presentación de powerpoint95 % de los genes humanos. 2. explica cómo se genera una vasta...

Splicing alternativo:

el sastre de nuestras células (o de cómo no se puede curar

enfermedades sin una fuerte investigación básica)

CNEA

12/11/19

Alberto Kornblihtt

IFIBYNE-UBA-CONICET

Depto. Fisiol. Biol. Mol. Cel.

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires - Argentina

Los principales productos de los

genes son proteínas

¿Cómo se fabrican?

ADN ARN PROTEÍNA

copiado 1(transcripción)

copiado 2(traducción)

duplicación

ADN

función

proteína

traducción

Ácido ribonucleico mensajero

(mRNA)

transcripción

gen

célulacromosoma

intrón intrónexón exónexón ADN

Un gen

ARN mensajero

(sólo exones)

proteína

ARN inmaduro

(exones + intrones)

intrones

splicing

Pol

transcripción

traducción

“SPLICEOSOMA”

Phil Sharp Rich Roberts

Premios Nobel 1993

Splicing alternativo

ARN mensajeros

(2 variantes)

splicing alternativo

ADN

Un gen

proteínas

(2 variantes)

ARN

Pol

intrón intrónexón exónexón

transcripción

traducción

“SPLICEOSOMA”

Splicing alternativo

1. Es la regla más que una excepción. Se estima que afecta a un

95 % de los genes humanos.

2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a

partir de un número limitado de genes.

3. Mutaciones que alteran las secuencias regulatorias del splicing

alternativo son frecuentes en enfermedades hereditarias.

4. Su regulación no sólo depende de la interacción de factores

proteicos (SR y hNRNPs) con sus secuencias blanco en el pre-

mRNA sino también del acoplamiento con la maquinaria

transcripcional de la RNA polimerasa II.

“SPLICEOSOMA”

“SPLICING

ALTERNATIVO

”

ARN mensajero

precursor

2 ARN mensajeros

diferentes

2 proteínas diferentes

NÚCLEO

CITOPLASMA

ADN (gen)

un gen una proteína

un gen muchas proteínas

El splicing alternativo parece ser la

causa de la gran complejidad de los

vertebrados (nosotros)

Gusano Caenorhabditis elegans

Invertebrado microscópico de 1 mm de largo formado por 1000 células

19.000 genes en cada célulaFuente: http://www.bio.unc.edu/faculty/goldstein/lab/movies.html

Homo sapiens sapiens

Vertebrado macroscópico de casi 2 m de largo formado por 1013 células

21.000 genes en cada célula

No somos más complejos porque

tengamos más genes

19.000 ~ 21.000

gusano humano

genes

Lo que ocurre es que nuestros genes pueden

generar muchas más proteínas que los del

gusano

25.000 ≠ 100.000proteínas


3'

NH2 COOH

ED A(ED I)

ED B(ED II) IIICS

120 aa

64 aa

95 aa

89 aa

0 aa

90 aa91 aa

5'

RGD

Fibronectina humana

Kornblihtt et al. PNAS 1983

Kornblihtt et al. EMBO J 1984

Vibe Pedersen et al. EMBO J. 1984

Kornblihtt et al. EMBO J. 1985

Gutman et al. FEBS Lett. 1986

Gutman et al. PNAS 1987

Schmucker et al. Cell 101, 671-684 (2000)

Gene de la mosca DSCAM

38.016 variantes de mRNA

Potencial de acción

Neurona

pre-sináptica

Neurona

post-sináptica

SINAPSIS

X

Auto evitación (self avoidance)

Desmodus rotundus (vampire bat)

Ganglios de la raíz dorsal

N N

C

C

Ganglios del trigémino

>43 ºC >30 ºC

CALOR NOCIVO SENSADO DE INFRARROJO

DOLOR ALIMENTACIÓN

TRPV1 (CANAL IÓNICO DE

NEURONAS)

Julius group: Gracheva et al. Nature 2011

El splicing ocurre co-transcripcionalmente

Guigó lab: Tilgner et al. Genome Res. 2012

Beyer and Osheim Genes Dev. 1988

Beyer and Osheim, Genes Dev. 1988

EL splicing y el splicing alternativo están

acoplados a la transcripción de los genes

Cramer et al. PNAS 1997

Cramer et al. Molecular Cell 1999

Cambios en la velocidad de

transcripción regulan las

opciones de splicing alternativo

(acoplamiento cinético)

Velocidad baja, alta inclusión

de exones alternativos en el

ARN mensajero maduro

Sitio débil Sitio fuerte

Exclusión

Velocidad rápida

pol II

SF1U2AF

65U1

U2AF35

First come, first served (el que llega primero se sirve primero)

U1

U2AF35U2AF

65SF1

U1

U2AF35U2AF

65SF1

pol II

U1

U2AF35U2AF

65SF1

U1

U2AF35U2AF

65SF1

Inclusión

Velocidad lenta

Sitio débil Sitio fuerte

Kadener et al. EMBO J. 2001

Nogués et al. JBC 2002

de la Mata et al. Mol. Cell 2003

Fededa et al. Mol. Cell 2005

Alló et al. NSMB 2009

Muñoz et al. Cell 2009

de la Mata et al. RNA 2010

Dujardin et al. Mol. Cell 2014

Velocidad lenta, alta inclusión

de exones

80% de los eventos de


controlados por la velocidad

Velocidad lenta, baja inclusión

de exones (son salteados)

20% de los eventos de


controlados por la velocidad

Sitio fuerte

Velocidad rápida

Velocidad lenta

Sitio fuerte

Sitio fuerte

Sitio fuerte

ADN

ADN

Inhibidor

Sitio fuerte

ADN

Velocidad rápida

Inclusión

pol II

U2AF35U2AF

65SF1

U1U1

U1U1

U2AF35U2AF

65SF1

U2AF35U2AF

65SF1

ETR-3

U2AF35U2AF

65SF1

Velocidad lenta

U2AF35U2AF

65SF1

Sitio fuerte

ADN

U2AF35U2AF

65SF1

U2AF35U2AF

65SF1

Salteado

pol II

U1

U1

ETR-3U1

Sitio fuerte

Sitio fuerte

Dujardin et al. Molecular Cell 2014

¿Qué puede hacer cambiar la

velocidad de la transcripción en

las células?

Cambios en la cromatina que

dificulten o faciliten el pasaje de la

enzima que transcripbe

(polimerasa)

Cambios intrínsecos en la enzima que

transcribe (polimerasa)

Muñoz et al. Cell 2009

Muñoz, Nieto Moreno, Giono et al.

Cell Reports 2017

Regulación del splicing alternativo por la

cromatina

CROMOSOMA

NUCLEOSOMA

CROMATINA

Figure 4-33a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Kadener et al., EMBO J. 2001

Nogués et al., J. Biol. Chem. 2002

Cromatina

compacta

TSA

(droga que abre la

cromatina)

Pol II

Pol II

Cromatina laxa o

abierta

Histonas acetiladas Histonas metiladas

Neuronas poco diferenciadas Neuronas diferenciadas

Schor et al. EMBO J. 2013Schor et al. PNAS 2009

Pol II Pol II

Cromatina relajadaVelocidad rápida

Cromatina compactaVelocidad lenta

Salteado del exón Inclusión del exón

Cromatina alternativa, splicing alternativo

Fiszbein et al. Cell Reports 2016

Celula Nave (It happens in the body of time, where truth dances) (Ernesto Neto, 2005)


AME = atrofia muscular espinal

SMA = Spinal muscular atrophy

ATROFIA MUSCULAR ESPINAL (SMA)

NEURONA NORMAL NEURONA ENFERMA

MÚSCULO NORMAL MÚSCULO ATROFIADO

Fibra nerviosa normal Fibra nerviosa afectada

ADN

gen SMN1

exón 6 exón 8exón 7

exón 6 exón 8exón 7ARN

ARN

transcripción

splicing

100%proteína sana

proteína SMN

traducción


gen SMN2

inhibidor

traducción

transcripción



20%proteína sana

80%proteína enferma

Adrian KrainerCSHL, New York

inhibidor

exon 8

exon 6 exon 8exon 7

ADN

gen SMN1 gen SMN2

ARN

ARN


proteína SMN

traducción

transcripción





transcripción

splicing

traducción

100%proteína sana

80%proteína sana

20%proteína enferma

SPINRAZA

Paciente argentina: Antonella, 5 años, 2 aplicaciones de Spinraza

¿La inclusión del exón 7 del gen SMN2

está regulada por la velocidad de la

transcripción?

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

FL

DE7

FL

DE7

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

0 6 24 48

PercentageofFL

HourswithTSA

062448

HourswithTSA

p<0.01

0%

20%

40%

60%

80%

PercentageofFL

0

0.5

1

1.5

2FL

DE7

p<0.01

p<0.01

FL

DE7

WT slow

RNAPII

WT slow

RNAPII

DE7

FL

0

1

2

3

4

5

6

0%

20%

40%

60%

80%

100%

- TSA ASO TSA+ASO

PercentageofFL

FL

DE7

p<0.01

p<0.01

- TSAASOTSA+ASO

A B C

La inclusión del exón 7 (E7) del gen SMN2 está controlada

por la velocidad de la transcripción

Marasco et al., en preparación

VELOCIDADnormal lenta

con E7 (normal)

sin E7 (defectuosa)

normal/defectuosa

U2AF35U2AF

65SF1

U2AF35U2AF

65SF1

U2AF35U2AF

65SF1

Pol

U1

U1

U1

Dujardin et al., Mol. Cell 2014

ADN

copiado lento

ARN

Pol

U2AF35U2AF

65SF1

U1U1

U1U1

U2AF35U2AF

65SF1

U2AF35U2AF

65SF1U2AF

35U2AF65SF1

copiado rápido

ADN

ARN

Exón incluido

Proteína sana

Exón 7 salteado

Proteína enferma

Histonas acetiladas Histonas metiladas

Neuronas poco diferenciadas Neuronas diferenciadas

Schor et al. EMBO J. 2013Schor et al. PNAS 2009

Pol II Pol II

Cromatina relajadaVelocidad rápida

Cromatina compactaVelocidad lenta

Salteado del exón Inclusión del exón

Cromatina alternativa, splicing alternativo


Probamos tricostatina A (TSA) una

droga que inhibe la desacetilación de

las histonas y que por

consiguiente, abre la cromatina

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

FL

DE7

FL

DE7

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

0 6 24 48

PercentageofFL

HourswithTSA

062448

HourswithTSA

p<0.01

0%

20%

40%

60%

80%

PercentageofFL

0

0.5

1

1.5

2FL

DE7

p<0.01

p<0.01

FL

DE7

WT slow

RNAPII

WT slow

RNAPII

DE7

FL

0

1

2

3

4

5

6

0%

20%

40%

60%

80%

100%

- TSA ASO TSA+ASO

PercentageofFL

FL

DE7

p<0.01

p<0.01

- TSAASOTSA+ASO

A B C

PROTEÍNA SANA


Experimentos con ratones SMA

Alelo paterno

Único gen SMN de ratón


exón 6 exón 8exón 7Alelo

materno


Transgén SMN2 humano

hnRNPA1/A2



Spinraza solo Spinraza + Tricostatina (TSA)

Día 11 después del nacimiento

El efecto de Spinraza mejora con la apertura de la cromatina


NORMAL

NORMAL


Día 17 después del nacimiento


P42

Spinraza-like ASO and HDACs inhibitor act cooperatively in SMA mice model

Spinraza-like ASO

Spinraza-like ASO + TSA

Marasco et al., unpublished



Spinraza solo Spinraza + Tricostatina (TSA)

Día 11


0

5

10

15

20

25

0 20 40 60

*

AGE (DAYS)

*

**

TSA

Heterozygous (WT)

BO

DY

WEI

GH

T (G

RA

MS)

(mSm

n -

/-; h

Smn

2)

Spinraza-like ASO and HDACs inhibitor act cooperatively in SMA mice model

Spinraza-like ASO (suboptimal dose)


Nusinersen-like (MOE-ASO) and HDACs act cooperatively in SMA mice model



Spinraza-like ASO (suboptimal dose )

TSASUR

VIV

AL

PR

OB

AB

ILIT

Y

P11

Spinraza-like ASO and TSA act cooperatively in SMA mice model

Spinraza-like ASO + TSASpinraza-like ASO

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 20 40 60

AGE (days)

Spinraza-like (ASO) and VPA act cooperatively in SMA mice model

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60

BO

DY

WEI

GH

T (G

RA

MS)

AGE (DAYS)

Heterozygous (WT)

Spinraza-like ASO + VPA

VPA

SUR

VIV

AL

PR

OB

AB

ILIT

Y

AGE (DAYS)

Spinraza-like ASO + VPA

VPA0

0,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 10 20 30 40 50



P11 P11

Spinraza-like ASO and HDAC inhibitors act cooperatively in SMA mice model

Spinraza-like ASO Spinraza-like ASO + HDAC inhibitor


Surface righting

Surface righting

0

10

20

30

40

50

60

70

RIG

HTI

NG

REF

LEX

LAT

ENC

Y (s

ec)

ASOVPA ASO+

VPA

UNTREATEDMUTANT

HET(WT)

P7


n = 10 (3 tests each)

Grip strength

0

20

40

60

80

100

ASOVPA ASO+

VPA

AN

GLE

(D

EGR

EES)

UNTREATEDMUTANT

HET(WT)

P7


n = 10 (3 tests each)

ASO + VPAASO

Conclusiones

La velocidad de la transcripción regula el splicing alternativo

Una transcripción lenta puede provocar tanto aumento de la inclusión como

salteado de exones alternativos delendiendo del gen en particular

La estructura de la cromatina afecta el splicing alternativo

La apertura de la cromatina puede ayudar en la terapia de la atrofia muscular

espinal

La luz regula el splicing alternativo en plantas

Valeria Buggiano

Ezequiel Petrillo

Micaela Godoy Herz

Manuel MuñozLuciana Giono

Nicolás Nieto Moreno

UVLuciano Marasco

Ana Fiszbein

Luciana Gómez AcuñaIgnacio Schor

Mariano Alló

Guillermna Kubaczka

Carmen Cuenca

José Stigliano

IFIBYNE-UBA-CONICET

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires - Argentina

Past

Ana Fiszbein

Celina Lafaille

Luciana Gómez Acuña

Manuel Muñoz

Mariano Alló

Gwendal Dujardin

Ezequiel Petrillo

Ignacio Schor

Manuel de la Mata

Paula Cramer

Guadalupe Nogués

Sebastián Kadener

Demián Cazalla

Juan Pablo Fededa

Nicolás Rascovan

Soledad Pérez Santangelo

Anabella Srebrow

Present

Luciana Giono

Valeria Buggiano

Micaela Godoy Herz

Nicolás Nieto Moreno

Luciano Marasco

Carmen Cuenca

Guillermina Kubaczka

Colaboraciones

Adrian Krainer (Nueva York)

Ben Blencowe (Toronto)

Carlos Menck (San Pablo)

Financiamiento

HHMI (EEUU) 2002-2017

Cure SMA (EEUU)

FAME (Argentina)

Lounsbery Foundation (EEUU)

ANPCyT (Argentina)

Universidad de Buenos Aires

CONICET (Argentina)

2002-2017

presentación de powerpoint95 % de los genes humanos. 2. explica cómo se genera una vasta...

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