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PREPARACIONES Y
TINCIONES
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PREPARACIONES
• En fresco• Temporales:
Microcultivos de hongos, preparaciones de tejidos
• Fijas:Gram, Ziehl Nielsen, Sheaffer y fulton, SEM, TEM, naranja de acridina.
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CONTRASTE DE FASES
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PREPARACIONES TEMPORALES: microcultivo de hongos
1. Colocar en una caja de petri, un soporte para portaobjetos, un portaobjetos, 2 cubreobjetos y esterilizar a 121°C por 15 min.
2. Colocar sobre el portaobjetos un fragmento de agar papa dextrosa de 1cm2.
3. Inocular con el asa micológica cada lado del cuadrito de agar con el cultivo del hongo. Colocar encima un cubreobjetos.
4. Colocar a un lado, una torunda de algodón impregnada de glicerol al 10%, estéril; incubar a 28°C durante 48 h.
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MICROCULTIVO
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5. Eliminar la torunda y agregar dos gotitas deformaldehído g.r. Dejar reposar una hora.
6. En un portaobjetos, colocar una gotita de azulde algodón y colocar el cubreobjetos superiordel microcultivo, sellar con esmalte de uñastransparente. Eliminar el agar y colocar otragotita de azul de algodón, sellar con esmalte.
7. Observar a 10X y 40 X. Realizar dibujosrespetando los aumentos y colorearlos.
PREPARACIONES TEMPORALES:
microcultivo de hongos
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MICROCULTIVO
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Penicillium sp.
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Acremonium sp.
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Preparaciones Fijas
Agentes fijadores
• Agentes físicos .- calor, resinas
• Agentes químicos:
Etanol al 100%
Paraformaldehído
Gliceraldehído
tetróxido de osmio
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Preparaciones Fijas:
• Transferir una pequeña porción de la colonia a un portaobjetos limpio y desengrasado, homogeneizar con una gotita de agua.
• Dejar secar al aire y fijar con calor suave.
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TINCIONES
• TINCIONES SIMPLES
• TINCIONES DIFERENCIALES
• TINCIONES ESPECÍFICAS
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Tinción de Gram
• Colocar una gotita de cristal violeta sobre el frotis, dejar interactuar 1 min. Enjuagar con agua
• Colocar una gotita de lugol durante 1 min., enjuagar con agua
• Colocar dos gotitas de etanol-acetona y enjuagar con agua
• Colocar una gotita de safranina, 30 seg., y enjuagar con agua
• dejar secar y observar a 10X, 40X y 100X a inmersión. Dibujar y colorear.
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Cepas aisladas de gasoductos(Tinción de Gram)
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TINCIÓN CON NARANJA DE ACRIDINA
• Transferir una gota del cultivo a un portaobjetos limpio y desengrasado, dejar secar al aire.
• Fijar con etanol al 100%, cubriendo el frotis durante 5 min.
• Eliminar el etanol y colocar 100 L de naranja de acridina durante 3 min.
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TINCIÓN CON NARANJA DE ACRIDINA
• Eliminar el exceso del colorante con etanol al 70%.
• Observar en un microscopio de epifluorescencia con un filtro azul, emisión a 490 nm.
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MICROSCOPIA DE EPIFLUORESCENCIA
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PREPARACIÓN FIJA:SEM
• Fijar una porción del cultivo con glutaraldehído al 2%, g.m. por
8 h.
• Eliminar el glutaraldehído lavando 3-4 veces con amortiguador
de fosfatos
• Agregar 2 gotas de tetróxido de osmio y fijar durante 3 h.
• Lavar con amortiguador de fosfatos
• Deshidratar con etanol en concentraciones crecientes (40, 50,
60, 70 , 90 y 100%)
• Secar al punto crítico durante 1h
• Cubrir con carbono y oro en polvo
• Observar en el microscopio electrónico.
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Microscopía Electrónica De Barrido (SEM)
D. alaskensis biopelícula de 10 m de grosor
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TINCIÓN DIFERENCIAL
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)
• Se utiliza para diferenciar las bacteriasdenominadas ácido alcohol resistentes de lasNo ácido alcohol resistentes
• Algunas bacterias poseen, en su pared celular,ciertos ácidos grasos de cadena larga que lesconfiere la propiedad de resistir la decoloracióncon alcohol ácido, tras haber sido teñidas concolorantes básicos.
• Esta tinción requiere un calentamiento para queel colorante atraviese la pared bacteriana quecontiene la capa cerosa formada por ácidomicólico
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TINCIÓN DIFERENCIAL
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)
• Frotis bacteriano
• Cubrir el frotis con Fucsina fenicada y calentar hasta emisión de vapores durante 5 minutos.
• Lavar con agua de la llave
• Decolorar con alcohol ácido 1 minuto (asegurándose de que no se desprende mas color rojo).
• Lavar con agua de la llave para eliminar el exceso
• Agregar azul de metileno al 1% como colorante de contraste
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Los bacilos ácido alcohol resistentes aparecen coloreados en rojo sobre
el fondo azul de la preparación. Este tipo de tinción se utiliza para
observar los géneros Mycobacterium y Nocardia
Las bacterias No ácido alcohol resistentes se tiñen con el colorante de
contraste (azul)
Mycobacterium sp. 1000 X Nocardia asteroides, 1000 X
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Tinciones Estructurales
Flagelos Método de Fontana-Tribondeau
Método de Leifson
Esporas Método de Moeller
Método de Wirtz-Conklin
Cápsula Método de Hiss
Método de la Tinta china
Corpúsculos Método de Albert
Gránulos Metacromáticos Método de Loeffler
Estructura Tinción
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TINCIÓN DE SCHAEFFER-FULTON
Las esporas son formas de resistencia bacteriana.Tienen forma esférica u oval. Al microscopio lasesporas sin teñir se observan como gránulosbrillantes.
Según su localización se distinguen tres tipos deesporas: Centrales, Subterminales, Terminales
• Realizar el frotis
• Cubrir el frotis con verde de malaquita
• Calentar 5 minutos a emisión de vapores
• Enjuagar con agua de la llave
• Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto
• lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.
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Endosporas: Técnica Schaeffer y Fulton
Bacillus sp. 2000 X 1250X
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TINCIÓN DE NEGATIVA DE
CAPSULA• La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que
envuelve la pared celular de algunas bacterias.
• Esta compuesta de polisacaridos, mucopolisacaridos o polipéptidos
• Por su alto contenido de agua se tiñen débilmente por los colorantes
• Prepara un frotis a partir de una suspensión densa de bacterias en solución salina al 0.85%
• Agregar una gotita de cristal violeta o de tinta china.
• Dejar secar al aire y observar