cultura eram utilizadas as soluções-

estoque relacionadas a seguir (todas as porcentagens são em massa/volume):

II –– solução de MgSO4.7H2O a 10%;

IIII –– solução de NaCl a 10%;

IIIIII –– solução de CaCl2.2H2O a 1%;

IIVV –– solução de Fe EDTA a 1,64%;

VV –– solução de micronutrientes

VVII –– solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%; (solução 0,5% em 0,2N KOH)

VVIIII –– solução de vitaminas.

A solução de Fe EDTA foi preparada misturando-se 16,0 g de Na2 EDTA (sal

di-sódico do ácido etileno diaminotetra-acético) com 11,95 g de FeSO4.7H2O e 950


mL de água, aquecendo-se até dissolução e, após resfriamento, completando-se o

volume até 1,0 litro.

A - A solução de micronutrientes continha, por litro: (Döbereiner, 1995):

0,04 g CuSO4.5H2O;

1,20 g ZnSO4.7H2O;

1,40 g H3BO3;

1,00 g Na2MoO4.2H2O

1,175 g MnSO4.H2O.

B – A solução de vitaminas continha: (Döbereiner, 1995)

10 mg biotina

20 mg piridoxol-HCl

A solução era dissolvida em banho-maria e completada o volume para 100

mL com água destilada, em seguida era filtrada e mantida a solução em geladeira.

5.2.2 Solução salina

Para diluição do inóculo foi utilizada solução salina com a seguinte

composição, por litro: (Döbereiner, 1995)

3,4 g KH2PO4;

2,0 mL da solução de MgSO4.7H2O a 10%;

1,0 mL da solução de NaCl a 10%;

2,0 mL da solução de CaCl2.2H2O a 1%;

2,0 mL da solução de micronutrientes;

4,0 mL Fe EDTA (solução 1,64%);

4,5 g KOH

O pH desta solução foi ajustado para 7,0 com KOH.


5.2.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo

A partir dos liófilos armazenados foram preparados tubos com meio de

cultura NFb sólido e incubação em estufa a 30ºC. A composição do meio é a

seguinte:

5 g de ácido málico;

0,5 g de K2HPO4;

1,0 g de Extrato de Levedura;




2,0 mL de solução de micronutrientes;

2,0 mL de solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%;

4,0 mL de solução de Fe EDTA a 1,64%;

1,0 mL de solução de vitaminas;

4,5 g de KOH;

15 g de agar-agar.

No preparo do meio adicionavam-se as substâncias na ordem indicada e

ajustava o pH para 6,8 utilizando-se solução de NaOH e completava o volume para

1000 mL com água destilada.

A cultura foi transferida a erlenmeyer contendo o meio citado, com exceção

do agar, em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC por 72 horas. Após o cultivo foi

preparada uma solução a 50% de glicerol (p/v) para ser adicionada à cultura crescida.

Posteriormente, 0,5 mL da solução de glicerol 50% e 0,5 mL do meio NFb foram

dispostos em tubos Eppendorfs estéreis e levados ao freezer à -80ºC.


5.2.4 Meios de cultura sólido para preparo do inóculo

Pré-inóculo: Um tubo Eppendorf contendo as cepas de Azospirillum spp

foram crescidas em meios sólido que consistiram de Agar nutriente (AN), Luria

Bertani (LB), Agar de Soja-Triptona (TSA), Agar Potato Dextrose (PDA) e NFb (já

descrito no item anterior) para averiguação da adaptação e crescimento por 5 dias em

estufa a 30ºC.

Inóculo: Baseado nos resultados da etapa anterior selecionou-se entre os

meios sólidos testados suas respectivas formulações líquidas para preparação dos

inóculos.

5.2.5 Meios de cultura líquidos

Foram utilizados meios de cultura nos ensaios em incubador rotativo e reator

com as fontes de carbono e nitrogênio selecionadas. A composição básica de todos

os meios, que será identificado como meio F, era composto de: (Dias, 1988).

2,64 g K2HPO4;




4,0 mL da solução solução de Fe EDTA a 1,64%;

5,0 Fonte de C selecionadas (frutose, sacarose, glicerol, lactato e etanol);

1,0g Extrato de Levedura;

1,32g (NH4)2HPO4/NH4Cl;

água filtrada ... qsp 1000 mL


Todos os meios de cultura tiveram seu pH ajustado para 6,8 e foram

esterilizados a 121ºC por 30 minutos. A frutose, a sacarose, o glicerol e o lactato

foram esterilizados em separado, o etanol foi devidamente filtrado com filtro estéril e

posteriormente adicionadas ao meio no momento da inoculação.

Averiguação do crescimento aeróbio de Azospirillum brasilense e

Azospirilum lipoferum em meio mínimo que continha respectivamente por litro

(Martinez & Burris, 1983):

4,0 g KH2PO4;

6,0 g K2HPO4;

0,2 g MgSO4.7H2O;

0,1 g NaCl;

0,026 g CaCl2.2H2O;

1,0 g NH4Cl;

0,01 g FeCl3;

0,002 g Na2MoO4.2H2O;

0,001 g biotina;

9,72 g sacarose (pH 6,8)

5.3 Ensaios em incubador rotativo

5.3.1 Equipamento

Foram utilizados incubadores rotativos, com controle de temperatura por

circulação de ar aquecido e freqüência de agitação ajustável.


5.3.2 Preparo do Pré-inóculo

Foi retirado da cultura estoque mantida em freezer à -80ºC, inoculado em

meio CN (3g Extrato de carne e 5g de Peptona bacteriológica por litro) em frascos

erlenmeyer de 125 mL e colocado em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC, com os

seguintes tempos de incubação: A. brasilense, 40 horas; A. lipoferum, 18 horas.

5.3.3 Preparo do inóculo

Em seguida, cerca de 10% da suspensão foi transferida para Caldo Nutriente e

incubadas novamente por 24 horas. Em alguns experimentos em biorreator a segunda

passagem foi realizada com meio de cultura com a mesma composição do meio

utilizado no ensaio.

5.3.4 Inoculação dos frascos

Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos com frascos erlenmeyer

de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura (meioF). A inoculação de cada um

dos frascos era feita com 10% da suspensão bacteriana preparada e padronizada

como anteriormente descrito.

5.3.5 Incubação e amostragem

Os frascos eram incubados à temperatura constante de 30ºC, com velocidades

de 200 rpm. A amostragem era feita retirando-se, de tempos em tempos, um frasco

de erlenmeyer do incubador.


5.3.6 Determinações efetuadas

Em cada amostra dos ensaios de incubador rotativo foram determinados;

- pH;

- absorbância celular;

- a concentração celular (massa seca e em termos de número de unidades f

ormadoras de colônias em placas/mL);

- consumo da fonte de carbono (frutose, sacarose, etanol, lactato e glicerol);

- consumo do nitrogênio inorgânico;

- consumo de fósforo.

5.4 Ensaios em fermentador, processo descontínuo

5.4.1 Equipamento

Foram utilizados biorreatores New Brunswick Scientific de 5 L de volume

para os ensaios em batelada e o Biostat Braun ED de 10 L de volume útil, que

permitia o controle da freqüência de agitação, de vazão de ar, temperatura e oxigênio

dissolvido e monitorava automaticamente o pH por adição de solução de HCl ou

NaOH 2N.

A esterilização do meio de cultura, do fermentador, e dos filtros de ar e frasco

com anti-espumante e soluções controladoras de pH era efetuada por autoclavação a

121ºC por 40 minutos. Para o cultivo em alta densidade celular foi utilizado

biorreator.


5.4.2 Preparo do inóculo

O inoculo de um ensaio descontínuo constituía-se de microrganismos

cultivados em incubador rotativo, segundo a seqüência descrita no item 5.3.2 e 5.3.3,

utilizando-se erlenmeyers de 2 litros com 500 mL de meio utilizado no fermentador.

5.4.3 Inoculação do Fermentador

A inoculação do fermentador era feita com de 24 horas para A. brasilense e

de 18 horas para A. lipoferum.

O volume de inoculo era cerca de 10% do volume total no fermentador.

5.4.4 Amostragem

Para possibilitar a coleta de amostras de forma asséptica, foram utilizados

tubos de ensaios estéreis e auxílio do bico de Bunsen.

5.4.5 Determinações efetuadas

Durante o cultivo são retiradas, em periodicidade e volumes

previamente definidos, amostras assépticas e não-assépticas. As assépticas destinam-

se à avaliação da concentração de unidades formadoras de colônias e a amostra não

asséptica para outras determinações representado na Figura 5.1.


Figura 5.1 - Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das amostras.

5.5 Métodos de Análises Físicas, Químicas e Microbiológicas

5.5.1 Determinação da Absorbância (A)

Foi determinada diretamente no caldo fermentado dos cultivos em

incubador rotativo e em fermentador.

A leitura foi feita em espectrofotômetro Thermoelectric cell Holder (U-

2001) modelo 131-0307 no comprimento de onda de 540nm. Como “branco”,

utilizou-se água destilada. A leitura foi realizada na faixa de 0,01 a 0,7 de

absorbância. Quando superior, dilui-se a amostra o número de vezes necessárias.


5.5.2 Concentração Celular Mássica (X)

Para efetuar a determinação da concentração celular centrifugava-se a 4ºC um

volume adequado do caldo a 9800 xg durante 10 minutos.

Separava-se o sobrenadante, ressuspendia-se o centrifugado em pequeno

volume de água destilada e filtrava-se a suspensão através da membrana Millipore

(diâmetro de poro de 0,45 ųm), previamente pesada.

O resíduo em conjunto com o filtro era colocado em estufa a 105ºC por 4

horas (tempo sulficiente para obter peso constante). Decorrido esse período,

transferia-se o conjunto para um dessecador e, quando frio (após aproximadamente

15 minutos), procedia-se a pesagem.

5.5.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas (UFC)

A contagem de unidades formadoras de colônias em placas foi realizada

segundo o método de Miles & Misra (1938). As amostras foram convenientemente

diluídas e gotas de 25 µL cada foram semeadas em meio AN (Agar nutriente). Após

incubação por 48 horas, em estufa a 30ºC, obteve-se a média da contagem de 9 gotas

para cada ponto obtido, exprimindo-se os resultados em UFC/mL de amostra.

5.5.4 Concentração de Frutose, Sacarose, Etanol, Glicerol e Lactato ((SS))

As concentrações de frutose, sacarose, lactato foram determinadas por

cromatografia de fase líquida (HPLC – Waters 510) equipado com uma coluna para

determinação de açúcares. Um volume de µL do sobrenadante da amostra era

injetado no equipamento. E para a determinação de etanol, foi utilizado

Cromatógrafo a gás (HP 5840-A) equipado com detector de ionização por chama de


hidrogênio, injetor tipo split/splitless e forno com capacidade de realizar de

programação de temperatura. Para o preparo da curva de calibração foram preparadas

soluções padrões contendo diferentes concentrações (% em massa) utilizando o n-

butanol como solvente. As soluções preparadas devem estar numa faixa de

concentrações que normalmente são encontradas nas amostras. Identificados os picos

de etanol, de acordo com o cromatograma padrão anexo, obteve-se as respectivas

áreas. Criou-se uma curva de calibração, colocando no eixo das abscissas os valores

das relações de área e, no eixo das ordenadas os valores de concentração dos

respectivos componentes nas soluções.

Para determinação da concentração de glicerol, foi realizado conforme o

método IPT/DQEQ (1982), determinação de glicerol por oxidação de periodato de

sódio.

a - Pesava-se uma alíquota (filtrada da determinação da massa seca ou sobrenadante

da centrifugação) em pés-filtro ou béquer pequeno, segundo a tabela 5.2:

Tabela 5.2 Concentração de glicerol em g/L na amostras.

Concentração esperada de Glicerol na amostra (g/L) Peso da alíquota (g)

8 – 10 5

5 – 8 10

2 – 5 15

< 2 20

b – Transferia a amostra a um béquer de 300 mL, lavando-se algumas vezes com

água destilada o recipiente usado para a pesagem da amostra;

c – Diluia-se a amostra a 50 mL;

d – Adicionava-se H2SO4 0,2N até que o pH se tornasse iguala 3,0;


e – Em seguida, adicionava-se NaOH 0,05 N até que o pH atingisse o valor 8,1 ± 0,1

(no final, usava NaOH 0,005 N para facilitar este acerto);

f – Preparava-se um branco contendo 50 mL de água destilada e procedia ao mesmo

ajuste de pH;

g – Adicionava-se 10 mL de solução de periodato de sódio (obtida dissolvendo-se 60

g de NaIO4 em água destilada contendo 120 N de H2SO4 0,1 N e diluído a 1 L),

agitava-se o conteúdo para homogenizar, cobria com vidro de relógio e deixava em

repouso por 30 minutos, no escuro, a temperatura inferior a 35ºC;

h – Adicionava 2 mL de solução de etilenoglicol 50% e deixava por 20 minutos;

i – Diluia a a proximadamente 100 mL e titulava com NaOH aproximadamente 0,125

N (normalidade perfeitamente conhecida), usando medidor de pH, até pH 6,5 para

branco e Ph 8,1 ± 0,1 para a amostra. Perto do ponto final, colocava-se 1 gota ou

fração de gota de cada vez;

j – Cálculo:

% glicerol = mNVbVa 20959,**)( −

onde: Va = volume de NaOH gasto na titulação da amostra (mL);

Vb = volume de NaOH gasto na titulação do branco (mL);

N = normalidade do NaOH;

m = massa da alíquota da amostra (g)

5.5.5 Avaliação da concentração de nitrogênio amoniacal

O método permite a determinação de nitrogênio na forma de amônio via

eletrodo específico (Orion ammonia gas-sensing electrod, Model 95-12) através da

conversão de amônio a amônia.


Esse eletrodo é constituído por uma membrana hidrofóbica gás-permeável

que separa a solução de amostra da sua solução interna. A amônia dissolvida na

amostra difunde-se através da membrana até que as pressões parciais do lado interno

e externo à membrana se igualem. A pressão parcial de amônia será proporcional á

concentração presente na amostra.

Preparo das amostras:

Devem ser preparadas curvas de calibração com solução-padrão de sulfato de

amônio em diferentes concentrações a cada lote de amostras a serem analisadas.

Amostras e soluções-padrão devem ser analisadas sempre à mesma temperatura.

Procedimento analítico:

(1) Adiciona-se 0,2 mL de NaOH de solução 10 N em 2,0 mL de amostra

(sobrenadante do centrifugado) ou solução-padrão, no momento da leitura. Com esse

procedimento o amônio presente na solução passa a forma de amônia, sendo então

determinado;

(2) Amostras e padrões são agitados com agitador magnético;

(3) As leituras são realizadas no condutivímetro (Procyon Model AS 720), em

milivolt, a cada 30 segundos, até que a corrente se estabilize;

(4) O eletrodo deve ser lavado com água destilada entre as medidas de uma

amostra e outra e colocado em uma solução de descanso (solução-padrão 10 ppm);

(5) A concentração de amônio é calculada segundo a curva de calibração obtida

com as soluções-padrão.

5.5.6 Avaliação da concentração de fósforo

O método do ácido ascórbico determina o in fosfato (PO4) contido na amostra

por análise colorimétrica (Franson, 1998).


Para efetuar o procedimento do método do ácido ascórbico é necessário

preparar os seguintes reagentes:

1. H2SO4 5 N – Diluir 70 mL de ácido sulfúrico concentrado em 500 mL de

água destilada;

2. Tartarato de antimônio e potássio – Dissolver 1,3715 g do sal em 400 mL de

água destilada, elevar o volume para 500 Ml. Acondicionar em frasco de vidro.

3. Molibdato de amônio – Dissolver 20 g do sal em 500 mL de água destilada.

(Acondicionar em frasco de vidro).

4. Ácido ascórbico 0,1 M – Dissolver 1,76 g de ácido ascórbico em 100 mL de

água destilada. (A solução fica estável por uma semana à 4ºC).

Em seguida, prepara-se o reativo utilizando as soluções descritas acima:

Para obter 100 mL do reativo prepara-se: 50 mL do reagente 1;

5 mL do reagente 2;

15 mL do reagente 3;

30 mL do reagente 4.

Deve-se preparar o reativo à temperatura ambiente. (Esta mistura é estável

por um período de 4 horas).

Na solução padrão (0,15 a 1,30 mg/L de P) deverá dissolver 219,5 mg de

K2HPO4 anidro em 1000 mL de água destilada e assim prepara-se os padrões por

diluição (1:0; 1:2; 1:4; 1:6; 1:8 e 1:10).

Procedimento para análise colorimétrica:

(1) Prepara-se 200 µL de amostra ou padrão ou água destilada (branco);

(2) Adiciona-se 4,9 Ml de água destilada e deionizada no tubo contendo o item 1;

(3) Adiciona-se 800 µL do reativo;

(4) Incuba-se por 10 minutos;


(5) Efetua-se as leituras a 880 nm em durante;

(6) Calcular a concentração de Fósforo em mg/L segundo a curva de calibração

obtida com as soluções-padrões.

5.6 Cálculo dos parâmetros cinéticos

Os parâmetros cinéticos µmax (velocidade específica máxima de crescimento) e

os fatores de conversão substrato a células, nitrogênio a células, respectivamente

YX/S, YX/N e produtividade de biomassa Px foram calculados conforme Hiss, (2001) e

Carvalho e Sato, (2001).

Determinou-se um tempo “final” (tf) em que a concentração celular mássica era

máxima ou que fonte de carbono estava esgotada, e em relação a esse tempo

calcularam-se os fatores de conversão e produtividade, pela equações a seguir:

Fator de conversão de substrato em células (YX/S)

(1)

onde: Xf = concentração celular final (g/L);

XO = concentração celular inicial (g/L);

So = concentração da fonte de carbono inicial (g/L);

Sf = concentração da fonte de carbono final (g/L).

Fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N)

(2)

onde: NO = concentração de nitrogênio amoniacal inicial (g/L);

Nf = concentração de nitrogênio amoniacal final(g/L).


Produtividade celular mássica

(3)

onde: tf = tempo para consumo da fonte de carbono (h).

A velocidade específica máxima de crescimento celular (µmax)

Para determinar a fase de crescimento exponencial, foram traçadas curvas de

ln(X) (logaritmo neperiano da massa de célula) em função do tempo. Após traçadas

as curvas, notou-se que os pontos podia, ser correlacionados por uma reta e com isso

foi possível obter o µmax (velocidade específica de crescimento), através de uma

regressão linear (o coeficiente angular da correlação linear era o valor utlizado),

segundo a equação (4):

lnX = µmax . t (4)

Xo

5.7 – Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios

Para estudar o crescimento de Azospirillum ssp em diversas fontes de carbono

e nitrogênio, em dois sistemas de cultivo, foram desenvolvidos 27 experimentos para

A. brasilense e 22 para A. lipoferum.

O nome de cada ensaio é composto por cinco letras e um número: as duas

primeiras letras (Az) indicam a abreviação da palavra Azospirillum e as duas

seguintes (br ou lp) o organismo que participa no ensaio e a última letra (S ou F)

demonstra o processo/equipamento utilizado; o número é seqüencial por tipo de

ensaio (Tabela 5.1).


Tabelas 5.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada experimento.

Experimento Ensaios Fonte de Carbono Fonte de Nitrogênio Tempo de ensaio (h) Título

Azbr01 (S) (NH4)2HPO4

E1 Azbr02 (S) Frutose NH4Cl 120,0


E2 Azbr04 (S) Glicerol NH4Cl 120,0


E3 Azbr06 (S) Sacarose NH4Cl 120,0


E4 Azbr08 (S) Lactato NH4Cl 120,0


E5 Azbr10 (S) Etanol NH4Cl 120,0

Azlp01 (S) (NH4)2HPO4

E6 Azlp02 (S) Frutose NH4Cl 120,0


E7 Azlp04 (S) Glicerol NH4Cl 120,0


E8 Azlp 06 (S) Sacarose NH4Cl 120,0


E9 Azlp08 (S) Lactato NH4Cl 120,0


E10 Azlp10 (S) Etanol NH4Cl 120,0

Influ

ênci

a da

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cent

raçã

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s fon

tes d

e Ca

rbon

o e

Nitr

ogên

io so

bre

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esci

men

to m

icro

bian

o.

E11 Azlp01 (F) Sacarose (NH4)2HPO4 7,5

E12 Azlp02 (F) Glicerol (NH4)2HPO4 11,0

Azbr01(F) 15,0

Azbr02 (F) 13,0

E13 Azbr03 (F) Frutose (NH4)2HPO4 13,0

Azbr04 (F) 18,0

E14 Azbr05 (F) Glicerol (NH4)2HPO4 37,0

Azbr06 (F) 26,0

E15 Azbr07 (F) Etanol (NH4)2HPO4 12,0

Det

erm

inar

qua

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s fon

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elho

r do

pon

to

de v

ista

de

proc

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e d

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pont

o de

vis

ta e

conô

mic

o.

(S) = shaker e (F) = Fermentador Obs:. Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos em duplicata.

6 Resultados e Discussão

60

6. Resultados e Discussão

6.1 Meios sólidos

Os resultados obtidos após incubação por cinco dias, em meio sólido a 30ºC estão

resumidos na tabela 6.1. Dos meios de cultura testados: Agar nutriente (AN), Luria Bertani

(LB) e Agar de Soja-Triptona (TSA) demonstraram colônias bem caracterizadas quanto à

cor, diâmetro, consistência das colônias e excelente crescimento celular para ambas as

linhagens. Entretanto, o meio de cultura que atendeu tanto o critério de maior velocidade de

crescimento e maior quantidade de células quanto aos critérios de disponibilidade e preço,

evitando a utilização de matéria-prima que tenha apenas um único fabricante ou fornecedor

foi o Agar nutriente (AN).

Tabela 6.1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados.

Meio de cultura A. brasilense Sp7 A. lipoferum BR 17

NA +++ +++

LB +++ +++

PDA + +++

TSA +++ +++

NFb ++ ++

Símbolos: +++, excelente crescimento; ++ bom crescimento; + pouco crescimento. Agar nutriente (AN), Luria Bertani (LB), Agar de Soja-Triptona (TSA), Agar Potato Dextrose (PDA) e Novo Fábio Pedrosa. (NFb)

6.2 Fonte de Nitrogênio

A princípio, poder-se-ia empregar amônia, aminoácidos, proteínas e até mesmo

nitrogênio gasoso como fontes desse elemento para o crescimento microbiano, mas deve-se

levar em consideração critérios que se referem à velocidade da produção, aos fatores de


61

conversão, e à facilidade de compatibilização da etapa de crescimento celular com as

demais etapas do processo. A tabela 6.2 apresenta os melhores resultados da seleção

realizada nos ensaios em duplicata em incubador rotativo e suas respectivas biomassas. Das

duas fontes suplementadas ao meio de cultura, NH4Cl, conforme citado por Döbereiner,

(1995) e (NH4)2HPO4 mencionada em Dias, (1988). Os resultados mostram que elas são

equivalentes em termos de crescimento e, por facilidade de preparação já que (NH4)2HPO4

é fornecedor de P ao sistema, este foi o escolhido.

Tabela 6.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de cultivo)

Ensaios A. brasilense Sp7 A. lipoferum BR17

(NH4)2HPO4/frutose 2,82 g/L 1,58 g/L

NH4Cl/frutose 2,38 g/L 1,27 g/L

(NH4)2HPO4/glicerol 2,20 g/L 1,62 g/L

NH4Cl/glicerol 2,19 g/L 2,04 g/L

(NH4)2HPO4/sacarose 0,89 g/L 2,21 g/L

NH4Cl/sacarose 0,57 g/L 2,19 g/L

(NH4)2HPO4/lactato 2,01 g/L 1,82 g/L

NH4Cl/lactato 1,73 g/L 1,76 gL

(NH4)2HPO4/etanol 1,85 g/L 1,26 g/L

NH4Cl/etanol 1,57 g/L 1,06 g/L

* fontes testadas nos ensaios em incubador rotativo

6.3 Ensaios em incubador rotativo

São apresentados na tabela 6.3 o resumo de todos os resultados obtidos nos ensaios

em incubador rotativo e nas figuras 6.1 a 6.5 as curvas dos resultados destes ensaios, todos

realizados à temperatura de 30ºC e 200 rpm.


62

O principal objetivo destes ensaios foi avaliar a influência das fontes de carbono e

nitrogênio no crescimento de Azospirilla e nos correspondentes fatores de conversão e

produtividade.

6.3.1 Frutose

O desenvolvimento das bactérias do gênero Azospirillum utilizando frutose como

principal fonte de carbono, apresentaram-se bem caracterizado.

Nos ensaios em duplicata em Azbr01, Azbr02, Azlp01 e Azlp02, utilizando fontes

de nitrogênio diferentes (NH4)2HPO4 e NH4Cl) pôde-se observar que antes de completar 24

horas de ensaio, as células iniciavam uma fase de aumento da concentração celular que era

acompanhada pelo decréscimo da concentração de frutose e de nitrogênio. Esta fase de

crescimento terminou quando a concentração de C limitante. Nos ensaios utilizando

(NH4)2HPO4 com A. brasilense Sp7 observou-se um pequeno decréscimo no pH até o final

dos ensaios. Já para o NH4Cl usando o mesmo organismo, há aumento do pH a partir de

100 horas de ensaio, em resposta à liberação de íons fosfato (a parte não foi utilizada pelas

bactérias) pelo consumo de amônia e por conseqüência da lise celular, que libera N protéico

para o meio. Houve consumo de nitrogênio e frutose em ambas e não se percebe o

crescimento subseqüente a partir de aproximadamente 30 horas de ensaio (Figuras 6.1).

Deve-se salientar que foi observado a formação de flocos, sendo mais intensa quando maior

o tempo do ensaio.


63

6.3.2 Glicerol

Uma primeira característica de todos os cultivos com glicerol foi um período de

crescimento celular com baixo consumo de N presente no meio de cultura. Esse período foi

acompanhado por valores de pH constantes ou ligeiramente ascendentes. Quando se iniciou

o consumo de nitrogênio inorgânico, o pH decresceu. Não se verificou o aparecimento de

duas fases exponenciais de crescimento nos ensaios utilizando glicerol e extrato de

levedura. Mas também houve o consumo de nitrogênio e glicerol sem o crescimento

subseqüente. Foi observado o aparecimento de flocos (Figuras 6.2). Para o glicerol obteve-

se o dobro dos valores dos fatores de conversão e das produtividades de A. brasilense Sp7

em relação a A. lipoferum Br 17 (Tabela 6.4).

6.3.3 Sacarose

Para averiguar o crescimento de Azospirillum utilizando sacarose como fonte de

carbono, o meio de cultura (MM), descrito na página 46, foi preparado e inoculado com as

linhagens utilizadas neste trabalho. Pois Martinez & Buris, (1983), cresceram aerobiamente

A. brasilense e A. lipoferum e concluíram que ambas as linhagens não crescem utilizando

sacarose como fonte de carbono.

Os resultados confirmaram que Azospirillum realmente não cresce no meio mínimo

proposto, por ser um meio pobre, não contêm os nutrientes necessários para a mesma

desenvolver-se adequadamente. Levando-se essas informações em consideração, foi

acrescentado ao meio mínimo (MM), extrato de levedura, numa concentração pré-

determinada (0,075 g/L). Observou-se que para o crescimento sem fixação de nitrogênio,

nas temperaturas de 30 ou 35ºC, há necessidade da adição de extrato de levedura ao meio

de cultura, sendo ele provavelmente um dos nutrientes essenciais que age em conjunto com

os outros componentes para o desenvolvimento da bactéria. Constatou-se que a introdução

do estrato de levedura no meio propiciou o crescimento apenas de A. lipoferum BR17.


64

Para os ensaios com sacarose, as linhagens crescidas em meio F, foram obtidos

resultados desfavoráveis para A. brasilense Sp7, pois a concentração celular encontrada foi

baixa (0,3 g/L) e em momento algum do ensaio as fontes de carbono e nitrogênio foram

consumidas, implicando, conseqüentemente, em uma baixa produtividade (0,006 g/L.h),

dado apresentado na tabela 6.3. Entretanto, para A. lipoferum Br 17, obteve-se um

excelente crescimento celular, acompanhada pelo decréscimo da concentração das mesmas

fontes. A concentração de sacarose, glicose e frutose determinada por cromatografia de fase

líquida (HPLC) (resultados não apresentados), mostraram o consumo total deste substrato

antes de atingir 24 horas de ensaio. Ao contrário, para A. brasilense, em todas as amostras

analisadas, a concentração de sacarose permeneceu constante, e a concentração de glicose e

frutose não aparecem. Por ser um carboidrato, o decréscimo do pH ao longo do cultivo

pode ter ocorrido pela mesma razão verificada em frutose (Figura 6.3). Notou-se ainda,

mudança de cor e formação de flocos.

6.3.4 Lactato

Na utilização de sais de ácidos orgânicos (lactato) como fonte de carbono, a

tendência do pH foi aumentar em decorrência à liberação de íons de sódio que libera N

protéico para o meio. Como demonstrado nos ensaios, alterou-se o pH de 6,8 para 9,0 não

prejudicando, aparentemente, o crescimento celular ou o consumo dos substratos (Figuras

6.4). Em A. brasilense, os ensaios suplementados com DAP (diamônio-fosfato), o lactato

foi consumido mais rapidamente quando comparada a A. lipoferum. Metabolicamente o

lactato é convertido em piruvato e são utilizados como fonte de energia, acelerando o

consumo do substrato nesta bactéria.

Nos ensaios observou-se a formação de flocos.


65

6.4.5 Etanol

É possível que as linhagens não tenham se adaptado ao meio de cultura que

continha etanol como única fonte de carbono. Pela análise da variação dos parâmetros

obtidos, pode-se observar que houve diferenças significativas para fatores de conversão,

produtividade e a diferença nos pHs apresentados na Tabela 6.3 para a interação entre os

fatores linhagens e substrato.

O crescimento de A. brasilense Sp7 foi superior à outra linhagem, obteve

concentração celular final de 2,0 g/L e pH 6,0. Já A. lipoferum BR 17, apresentou

comportamento diferente, onde o pH final foi 7,6 e concentração celular

consideravelmente baixa (1,030 g/L), e os devidos comportamentos durante os ensaios

estão representados nas figuras 6.5. Sabe-se que quanto maior o valor do pH, maior será a

degradação dos nutrientes contidos no meio, e nesses ensaios ocorre aumento do pH. O fato

dos ensaios durarem 120 horas, com agitação e temperatura definidas, também é um fator

que auxilia na degradação dos nutrientes, assim, soluções de DAP, nas mesmas condições

foram utilizadas como teste para averiguar o grau de degradação de N num período de 5

dias. E após análises de nitrogênio amoniacal, constatou-se que a solução inicial continha

0,5 g/L de Nitrogênio inorgânico enquanto que a solução final tinha apenas 0,2 g/L, sem

que se tenha consumo pelas bactérias. Observou-se em A. brasilense, o consumo de

carbono associado ao crescimento celular quando utilizado DAP na composição do meio de

cultura, sendo que ocorre limitação desta fonte a partir das 40 horas de ensaio. E o consumo

de nitrogênio não associado ao crescimento celular para ambas as linhagens.


66

(NH4)2HPO4 NH4Cl

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

g/L

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

g/L

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

g/L

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

g/L

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

g/L

0,001,002,003,004,005,006,007,008,00

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

pH

0,001,002,003,004,005,006,007,008,00

0 20 40 60 80 100 120 140t empo ( h)

p H

Figura 6.1 Evolução das concentrações de Biomassa, Frutose, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

g/L

Frutose

Nitrogênio Amoniacal

Biomassa


67

(NH4)2HPO4 NH4Cl

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

g/L

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

g/L

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

g/L

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

g/L

0,001,002,003,004,005,006,007,008,00

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

pH

0,001,002,003,004,005,006,007,008,00

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

pH

Figura 6.2 Evolução das concentrações de Biomassa, Glicerol, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.

Biomassa

Glicerol



68

(NH4)2HPO4 NH4Cl

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,01,02,03,04,05,06,0

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

(g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,001,002,003,004,005,006,007,008,00

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

pH

0,001,002,003,004,005,006,007,008,00

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

pH

Figura 6.3 Evolução das concentrações de Biomassa, Sacarose, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.

Biomassa

Sacarose



69

(NH4)2HPO4 NH4Cl

0,00,51,01,52,02,53,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

(g/L)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

pH

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

pH

Figura 6.4 Evolução das concentrações de Biomassa, Lactato, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.

Biomassa

Lactato



70

(NH4)2HPO4 NH4Cl

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0 20 40 60 80 100 120 140

tempo (h)

(g/L)

0,01,02,03,04,05,06,07,08,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

(g/L)

0,01,02,03,04,05,06,07,08,0

0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)

pH

Figura 6.5 Evolução das concentrações de Biomassa, Etanol, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.

Biomassa

Etanol



71

6.4 Observações gerais

Os flocos formados nestes ensaios eram aproximadamente esféricos e decantavam

quando em repouso. Os flocos tornaram-se visíveis a partir das 6h de cultivo.

Nos ensaios em que houve floculação notou-se também que os meios de cultura e as

células retidas nos filtros apresentavam-se rosadas, denotando a formação de carotenóides.

Esses dois eventos (floculação e formação de carotenóides) foram observados para A.

brasilense cd (Nur & Henis, 1981). Deve-se ressaltar que a hipótese de produção de alguma

substância extracelular poderia explicar a ocorrência de floculação. Em relação aos valores

obtidos nas análises de fósforo, não se observa coerência nos resultados, devido à presença

de carotenóides.

A formação de subprodutos durante o crescimento de Azospirillum não chega a

preocupar. Goebel & Krieg, (1984), demonstraram que os produtos finais do cultivo deste

microrganismo além de CO2 e H2O são apenas alguns ácidos orgânicos, principalmente

acético, lático, glioxálico, málico, 2-oxoglutárico e β-hidroxibutírico; estes ácidos eram

formados em quantidades reduzidas, que consequentemente decrescem o pH e não

apresentavam efeito inibidor no metabolismo bacteriano.

Quase todos os ensaios com residual de substrato superior a 1 g/L indicavam que

possivelmente outro componente do meio de cultura era o limitante, quando não se

observou crescimento celular satisfatório. Esse limitante, entretanto, não era o nitrogênio

inorgânico, como pode ser visto nos resultados apresentados. Pois quando ocorria o

consumo total de substrato consequentemente ocorreu o aumento da concentração celular

final.

Para facilitar as comparações entre os resultados obtidos com substratos diferentes,

diversas grandezas, a tabela 6.3 reúne os valores iniciais e finais de pH, X, S, UFC (unidade


72

formadora de colônias), N, P, os fatores de conversão e a produtividade, para os ensaios em

incubador rotativo com A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17.

Para A. brasilense Sp7, foram avaliadas como mais eficientes as seguintes fontes de

carbono: frutose, glicerol, lactato e etanol.

As concentrações celulares e as produtividades nos cultivos com frutose foram

quase sempre superiores às obtidas com as demais fontes de carbono. Os fatores de

conversão de substrato e de nitrogênio em células apresentaram comportamentos distintos

para cada fonte de carbono. Considerando o mesmo tempo de ensaio para as linhagens, os

valores de pH, como pode ser visto na tabela 6.3, apresentam comportamento diferenciado,

ambas decresceram, pois com etanol as variações foram pequenas e suaves, mas com

glicerol e frutose foram bem mais abruptas. Com sacarose, observou-se o não consumo do

substrato, e consequentemente o retardamento do crescimento celular.

Já para A. lipoferum Br 17, foram avaliadas como melhores fontes de carbono em

ordem decrescente, de acordo com os valores numéricos da concentração celular e dos

fatores YX/S, os seguintes substratos: sacarose e glicerol. As demais fontes de C

conduziram os experimentos com resultados insatisfatórios.

Alguns comportamentos foram semelhantes para as fontes de carbono estudadas,

como por exemplo, o consumo de nitrogênio e substrato sem efetuar o crescimento celular.

Provavelmente, o oxigênio atuou como fator limitante, pois os nutrientes (nitrogênio e

substrato), que são consumidos após a velocidade específica de crescimento terem tendido

a zero, devem ter sido utilizadas somente para manutenção celular.

Nos ensaios em incubador rotativo, foram obtidas nas contagens de UFC valores

acima de 109 para ambas as linhagens, diferenciando-se segundo as fontes de carbono

utilizadas. Para A. brasilense utilizou-se frutose (3,22x109), glicerol (2,25x109) e etanol

(2,00x109) e para A. lipoferum, utilizou-se sacarose (3,21x109) e glicerol (1,02x109).


73

Tabela 6.3 - Dados experimentais obtidos nos ensaios com A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 em

incubador rotativo (200 rpm, 30ºC).

Ensaio

Tempo dos

ensaios (h)

pHo pHf Xo (g/L)

Xf (g/L)

So (g/L)

Sf (g/L)

U.F.C inicial

(U.F.C/mL)

U.F.C final (U.F.C/mL)

No (g/L)

Nf (g/L)

Po (g/L)

Pf (g/L)

Yx/s (g/g)

YX/N (g/g)

Px (g/L.h)

Azbr01 (a)1 24 6,80 4,89 0,11 2,82 5,04 0,80 9,53E+06 1,62E+09 0,28 0,11 0,75 0,80 0,64 15,94 0,11 Azbr01 (b)1 24 6,81 4,23 0,22 2,60 5,30 0,35 8,88E+06 2,31E+09 0,20 0,09 0,72 0,65 0,48 21,63 0,10 Azbr02 (a)2 24 6,80 5,77 0,19 2,39 5,20 0,00 8,66E+06 3,22E+09 0,22 0,09 0,73 0,03 0,42 16,75 0,09 Azbr02 (b)2 24 6,81 5,68 0,23 2,48 5,10 0,21 6,25E+06 1,43E+09 0,19 0,11 0,74 0,31 0,46 28,13 0,09

Azlp01 (a)1 24 6,92 4,72 0,27 1,58 4,83 0,55 7,53E+06 9,80E+08 0,28 0,09 0,64 0,72 0,31 6,52 0,05 Azlp01 (b)1 24 6,88 4,59 0,21 1,42 5,30 0,02 4,25E+06 6,78E+08 0,21 0,12 0,45 0,80 0,23 13,65 0,05 Azlp02 (a)2 24 6,82 4,73 0,17 1,13 5,00 0,00 4,66E+06 5,28E+08 0,22 0,03 0,56 0,43 0,19 5,02 0,03 Azlp02 (b)2 24 6,80 4,75 0,25 1,27 4,98 0,02 6,48E+06 6,66E+08 0,23 0,11 0,55 0,66 0,21 8,65 0,05



Azbr05 (a)5 48 6,78 5,72 0,18 0,90 4,88 4,05 3,93E+07 3,99E+08 0,28 0,19 0,80 0,68 0,25 6,88 0,02 Azbr05 (b)5 48 6,82 5,73 0,19 0,36 5,00 3,85 1,05E+07 2,86E+08 0,29 0,19 0,73 0,69 0,23 2,90 0,003Azbr06 (a)6 48 6,79 5,31 0,20 0,50 5,00 4,30 1,60E+07 3,28E+08 0,21 0,18 0,85 0,60 0,43 9,67 0,006Azbr06 (b)6 48 6,78 5,73 0,21 0,57 4,99 4,26 2,02E+07 5,21E+08 0,22 0,19 0,75 0,60 0,49 11,31 0,007





Azlp09 (a)9 120 6,81 7,21 0,14 1,03 5,02 0,07 1,33E+07 1,98E+08 0,28 0,11 0,74 0,70 0,18 5,05 0,007Azlp09 (a)9 120 6,85 7,44 0,12 1,26 5,00 0,04 1,29E+07 6,69E+08 0,23 0,09 0,48 0,99 0,23 8,21 0,011Azlp10 (a)10 72 6,81 7,60 0,22 0,99 4,95 1,02 2,22E+07 1,09E+08 0,25 0,08 0,59 0,65 0,20 4,57 0,010Azlp10 (b)10 72 6,81 7,26 0,14 1,06 4,87 0,55 1,65E+07 1,58E+08 0,21 0,10 0,16 0,46 0,21 8,42 0,013

1 - Frutose / (NH4)2HPO4; 2 - Frutose / NH4Cl; 3 - Glicerol / (NH4)2HPO4; 4 - Glicerol /NH4Cl; 5 - Sacarose / (NH4)2HPO4; 6 - Sacarose / NH4Cl; 7 - Lactato / (NH4)2HPO4; 8 - Lactato / NH4Cl; 9 - Etanol / (NH4)2HPO4; 10 - Etanol / NH4Cl. Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de Células (Xo, Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf), Fósforo (Po, Pf), pH e U.F.C; e Fatores de conversão do substrato (YX/S), de nitrogênio (YX/N) em células e produtividade (PX) para todos os ensaios realizados.


74

6.5 Ensaios em biorreator

Os experimentos foram realizados com o intuito de se estabelecer melhores

condições para a produção de A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 em processo

descontínuo, a partir dos resultados já obtidos em incubador rotativo. Para o processo

industrial deve-se utilizar a concentração inicial de nutrientes que proporcione os maiores

fatores de conversão (que estão associados aos custos dos reagentes e matérias-primas) e

produtividade (que é inversamente proporcional ao tamanho dos equipamentos e aos custos

operacionais) e, no caso dos inoculantes, as maiores concentrações de células viáveis.

Todos os ensaios foram realizados segundo a metodologia descrita no item 9.4, à

temperatura de 30ºC e a uma vazão de ar entre 0,5 e 1,0 L/min de O2 (oxigênio dissolvido),

e aumento da agitação conforme necessidade das bactérias durante o cultivo. Dias (1988),

estudou diferentes concentrações de substrato e concluiu que os meios de cultura com 1,0

g/L de extrato de Levedura, concentrações iniciais de substratos maiores que 11,5 g/L não

seriam vantajosas, pois não aumentariam os fatores de conversão nem a produtividade

celular. Concentrações iniciais de substrato inferiores a 5,2 g/L trariam acentuados

decréscimos na concentração celular final e na produtividade, embora pudessem conduzir a

fatores YX/S bastante elevados. Assim, para programar os ensaios em processo descontínuo,

em fermentador, pôde-se restringir a faixa de experimentação para 5,2 < So < 11,5 g/L para

frutose.

O controle de pH, não foi realizado. Foi adotado esse procedimento levando-se em

consideração que o crescimento bacteriano não é muito sensível à variação de pH, como

pôde ser verificado nos cultivos em agitador rotativo, em que houve crescimento

exponencial para variações de pH bem pronunciadas.


75

A tabela 6.4, resume as condições preliminares dos ensaios realizados em

fermentador.

Tabela 6.4 - Etapas preliminares dos ensaios em fermentador.

Ensaios Pré-inóculo Fonte de Carbono (5 g/L) Inóculo

Azlp01 CN Sacarose MEIO F

Azlp02 CN Glicerol MEIO F

Azbr01 CN Frutose CN

Azbr02 CN Frutose MEIO F

Azbr03 CN Frutose MEIO F

Azbr04 CN Glicerol MEIO F

Azbr05 CN Glicerol CN

Azbr06 CN Etanol CN

Azbr07 CN Etanol MEIO F Meio F: Meio de fermentador CN: Caldo nutriente

Observando-se as variações de oxigênio dissolvido, notou-se um mesmo padrão de

comportamento, ou seja, ao longo dos ensaios a concentração de oxigênio tendia a

decrescer de 10% até 40% de saturação e ao término da fonte de carbono, as bactérias não

tinha o que oxidar e a mesma concentração subia de forma acentuada (dados não

apresentados).

Esse parâmetro poderá, então, ser de grande utilidade no controle do processo

descontínuo, indicando rapidamente o término do crescimento e evitando que o reator fique

em operação com células em estado estacionário ou de declínio.

Tendo em vista que a taxa de respiração para adequar ao fermentador seja

suficiente para atender às necessidades do crescimento da cultura microbiana, faz-se

necessário conhecer a concentração crítica de O2 dissolvido para Azospirilla em cultivo

submerso. Tal & Okon, (1985) concluíram que as bactérias do gênero Azospirillum


76

desenvolvem-se em uma ampla faixa de oxigênio dissolvido (OD). Mas em concentrações

de 0,5 a 0,9 g/L de NH4+

contida no meio de cultura, o crescimento de Azospirillum

lipoferum ficou restringido quando a OD era de 30 µM (cerca de 10% de saturação)

(Tsagou and Aggelis, 2003).

6.5.1 Glicerol

Provavelmente, uma primeira característica muito interessante dos ensaios com A.

brasilense, foi o aumento de NH4+ devido o consumo do extrato de levedura presente no

meio de cultura. No caso do A. lipoferum, no ensaio Azlp02, pode-se afirmar que em todos

os ensaios com glicerol houve um período de crescimento celular (e de consumo de

glicerol) sem que houvesse o decréscimo de N (Figura 6.6).

No ensaio Azbr04 o inóculo utilizado foi preparado com meio F e no ensaio Azbr05

utilizou-se CN (Tabela 6.5). Supõe-se que em Azbr05, o cultivo vindo de caldo nutriente

carreou algum nutriente para o meio fermentador, aparentando uma pequena diferença na

velocidade de crescimento entre um ensaio e outro, pois ao alcançar 18 horas de cultivo, no

ensaio Azbr05 obteve-se 2 g/L de biomassa, enquanto que para Azbr04, o valor obtido foi

de 1,33 g/L.

Verificou-se na figura 6.6 que em Azlp02, A. lipoferum pára de crescer, com 9

horas de cultivo, quando utilizou inóculo crescido em meio F, e quando ocorre decréscimo

do pH juntamente com a queda do Nitrogênio.

Apesar de serem linhagens diferentes, as curvas mostram alguns comportamentos

semelhantes, como a utilização total da fonte de carbono e nitrogênio, o aumento da

absorbância em conseqüência do acúmulo da biomassa, maior variação do pH e menor

tamponamento das soluções.


77

Esses períodos foram acompanhados por valores de pH constantes, ou ligeiramente

ascendentes e quando se iniciava o consumo de nitrogênio o pH decrescia.

É provável que nesse período de concentração constante de nitrogênio inorgânico, o

microrganismo tenha utilizado nitrogênio orgânico presente no extrato de levedura através

das reações da assimilação de aminoácidos e proteínas.

Mais uma vez a floculação pôde ser associada, ainda que de forma qualitativa à

formação de carotenóides, pois os ensaios com maior densidade de flocos eram também os

mais rosados. Entretanto, a floculação não afetou o crescimento celular, embora tenha

interferido nas leituras de absorbância (Tabela 6.6).

Na figura 6.7 foram calculadas as velocidades específicas máximas de crescimento

celular e como se observa não foi obtida duas fases de crescimento exponencial, pois há

consumo simultâneo de ambas as fontes, diferenciando do resultado observado por Dias,

(1988). Este autor concluiu que o aparecimento de duas fases de crescimento nos cultivos

de A. brasilense Sp 245 em glicerol e extrato de levedura não era devido a diauxia, devia-se

ao consumo preferencial de compostos nitrogenados presentes no extrato de levedura.

Uma observação final a respeito dos ensaios com glicerol é que as pequenas

diferenças entre eles parecem provir do uso de inóculo com diferentes concentrações da

composição do meio utilizado no preparo do mesmo.


78

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15 20tempo (h)

Variáveis

0,00,10,10,20,20,30,30,40,40,50,5 N (g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

tempo (h)

Variáveis

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15tempo (h)

Variáveis

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)

FiGURA 6.6 Evolução das concentrações de biomassa (□); Glicerol (◊); Absorbância ( );

Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.

Azbr04 (inóculo = Meio F)

Azbr05 (inóculo = CN)

Azlp02 (inóculo = Meio F)


79

Figura 6.7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os ensaios

com Glicerol.

6.5.2 Frutose

Nos ensaios com A. brasilense, o meio de cultura diferenciado no preparo do pré-

inóculo pode ter sido um fator representativo para o crescimento da bactéria em

fermentador, pois os ensaios foram efetuados em condições semelhantes. Para o ensaio

Azbr01, utilizou-se caldo nutriente, em cultivo de 15 horas, resultando a concentração

celular final em 4,01 g/L e consumo total do substrato, diferenciando-se dos resultados

obtidos em Azbr02 e 03 com concentrações finais de 0,6 g/L e 0,69 g/L, houve decréscimo

de N semelhante entre os três ensaios. Comparando-se os valores de pH, nota-se que há

decréscimo no ensaio Azbr01 nos outros dois ensaios, o pH permance praticamente

constante (Figura 6.8).

-2,50-2,00-1,50-1,00-0,500,000,501,001,50

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

tempo (h)

LN(X

)

Azlp02 Azbr05Azbr04


80

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15 20 25 30tempo (h)

Variáveis

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15

tempo (h)

Variáveis

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 5 10 15 20

tempo (h)

Variáveis

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)

Figura 6.8 Evolução das concentrações de biomassa (□); frutose (◊); Absorbância ( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.

Azbr02 – (inóculo = Meio F)


Azbr01 – (inóculo = CN)


81

Não se conhece muito a respeito da influência do pH sobre os aspectos fisiológicos

e bioquímicos em Azospirillum. De uma maneira, variações de pH podem causar: alterações

nas funções das membranas, modificações no consumo de substrato e no perfil de produtos

metabólicos, alterações na morfologia e estruturas celulares e na floculação e/ou adesão a

superfícies (Forage & Pitt, 1985).

6.5.3 Sacarose

Como os ensaios foram determinados de acordo com os resultados em incubador

rotativo, utilizou-se a fonte de carbono sacarose apenas com A.lipoferum (Figura 6.9), no

qual, utilizou-se o mesmo meio de cultura do fermentador na etapa do pré-inóculo. O tempo

de crescimento para esta linhagem foi de 7,5 horas e obtendo-se um crescimento celular

não muito satisfatório (1,92 g/L), acompanhada pelo decréscimo da concentração do

substrato e de nitrogênio, atingindo-se um valor consideravelmente alto de velocidade

específica máxima de crescimento (0,35 h-1). Como ocorreu nos ensaios em shaker, o pH

neste processo também decresceu.

Nos ensaios em biorreator, pôde-se observar as variações mais detalhadamente,

devido a periodicidade das amostragens. Esse caso especificamente, detectou-se

concentrações de glicose e frutose. As curvas nas figuras 6.9 e 6.10 mostram o consumo

total de sacarose e sua associação com a término de crescimento celular. Da mesma

maneira, as concentrações de glicose e frutose caíram sem nenhum acúmulo no meio de

cultura. De acordo com Jackson and Ricard, (2003), sacarose é hidrolisada a glicose e

frutose e posteriormente oxidada (Figura 3.1). De acordo também com a figura 6.10, a

etapa principal da enzima da sacarose é sua hidrólise a glicose e frutose, uma vez que

aparentemente toda sacarose transformada em glicose e frutose é consumida, não havendo

acúmulo destas fontes de carbono no meio.


82

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

0 2 4 6 8 10tempo (h)

Variáveis

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0 N (g/L)

Figura 6.9 Evolução das concentrações de biomassa (□); sacarose (◊); Absorbância ( );


0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

0 2 4 6 8 10

tempo (h)

g/L Frutose Glicose Sacarose

Figura 6.10 Evolução das concentrações de frutose, glicose e sacarose em Azlp01.

Foi observada dois tipos de floculação bacteriana caracterizados por sua densidade e

aparência. Um dos tipos, menor e mais compacto sedimentava com rapidez quando em

repouso e era facilmente colocado em suspensão quando a agitação era reiniciada. O outro

tipo de floco apresentava tamanho maior, densidade menor e aparência de “algodão”, com

ramificações (“fiapos”) visíveis. Pensou-se inicialmente em contaminação por outras

Azlp01 – (inóculo = Meio F)

Azlp01 – (inóculo = Meio F)


83

bactérias ou fungos, mas observações microscópicas efetuadas não demonstraram a

presença de outros microrganismos que não Azospirillum.

Este tipo de floco talvez tenha se formado, principalmente, pela adesão inicial das

células em bolhas de ar depois permanecido ocluso, inflando o floco.

6.5.4 Etanol

Os ensaios com etanol também foram processados somente com A. brasilense, e

observou-se que o tempo de crescimento e a formação de biomassa podem estar envolvidos

com o fato de utilizar caldo nutriente no inóculo, pois para o mesmo crescido em meio

fermentador o cultivo atingiu 12 h, sem consumo do etanol. Os resultados comparativos nos

ensaios com etanol, estão apresentados na tabela 6.6, e mostram resultados satisfatórios,

baseando–se nos valores de concentração final (3,03 g/L), µmax (0,103 h-1) e produtividade

(0,110 g/L.h). Os acompanhamentos realizados durante os experimentos podem ser

observados na figura 6.11.


84

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15 20 25 30tempo (h)

Variáveis

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60 N (g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15tempo (h)

Variáveis

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60 N (g/L)

Figura 6.11 - Evolução das concentrações de biomassa (□); etanol (◊); Absorbância ( );


Azbr06 – (inóculo = CN)



85

6.6 Comparação entre os ensaios

A comparação entre os ensaios foi realizada levando-se em conta os fatores de

conversão e produtividade no desenvolvimento do processo de produção de Azospirillum,

bem como a tendência à formação de flocos e carotenóides. As comparações entre as

fontes de carbono foram efetuadas preponderantemente nos resultados obtidos em

fermentador de 5L (Tabela 6.5).

Tabela 6.5 – Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de células (Xo, Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf) para os diferentes ensaios, em função da composição do meio de cultura.

ENSAIOS Pré-inóculo Fonte de Inóculo Tempo de Xo Xf So Sf No (N)f µmax YX/S YX/N PX

Carbono (5g/L) cresc. (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (h-1) (g/g) (g/g) (g/L.h)

Azlp01 CN Sacarose MEIO F 7,5 0,11 1,93 4,55 0,08 1,43 0,08 0,35 0,41 1,35 0,24

Azlp02 CN Glicerol MEIO F 11 0,11 2,56 5,20 0,05 0,60 0,07 0,28 0,46 4,49 0,22

Azbr01 CN Frutose CN 15 0,11 2,67 5,04 0,80 0,28 0,07 0,20 0,60 12,61 0,17

Azbr02 CN Frutose MEIO F 13 0,18 0,62 4,82 3,02 0,30 0,21 0,05 0,24 5,24 0,03

Azbr03 CN Frutose MEIO F 13 0,26 0,69 5,69 0,29 0,30 0,11 0,07 0,08 2,31 0,03

Azbr04 CN Glicerol MEIO F 18 0,20 1,33 5,26 3,24 0,24 0,09 0,09 0,69 9,06 0,08

Azbr05 CN Glicerol CN 37 0,13 4,04 5,70 0,00 0,50 0,05 0,10 0,69 8,61 0,10

Azbr06 CN Etanol CN 26 0,17 3,03 5,06 0,05 0,28 0,06 0,10 0,57 12,83 0,11

Azbr07 CN Etanol MEIO F 12 0,24 0,67 5,53 4,84 0,53 0,48 0,09 0,62 7,81 0,07

Velocidade específica máxima de crescimento (µx), fatores de conversão de Substrato (YX/S) e de nitrogênio (YX/N) em células, produtividade (PX). Obs:. Meio F.= acrescentado da fonte de carbono em estudo, CN = caldo nutriente

A tabela 6.5 demonstra que para A. lipoferum, a utilização do próprio meio de

cultura utilizado em fermentador igual ao do inóculo como forma de adaptação da bactéria,

foram obtidos resultados expressivos. Para sacarose e glicerol como fonte de carbono foram

obtidas, respectivamente, após 7,5 e 11 h de cultivo, concentrações celulares finais de 1,93

e 2,56 g/L. Foram obtidos altos valores de produtividade, velocidade específica máxima de

crescimento e fator de conversão em células (0,24 g/L.h, 0,35 h-1 e 0,41 g/g), quando foi


86

comparada sacarose ao segundo substrato escolhido, glicerol (0,22 g/L.h, 0,28 h-1 e 0,46

g/g). Nos ensaios com A. brasilense, não foram obtidos bons resultados quando o meio de

crescimento do inoculo (CN) foi substituído pelo meio utilizado em fermentador (ensaios

Azbr02, 03, 04 e 07). Por outro lado, utilizando-se inoculo com CN, o tempo de ensaio para

A. brasilense no esgotamento total das fontes de C, frutose, glicerol e etanol foram,

respectivamente, 15h, 37h e 26h. A concentração celular final, a velocidade específica

máxima de crescimento, os fatores de conversão substrato e nitrogênio em células e

produtividade foram altas (Tabela 6.6). As concentrações celulares finais foram,

respectivamente de 2,67 g/L, 4,04 g/L e 3,03 g/L.

Percebe-se que os ensaios em biorreator desenvolveram-se de forma semelhante aos

ensaios em incubador rotativo. Entretanto, observou-se uma importante diferença em

relação a influência das condições ambientais melhor controladas obtidas no biorreator

relativa à agitação, aeração e nível de O2 dissolvido, que contribuíram positivamente para

aumentar os parâmetros cinéticos do cultivo.

Para o desenvolvimento de um processo aeróbio de produção de microrganismos, a

adequação do binômio agitação-aeração é de fundamental importância devido aos efeitos

diretos (falta de homogeneidade do sistema, ruptura de células por cisalhamento,

floculação, formação de espuma, etc.) ou indiretos (limitação pelo oxigênio dissolvido) que

influem no metabolismo celular, nas velocidades de crescimento e de respiração, na

formação de subprodutos e de materiais de reserva e na eficiência energética.

Taciro (1986) obteve para A. brasilense Sp 7 cultivada em biorreatore valor de

produtividade de 0,4 g/Lh, Yx/s = 0,45 g/g e µmax = 0,3 h-1 usando frutose (10 g/L) como

fonte de C DAP como fontes de nitrogênio e fósforo (2,64 g/L), extrato de levedura (1g/L)

e outros sais minerais. Os valores destes parâmetros para esta linhagem foram superiores

aos encontrados no presente trabalho (Tabela 6.6), devido provavelmente a diferenças

fisiológicas entre as linhagens.


87

Em todas as amostras coletadas durante os cultivos, foram efetuadas em paralelo,

determinações de absorbância e concentração celular mássica. Na Figura 6.12 reuniram-se

os valores de absorbância e concentração celular obtidos nos ensaios em fermentador,

obtendo-se através de uma regressão linear a equação abaixo, com o coeficiente de

correlação de 0,9799. O correu uma correlação linear entre os pontos obtidos até 0,6 g/L,

após este valor, houve algumas diferenças entre as grandezas devido à floculação e à

formação de carotenóides. Já a correlação logarítmica, a absorbância acompanhou bem de

perto a concentração celular ao longo dos ensaios.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

X (g/L)

A

Azlp01 Azlp02 Azbr02 Azbr03Azbr04 Azbr05 Azbr06 Azbr07

Figura 6.12 Correlação obtida entre os valores de concentração celular (X) e absorbância

para os ensaios em fermentador.


88

Os ensaios realizados ainda permitiram a comparação do custo de produção da

biomassa em biorreator relativo às fontes de carbono empregada (Tabela 6.6). Esta tabela

mostra os valores.

Tabela 6.6 Comparação do custo de produção de biomassa de Azospirillin em biorreator em relação ao custo do substrato.

Fonte de carbono Linhagem Yx/s

(g/g) Px

(g/Lh)

Custo de substrato (R$/kg)

Custo produção (R$/kg)

Frutose A. brasilense 0,52 0,17 4,00 7,75

Sacarose A.lipoferum 0,41 0,24 0,90 2,21

Glicerol A. lipoferum 0,45 0,21 3,80 5,51

Glicerol A. brasilense 0,69 0,11 3,80 5,54

Etanol A.brasilense 0,50 0,11 1,00 1,99

Revista Química e derivados - Jan 2006. Custo de produção = Custo de substrato/Yx/s

Para A. brasilense Sp 7 o menor custo de produção é alcançado com etanol.

Entratanto, a produtividade conseguida com esta fonte de C é muito baixa (0,11 g/Lh).

glicerol seria a fonte de C de escolha, uma vez que o custo de produção da biomassa é o

segundo mais baixo e a produtividade alcançada é a maior entre as fontes de C estudas.

Este resultado corrobora a escolha da fonte de C feita segundo os dados da tabela 6.6. Esta

conclusão é diversa da encontrada por Dias (1988) que propôs a frutose como a fonte de

Carbono de escolha para produção industrial de A. brasilense Sp 245.

Para A. lipoferum Br 17 a escolha recairia sobre sacarose uma vez que foram

atingidas com esta fonte de C a maior produtividade e o menor custo de produção de

biomass, seguido de glicerol. Entretanto, considerações de ordem prática como

possibilidade de utilizar a fonte de C sem diluição da mesma em cultivo descontínuo-

alimentado, diminundo gasto de água de diluição e possibilitando maiores concentrações

de biomassa, e o fato das indústrias de inoculantes para FBN à base de rizóbio já utilizarem


89

glicerol no meio de cultura, propõe-se o uso deste substrato também para o cultivo de A.

lipoferum.

6.7 Cultivo em alta densidade celular (ADC)

Neste item foram desenvolvidos protocolos em ADC para as linhagens de

Azospirilla utilizadas no presente trabalho, usando glicerol como fonte de carbono,

condição experimentada como modelo para confirmar a possibilidade de se obter cultivos a

alta densidade celular para esta categoria de microrganismos.

Como já explicitado na revisão de literatura, a obtenção de alta densidade celular

pode ser alcançada com a condução do processo de forma descontínua alimentada

(Schmidell, 2001; Yamane et al., 1984).

De acordo com este processo, meio de cultura é disponibilizado aos microrganismos

de forma parcelada, de tal forma que os efeitos de inibição pelo substrato ou,

eventualmente, algum desvio metabólico não desejável, como por exemplo, produção de

ácido orgânico, como é o caso em E. coli (Yamane et al., 1984), tende a ser minimizado. O

metabolismo dos Azozpirilla é desconhecido sob este aspecto.

Baseados nos experimentos em batelada realizados foram propostos protocolos

descontínuo-alimentado para obtenção de ADC para as duas linhagens estudadas. A fonte

de carbono de escolha foi o glicerol, devido aos bons resultados atingidos nos ensaios

realizados em batelada em biorreator, a facilidade de manipulação desta fonte de C,

podendo ser alimentada ao biorreator sem diluição prévia, grande disponibilidade e baixa

custo.

Basicamente os protocolos constituíram-se de uma batelada inicial igual ao ensaio

em bataleda conduzido em biorreator, Azlp 02 e Azbr 05, respectivamente, para as


90

linhagens A. lipoferum BR 17 e A. brasilense Sp 7, seguido de uma fase de alimentação a

uma vazão constante.

Para o desenvolvimento deste protocolo em ADC assumimos as seguintes hipóteses:

a) O crescimento microbiano se dava segundo a cinética de Monod (Schimidell, 2001),

acrescido do coeficiente de morte, Kd, quando necessário, dado pela equação 5:

µ - Kd = µ max KsS

S+

(5)

b) Os valores paramétricos da equação foram estimados dos experimentos conduzidos em

batelada;

c) Considerou-se que o meio de cultura em ensaios em batelada estava balanceada;

d) para o crescimento celular e que o substrato limitante S da equação 5 era o glicerol.

e) Como meta foi proposto a obtenção de concentração final de biomassa cerca de 10

vezes superior aos ensaios em batelada. Assim, pretendia-se ao final dos ensaios, 30 g/L de

biomassa. Para um volume útil de 10L, esta concentração corresponde a cerca de 300 g de

biomassa.

f) Pela hipótese (c), o meio de cultura concentrado foi obtido simplesmente pela

multiplicação por 10 vezes das concentrações descritas do meio utilizado nos ensaios em

batelada. Levamos em consideração que as quantidades de Mg SO4.7H2O; NaCl, Fe

(EDTA), K2HPO4 e micronutrientes da solução de elementos traço já estavam em

quantidade suficiente para sustentar o crescimento de 30 g/L.


91

g) Assim, o meio de cultura para a fase do protocolo constituída pela operação

descontínuo- alimentada que sucedeu à batelada inicial, foi composto segundo o descrito na

tabela 6.7.

Tabela 6.7 Composição do meio de cultura alimentado durante a fase descontínua-

alimentada à vazão constante do protocolo de ADC para cultivo de A. lipoferum BR 17 e A. brasilense Sp 7.

Componente Massa (g)

Glicerol 500

(NH4)2 HPO4 132

Extrato de levedura 100

CaCl2.2H2O 2

Água 2 litros

6.7.1 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para linhagem A. lipoferum

BR 17

Como se disse, o protocolo consistiu em conduzir o processo iniciando por uma

batelada exatamente igual ao ensaios Azlp02 seguida de alimentação a vazão constante de

meio de cultura concentrado composto por todos os nutrientes do meio descrito na tabela

6.9.

Para estimar o valor da vazão de alimentação, F, foi utilizado o programa de

computador ANABIO (Silva e Badino Jr, 2003) que simula a cinética de crescimento

microbiano, dado um modelo matemático de crescimento celular, os valores dos parâmetros

do modelo, o tipo de condução do processo e suas condições iniciais. Foi utilizado a

cinética de Monod, equação A. Os valores de µmax e Yx/s foram retirados dos

experimentos em batelada realizadas em biorreator da (Tabela 6.6). O valor de Ks foi

estimado utilizando-se o programa ANABIO através de sua variação e visualização das

curvas calculadas de X e G e sua comparação com os dados experimentais do ensaio


92

Azlp02, como mostra a figura 6.13. O valor da vazão de alimentação F durante a fase

descontínua-alimentada foi estimada levando-se em conta um perfil de concentração de

glicerol que não excedesse 5 g/L, para evitar possíveis efeitos inibitórios por substrato.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 5 10 15

tempo (h)

X (g/L)

X exp X simulG exp G simul

Figura 6.13 Crescimento de A. lipoferum BR 17 em batelada, ensaio Azlp02.

Os seguintes parâmetros foram utilizados na simulação do processo em ADC para A

lipoferum e cujos resultados estão apresentados na figura 6.14:


93

Xo; concentração inicial de biomassa na batelada: 0,13 g/L

So: concentração inicial de glicerol na batelada: 5 g/L

µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular 0,28 h-1

Ks: constante de Monod 0,5 g/L

Kd: coeficiente de morte celular: 0,0 h-1

Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa 0,47 g/g

T bat: tempo da batelada inicial: 13 h

Se: concentração de glicerol na solução de alimentação 250 e 300 g/L

Xe: concentração inicial do processo descontínuo alimentado 2,48 g/L

T total: tempo total do ensaio: 30 h

A vazão obtida pela simulação foi de 100 ml/h.


94

Figura 6.14 Resultados do protocolo a ADC para A lipoferum Br 17.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

0 10 20 30 40

tempo (h)

X (g/L)

X exp X simul (G=300 g/ L)X simul (G= 250 g/L)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

0 10 20 30 40

tempo (h)

G (g/L)

G exp G simu (G=300 g/L)G simul (G=250 g/L)

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

0 10 20 30 40 50tempo (h)

F (mL/h)

Fmédio = 102 mL/h

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40tempo (h)

X (g/L)


95

Tabela 6.8 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A lipoferum BR 17.

Tempo (h) UFC/mL

0 2.35x108

0 6.67x108

0 1.33x109

28 1,01x1010

28 1.93x1010

A

. lip

ofer

um B

R 1

7

28 6,13x1010

Nota-se que as curvas calculadas e experimentais mostraram tendência parecidas,

embora não conseguissem prever com exatidão os valores das concentrações experimentais,

principalmente no que se refere ao glicerol, levando-nos a concluir que a metodologia

usada para o proposição do protocolo em ADC foi adequada. Desta forma, foi obtido cerca

de 25 g/L em 30 h de fermentação, atingindo-se produtividade de cerca de 0,8 g/Lh, 300%

superior ao obtido ao experimento em batelada. A concentração celular atingida em UFC

também foi bastante elevada, superior a 1x 1010 UFC/mL, para amostras em triplicata

(Tabela 6.8).

6.7.2 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para linhagem A brasilense

Sp 7

Da mesma maneira, para a linhagem A brasilense Sp 7, estimou-se o valor inicial da

vazão de alimentação utilizando-se o programa de computador ANABIO. Os valores de

µmax e Yx/s foram retirados da tabela (valores de batch). O valor de Ks foi estimado

utilizando-se o programa ANABIO através de sua variação e visualização das curvas

simuladas de X e G e sua comparação com os dados experimentais do ensaio Azbr05, como

mostra a figura C. Neste caso, foi utilizado o modelo de Monod acrescido do coeficiente de

morte celular, Kd.


96

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 10 20 30 40 50

tempo (h)

X (g/L)

X exp X simul G exp G simul

Figura 6.15 Crescimento de A. brasilense em batelada, ensaio Azbr05.

Os seguintes parâmetros foram utilizados na simulação do processo a ADC para A

brasilense e cujos resultados estão apresentados na figura 6.16:

Xo: concentração inicial de biomassa na batelada: 0,13 g/l

So: concentração inicial de glicerol na batelada: 5 g/l


Ks: constante de Monod 0,1 g/l

Kd: coeficiente de morte celular 0,16 h-1

(quando a concentração de glicerol for ≤ 0,0001 g/L)


T bat: tempo da batelada inicial: 35 h

Se: concentração de glicerol na solução de alimentação 250 g/l

Xe: concentração inicial do processo descontínuo alimentado 4 g/l

T total: tempo total do ensaio: 100 h

A vazão obtida pela simulação foi de 50 ml/h.

Da mesma forma como ocorrido anteriormente, a evolução da simulação e dos dados

experimentais relativos às concentrações de biomassa e do substrato com o tempo, embora


97

não tenham sido previstas com exatidão, apresentaram tendências semelhantes. Pelo

protocolo em ADC proposto foi obtido cerca de 25 g/L em 74 h de fermentação

atingindo-se produtividade de cerca de 0,34 g/Lh, 200% superior ao obtido ao experimento

em batelada. A concentração celular atingida em UFC também foi bastante elevada,

superior a 1x 1010 UFC/mL (Tabela 6.9).


98

Figura 6.16 Resultados do protocolo de cultivo a ADC de A brasilense Sp 7

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

tempo (h)

X (g/L)

X exp X simul

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

tempo (h)

G (g/L)

G exp G simul

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

160.0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90tempo (h)

F (mL/h)

Fmédio = 69,7 mL/h

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 20 40 60 80 100

tempo (h)

N (g/L)

Fmédio = 69,7 mL/h


99

Tabela 6.9 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A brasilense Sp 7.

Tempo (h) UFC/mL

0 2.92x108

0 6.33x108

0 8.00x108

74 3.29x109

74 1.35x1010

A

. bra

sile

nse

Sp 7

74 3.27x1010

7 Conclusões 142

7. Conclusões

Dos experimentos e análises realizadas neste trabalho, as seguintes

conclusões puderam ser obtidas:

Ensaios em incubador rotativo

A. brasilense Sp7

1) O crescimento de A. brasilense Sp7 com frutose como fonte de carbono foi mais

rápido do que as demais; as velocidades específicas máximas de crescimento em

processo descontínuo foi 0,20 h-1 quando utilizou-se caldo nutriente no crescimento

do inóculo..

2) Para todas as fontes de carbono, observou-se crescimento celular significativo

antes de completar 24 horas de ensaio.

3) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. brasilense

Sp 7 foram frutose (2,82 g/L), glicerol (2,10 g/L), lactato (2,09 g/L) e etanol (1,85

g/L). O fator de conversão de substrato em células (YX/S = 0,54 g/g) e a

produtividade (Px = 0,12 g/L.h) nos cultivos com frutose foram superiores às obtidas

com as demais.

A. lipoferum Br 17

1) As fontes de carbono e nitrogênio que possibilitaram melhor desempenho no

crescimento de A. lipoferum foram sacarose e (NH4)2HPO4, obtendo-se µmax 0,350

2) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. lipoferum

BR17 foram: sacarose (2,21 g/L), glicerol (2,19 g/L) e lactato (1,82 g/L).

7 Conclusões 143

3) O consumo das fontes de nitrogênio e de carbono após a cessação do

crescimento celular foi atribuido à manutenção celular

4) Houve associação entre a floculação e a formação de carotenóides para os

cultivos.

Ensaios de batelada em biorreator

A. brasilense Sp7

1) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. brasilense

Sp 7 foram glicerol (4,04 g/L), etanol (3,03 g/L) e frutose (2,67 g/L). Os fatores de

conversão de substrato em células para estas fontes foram, respectivamente, YX/S =

0,69 g/g, YX/S = 0,57 g/g e YX/S = 0,60 g/g. As produtividade foram respectivamente,

Px = 0,11 g/L.h , Px = 0,11 g/L.h e Px = 0,17 g/L.h.

A. lipoferum BR17

2) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. lipoferum

BR 17 foram: glicerol (2,56 g/L) e sacarose (1,93 g/L). Os fatores de conversão de

substrato em células para estas fontes foram, respectivamente, YX/S = 0,46 g/g, YX/S =

0,41 g/g e YX/S = 0,60 g/g. As produtividade foram respectivamente, Px = 0,22

g/L.h e Px = 0,24 g/L.h.

A. brasilense Sp7 e A. lipoferum BR17

1) Para uma definição com vista à utilização industrial, levando-se em

consideração aspectos econômicos da aquisição das matérias-primas (custo e

disponibilidade) bem como praticidade de preparação de meio de cultura visando

7 Conclusões 144

produção a alta densidade celular, a fonte de carbono glicerol pode ser uma

alternativa para ambas as linhagens.

2) A utilização do meio de cultura diferenciado no preparo do pré-inóculo foi

um fator representativo para o crescimento dos microorganismos em biorreator e

foram observadas variações para as bactérias e fontes de carbono testadas.

3) O aumento da concentração de NH4+ no início dos cultivos em biorreator, foi

atribuído ao consumo preferencial de compostos nitrogenados presentes no extrato

de levedura, embora não tenha sido observado diauxia.

4) Nos cultivos em biorreator, a queda do pH abaixo de 5,0 provavelmente

ocasionou limitação do crescimento celular.

5) Houve uma correlação linear (r2 = 0,9799) entre absorbância e biomassa

somente até concentração celular de 0,6 g/L, após a qual floculação e produção de

carotenóides produziram desvio desta relação.

Ensaios em alta densidade celular (ADC)

1) Os resultados para ambas as linhagens foram modelados satisfaroriamente por

uma cinética de crescimento segundo Monod , acrescido do coefeiciente de morte

Kd, para A.brasilense Sp 7.

2) Os valores dos parâmteros da equação de Monod foram os seguintes:

A. brasilens Sp 7.


Ks: constante de Monod 0,1 g/l

7 Conclusões 145

Kd: coeficiente de morte celular 0,16 h-1

(quando a concentração de glicerol for ≤ 0,0001 g/L)


A. lipoferum BR 17


Ks: constante de Monod 0,5 g/L

Kd: coeficiente de morte celular: 0,0 h-1


3) Nos experimentos em sistema descontínuo alimentado, a concentração final

de biomassa atingida para A. brasilense foi de 24,78g/L e em A. lipoferum foi de

23,87 g/L., com produtividades, respectivamente, de 0,34 g/L.h e 0,8 g/L.h

4) Os valores de UFC foram superiores a 1x1010 /mL para ambas as linhagens,

cerca de 10 vezes superiores aos ensaios em batelada conduzidos em incubador

rotativo.

5) A metodologia usada para a proposição do protocolo em ADC foi adequada,

atingindo-se valor muito próximo da concentração de biomassa pretendida que era de

30 g/L.

6) Glicerol é uma fonte de carbono conveniente para o cultivo de Azospirilla

em alta densidade celular.


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