preparation and characterisation of linear dextrins and their use as substrates in in vitro studies...

6
Preparation and characterisation of linear dextrins and their use as substrates in in vitro studies of starch branching enzymes Lena Andersson a, * , Ulrika Rydberg b , Ha Êkan Larsson b , Roger Andersson a , Per A Ê man a a Department of Food Science, Swedish University of Agricultural Sciences, P.O. Box 7051, SE-750 07 Uppsala, Sweden b Department of Plant Biology, Swedish University of Agricultural Sciences, P.O. Box 7080, SE-750 07 Uppsala, Sweden Received 31 July 2000; revised 23 November 2000; accepted 21 December 2000 Abstract Essentially linear glucose chains with a relatively narrow molecular weight range were produced by enzymatic degradation of commer- cially available retrograded starch. The retrograded maize starch was hydrolysed by thermostable a-amylase and amyloglucosidase, which degraded the enzyme-available starch fraction. Gel permeation chromatography GPC) of the enzyme-resistant dextrins revealed a molecular weight distribution with a peak maximum at a degree of polymerisation dp) 50±60. Hydrolysis with b-amylase gave a b-amylolysis limit of 92%, suggesting that the dextrins were essentially linear. These linear dextrins were used as a substrate in a study of starch branching enzyme I from potato. The enzyme products were debranched and analysed by HPAEC-PAD revealing two major populations of chains with a dp around 11 and 30, respectively. GPC analysis of the same sample, before debranching, gave a peak with a maximum similar to that of the original substrate. However, hydrolysis of a-1,6)-linkages by isoamylase clearly shifted the elution peak towards lower molecular weights and showing also that the majority of the glucose chains being longer than 60 glucose units had been used by the branching enzyme. q 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. Keywords: Linear dextrins; Gel permeation chromatography; Potato starch branching enzyme 1. Introduction Starch is a major storage carbohydrate in plants. It consists of two types of glucose polymers, amylopectin which is a highly branched macromolecule composed of glucose residues linked together with a-1,4)- and a-1,6)- linkages and amylose which is composed of mainly linear glucose chains containing a-1,4)-linkages. Starch polymers can be hydrolysed enzymatically by a- amylase, which is one of the enzymes responsible for in vivo degradation of starch. Retrograded starches, however, are not completely hydrolysed during digestion by a- amylase, leaving an enzyme-resistant starch fraction that consists mainly of linear amylose-type chains Cairns, Morris, Botham & Ring, 1996; Russell, Berry & Greenwell, 1989; Siljestro Èm, Eliasson & Bjo Èrk, 1989). The enzyme- resistant residue is partially crystalline Cairns, Leloup, Miles, Ring & Morris, 1990; Russell et al., 1989; Siljestro Èm et al., 1989) which makes it resistant to hydrolysis by a- amylase unless the sample has been dissolved in alkali or DMSO Englyst & Cummings, 1984). The glucose chains in the crystallites are organised as double helices Wu & Sarko, 1978) where a minimum degree of polymerisation dp) of 10 is thought to be required for the formation of a double helix Gidley & Bulpin, 1987). However, chains containing as few as six glucose units can co-crystallise in the presence of longer chains Gidley & Bulpin, 1987). The average dp of the enzyme-resistant residue has previously been reported to 40±70 glucose units in retrograded starch or amylose obtained from different botanical sources Jane &Robyt, 1984; Russell et al., 1989; Siljestro Èm et al., 1989). Starch is synthesised by a number of enzymes including starch synthases, branching enzymes and debranching enzymes Smith, 1999). For many of these enzymes their precise mechanism and their role in starch synthesis are not yet fully understood. The branching enzymes, which are responsible for the formation of a-1,6-linkages in starch, can be divided into two classes. Potato starch branching enzyme I SBEI) belongs to class B, according to the divi- sion into class A and B by Martin and Smith 1995) based on amino acid sequences and activity characteristics, where class B is relatively more active on longer chains. The branching reaction of this enzyme has been reported to be an inter-molecular chain transfer Borovsky, Smith & Whelan, 1976; Viksù-Nielsen, Blennow, Hamborg Nielsen Carbohydrate Polymers 47 2002) 53±58 0144-8617/02/$ - see front matter q 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. PII: S0144-861701)00162-X www.elsevier.com/locate/carbpol * Corresponding author. Fax: 146-18-672995. E-mail address: [email protected] L. Andersson).

Upload: lena-andersson

Post on 02-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

���������� � ���������� ���� �� ����� ����� � ����� � �� �� ����� � � ����� ���� �� ����� ������� �����

��� ��� ����� ������ �������� �� �� ��� ��� ����� ��� ��� ��� � ���

����������� �� ������� ������ ���������� ������������ �������� ���� �� !"#� $% "! ! �������� ���������������� ����� ������ ������ ���������� ������������ �������� ���� �� !&!� $% "! ! �������� �����

������� !" #��� $%%%& ���� � $! '������� $%%%& ������� $" (������� $%%%

��������

) ������� ����� ����� � ���� *��� � ���������� ����* ��������� *����� ���� *��� ������ �� �������� �������� �� ������+

������ ��������� ��������� �����, -�� ��������� ����� ����� *� ������ � �� ������ ����� �+����� � � ���������� �� �� *����

����� ��� �����+��������� ����� �������, .�� ��������� �������������� /.�01 �� ��� �����+�� � ��� ����� ������� � ���������

*����� � �������� *��� � ���� ������� �� � ����� �� �������� ���� /�1 2%34%, ������ � *��� �+����� � ���� � �+������� � ����� ��

5$6� ���� ��� ���� ��� ����� *��� � ������� �����, -�� � ����� ����� *��� � � � � �� ����� � � ��� �� ����� ������� �����

7 ���� ������, -�� ����� ������ *��� ������� � ���� � �� ���)0+��( �������� �*� ��8�� ��������� �� ���� *��� � �

���� "" � !%� �� ���������, .�0 ���� � �� ��� ��� ������ ������ ��������� ���� � ���� *��� � ������� ������ �� ���� �� ���

������� �� �����, ��*����� ������ � �� �+/"�41+������ �� � ������ � ������� ����� ��� ������ ���� ��*�� ��*�� ��������� *�����

� ��*�� �� � ���� ��� ��8����� �� ��� ����� � ���� ���� ����� ��� 4% ����� � ��� �� ��� � � �� ��� ������� �����, � $%%$

)� ����� 9����� ��, ��� ����� �� ����,

'������: ����� ����� & .�� ��������� ��������������& ������ ����� ������� �����

� ���� ������

9����� � � ��8�� ������ ����������� � ���� , 7�

�� � � �� �*� ���� �� ����� � ������� � ����������

*���� � � ������ ������ ������������� ����� � ��

����� � �� ��� ���� �������� *��� �+/"�;1+ � �+/"�41+

������ � ����� � *���� � ����� � �� ����� �����

����� � ���� ������� �+/"�;1+������ ,

9����� ������� �� �� ������ � ������������ �� �+

����� �� *���� � �� �� ��� ����� �� �� ���� ��� �

���� �������� �� �����, ��������� ������ � ��*�����

��� �� ���������� ������ � ���� ��� ��� �� �+

����� �� ������ � �����+�� � ��� ����� ������� ����

�� � � ����� �� ����� ����� �+���� ���� /0��� �

<���� � =����� > ���� "554& �� ���� =���� > .���*����

"5?5& 9��8� ���@�� )��� � > =8�@��� "5?51, -�� �����+

�� � ��� �� ��� � ��������� ��� ������ /0��� � �������

<��� � ��� > <���� � "55%& �� ��� �� ��,� "5?5& 9��8� ���@�

�� ��,� "5?51 *���� ���� �� �� � ��� �� ������ � �� �+

����� � ��� ��� ����� �� ��� � ���� � ������ ��

(<9A /)��� � > 0����� � "5?;1, -�� ����� � ���� �

��� ��� ������� ��� ����� � � ����� ������ /B� >

9����� "5C?1 *���� � ������ ����� �� �������� ����

/�1 �� "% � ������� �� �� ��D���� ��� ��� �������� �� �

����� ����� /.���� > =����� "5?C1, ��*����� ����

������� � ��* � �� ����� � ��� �� ��+��� ����� � �

��� ��� ��� �� ����� ���� /.���� > =����� "5?C1, -��

������� � �� ��� �����+�� � ��� �� ��� �� ������� ��

��� ������� �� ;%3C% ����� � ��� � ��������� �����

�� ����� � ������ ���� ������� �������� ����� /#��

>������ "5?;& �� ��� �� ��,� "5?5& 9��8� ���@� �� ��,� "5?51,

9����� � ���� � � �� � ����� �� ����� ������

����� ���� � � ������� ����� � ��������

����� /9����� "5551, E�� ��� �� ��� � ����� �����

����� � ������ � � ����� ���� � ����� ���� � ��� ��

��� ����� ��� ���, -�� ������� ����� � *���� ���

�� �� ���� ��� ��� �������� �� �+"�4+������ � ������

�� �� ���� ��� �*� ��� � , ������ ����� �������

����� 7 /9=)71 ����� �� ��� =� ������� �� ��� ���+

�� ��� ��� � � = �� <���� � 9���� /"5521 �� � �

���� ��� �D���� � �������� ���������� ��� � *����

��� = � ���������� ���� ������ � ����� ���� , -��

������� ������� �� ��� ����� �� ��� ������� �� ��

� ����+��������� ���� ��� ��� /=���� ��� 9���� >

B����� "5C4& F�� G+'��� �� =���*� ������� '��� �

0���������� ������� ;C /$%%$1 2!32?

%";;+?4"CH%$HI + �� ���� ������ � $%%$ )� ����� 9����� ��, ��� ����� �� ����,

�77: 9%";;+?4"C/%"1%%"4$+J

***,�� �����,���H������H�������

� 0���� ���� ������, E��: �;4+"?+4C$552,

$%���� �������( ���,��� �K���, ��, � /�, ��� �1,

> ������+<G����� "55?1� �������� ����+��������� ��� +

��� �� ���� ���� �� �� ������ ���� ��� �� ��� � ��� �

��������� ,

E�� ���� �� ��� ����� �� ������� ����� � �����

������ � ����� ��������� ����� ��� � ���� ������

��� ������� � ��������� � �� � �����+������ � ���

���� ������� ��� ������� / =���� � ���� � "5C?&

L�� ��� "54$& ����� B���� > =������ "52!& -�����

.�� > ���� � "55!1, -���� ���� ���������� ���

������� �������������� /���)01 � � ���D����� � �

����� �� ���� � �� ��� �� ����� ����� ������ , �

� ����� �� ������ ����� � �� ���������� ���� ��

� �, ��*����� � *���+���������� � ����� �� ����� *���

� ����* ��������� *����� ���� *��� �� ��������,

-�� ����� � �� ��� ��� *� �� ������� � ���������� �

����� ����� � �� � � ��� � � �� ����� � � ��� ��

����� ������� ����� �����,

� ��������� �� ����� �

)�#� *�������

��������� ����+����� � ����� ����� /'����� ��1 *�

������ ���� '������ 9����� � 0������� 0������

=����*����� �9�, � �+���������� ����� �� �����+

���� ����+����� � ����� ����� ������ �� 0��� ����

F�������� =������ *� � � � ��� ���� � , -�����+

����� �������� ����������� �+����� � /)0 !,$,","1 �

����������� ����� ���������� �� � /)0 !,$,",!1 *���

������ ���� <�������� =���� B�����*� 7����, 7 ����+

�� � /)0 !,$,",4?� 25 %%% �H�� ������1 *� ������ �

���� ���� ������ =���������� ����������� � A�������

#��� � �+����� � /)0 !,$,",$� ??% �H�� ������1 ����

9���� 0�������� 9� ���� � <A� �9�, ������ �������

����� 7 /"%! �(� ����1 *� ����+����� � � $� ���

� ����M� �� ����� ��M��� �������������� � ��+

������� �������������� � � ����� �� L�� ����

/"55C1, ������� ���� *��� ���� 9����� -�����

#���,

)�)� ���������� ������ ��������

��������� ����� /������, 2%% ��1 *� � ��� � �

"2 �� �� %," < ������� ������ �� 2,% � ������ *���

;% �� �+����� � /!%% �H��1 ��� " � � � ������ *����

����, ����� ������� 2%% �� �� ���������� �� �� �����

�� ";% �H�� � ��� ������� ������� *� �� � ��� �����

*� ������� �������� �� 4%�0, E������ ��� ����� *�

���������� *� �� �*��� *��� ��� ������� ������� �*���

*��� ������ � ��� ��� �������� �� ;%�0,

)�+� �%���������

�+������� � *� �������� �� � ����� 2 �� �� ���

����� � $%% �� (<9A � � ������ *���� ����, -��

����� *� ��� ����� *��� " �� �� %," < ���� ��������

�� ;,? � " �� �� �+����� � /$$ ??% �H��1 *� ��,

-�� �������� /�� $2�01 *� ����� ����� 2 � �� ������

��� ����� ��� 2 ��, -�� ����� *� ����� ":" *��� *����

����� �� �8����� � � =����� �+$ ����� /"�4 � 5% ��1

,� �������� �� ��� - .��/������� ������� 0 1)!!)2 "+3"&2;

20 25 30 35 40 45 50 55

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4102050100200500

Fraction n mber

Abs

orba

nce

E��, ", .�0 ������ ���M�� �� � ������� ����� ����� ����� �� /+�+1 � ����� /+�+1 ������ � �� � ������ �, ��������� ����� ����� �� ������ � �� �+

����� � � ���������� �� � � �� � ��* /+�+1, (� ����� ������ ����� ����� ���������� *��� ������� ��� ��* � ��� ����� ��� ,

����� *��� *����, 0���������� � �������� �������

/$ ��1 *��� ������ �� ��� �����3 �������� ��� �����

/(���� � .���� � �������� ����� > 9����� "5241, -�� �+

������� � ����� *� ��������� � ��� ��������� �� �����+

������ *��� � � �;,

)�0� .������������ ������

.�� ��������� �������������� /.�01 � � 9������ �

0�+4= ����� ����� *��� %,$2 < LA� *� ������ �

������� �� � ����� /E����� �� 9�������� ��� ��

)��� � > � ��� "55?1, -�� �������� ����� �� �������+

���� � ��� �������� ������� *��� ��� ��� �� ���

�����3 �������� ��� ����� /(���� �� ��,� "5241, ����

���������� ��� ������� �������������� *��� ��� �

������������ ������� /���)0+��(1 � � 0�������

��+"%% ����� *� � � � � ����� �� L���� ��� �

> � �� /"55?1, -�� ����� ��� ���)0 *��� ������

� ���� � "2% �< '�A� �� � ��� ������� �����

�������� ������� � ����� ����*,

)�"� ����� � ���� ������ /�������� ��4��� 5

9����� ��� ���� � �� ���)0 �� .�0 *��� �������

�� � ����� ����� ����� /43? ��1 � "%% �� �� $ <

LA�, " �� �� *���� � $%% �� �� %,2 < -�� ������ ��

C,4 *� ��� ��� �� *� �8� �� �� C,4 *��� �0� �

��� ����� *� ����� *��� *���� �� $ ��, -� 5%% �� �� ���

������ *� �� "%% �� �� � " �< ������ �� �����

������� ����� 7 �� "%% �� �� *���� /������ �����1,

-�� ����� *��� ������� ��� "4 � �� ���� �����������

� ��� ������� *� ��� �������� �� ������ � � ������

*���� ���� ��� 2 ��, " < ������� ������ �� !,4 /�"2% ��1

� 2 �� �� � ������ � /$52 �1 *��� �� � ��� �����

*��� ������� �� !?�0 ��� 2 �, ����� �� �8����� ��� ���+

����� ������� *� ����� �� ������ ��� 2 �� � ��� ��

�� ��� ����� *� �8� �� �� �� � "% � �� < '�A�,

� ������� �� ���������

+�#� ���������� ��� ��������������� ������ ��������

-�� ������ ��������� ������������ ��������� ���������

����� ������ *� ������ � *��� �+����� � � �����+

����� �� � ������� �+����� �+�� � ��� ������� , �����

$H! �� ��� ������� �������� *� ������ � ���� ���

����� ��������,

0�������������� � �������� ����� *��� � � ��

������� ��������� ��� � �������� � ������� �� ���

����� , .�0 ������ ���M�� �� ��������� �����

/'����� ��1 ����� �� � ����� ������ � *��� �+����� �

� ���������� �� � ��� ��* � E��, ", -�� ���������

����� ����� �������� � ���� ��������� *����� � �����+

��� *���� ��� ������ ���M�� �� ��� ����� ������� � ����

*��� � ������� � ��� ���� �� � 2%34% �� � � �����

���������� *��� ������� ���� , -�� *� � ��� *���

,� �������� �� ��� - .��/������� ������� 0 1)!!)2 "+3"& 22

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

5

10

15

20

25

30

35

40

A

B

6

10

20

30 4050

6

10

20

3040 50

Retention time (min)

Det

ecto

rre

spon

se(m

V)

E��, $, ���� ���������� ��� ������� �������������� �� ����� ����� ������� ���� '����� � /�1 � 0��� ��� ����� /=1, (� ����� ��� ������

����� ��� ���� ,

�� ��� ������� ���� ����� ���� /#�� �� ��,� "5?;& �� ���

�� ��,� "5?5& 9��8� ���@� �� ��,� "5?51, ����� �������� *���

� ������ � ��� ������ ���M�� � �� ����� �������

���� ��� ����� ������ ������ �� � ������ ��������,

� ��������� ����� ������ ���� 0��� ��� *� �� � ���+

��������� ��� �� � ���� � �� .�0 ����� ������

������ ���M�� /�� ��*1,

B��� ���)0� ������� ���� �� �� (� C$ ���� �� ���+

���� /E��, $�1, -�� ��8����� �� ��� ���� �� ���� *���

����� ��� ����� ����� � �� ��� ��� ���� ����� ��

������ ���� ���� �� � �� ������, -�� � � ��� *���

������� ���� � �����+�� � ��� ����� /.����� 0�����

(�������������� ���>.���*���� "5521,-�� �������

���� *��� ���� � *��� �� ����� ������ ���� ��� ����

��� ����� *��� �����, E����������� �������� �� ���

����� � �� ����� ��� ������ ������ /�� ��*1, �

�� ������� ������ �� ��� ����� � ���� �� � � �����

C%� � ��M��� �� .�0, -�� � ���� *��� �� �������

��� ������� ���� ��� ��� � ��������������� ������

��� *��� ���� �� ���� � ��� ������������,

� ������� � �� ����� ������ ���� '����� � � ���

0��� ��� ����� ������� � ����� �������� � ���� �����

���M�� /E��, $� � =1, ����� ����� ������ ����

'����� � ������ � ������ ��������� �� ���� ������

��� �$$ ����� � ��� *����� ����� ����� ������

���� ��� 0��� ��� ����� ������ � ���������� ������

����� �� ���� *��� � � �� $$32%,

�+����� � ������ � �������� �+/"�;1+������ �

����� � � ����������� ������� ����� ����� � �

�+����� ����� , ����� ��� ��� *��� �+����� �� 5$6 ��

��� ����� �� ��� ������ � �� ��� �����, -��

����� ������� ������� ��� � ������ ���� ��� ����� �

���� *��� � ������� �����,

+�)� ������ � ���� ������ /�������� ��4��� 5

-�� ����� ����� *��� � � � �� ����� ��� ���� �

��� ��� �� ����� �� ����� ������� ����� 7 ����

������, -�� �� ����� � *��� �M� *��� ������ �� � �����+

�� � *��� � ������������� ����* ���� ����� � �����+

���, -�� ���� ���� �� ���� �� ������� � ������ �����

D������� � ���� �� �� � ��������� *����� ���� �������

��� ���� � �� ���)0 ��� �� *��� ���� ��� � � � � �����

����� � �� ,

0��� ����� � �������� *��� ������� �� ���)0�

����� � ������� �� ��* ��� ��������� �� ������� ����

�� ����� ���� �������� *��� ������ ����� �������

����� 7 /E��, !1, 7 ��� ������ ����� /E��, !=1� �������

*������ ������ ���� *��� ���� �� �� � � C% *���

�� ���� *���� ���� �������� ���� ����� ��� C%

����� � ��� *��� ������ � ��� ���� ���� , E�� ���

����� ������� *��� 9=)7� ���� �� ��� ���� ���������

*����� �������� �� � ������� /E��, !�1, -*� �* ����+

����� *��� ������� �� ����& �� *��� � ���� �������

���� � "" � � ��� *��� � ������� ���� �

!%, � ������ ������ �� ���� � �������� � ��* � �

,� �������� �� ��� - .��/������� ������� 0 1)!!)2 "+3"&24

0 10 20 30 40 50 60 70 800

50

100

150

B

A

Retention time (min)

Det

ecto

rre

spon

se(m

V)

E��, !, 0����������� �� ����� ����� ������� *��� /�1 �� *������ /=1 9=)7 � ������� *��� � ������ � ����� �� ���� � �� ���)0,

��� �� ����� ������� ����� 7 ���� ����� /-���� ��

��,� "55!1,

����� ����� ������� *��� 9=)7 *��� �� � ���� � �

� 9������ � 0�+4= ����� ������ � ����� �������� *���

� ������ � /E��, ;1, =����� ��������� ��� ����� ��*�

������� ���M��*��� � ������������� � ��� ;%32%,�����

��������� ��� ���� ������� ����� �� � !%, -�� ����

*� *��� �M� � ��� ���� ��������� *����� ���� *���� ���

��8����� �� ���� ����� � 4% *��� �� ��, �� ��� ���

����� ��� ��������� �� ���� ���� *� ����� � � �*

���� ������ ��� � ��� ������� �� ����� �� ��� �����,

-�� ��*� ������ � ���� ����� � 4% ���� � �� �����

��� ��� ������� �����, E����������� ��� ��������� *�����

� �������� ��� ��� ������ ����� /*������ �������

����� ��1 � ��� ������ ����� ����� �� ��������

�� � ������ � ��� ������, -�� ���� �� ��������� � ���

��� ��� �� ���� �� ������ 9=)7 ���� ����+��������� ������

��� ����+���������, ��*����� ����+��������� ��� ���

���� �� ������ � �� �� � ��� ������� � �������

���� /=���� �� �� ��,� "5C4& ���� �� ��,� "52!&F�� G+'��� �

�� ��,� "55?1,

7 ��� ������ ����� ����� ���� ��� ������� �� ���+

����� ������ � �� ��������� �����, -�� � � �� ��� �

����� ����� � � ����� �� ����� � � ����� ����

�� ��� ����� �� � ������� ����� �� ��� ��� �����,

����������

=���� ��� (,� 9����� ), ),� > B����� B, #, /"5C41, A ��� ������ � ��

����� � ������� �� ������ N+�����, $������ 6�����

������������ 7)� !%C3!"$,

=����� 0, (,� > ���� � #, /"5C?1, <������� ���� �� /" � ;1+/+�+������

/" � ;1+/+�+�����+4+����� �� ��� ���� � ���� �������� 8�� ���� �,

����� , .��/������� 9�������� 7#� !$"3!!;,

0��� � �,� ������� F, <,� <��� � <, #,� ���� 9, .,� > <���� � F, #, /"55%1,

�� � ��� �����: � J+��� ��������� ��� ��� ��� ������ �� ��������

������ � � ����� � ��� � �����, 6����� .������ ������� #)�

$%!3$%4,

0��� � �,� <���� � F, #,� =������ �, �,� > ���� 9, ., /"5541, ��� ���+

�������� ���� � �� � ��� ����� � ����� � � ����, 6�����

.����� ������� )+� $423$C2,

(���� � <,� .���� � L, �,� �������� #, L,� ����� � �, �,� > 9����� E,

/"5241, 0����������� ����� ��� ���������� �� ���� � ������

�� ���� , ���������� .��������� )&� !2%3!24,

)��� �� �,',�>0����� � #,�, /"5?;1, 9�����M������ ��� ������ ���+

��� �� ����� �+ ����� ���� �������� �� �� +��D�� �������������� ��

�� ������ ���� � ������ ������� , �������� #!:� 5!C35;$,

E����� �� �,� 9�������� #,� ��� �� �,� )��� �� �, +0,� > � ��� �,

/"55?1, -�� �O���� �� ����� � � ���������� ���������� ��� �

������� ���� � ������������ ��������� �� ������� ������ ,.��/%

������� �������� +"� ""53"!;,

.����� <, #,� > =����� �, F, /"5?C1, 0�� ����� ���� �� �����+����� ��+

������ � ���� �� ��� ��� ������ ���� �� �����: <����� ����+

����� ��D������� ��� ��� �������� �� ����� ������ , .��/�������

9�������� #7#� $5"3!%%,

.����� <, #,� 0����� (,� (����� �, �,� ������� �, �,� �� ���� �, �,� >

.���*���� �, /"5521, <�������� ���� � �������� � �����+�� � ���

��������� �����, .��/������� �������� )&� $!3!",

#��� #, +�,� > ������ #, E, /"5?;1, 9�������� ���� �� ����� � F+

�������� � ��������� ����� � �� ����� �� ����� ����� � � �

� �* ����� ��� �������� ���������� , .��/������� 9��������

#+)� "%23""?,

L�� ����� #, /"55C1, 9����� ������� ����� � ����� ��/�����

� ���/������ ��������, (������� ��� � � 9*�� � ����� ��� ��

������������ 9����� ,

,� �������� �� ��� - .��/������� ������� 0 1)!!)2 "+3"& 2C

30 35 40 45 50 55 60 65

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4102050100200500

Fraction n mber

Abs

orba

nce

E��, ;, .�0 ������ ���M�� �� ��� ������ ����� �� �������� �� ������ ����� ������� ����� 7 /9=)71 *��� ����� ����� , 0����� ����� *������

9=)7 �� /+�+1� 9=)7+������ ������ /+�+1 � ����� /+�+1 �������� *��� � ������ �, (� ����� ������ ����� ����� ���������� *��� �������

���� ��� ��* � ��� ����� ��� ,

L���� L,� ��� �� �,� > � ��� �, /"55?1, N���������� ���� � ��

���������� ��� ���� �� ��� �� ����+���������� ���+�������

�������������� *��� ��� � ������������ �������, 6����� .��%

��������� �� &!!� "553$%4,

L�� ��� 0, �, /"54$1, � ����� ��� ��� ������������ � ������� �� �����+

�� *��� ����, ���������� ������������ 0� "C3$!,

<����� 0,� > 9����� �, <, /"5521, 9����� ��� ���� � , ����� .���� � 5C"3

5?2,

����� 9,� B����� B, #,� > =������ #, <, /"52!1, -�� ������ ���� � �

�������� �� �����, ���� JF777, -�� ������ ����+����� ��� N+

����� �����, 6����� .������� ������ ";$$3";$C,

�� ���� �, �,� =����� 0, 9,� > .���*���� �, /"5?51, 0��������� ���� ��

�� � ��� ����� ���� *���� � �����, 6����� .����� ������� :� "3

"2,

9��8� ���@�� <,� )��� �� �, +0,� > =8�@���� 7, /"5?51, 0��������� ���� ��

�� � ��� ����� ���� ��������� *���� �����, �����- ��;�<�� 0#� ";C3

"2",

9����� �, <, /"5551, <���� �����, .������ ������ �� ����� ������ )�

$$!3$$5,

-����� P,� .��� �, +�,� > ���� � #, /"55!1, =������ �� ����� � �� ���

������� � ������ �� ����� �� ����, .��/������� 9��������

)0!� $2!3$4!,

F�� G+'��� �� �,� =���*� �,� ������� '��� �� -,� > ������+

<G����� =, /"55?1, ��� ��������� �/" � ;1+����� � �� �����

��� ������ �����+������� ����� 7, ����� �������� ## � ?453

?C2,

B�� �, +0, �,� > 9����� �, /"5C?1, -�� �����+������� ��������� ��������

�� ��� ������ =+����� �, .��/������� 9�������� 7#� C3$2,

,� �������� �� ��� - .��/������� ������� 0 1)!!)2 "+3"&2?