principi rada sa eksperimentalnim ž · pdf file1 principi rada sa eksperimentalnim...
TRANSCRIPT
1
Principi rada sa eksperimentalnim životinjama
Prof. Zoran Todorović
Institut za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologijuMedicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu
Eksperiment na životinjama:
• “... bilo koji postupak u kome se žive životinje koriste za proveru naučnih hipoteza, prikupljanja informacija, izolovanje ili ispitivanje supstanci ili razjašnjenje efekata nekog postupka, kao i korišćenje životinja u bihejvioralnim eksperimentima...”
(Swiss Animal Protection Act; www.roche.com)
2
Principi rada sa eksperimentalnim životinjama
• Istorijat• Sistemi u eksperimentalnom radu; biološki ogled• Zakonodavstvo• Uzgoj, vrste, najčešća oboljenja, dobrobit
eksperimentalnih životinja• Bol i patnja eksperimentalnih životinja• Primena lekova• Anestezija, hirurške tehnike• Odabrani in vivo modeli
Istorijat• Eksperimenti na životinjama:
– Egipat, Kina, Indija– 5. vek p.n.e. – prvi zabeleženi– 4. vek p.n.e. - Aristotel– 2. vek n.e. – formirani prvi standardi
• Galen iz Pergamona (disekcija životinja) Vesalius (disekcija ljudi)– 17. vek – krvotok: William Harvey, Jan de Wales; Descartes –
mašine koje ne osećaju bol– 18. vek – Voltaire – 19. vek - Claude Bernard (An Introduction to the Study of
Experimental Medicine); Schopenhauer; Hume;• Jeremy Bentham: “Nije pitanje da li životinje mogu rasuđivati
ili govoriti, već da li mogu (fizički) patiti.”• Charles Bell & Francois Magendie – funkcija perifernih nerava,
neanestetisane životinje
3
Istorijat• Eksperimenti na životinjama:
– 1824. – Prvo udruženje koje sprečava surovost prema životinjama
– 1835. – pod patronatom princeze Viktorije– 1854. – dva psa – eksperimentalno izazvana epilepsija –
burna reakcija (British Medical Association Meeting)– ~1875. – udruženja protiv vivisekcije + peticija (Darwin,
Jenner, Owen)– 1926. – University of London (Udruženje za dobrobit
životinja)– 1971. – 5,5 miliona životinja u UK– 2003. – 2% porast broja eksp. procedura (na 2,8 miliona),
2,4% porast broja korišćenih životinja uopšte i 21% porast broja eksperimenata na primatima (izuzev čoveka)
Biološki ogled• Biološki ogled - merenje potentnosti leka ili nepoznatog
medijatora na osnovu intenziteta bioloških efekata koje on izaziva
• Poređenje nepoznatog preparata sa standardom (često nepouzdano, varira od laboratorije do laboratorije), na osnovu krive doza–odgovor
• Biološki odgovor - kvantalan (procenat testova sa efektom sve-ili-ništa) ili stupnjevit
• Nivoi biološke organizacije - različiti pristupi sistemumerenja– molekularne i hemijske tehnike– testovi na životinjama in vitro i in vivo– klinička ispitivanja na dobrovoljcima i pacijentima– merenje efekata lekova na socioekonomskom nivou
4
Rang et al., 2003
Nivoibiološkeorganizacije
Sistemi u eksperimentalnom radu- Prednosti -
Delovimembrana
Pojedinačnećelije
Ćelijskekulture
Izolovanatkiva
In vivo(umrtvljeni refleksi)
In vivo(intaktna živ.)
Kontrolisana koncentracija leka
Merenjeafinitetaleka zareceptor
Pojačavanje signala
Merenje primarnog odgovora
Merenje relativne efikasnosti
Refleks ne utičena odgovor
Integrisanodgovor
Kenakin T. Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interaction (3rd ed). Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997
5
Biološki ogled
• Nove supstance• Endogeni medijatori• Toksikološka ispitivanja
Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (1)
• Životinjski modeli– značajni za otkrivanje novih lekova– reprodukuju samo neke aspekte humanih
bolesti• modeli psihijatrijskih oboljenja - naročito
problematični
6
Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (2)
• Životinjski model treba da liči na humano oboljenje po sledećim parametrima
1. sličan fenotip (manija? migrena?)2. uobičajeni uzrok (Alzheimerova bolest?
parkinsonizam?)3. patofiziološka sličnost (depresija, anksioznost?)4. odgovor na terapiju (novi lekovi?)
Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (3)
• Genetski pristup– selektivno razmnožavanje (spontane
mutacije) – npr. spontano hipertenzivni pacovi
– planirana genetska manipulacija –transgene životinje
7
Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (4)
• Transgene životinje - izazivanjem mutacija u jajnim ćelijama (ili ćelijama spermatozoida) životinje (uglavnom miševa), što omogućuje
• uvođenje novih gena („knock in”) ili• inaktiviranje ili mutaciju već postojećih gena („knock-out”) kod
kolonija priplodnih životinja– insercija ili delecija određenih gena – može da izazove
fenotipske promene slične humanim oboljenjima– veliki broj takvih modela– izazvana mutacija deluje tokom celog života i razvoja životinje, a
može biti i letalna.– uslovna mutageneze – aktivacija i inaktivacija izmenjenog gena
Pacov (Rattus norvegicus)- inbred sojevi -
– Helen Dean King – albino pacovi – Wistar Institute, Philadelphia, 1919.god.
– Uzgoj Wistar i Sprague-Dawley soja– Publikacije sa eksp. na pacovima i miševima 1,5:1
(pre mol. biol. ere 2:1)
8
Pacov (Rattus norvegicus)- Modeli -
– KV bolesti– Metabolički poremećaji
(npr. lipidi, DM)– Neurološki poremećaji
(npr. epilepsija, parkinsonizam, neuropatski bol)
– Bihejvioralni poremećaji
– Transplantacija organa
– Autoimune bolesti (npr. artritis, eksp. alerg. encefalomijelitis)
– Maligne bolesti– Poremećaji bubrega– Toksikologija...– + Genetika!
Etičnost• 3 miliona u eksperimentima vs. x00 miliona –
hrana i sl., ali:– na istraživanja – teško uticati– u istraživanjima – bol, patnja, poremećaji ili trajna
oštećenja (mučenje?)• Dilema u društvu:
– životinje su u podređenom položaju– fizička patnja postoji kod životinja– korišćenje životinja – može dovesti do njihove patnje
9
Etičnost
• Dva pristupa:– odnos koristi (za ljude!) i štete (za životinje!)– vrednost života i prava životinja
• zakoni – interpretacija moralnih načela...• suprotni stavovi: René Descartes (“preterana
sentimentalnost prema životinjama”)
Etičnost• Korist
– polio vakcina – in vivo test – jedini pouzdan za utvrđivanje potencijalne virulentnosti serije
• icv., majmuni• GM miševi sa receptorima za virus
– tehnike dijalize i transplantacije bubrega i primena ciklosporina• kunići, psi
– želudačna sekrecija i H2-antihistaminici• pacovi, zamorci
– cistična fibroza (CFTR protein; genomika i proteomika)• GM miševi
10
Etičnost
• Buduća istraživanja na životinjama (modeli in vivo) – razvoj novih lekova– infekcije rezistentnim sojevima (GM miševi)– psihički poremećaji i duševne bolesti (depresija,
shizofrenija, anksioznost)– bolesti zglobnih struktura i imunološki poremećaji– urođeni poremećaji (Duchenne distrofija)– bolesti sa gubitkom vida i sluha– HIV infekcija i AIDS– demencije– ...
Etičnost• Pitanja:
– Zašto radite taj eksperiment?• korist/šteta
– Da li to što radite pokreće pitanje etičnosti?• bol, patnja, izolacija...
– Alternative (Replacement)?• in vitro, in silico, matematički modeli, ljudi, vrsta koja je niže na
filogenetskoj lestvici– Možete li koristiti manji broj životinja (Reduction)?
• promena dizajna, faktorska analiza, uzajamno korišćenje iste životinje za više eksperimenata, inbred sojevi, ponovno korišćenje iste životinje (nekada moguće uz dozvolu)
– Usavršavanje metode (Refinement)?• bolje hirurške tehnike (laparoskopija umesto laparotomije), promena
uslova uzgoja ili smanjenje doze/zapremine leka
11
Etičnost
– “3 R” (Russel & Burch, 1959)• Replacement
– kulture ćelija, tkiva i organa– mikroorganizmi– hemijske i druge metode (transkranijalna magnetna
stimulacija – TMS, privremeno remeti funkciju mozga)– in silico – kompjuterski modeli– filmovi– modeli, statistika– ljudi
Etičnost
– “3 R” (Russel & Burch, 1959)• Reduction; npr.
– izazivanje reverzibilnih lezija mozga (hladan FR) umesto trajnog uklanjanja određenih delova
– nove tehnike vizuelizacije– nove hirurške tehnike (gubitak samo jednog kvadranta
vidnog polja – životinja je sama sebi kontrola)
12
Etičnost
– “3 R” (Russel & Burch, 1959)• Refinement
– korišćenje životinja kontrolisanog zdravstvenog stanja– vrsta i soj; inbred sojevi; GM
» 90% gena bolesti čoveka prisutno kod miša» npr. SOD1 gen i ALS
– obuka i vežba– statističke metode; eksperimentalni dizajn
» greška kod talidomida u dizajnu, a ne u pouzdanosti animalnih modela!
Etičnost
• Neprekidno, tokom eksperimenta: “Može li se smanjiti patnja životinja i povećati korist od istraživanja?”
• Kontrola/Inspekcija!
13
Eksperimenti na životinjama- Zakoni -
• Privilegija izvođenja eksperimenta na živim životinjama u cilju zaštite i unapređenja zdravlja životinja i ljudi
• Prilika i sposobnost da se unapredi nauka za dobrobit čovečanstva
• Najviši mogući standardi za dobrobit životinja, u skladu sa ciljevima istraživanja
Eksperimenti na životinjama- Zakoni -
– Principi eksperimentalnog rada na životinjama (Marshall Hall, 1831.):
• ne raditi eksperiment ako se podaci mogu dobiti posmatranjem
• eksperiment samo ako su ciljevi definisani i realni (dostižni)• informacije o prethodnim istraživanjima – izbeći ponavljanje• patnja – svedena na minimum (npr. niže vrste)• što jasniji rezultati istraživanja, tako da je potreban broj
životinja najmanji moguć
14
Eksperimenti na životinjama- Propisi -
• EC: 1985., 26 zemalja: “Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for the Experimental and Other Scientific Purposes” (ETS 123) – nema snagu zakona, ali je prihvaćen (ratifikovan u nekim zemljama, pa u EU 1998.)
– Council Directive, 1986. - EU Directive for the Protection of the Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (86/609/EEC)
– Council Directive, 2003. - 2003/65/EC
Eksperimenti na životinjama- Propisi -
• Eksperimenti na životinjama:– UK (“animal lovers”)
• 1986. – The Animals (Scientific Procedures) Act 1986
– SAD, Kanada, Australija...• Animal Welfare Act (SAD)
– Zakonska regulativa – promene u korist životinja i obrnuto
15
Zakonodavstvo - Srbija
• Eksperimenti na životinjama:– 2003/04. – Pravilnik za rad sa
eksperimentalnim životinjama – MF Univ. u Beogradu (pre toga – Univerz. u NS, VMA, inicijativa FDJ...)
– Zakon RS u pripremi
Pravilnik MF u Beogradu• Zaštićene životinjske vrste:
– živi kičmenjaci (osim čoveka), uključujući sve stadijume razvoja, od sredine gestacije (do trajnog prekida cirkulacije ili destrukcije mozga)
• Etičke eksperimentalne procedure:– postupci sa eksperimentalnim životinjama koji imaju za cilj da
stvore nova znanja iz biomedicine, a mogu uzrokovati bol, patnju, trajno oštećenje
– namerno žrtvovanje eksperimentalnih životinja u cilju dobijanja izolovanih organa ili usmrćivanje na kraju eksperimenta
• Obučenost istraživača (dokaz! – kurs, radovi)• Etički komitet za rad na eksperimentalnim životinjama
MF• Dozvola za rad• Nepoštovanje
16
Eksperimentalne procedure• Prema intenzitetu
oštećenja:– neklasifikovane– blage– srednjeg intenziteta– teške
• Prema nameni:– medicinska istraživanja– (ostala osnovna i
primenjena) naučna istraživanja
– zaštita životne sredine– nastava– sudsko-medicinska– uzgoj– genetske manipulacije
Uginuće• Bezbolno• Uz što brži gubitak svesti i samo žrtvovanje• Pouzdanom, ireverzibilnom metodom• Uz minimalan stres za životinju i onoga ko
žrtvuje• Bezbedno za onoga ko žrtvuje• Kompatibilno sa eksperimentom• Jednostavno• Ekonomski prihvatljivo
17
Potvrda uginuća
• Trajan prekid cirkulacije• Iskrvarenje• Destrukcija mozga• Cervikalna dislokacija• Mrtvačka ukočenost (rigor mortis)• Razaranje celog organizma
Metode žrtvovanja odraslih jedinki
• Predoziranje anestetika• CO2
• Cervikalna dislokacija• Kontuzija lobanje
18
Uzgoj...
• Standardi (prostorije, osvetljenje, provetravanje, pristup, smeštaj, mikrobiološka kontrola, čišćenje, transport)
• Vrste– genetička podela: autbredni zapati, inbredni sojevi, F1
hibridi, koisogene i kongene životinje, nokaut i transgene životinje
– gnobiotička podela: aksenične, gnobiotičke, SPF (specific pathogen free), VAF (virus antibody free) i konvencionalne životinje
Uzgoj...
• Autbredni sojevi –životinje u zatvorenim kolonijama, nepoznatog genotipa– dobra fertilnost, rast i razvoj, otpornost,
preživljavanje, jeftinije• Inbredni sojevi – dobijeni uzastopnim
sparivanjem u srodstvu (≥ 20 x), tako da nastanu 99% homozigotne jedinke– smanjene - reproduktivna sposobnost,
preživljavanje, otpornost, masa i veličina okota, a povećana agresivnost
19
Eksperimentalne životinjeiz registrovanih uzgajališta
• Miš• Pacov• Hrčak• Gerbil• Zamorac• Kunić• Pas• Mačka• ...
Praćenje zdravstvenog stanja životinja
• Za dobrobit životinja• Za kvalitet naučnih istraživanja• Za bezbednost osoblja i istraživača
20
Patologija (1)
• Miš– virusi – adeno, CMV...– bakterije – stafilokoke, streprokoke, Salmonella
enteritidis– paraziti – Hymenolepis nana...
• Pacov– virusi – parvo, adeno, CMV...– bakterije – P. aeruginosa (pluća, slezina, bubreg)...– paraziti – Hymenolepis nana...
Patologija (2)
• Redosled praćenja oboljenja kod eksperimentalnih životinja
1. zoonoze2. bolesti koje su u subkliničkom obliku, a
mogu postati manifestne tokom eksperimenta
3. bolesti koje mogu uticati na validnost rezultata
21
Bezbednostlaboratorijskog osoblja
• Alergije– alergeni
• proteini urina, pljuvačke, lojnih žlezda, krzna...• Infekcije• Povrede
Bol, patnja, distres kod eksperimentalnih životinja
- Opšti skor -• Izgled• Unos hrane i vode• Klinički znaci• Spontano ponašanje• Indukovano ponašanje
22
Primena lekova kod eksperimentalnih životinja
• Putevi primene: p.o., i.v., i.d., i.p., i.m., s.c., p.r., direktno
• Lokalni i sistemski efekti• Uzimanje uzoraka krvi (pacovi – repna vena...)• Zapremine:
– miš – 0,2 ml (i.v.), 1-2 ml (i.p.), 0,4 ml (p.o.)...– pacov - 1 ml (i.v.), 2-4 ml (i.p.), 5 ml (p.o.)...– kunić - 4 ml (i.v.), 10-15 ml (i.p.), 10 ml (p.o.)...
Osnovne hirurške tehnike- Halstead-ovi principi -
• Pažljivo rukovanje tkivom• Dobra hemostaza• Očuvano snabdevanje krvlju ciljnog tkiva• Striktna asepsa• Minimalno tenzija tkiva• Odgovarajuća apozicija tkiva, šavovi• Obliteracija zaostalih šupljina