procedimiento de ausencia o presencia de … · productos de la pesca: son todas y cada una de las...

PROCEDIMIENTO DE AUSENCIA O PRESENCIA DE Vibrio cholerae 01 MUESTRAS DE PESCADOS, MOLUSCOS Y

CRUSTÁCEOS, CRUDOS Y PRECOCIDOS (ULTRACONGELADOS Y CONGELADOS)

FDA: 2004 CAPITULO 9

CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

29/07/2016

VERSIÓN 01

PÁGINA Página 1 de 14

PROCEDIMIENTO DE AUSENCIA O PRESENCIA DE Vibrio cholerae 01 MUESTRAS DE

PESCADOS, MOLUSCOS Y CRUSTÁCEOS, CRUDOS Y PRECOCIDOS (ULTRACONGELADOS Y CONGELADOS)


ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN

PROCEDIMIENTO DE AUSENCIA O PRESENCIA DE Vibrio

cholerae 01 MUESTRAS DE PESCADOS, MOLUSCOS Y CRUSTÁCEOS, CRUDOS Y PRECOCIDOS (ULTRACONGELADOS Y CONGELADOS)


CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


1 OBJETIVO

Establecer el Procedimiento de la Calidad microbiológica de los pescados, moluscos y crustáceos, crudos y precocidos (ultracongelados y congelados) en cuanto la ausencia o presencia de Vibrio cholerae 01, en el marco de la Resolución 122 de 1012, método FDA: 2004 Capitulo 9

2 DEFINICIONES

Productos de la pesca: Son todas y cada una de las especies comestibles

hidrobiologías, marinas o de agua dulce, tales como pescados, crustáceos, moluscos, batracios, anfibios, reptiles y mamíferos estarán sujetas a lo dispuesto en el presente decreto las algas marinas y las distintas especies que constituyan la flora acuática destinadas a la alimentación humana.

Producto de la pesca refrigerado: Es aquel que en estado fresco, ya sea: entero,

fraccionado, eviscerado o no, ha sido sometido a la acción" del frío, hasta alcanzar en el centro térmico una temperatura de cero a cuatro grados centígrados (O°C a 4°C).

Producto de la pesca congelado: Es aquel que en estado fresco, ya sea entero,

fraccionado, eviscerado o no, ha sido sometido a la acción del frío, hasta alcanzar en el centro térmico una temperatura no superior a menos dieciocho grados centígrados (- 18°C). Los tiempos y temperaturas para congelar dependerán del procedimiento y de las características de los productos a congelar.

Producto de la pesca fresco: Es aquel que no es apto para el consumo humano y no

ha sido sometido, desde el momento de su captura, hasta el de su venta a algún procesamiento. No se considera procesamiento al desangrado, descabezado, eviscerado, ni la adición preventiva de hielo o el enfriamiento por otro método.

4. RESPONSABLES Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Pública del Meta cumplir con los lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de muestras. 5. GENERALIDADES

El cólera es la enfermedad diarreica aguda más grave que se conoce y tiene la particularidad de que se disemina rápidamente causando epidemias; es provocada por la bacteria Vibrio cholerae que se encuentra en el agua o alimentos contaminados y puede




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


llegar a producir la muerte hasta en 50% de los pacientes, si no se cuenta con una adecuada preparación y tratamiento. Es esta una enfermedad bacteriana intestinal aguda de tipo secretorio que se caracteriza por un comienzo repentino, generalmente sin fiebre. La enterotoxina producida por Vibrio cholerae O1 provoca el escape de enormes cantidades de líquido y electrolitos hacia la luz del intestino, lo cual produce rápidamente una diarrea acuosa y profusa sin dolor, vómito ocasional, deshidratación rápida, acidosis, calambres y choque circulatorio. El cólera es causado por un bacilo anaerobio facultativo, Gram negativo, con un solo flagelo polar que le da gran movilidad, llamado Vibrio cholerae. La mayoría de los aislamientos de V. cholerae obtenidos en epidemias de cólera son de los serogrupos O1 y O139. Los aislamientos de V. cholerae O1 responsables del cólera endémico y epidémico están clasificados en dos biotipos de acuerdo con sus propiedades bioquímicas: el clásico y el Tor, de los cuales este último es el causante de las epidemias en el mundo, debido a que el clásico no se ha encontrado fuera de India y Bangladesh. Además, V. cholerae O1 se clasifica en dos serotipos principales: el Ogawa y el Inaba, con base en la aglutinación con antisueros. Un tercer serotipo, el Hikojima, se presenta rara vez 5.1 Transmisión del Cólera La infección por V. cholerae es adquirida por la ingestión de agua o alimentos contaminados consumidos crudos o insuficientemente cocidos. Uno de los tipos de alimento involucrados son los moluscos bivalvos que se contaminan en el medio marino. Las almejas, ostras, mejillones se suelen consumir crudos o con un tratamiento de calor mínimo, en los cuales, V. cholerae puede ser no sólo contaminante de superficie, sino estar presentes en su tracto intestinal, ya que estas especies son filtradoras y concentran el microorganismo. La posibilidad que se desencadene un brote de cólera en una región dada depende de varios factores: el número de individuos susceptibles, la exposición a aguas cloacales o agua no tratada y alimentos contaminados, y la presencia de un reservorio acuático de V. cholerae. La interacción de estas variables podría explicar la aparición del cólera endémico en forma estacional o el surgimiento del cólera epidémico (Fig. 1).




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


Figura 1. Diagrama modelo de la dinámica del cólera. 5.2 Ecología del cólera Vibrio cholerae es un habitante autóctono de los ecosistemas acuáticos, tanto en ríos, como en estuarios y en ambientes marinos. Tanto en áreas endémicas como epidémicas, los brotes de cólera siguen un patrón estacional, apareciendo de forma explosiva en varios focos simultáneamente, indicando un posible rol de factores ambientales en la aparición de las epidemias. El medio acuático ha sido reconocido como reservorio y vehículo para la transmisión de V. cholerae en numerosos estudios. 6. REFERENCIAS

Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para consumo humano. INVIMA

7. DESARROLLO

7.1 FUNDAMENTO

El método de detección estándar para la recuperación y la detección de Vibrio cholerae es cualitativo. Sin embargo se recomienda para las especies aisladas de V. cholerae de los




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


serotipos O1 y no-O1 demostrar la producción de la toxina del cólera. Este método describe un esquema general que consiste en: Enriquecimiento a diferentes temperaturas, dependiendo del tipo de alimento que se

desee analizar, donde se pretende incrementar las poblaciones de Vibrio e inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.

Aislamiento diferencial en medio sólido selectivo, el cual restringe el crecimiento de otros géneros diferentes a Vibrio, permitiendo el reconocimiento de colonias sospechosas de la especie Vibrio cholerae.

Purificación: Las colonias características sospechosas de pertenecer a la especie cholerae, se purifican en medios no selectivos. Identificación bioquímica, que permite la identificación de los cultivos de V. cholerae.

Pruebas serológicas, que permitan la identificación de los cultivos de V. cholerae. 7.1.1 Agua Pepetonada Alcalina

La viabilidad de Vibrio spp. Se mantiene intacta a pH alcalino y el uso de agua peptonada alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperación de Vibrio spp. de materia fecal y de otras muestras. El medio contiene peptona de carne, cloruro de sodio y el pH final es de 8.6 ± 0.2 a 25ºC. Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo. 7.1.2 Agar TCBS

Es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio cholerae. El medio contiene: tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa y está disponible comercialmente. Se prepara según las indicaciones del fabricante. No se debe autoclavar. Por su doble indicador (azul de timol y azul de brotimol) vira al amarillo con pequeñas variaciones de pH por la acidificación de la sacarosa. Aspecto de las colonias y crecimiento.

Escherichia coli Translúcidas Ninguno a escaso

Proteus Pequeña, amarilla Ninguno a escaso

Sterptococcus feacalis Pequeña, amarilla Ninguno a escaso

Vibrio cholerae Amarilla Bueno

Virio fluviales Amarilla Bueno

Vibrio parahaemolytivus Azul Bueno

Vibrio vulnficus Amarillas o translúcidas Bueno




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


7.2 MATERIALES

Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

7.2.1 Equipos

Frascos con tapa rosca estériles capacidad de 500ml. Incubadora a 35°C ±1°C Asas estériles desechables o varillas de hockey Tubos Estériles 7.2.2 Medios de cultivo y reactivos

Agua Peptona Alcalina Agar TCBS Agar Nutritivo 0.1% NaCl Prueba de Oxidasa Desoxicolato sódico Bioquímicas comerciales Medio de Transporte 7.2.3 Cepas de Referencia Escherichia coli ATCC 25922

Vibrio parahemolyticus ATCC 17802

7.3 PROCEDIMIENTO 7.3.1 Controles y o curvas de calibración

Control Positivo: A partir de una siembra de Vibrio cholerae parahemolyticus ATCC 17802 sembrado en Agar TSAYE, se toma una porción de la colonia con la ayuda de un asa estéril y se siembra sobre el agar TCBS Invertir las placas e incubarlas a 35°C +/- 2°C durante 18 - 24 horas.

Control Negativo: A partir de una siembra de Escherichia coli ATCC 25922

sembrado en Agar TSAYE, se toma una porción de la colonia con la ayuda de un asa estéril y se siembra sobre el agar TCBS Invertir las placas e incubarlas a 35°C +/- 2°C durante 18 - 24 horas

7.3.2 Condiciones Ambientales y manejo de equipos




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


El acondicionamiento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los mismos 7.3.3 Condiciones Generales

Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. 7.4 Descripción del Método 7.4.1. Selección de las Muestras

Pescado entero: remover la carne alrededor de las tripas, agallas y piel, conformar la

unidad de muestra necesaria para el análisis. Moluscos: preparar una muestra de 10 a 12 animales o 20 o 30 animales pequeños

que incluya el licor de conchas, para conformar la unidad de muestra necesaria para el análisis.

Crustáceos: extraer la carne para conformar la unidad de muestra. Frutas y Vegetales: enjuagar cada fruto o vegetal con el agua peptona alcalina

(225ml) en una bolsa plástica estéril. Frutas Pequeñas: utilizar 5 unidades (ejemplo 5 tomates) Vegetales con Hojas: tomar mínimo 5 hojas externas completas.

7.4.2. Preparación de la Muestra para el Análisis

El método de detección estándar para la recuperación y la detección de Vibrio cholerae es cualitativo.

Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-

SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. Pesar 25g del total de la muestra en una bolsa posteriormente se pasa muestra pesada a un frasco tapa rosca que contenga 225ml de agua de peptona alcalina y mezclar cuidadosamente. Incubar a 35°C±1°C, por 6 – 8 horas.




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


Pasado el tiempo de incubación, sin mezclar el frasco, realizar un barrido de la superficie del cultivo con el asa redonda desechables estéril y sembrar en superficie por agotamiento en Agar Tiosulfato citrato sales biliares sacarosa TCBS

Tapar las cajas y colocarlas invertidas en la incubar de 35°C ± 1°C / 18 - 24 horas. Observar las placas a las 24 horas y si la reacción no es clara dejar por 24 horas

adicionales.

Produce colonias color amarillas que son fácilmente visibles contra el fondo verde-oscuro del agar

Agar BHI ( Agar Infusión Cerebro Corazón) Es un medio sólido que contiene infusión altamente nutritiva, es un medio enriquecido no selectivo, para el aislamiento de microorganismos pocos exigentes; por no ser selectivos, está libre de inhibidores lo que facilita su uso para pruebas de serotipificación, recolección de cepas etc.

Tomar una colonia aislada del agar selectivo.

Realizar una siembra por agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas.

Incube a 35°C por 18 – 12 horas.

Agar Nutritivo al 1% de NaCl

Es un medio sólido para el cultivo de un gran número de microorganismos no fastidiosos que se usa para el estudio en muestras de aguas, alimentos, aguas residuales, el medio contiene extracto de carne que aporta al medio carbohidratos, vitaminas, compuestos de nitrógeno orgánico y sales. También contiene peptona que es fuente de nitrógeno particularmente aminoácidos y péptidos de cadena larga. La




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


adición de 1% es necesario en el caso del crecimiento de Vibrio cholerae por su naturaleza halófila.

Siembre la colonia sacarosa positiva del TCBS directamente en la placa.

Realice una siembra por agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas.

Incube a 35°C por 18 – 24 horas.

Prueba de Oxidasa

La citocromo oxidasa es una enzima de la cadena respiratoria perteneciente al grupo de las hierro porfirinas. Se encuentra presente en los géneros Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, etc, pero no en los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cuando oxida el citrocromo C reducido y se reduce a una forma inactiva. La enzima reducida es reconvertida a su forma activa por la transferencia de electrones al oxígeno molecular. En presencia de oxígeno molecular los electrones pueden ser transferidos por el sistema citocromo oxidasa/citroctromo C a un gran número de compuestos orgánicos, entre ellos la p-aminodimetilanilina.

En una caja de Petri, colocar papel de filtro e impregnado con el reactivo para oxidasa. Hacer un extendido con asa o palillo de madera de una colonia sospechosa sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo, siguiendo una línea de 3 a 6 mm de longitud.

Reacción positiva: azul violeta

Reacción negativa: No hay cambio de color.

Nota:

Hacer controles positivos y negativos con cepas conocidas

La reacción de la oxidasa no puede ser realizada a partir de medios que contienen azucares fermentables o sangre por la posibilidad de obtener resultados falsamente negativos.

Prueba de la Cuerda Elegir una colonia del agar nutritivo o agar BHI, emulsificarla sobre una lámina portaobjeto, con ayuda de un asa, en una gota de suspensión acuosa al 0.5% de desoxicolato sódico. Si el resultado es positivo, las células bacterianas se lisan por efecto




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01

PÁGINA Página 10 de

14

del desoxicolato, con lo cual la suspensión perderá turbidez y el DNA liberado de las células lisadas ocasionara que la mezcla se haga viscosa. AI retirar lentamente de la suspensión el asa, se forma un "hilo" mucoide. La mayor parte de los vibriones son positivos, en tanto que las cepas de Aeromonas suelen ser negativas. Si la prueba de la oxidasa y de la cuerda es positivas, a partir de las colonias de agar nutritivo o agar BHI realizar Bioquímicas comerciales.

Coloración de Gram Preparar una tinción de Gram y observar microscópicamente: Bacilos curvos Gram negativos

Pruebas Bioquímicas Comerciales Api 20E

Api 50CHB/E




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


14

Identificación de Vibrio cholerae

Una vez identificadas las cepas por sus características bioquímicas, se precede a la identificación serológica.

7.4.3. Cálculos y/o Valores de Referencia El método no requiriere cálculos para la expresión de resultado y el valor de referencia para los alimentos debe ser NEGATIVO. 7.4.3.1. Obtención de Resultados

De acuerdo con la interpretación de los resultados, indicar la presencia o ausencia de Salmonella x 25g o ml, como POSITIVO ó NEGATIVO. El resultado del análisis se registra en el resultado microbiológico de alimentos F-SA-75




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


14

8. VERIFICACIONES

8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados

Para comprobar la capacidad del laboratorio de detectar Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva con el método técnico de Aislamiento y Recuento, realizar los siguientes controles con material de Referencia y analizados en las mismas condiciones que la muestra.

Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa de siembra estéril e inoculo en una caja del medio selectivo utilizado una muestra (actividad 7.5)

8.1.1. Control de Calidad Interno En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia ATCC 25922 de E. coli (control negativo) En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia Vibrio

parahemolyticus ATCC 17802 (Control positivo)

Registrar en los formatos

F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas

F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos

F-SA-34 Control Interno de Equipos

F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos.

F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Criterio de Aceptación o Rechazo

CRITERIO LECTURA ACCION POR

INCUMPLIMIENTO DE CRITERIOS

Esterilidad del Medio de Cultivo

La prueba de esterilidad de los medios utilizados, no debe presentar crecimiento de ningún tipo.

Repetir Análisis Verificar proceso de preparación de medios de cultivo de nuevo lote.

Control Negativo E. coli ATCC 25922

No debe presentar crecimiento. Las colonias no deben poder diferenciarse claramente si los medios utilizados son selectivos.

Repetir siembra de cepas ATCC y repetir el Análisis




CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


14

Control Positivo Vibrio parahemolyticus ATCC 17802

Observando que el crecimiento sea adecuado y las colonias características.

Repetir siembra de cepas ATCC y repetir el Análisis

Reactivos vigentes Vigencia del reactivo dentro de la fecha

Descartar Reactivos y adquirir y procesar con reactivos en fechas vigentes

Temperaturas de Incubadoras

Temperatura ajusta a 35°C ± 1°C

Ajustar control de Temperatura y tomar nuevamente hasta obtener temperatura deseada.

Mantenimiento de equipos

Calibración, verificación y mantenimiento vigente

Solicitar y ejecutar los mantenimientos o verificaciones pendientes para realizar análisis con equipos idóneos

Control de Esterilización de Material

Verificar la fecha de esterilización de Material que no supere 8 días, verificar la cinta indicadora de esterilización su viraje.

Descartar el Material y realizar el proceso con material que cumpla la fecha y el viraje de la cinta.

Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis Microbiológico F-SA-101

9. REGISTROS

Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-18 Hoja de Vida de

Equipos

Profesional

Universitario o Profesional del

Laboratorio

Físico y/o Electrónico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o

tabla de retención documental





F-SA-34 Control Interno

de Equipos.

Auxiliar de

Laboratorio, Profesional


Laboratorio

Físico










CODIGO P-SA-108

FECHA DE EMISIÓN

07/07/2016

VERSIÓN 01


14

Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-46 Control De

Temperatura, Limpieza y

Desinfección de Equipos

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-64 Identificación de Sustancias

Químicas

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental



F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Profesional del Laboratorio





F-SA-109 Análisis de

resultados de control de

calidad externo

Profesional Universitario / Profesional de

Laboratorio








10. HISTORIAL

VERSIÓN

VIGENCIA

IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS

1

29/07/2016

Versión inicial

procedimiento de ausencia o presencia de … · productos de la pesca: son todas y cada una de las...

Documents