practica nº bioquimica

Manual de laboratorio – Bioquímica General

PRACTICA N° 01

TEORÍA Y EMPLEO DEL ESPECTROFOTOMETRO


I. INTRODUCCION

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

II. MARCO TEÓRICO

INSTRUMENTAL BÁSICO PARA COLORIMETRIALa comparación de la intensidad de color producida por una muestra con la producida por un patrón conocido de referencia se ha utilizado durante mucho tiempo en el laboratorio de química clínica. Originalmente se usaba un comparador visual en el cual se situaban los dos tubos de las soluciones uno al lado del otro para comparación. El aparato estaba diseñado de tal forma que la fuente de la luz pasaba a través de los tubos y así a través de la columna de solución contenida en los tubos. Se evitaba que la luz extraña entrara por las partes laterales del tubo utilizando el simple proceso de construirlos de cristal negro opaco.


La longitud del paso de luz se medía introduciendo un embolo opaco dentro de las soluciones. De nuevo, se evitaba que la luz entrara por los lados del embolo y su único paso era a través de la longitud del embolo. Los émbolos se introducen en el interior de las soluciones hasta que el ojo del operador juzgaba que el color en el tubo de muestra problema, era igual al del tubo patrón. Los principios de calorimetría se basan en las leyes de Beer y Lambert.

LEY DE BEER.Dice: que la cantidad de la luz absorbida por una solución, es directamente proporcional a la concentración del sólido en aquella solución.

LEY DE LAMBERT.

Dice: que la cantidad de la luz absorbida por una solución, es proporcional al espesor o intensidad de color de la solución.El mayor inconveniente del comparador visual de color, era que dos personas no llegaban a obtener el mismo resultado debido a variaciones individuales al juzgar el color. Además, algunas personas son ciegos para un color o para las matices y como tales son incapaces de usar un instrumento de comparación de este tipo.

FOTOMETROS FOTOELECTRICOS

Es un instrumento para medir la intensidad de la luz. La luz que incide sobre una fotocélula o fototubo, produce una corriente eléctrica dentro de la célula o tubo. Esta corriente es transferida a un galvanómetro donde puede medirse su intensidad.

Las desviaciones de la aguja del galvanómetro son directamente proporcionales a la cantidad de corriente que pasa por él, a su vez, es directamente proporcional a la cantidad de luz que índice sobre la fotocélula.

Combinada con el fotómetro hay una fuente de luz monocromática. El rayo monocromático se produce de varias formas. El método más simple es usar una luz blanca pasarla a través de un filtro selectivo que tenga una gama espectral relativamente estrecha.


TIPOS DE COLORIMETROS FOTOELECTRICOS.Los fotómetros de filtros o colorímetros existen o bien como instrumentos de fotocélula simple. Fotocélula doble. Los instrumentos de fotocélula simple están sujetos a las fluctuaciones del voltaje, y necesitan ser suministrados con algún tipo de regulador de voltaje. Los instrumentos de doble célula, no están sujetos a las fluctuaciones a las fluctuaciones del voltaje, ya que ellos emplean fotocélulas equilibradas y una de células es siempre una célula de referencia. Cualquier clase de cambios de intensidad de la luz debido a cambio de voltaje. Afecta a ambas células por igual no afecta a las lecturas correspondientes a muestra sucesivas.

A los fotómetros de prisma y de red de distracción se les conoce como espectrofotómetros, y son generalmente instrumentos de célula simple. Ambos necesitan una fuente de voltaje constante para un funcionamiento óptimo.

Generalmente, los espectrofotómetros proporcionan una lectura más sensible que los instrumentos de filtro.

LONGITUD DE ONDA.La luz se transmite por ondas y la distancia entre las dos cimas de una onda, se mide en milimicras. A tales distancias se les conoce como longitudes de onda.

ESPECTRO VISIBLE: Longitudes de onda entre 400 a 700 nm.

ESPECTRO ULTRAVIOLETA: Longitudes de onda por debajo de 400 nm.

ESPECTRO INFRAROJO: Longitudes de onda por encima de 700nm.

El sistema más delicado emplea un prisma que descompone la luz blanca en sus bandas componentes. La luz monocromática se selecciona luego mediante una rendija. El montaje de los prismas es muy delicado y relativamente fácil alterar. Un sistema más tosco emplea la red de difracción, que descompone la luz blanca de una forma muy parecida a como lo hace el prisma. Como las


redes de difracción, permiten la selección de bandas espectrales relativamente estrechas.

Los calorímetros visuales utilizan al espectro visible completo, mientras que los fotómetros y los espectrofotómetros, son más selectivos y utilizan bandas mucho más estrechas. En la mayoría de los ensayos en química clínica, se utiliza el espectro visible. Algunos constituyentes pueden ser medidos únicamente en bandas ultravioletas (UV) o infrarrojas (IR) y los fotómetros que se usan en las técnicas (UV) o (IR), son fabricados especialmente. La selección de las longitudes de onda adecuadas para cualquier análisis fotométrico, lleva consigo, la construcción de una curva de transmisión espectral (ts) usando soluciones conteniendo el color final producido en la reacción, para determinar el constituyente de la sangre que se está considerando. La longitud de onda seleccionada es aquella en la que las sustancias específicas coloreadas absorben la mayor cantidad de luz, o transmiten la menor cantidad de luz.

La curva (TS) (transmisión espectral) se prepara representando en un simple papel cuadriculado las lecturas de porcentaje de transmisión mínima. Es obvio que este procedimiento, no se puede usar con instrumentos de filtros, ya que raramente hay disponibles filtros suficientes, para permitir una selección tan precisa. Consecuentemente, el filtro correcto para cualquier técnica colorimétrica se indica generalmente en las instrucciones de la técnica. Normalmente el filtro a usar es aquel cuya transmisión espectral es opuesta a la de la materia que se está valorando.En otras palabras, el filtro a usar deberá ser uno que transmita la mayor cantidad de luz. No obstante, hay excepciones a esto, y que en ciertos casos habrá tal punto de sensibilidad que hará imposible lecturas exactas.

En estas condiciones se deberán usar un filtro arbitrario. Algunos fabricantes de colorímetros suministran listas de filtros coloreados junto con soluciones coloreadas para las que siguieren usar estos filtros. Un laboratorio hará uso de tales tablas, cuando ponga en marcha nuevas técnicas y cuando no este especificado el filtro.

TUBOS DE COLORIMETRO Y CUBETASTan importante como la correcta selección de una longitud de onda o de los filtros que han de utilizarse, es la selección de tubos


o cubetas del tamaño adecuado y características optimas aceptables. Debe recordarse que la cubeta es una parte del sistema óptimo del instrumento. Se introducen errores importantes, cuando se usan cubetas que están rayadas, grabadas, sucias o con marcas de dedos, o se utilizan otros materiales extraños. Durante una serie de análisis es de vital importancia, que totas las cubetas se sitúen en el aparato siempre con la misma orientación. Todos los fabricantes de instrumentos marcan sus cubetas de alguna forma e indican el alineamiento correcto de estas marcas.

Probablemente la forma más eficaz de eliminar los errores de las cubetas, es usar una sola cubeta para todas las lecturas. Sin embargo, esta puede ser no practico, dado que se pierde tiempo y exige que el tubo sea en juagado muy bien entre lecturas de las muestra. Las cubetas cuadradas están disponibles y son probablemente las más exactas de todas. Los dos lados opuestos de una cubeta cuadrada son rectificados y pulidos para asegurar las condiciones óptimas máximas. Como una protección más, los otros lados tienen su acabado satinado o de vidrio deslustrado, de forma que incluso el operario más descuidado, tendrá que detenerse en situar la cubeta en el espectrofotómetro, en la forma correcta. Las cubetas redondas deberán igualarse cuidadosamente para una transmisión de +- 0.68. El tamaño es importante en ello, ya que su diámetro rige la longitud del paso de luz a través de la solución coloreada que se está midiendo. Al seleccionar cubetas para un ensayo dado, deberá recordarse, que las lecturas más exactas se obtienen de cubetas en las lecturas de porcentaje de transmisión importantes resultan entre 10 y 80 T.

Los extremos de la escala del fotómetro no proporcionan medidas exactas.

LECTURAS DEL FOTOMETROLa lectura de los instrumentos depende o bien de la cantidad de a luz absorbida por una solución, o de la cantidad de luz no absorbida que pasa a través de la solución. La cantidad de luz absorbida por una solución se la conoce como densidad óptica, es una escala logarítmica. Para representar las lecturas de una escala de densidad óptica hay que utilizar papel milimetrado. La luz no absorbida que pasa a través de una solución, se la conoce como porcentaje de transmisión. Las divisiones de calibrado sobre la


escala de las lecturas del instrumento graduado en %T, son divisiones iguales y para representar las curvas con estas lecturas hay que utilizar papel semi-logarítmico. Algunos instrumentos utilizan las dos escalas graduadas con lecturas de densidad óptica y de porcentaje de transmisión y en estos casos como la escala de porcentaje de transmisión es más fácil de leer, los valores se toman de la escala en términos de porcentaje de transmisión %T, y la continuación se transforman en DO, para efectuar los cálculos.

Las soluciones blancas, son importantes especialmente en ensayos donde los reactivos tienen color. La concentración de color de ensayo está formada con el color producido por la substancia que se está investigando, más el color de los reactivos iniciales. Para conseguir resultados exactos, la lectura del blanco efectuada en le fotómetro, deberá restarse de las demás lecturas.Este ajuste se puede efectuar en una de estas dos formas.

1. Leer el blanco fijando el cero de DO, con agua destilada, y rescatar esta lectura de todas las otras lecturas de patrones y muestras.

2. Ajustar el fotómetro a 100%T, o cero de DO, con el blanco en lugar de agua destilada. Esto resta la lectura de blanco mecánicamente, en lugar de matemáticamente.

A. CURVAS PATRON

Las curvas patrón son útiles: 1. Para comprobar un ensayo y determinar su conformidad con la ley

de Beer.2. En determinaciones donde el patrón es difícil de obtener.3. En determinaciones donde los patrones son extremadamente

inestables.

Por reflexiones sobre -2 y -3, es esencial que estas curvas sean comprobadas detenidamente a intervalos regulares y efectuar un control con cada colección de muestras problema.Para preparar una curva patrón, se preparan varias concentraciones de un patrón y se leen a una longitud de onda específica contra un blanco adecuado. El porcentaje de transmisión, o las lecturas de densidad óptica para estos patrones, se representan contra sus concentraciones correspondientes. Se trata una línea desde el origen,


y uniendo todos los puntos las veces que una de las condiciones del ensayo cambie. Esto incluirá la preparación de reactivos nuevos III. OBJETIVOS

Conocer e interpretar un espectro de absorción Aprender a construir una curva de calibración

IV. MATERIALES Papel milimetrado Lápiz

V. DETERMIMACION DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIONA partir de la solución stock de azul de bromo fenol y anaranjado de metilo se prepara una solución diluida de 1:25.Se fija el instrumento a una transmisión de 100q% con agua destilada.La solución diluida de colorante 1:25 debe dar una lectura de aproximadamente en 30-40%Seleccionar una longitud de onda para cada colorante: 580Mu para el azul de bromo fenol; 460Mu para el anaranjado de metilo.Para determinar el espectro de absorción del azul de bromo fenol se debe leer las absorbancias usando la muestra diluida (1:25)Se emplea el agua para fijar el instrumento a una transmisión de 100%.El agua se utiliza cada vez que se lee las absorbancias a las distintas longitudes de ondaLeer la muestra diluida de azul de bromo fenol diluido (1:25) a las siguientes longitudes de ondaRepresentar gráficamente las longitudes de onda (abscisas) en función de las absorbancias (ordenada) trazando una curva suave que una todos los puntos. Indicar el punto de máxima de absorción.

VI. RESULTADOS

LONGITUD DE ONDA

LECTURA DE ABSORVANCIAS

400 mu 0,03430 mu 0,05520 mu 0,26570 mu 0,38620 mu 0,14700 mu 0,01


PRACTICA Nº 02EXAMEN BIOQUIMICO DE ORINA PATOLÓGICA

ANLISIS: cualitativoDESCRIPCION: visual-olfativo

I. INTRODUCCIONLa orina es un liquido muy complejo formado por 95% de agua y 5% de sólidos, constituye el producto final realizado por millones de células del sistema renal y urinario del metabolismo y tiene un gasto promedio de 1 a 1.5 litros de orina por día, que depende de la ingestión de líquidos. A través de la orinase excretan una gran variedad de productos metabólicos de desecho. La orina contiene miles de sustancias disueltas, aunque las 3 principales son agua, urea y cloruro desodio. Se excretan más sólidos a través de la orina que por cualquier otra vía, la composición de la orina depende en gran parte de la calidad y cantidad de material excretado. Algunos componentes de la sangre, como al glucosa, tiene un umbral renal, esto es, que deben alcanzar un nivel en la sangre antes de que cada sustancia sea excretada en la orina

CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE LA ORINA

COLOR En un individuo sano, la intensidad del color dependerá de la cantidad de la orina emitida. El color va desde el amarillo claro hasta el amarillo oscuro en función de su concentración. Cuando la orina está muy concentrada el color se oscurece, mientras que será más claro cuando está menos concentrada como consecuencia del exceso de agua. Es clara cuando se encuentra recién emitida y puede hacerse turbia por la formación de depósitos de fosfatos, oxalatos o uratos. El color de la orina puede ser clave para identificar una enfermedad más rápidamente, pero además hay una serie de signos que nos pueden revelar muchos datos como son alguno de los siguientes: Espuma: sugiere la presencia de proteinuria. Pus: se


denomina piuria. Orina lechosa: donde hay presencia de gran cantidad de grasa. Puede ser debido a una concentración elevada de colesterol y triglicéridos por un síndrome nefrótico o fractura ósea, denominándose lipiduria, es decir, concentración de lípidos en orina. Presencia de moco. Linfa: la presencia de linfa en la orina es muy extraña de encontrarla y se denomina quiluria

II. MARCO TEORICO

El análisis de la orina comienza con su inspección visual, para comprobar si a simple vista se observan cálculos, hematuria, coloración oscura o coluria por eliminación excesiva de Urobilinógeno, aspecto claro o turbio de la orina, lo que facilita, el diagnóstico de infección urinaria.

Mediante el análisis elemental de la orina puede saberse si existe o no glucosa en ella, su densidad y pH, el exceso de cuerpos cetónicos, iones en orina, la existencia de células, pus o bacterias, bilirrubina y urobilinógeno excesivos, la presencia o ausencia de proteínas, así como la detección de sustancias diversas (cannabis, heroína, cocaína, benzodiacepinas y otros fármacos).

En condiciones normales no debe haber glucosa en la orina. Aunque una pequeña parte de la población elimina glucosa con la orina sin padecer ningún trastorno,si aparece suele indicar que es muy elevado el nivel de glucosa en la sangre, por lo que interesa especialmente en el diagnóstico de la diabetes, intolerancia hidrocarbonada y algunas alteraciones renales.

La densidad de la orina debe estar entre 1003 y 1030. Su pH debe ser de entre 4,6 y 8 según la dieta: si aumenta, la orina se hace más básica y facilita la infección por algunos microorganismos y la formación de cálculos. Si hay un exceso de cuerpos cetónicos, posiblemente se deba a una cetoacidosis, diabética en la mayoría de los casos. Cuantificar los iones sodio y potasio sirve para conocer si la persona toma diuréticos.

Si aparecen glóbulos rojos en la orina, visibles al microscopio o a simple vista, más que tratar los síntomas a nivel local debe buscarse las causas, Podemos encontrarnos ante una hematuria en estos casos: Nefropatía, cálculos, procesos infecciosos, quistes renales, hidronefrosis, traumatismos, etc.La existencia de pus en orina, es patológica, se conoce como piuria, y obliga a pensar en infección del tracto urinario.Existe leucocituria si la cifra de leucocitos en orina es mayor de 2000 células. Puede ser debida a un proceso inflamatorio, causado a su vez por un proceso infeccioso o por una enfermedad inflamatoria, ante una cifra


alta de leucocitos, solicita un cultivo de orina, para comprobar si hay o no infección, y si éstos son positivos, pondremos el tratamiento oportuno. Sin embargo si los cultivos son negativos, hay que investigar la posibilidad de una enfermedad inflamatoria o de una infección no bacteriana

III. OBJETIVOS

IV. Analizar una muestra de orina patológica Mediante ensayos sencillos.

V. Analizar una muestra de orina patológica Mediante ensayos sencillos.


VI. Analizar una muestra de orina patológica Mediante ensayos sencillos.

Analizar una muestra de orina patológica Mediante ensayos sencillos.

Determinar la acides en una muestra de orina

VII. MATERIALES Y METODO MATERIALES Tubos de ensayos Tiras reactivas Mechero Gradilla Pinza Matraz erlenmeyer Pipetas

REACTIVOS Reactivo de Fehling Azufre

VIII. PROCEDIMIENTOPrimero se hace un análisis visual y olfativo de la muestra de orina:

*Color: amarillo ámbar*Turbidez: la muestra de orina se presentaba muy turbia.*Olor: amoniacal (olor intenso)


Para análisis de sustancias eliminadas por la orina

1. Para hacer el análisis de las sustancias eliminadas por la orina se utilizará la tira reactiva.

2. En un tubo de ensayo, se agrega la orina y luego colocamos la tira reactiva dejamos unos segundos y luego la retiramos para observar y comparar la tira con la leyenda.

3. Se colocará lo siguiente dependiendo el resultado

o (+)………………………. De baja cantidad

o (+)(+)……………………. En cantidades regulares

o (+)(+)(+)………………… en grandes cantidades

Leucocitos……………..(+) Nitratos……………… ---


Urobilinógeno:………...(+) Proteínas……………... (+) Ph……………………. --- Sangre……………….. --- Gravedad especifica… (+)(+) Cetona………………. --- Bilirrubina…………... (+) Glucosa……………..... (+)

IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA ( PRUEBA FEHLING)Otros métodos para la determinación de glucosa en orina:

o Método de benedict:o nylandero tiras reactivas.

FUNDAMENTO

El ensayo con el licor de Fehling se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo de un aldehído. Éste se oxida a un ácido carboxílico y reduce la sal de cobre (II) en medio alcalino a óxido de cobre(I), que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el licor de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice que es un azúcar reductor.

Esta reacción se produce en medio alcalino fuerte, por lo que algunos compuestos no reductores pueden enolizarse dando lugar a un falso positivo

MUESTRA 1:

Para identificar si hay presencia de glucosa se procede a hacer la prueba.

1. En un tubo de ensayo colocamos 5ml de reactivo fehling junto con la orina que se va a analizar, se pone a calentar la muestra hasta que esta ebulla

https://es.wikipedia.org/wiki/Enol

https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%93xido_de_cobre_(I)

https://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar

https://es.wikipedia.org/wiki/Precipitado

https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%93xido_de_cobre(I)

https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%93xido_de_cobre(I)

https://es.wikipedia.org/wiki/Alcalino

https://es.wikipedia.org/wiki/Sal_(qu%C3%ADmica)

https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_carbox%C3%ADlico

https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_carbox%C3%ADlico

https://es.wikipedia.org/wiki/Aldeh%C3%ADdo

https://es.wikipedia.org/wiki/Carbonilo


2. Observamos que el azul mantiene su misma coloración

MUESTRA 2:Para identificar si hay presencia de glucosa se procede a hacer la prueba.

1. En un tubo de ensayo colocamos 5ml de reactivo fehling junto con la orina que se va a analizar, se pone a calentar la muestra hasta que esta ebulla.


2. Observamos que el azul se torno rojo (+)(+)(+)

IDENTIFICACION DE SALES BILIARESMUESTRA 1:

1. En un tubo de ensayo se agrega 1gr, de azufre, junto a la orina la cantidad de ¾

del tubo.2. Observamos que el azufre se mantiene

en la superficie, lo que indica que no hay presencia de patógenos.

Nota: la reacción que se produce entre la glucosa y el reactivo fehling es una reacción redox


IX. RESULTADOS

IDENTIFICACION DE GLUCOSALa prueba de fehling será positiva si aparece un precipitado, en función del cual nos indicará si existe más o menos cantidad de glucosa.

o Si aparece un precipitado amarillo se considera +, o si el color que aparece es amarillo-anaranjado, se considerará

++o y, por último, habrá +++ cuando el precipitado sea rojo.

1. MUESTRA 1:Al realizar la prueba apareció un precipitado de color rojo por lo que resulta tener alto contenido de glucosa (+)(+)(+).

2. MUESTRA 2:Al realizar el segundo análisis no

se vio un precipitado (la coloración no cambia se mantiene en azul).


IDENTIFICACIÓN DE SALES BILIARES:

X. DISCUCIONES

XI. CONCLUSIONESLa orina patológica: Aspecto:

o La orina que analizamos tubo una turbidez intensa ( patólogica)o La turbidez se presenta como resultado de infecciones urinariaso La orina también se enturbia por la presencia de eritrocitos, leucocitos y bacterias.


PRACTICA Nº 03AISLAMIENTO DE CASEINA

I. INTRODUCCION:

II.MARCO TERORICO:La caseína es un conjunto heterogéneo de proteínas por lo que es difícil fijar una definición, sin embargo todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común que precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4.6 por ello a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche.

A este pH (4,6), la caseína precipita, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares. A diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor. Precipita bajo la acción de la renina (enzima proteolítica presente en el estómago de terneros) para formar la paracaseína. Al precipitar por acción de ácidos se le llama caseína ácida. Este precipitado blanco forma la base para la elaboración de todo tipo de quesos. La secuencia peptídica de la caseína contiene un número inusual de residuos de prolina (Ca. 15%). Como resultado, es relativamente hidrofóbica (poco soluble en agua) y carece de estructura secundaria o terciaria definidas. En la leche se encuentra como suspensión de partículas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeñas esferas hidrofílicas en el exterior e hidrofóbicas en el interior). Estas micelas de caseína se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofóbicas.

La caseína es una proteína de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico, por lo tanto su molécula contiene un elemento fósforo. La caseína representa cerca del 77 al 82 por ciento de las proteínas presentes en la leche y el 2.7 por ciento en la composición de la leche líquida.Cuando coagula con renina, es llamada paracaseína, y cuando coagula a través de la reducción del pH es llamada caseína ácida. Cuando no está coagulada se le llama caseinógeno.La caseína es un sólido blanco-amarillento, sin sabor ni olor, insoluble en agua. Se dispersa bien en un medio alcalino, como una solución acuosa de hidróxido de sodio: NaOH, formando caseinatos de sodio.

La reacción de Biuret es un procedimiento utilizado para identificar la presencia de proteínas en una mezcla. La reacción debe su nombre al


biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina de NaOH o KOH. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta (cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas), debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

PUNTO ISOELÉCTRICO.Todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.Las proteínas tienen un pH característico, en donde su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que las proteínas presenta su máxima posibilidad para ser precipitadas al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.

III. OBJETIVOS: Aislar la proteína caseína de la leche de vaca, aprovechando el

punto isoeléctrico de dicha proteína. Determinar la concentración de proteínas en la leche Determinar el pH. Determinar la densidad de la leche.

IV. MATERIALES Y METODOS: MATERIALES:

vasos de precipitación pipetas buretas soporte universal tiras reactivas para determinar pH(0-7) lactodensímetro

REACTIVOS:


Fenolftaleína Formol neutro NaOH 0,1N Leche fresca Cultivo Pastilla para cuajar

V. PROCEDIMEINTOS

1. AISLAMIENTO DE CASEINA

Utilizamos formol neutro para el aislamiento de caseína. Se preparan 2 muestras en un matraz 20ml cada una.

2. CALCULO DE PH

FUNDAMENTO:La leche de vaca recién ordeñada y sana, es ligeramente ácida, con un pH comprendido entre 6,5 y 6,8 como consecuencia de la presencia de caseínas, aniones fosfórico y cítrico, principalmente. Estos valores se aplican solamente a temperaturas cercanas a 25ºC

PROCEDIMIENTO: Colocamos la leche en un vaso de precipitación. Colocar la tira reactiva para cálculo de pH dentro del vaso de

precipitación. Observamos la coloración en la tira y la comparamos con el

de la leyenda para así determinar el pH de la leche.


3. CALCULO DE ACIDEZ

FUNDAMENTO

Los valores normales de acidez titulable en leche están comprendidos entre 16°D y 19°D (grados Dornic) que expresado en porcentaje del ácido mayoritario serían 0.16-0.19% de ácido láctico. Las alteraciones en la leche durante la síntesis o almacenamiento pueden originar cambios en la acidez. Además, determinadas adulteraciones hacen variar estos valores: el aguado la rebaja, el desnatado y adición de suero no la modifican y la neutralización la rebaja considerablemente. Aunque existen diferentes modos de expresar la acidez la forma más habitual de expresión son los grados Dornic (ºD) y el procentaje de ácido láctico.PROCEDIEMIENTO: Se toma los 20 ml de leche (de la muestra que aislamos la

caseína anteriormente) y se agrega 3 gotas de fenolftaleína. Luego procedemos a titular con NaOH 0.1 N., observar el

viraje y anotar el volumen gastado de NaOH. Calculamos el porcentaje de acidez, y para ello utilizamos la

siguiente formula.

Acidez = Vgastado x NaOH x K x 100 Vtotal

MUESTRA 1:

Volumen gastado: 4.4ml Realizamos los cálculos

Acidez = 4.4 x 0.1N x 0.09 x 100 20ml

Acidez = 0.198%

MUESTRA 2:

Volumen gastado: 3.1ml Realizamos los cálculos

Acidez = 3.1ml x 0.1N x 0.09 x 100 20ml

Acidez = 0.14%


4. CALCULO DE PROTEINAS ( METODO DE SORENSEN – WALKER)

FUNDAMENTO

Está técnica determina el contenido en proteínas de la leche mediante una valoración ácido-base, ya que tras la adición de formol a la muestra, el formaldehido se une a los grupos amino de los aminoácidos de las proteínas dejando los grupos carboxilos libres. Este hecho produce cambios en la acidez titulable de la leche siendo valorada con hidróxido sódico. La cantidad de hidróxido sódico utilizado en la neutralización es utilizado para calcular la cantidad de proteínas presente en la muestra.

PROCEDIMIENTO:

Tomar 20 mL de leche en un matraz erlenmeyer. Adicionar unas gotas de fenolftaleína.

Neutralizar la acidez titulable natural de la leche con la solución de hidróxido sódico hasta la aparición de un color rosa.

Añadir posteriormente a la leche neutralizada 4 mL de formol para dejar libres los grupos carboxilos de los aminoácidos. Tras la adición del formol la muestra se vuelve a acidificar y se muestra nuevamente de color blanco. Añadir unas gotas de fenolftaleína y valorar la acidez con

hidróxido sódico, hasta la aparición nuevamente del color rosa.

MUESTRA 1:

Volumen gastado NaOH : 2.3ml

Proteinas = 2.3ml x 0.1909 x 5 Proteinas = 2.20

Proteínas = Vgastado x K x 5

MUESTRA 2:

Volumen gastado NaOH : 2.1ml

Proteinas = 2.1ml x 0.1909 x 5 Proteinas = 2. 0

Proteínas = Vgastado x K x 5


5. CALCULO DE DENSIDAD: (TECNICA DEL LACTODENSIMETRO)

FUNDAMENTO


La densidad es una propiedad física utilizada para comparar las masas de diferentes sustancias o de una misma bajo diferentes condiciones. En la densidad de la leche influyen todos los constituyentes normales, así como todas aquellas sustancias extrañas que se adicionan de forma fraudulenta, tanto sólidos como líquidos. Existen muchas causas que actúan variando la densidad de la leche, como son la composición química, la temperatura de medición, la temperatura de almacenamiento, el tiempo transcurrido desde el ordeño, el ordeño fraccionado, la centrifugación y otras operaciones tecnológicas. Así, la densidad depende no sólo, de la temperatura del momento de la determinación, sino también de las temperaturas anteriores, y además este parámetro adquiere su valor más bajo poco después del ordeño, aumentando después lentamente. Por ello la temperatura a que ha estado sometida la muestra de leche influye muy ligeramente en el resultado final.

Para la determinación de la densidad de la leche vamos a utilizar la técnica de lactodensimetría. Los lactodensímetros son aerómetros, cuerpos flotadores de vidrio lastrados en su parte inferior con varilla graduada, y que en ocasiones pueden llevar incorporado un termómetro, permitiendo la lectura paralela de la densidad. Y la temperatura. Cuando el aerómetro se introduce en la leche sufre un impulso hacia arriba igual al peso del líquido desaloja, quedando el valor de densidad reflejado en la varilla graduada.

PROCEDIMIENTO: Llenamos la probeta con la leche Medimos la temperatura de la leche (se encontró a 25ºC) Introducimos con cuidado el lactodensímetro en la leche manteniendo

el aparato en el eje de la probeta y provocar un ligero movimiento de rotación.

Esperamos a que se estabilice y realizamos la lectura de la densidad. El valor que obtuvimos fue de 0.027, pero se le suma uno al este valor

por lo tanto el valor de la densidad seria 1.027.


VI. RESULTADOS:

CALCULO DE ACIDEZ

o La leche fresca tiene normalmente de 16-19°Dornic lo que en porcentaje seria 0.16 – 0.19

o Una acidez inferior a 16°D son sospechosas de aguado, neutralización, o de proceder de vacas con mamitis.

o Valores de acidez superior a 19°D son imputables a leches de más de 10 horas (ordeño de la noche) o y valores superiores a 23°D corresponden a leches muy ácidas

que han perdido la estabilidad térmica por lo que no podrían pasterizarse y/o esterilizarse, ya que se produciría una coagulación.

MUESTRA 1: El resultado que se obtuvo al realizar la prueba de acidez

fue 0.198% lo que nos indica que leche utilizada para esta prueba si esta dentro del rango aceptable como se explica en el fundamento presentado anteriormente.

MUESTRA 2:Al realizar el análisis para la segunda muestra de leche se obtuvo el siguiente resultado; 0.14%, lo que vendría a ser un nivel muy bajo de acidez, por lo que se concluimos que la leche fue adulterada.

CALCULO DE pH: MUESTRA 1: Para la muestra 1 el valor del pH fue de 5

MUESTRA 2: Para la muestra 2 el valor de pH fue de 6


CALCULO DE PROTEINAS:

Las proteínas normales en la leche están en un rango de 2,8 – 3.4 MUESTRA1:

El resultado que obtuvimos para la primera muestra fue 2.2, un rango muy bajo en el contenido de proteínas en la leche, y esto se debe a distintos factores (adulteración de la leche, etc)

MUESTRA 2:El resultado que se obtuvo en esta muestra fue 2,0; por lo tanto el contenido de proteínas de la muestra 2 es relativamente bajo, y esto también se debe a que la leche pudo ser adulterada.

CALCULO DE DENSIDAD:

La densidad varía según el tipo de leche.

o Para la leche de vaca oscila entre 1.028 y 1.042, siendo el valor medio de 1.031.

o Las adulteraciones influyen sobre el valor de la densidad. Así el aguado la rebaja, el desnatado y la adición de leche desnatada la aumentan. Sin embargo la densidad de la leche permanece invariable si la leche es aguada con soluciones preparadas que tengan la misma densidad o es aguada y desnatada al mismo tiempo.

MUESTRA1:Al realizar la prueba para esta muestra obtuvimos un valor de 1.027.

VII. DISCUSIONES:

VIII.CONCLUSIONES Podemos concluir que las diferentes pruebas químicas empleadas

en la leche, nos ayudan a conocer la composición química, determinar la calidad de la leche, si ha sufrido alteraciones y si pueden ser utilizadas para el consumo humano.


Cada prueba es importante ya que determina varios factores que pueden alterar la calidad de la leche como son, la acidez, pH, proteínas entre otras.

Todas las pruebas empleadas son diferentes, ya que todo depende del método utilizado para la determinación de las pruebas ya mencionadas.

PRACTICA Nº 05: DETERMINACIÓN DEL SISTEMA REDOX -

DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA CI. INTRODUCCIÓN:


Las vitaminas son compuestos orgánicos sencillos que nos sirven como combustible metabólico. Son indispensables para el mantenimiento de la vida, actuando en biocatalizadores en gran cantidad de reacciones bioquímicas ya que las vitaminas suelen ser coenzimas o componentes de coenzimas.Son producidas por vegetales y microorganismos. Los animales y, en especial el hombre, no suelen sintetizarlas o, si lo hacen, es en cantidades insuficientes.Los seres vivos necesitan ciertas cantidades diarias de cada vitamina y cualquier alteración de4 estos límites origina trastornos de los procesos metabólicos, que pueden derivar de tres tipos de alteraciones: si la carencia es total (avitaminosis), si la insuficiencia o carencia es parcial (hipovitaminosis); si existe un exceso de vitaminas (hipervitaminosis).Las vitaminas son sustancias que se alteran con facilidad, resisten mal a los cambios de temperatura y los almacenamientos prolongados. Comprenden un gran número de moléculas, que se han desglosado en dos grupos: vitaminas liposolubles, de naturaleza lipídica (vitaminas A, D, E y K) y vitaminas hidrosolubles(C, H-biotina- y las vitaminas del complejo).

II. MARCO TEORICOEl enantiómero L del acido ascórbico, también conocido como vitamina C, es un acido orgánico y un antioxidante perteneciente al grupo de vitaminas hidrosolubles. No se sintetiza en el organismo, por lo cual tiene que ser aportada en la dieta. Se encuentra, principalmente en verduras y frutas frescas y en zumos de cítricos. La mayoría de las especies de animales y vegetales sintetizan su propia vitamina C; por lo cual no constituye una vitamina para ellos. La síntesis se realiza en etapas catalizadas por cuatro enzimas que convierten la glucosa en acido ascórbico.Se considera que las necesidades diarias de acido ascórbico para un adulto no exceden de los 60mg y que las cantidades superiores a las 3 g diarios causan acidificación de la orina e incrementa el consiguiente riesgo de cálculos urinarios.

Ácido ascórbico (C6H8O6) El acido ascórbico y sus sales de sodio, potasio y calcio (ascorbatos minerales) son solubles en agua por lo que no protegen a las grasas de la oxidación. Los ascorbatos minerales se preparan a partir de reacción del acido con los respectivos carbonatos y bicarbonatos de calcio, magnesio, potasio y sodio,


Los ascorbatos minerales pueden ser mejor tolerados que la vitamina en su forma acida. El ascorbato actúa como antioxidante debido a que su oxidación es menos energética que a de las otras especies.Las especies oxidantes, tales como el radical hidroxilo formado a partir de peróxido de hidrógeno, contienen un electrón no apareado que las hace extremadamente reactivas y dañinas a nivel molecular, tanto para el ser humano como para las plantas.Esto se debe a su interacción con ácidos nucleicos, las proteínas y los lípidos. Las especies oxidantes con oxígenos reactivos pueden abstraer un átomo de hidrogeno del ascorbato, que se convierte en monodeshiroascorbato que inmediatamente pierde otro electrón para convertirse en deshidroascorbato.

III. OBJETIVOS:

Objetivo general

Determinar el contenido de acido ascórbico (vitamina C) en zumos de frutas cítricas y

comparar el contenido de dicha vitamina en bebidas comerciales que dicen ser

enriquecidas con la misma.

IV. MATERIALES Y METODOS: MATERIALES:

probeta matraz erlenmeyer tubos de ensayo gradilla zumos de fruta

V. PROCEDIEMIENTO: PASO 1:1. En un tubo de ensayo se vierten 1 ml. de zumo de fruta.2. Posteriormente se titula añadiendo gotas de diclorofenol-indofenol

que se encuentra en la bureta y observamos el cambio de coloración que pasa del azul-oscuro a rosa pálido acabando prácticamente incoloro.

3. Seguir añadiendo gotas hasta que el color rosado se mantenga


4. Anotamos el volumen gastado. (el volumen gastado nos dará idea de la cantidad de vitamina C que contiene cada una de las frutas que se está analizando)

5. Repetir el mismo proceso con cada una de las muestras


EXPLICACION: La causa de ésta pérdida de color se debe a que los átomos de hidrógeno de los carbonos unidos por un doble enlace se eliminan, oxidada de la vitamina, actuando el diclorofenol -indofenol como dador de electrones (hidrógenos) y dando la forma reducida de colorante transformándose-n ácido de-hidro-ascórbico que es la forma.

VI. RESULTADOS:

Gasto en la titulación: Zumo de naranja: 1.1ml Cifrut de naranja: 0.4ml Cifrut de granadilla: 0.3ml Zumo de lima: --- Zumo de limón: 0.7ml

Jugo de fruta

Solución Cambio de color

(azul a rosa palido)

Nro de gotas

ml

Lima 2ml zumo/ 9 ml de agua destilada

NO ______ ______

Limón 1ml zumo/ 9 ml de agua destilada

SI 13 gotas 0.7 ml

Cifrut de granadill

a

1ml zumo/ 9 ml de agua destilada

SI 5 gotas 0.3 ml

Naranja 1ml zumo/ 9 ml de agua destilada

SI 17 gotas 1.1 ml

Cifrut de naranja

1ml zumo/ 9ml de agua destilada

SI 7 gotas 0.4ml

Ahora se procederá a hacer los respectivos cálculos para ver cuál de todos los cítricos tiene más vitamina C. para ello se utilizará la siguiente formula

Vgastado x K x 100 = %vitamina C 1ml


Donde:Vgastado: es el volumen gastado en la titulaciónK: constante de cítricos1ml: esto es en relación al valor de jugo del cítrico utilizado en el tubo de ensayo

Zumo de naranja: 1.1x 0.088 x 100 = %vitamina C 1ml 9.68 = %vitamina C

Bebida comercial (cifrut naranja) 0.4 x 0.088 x 100 = %vitamina C 1ml 3.52 = %vitamina C

Bebida comercial (cifrut de granadilla) 0.7 x 0.088 x 100 = %vitamina C 1ml

VI.16 = %vitamina C

Zumo de lima:

No se pudo determinar ya que el zumo de lima no reacciono con 2-6 diclorofenol.


Zumo de limón: 0.7 x 0.088 x 100 = %vitamina C 1ml 6.16 = %vitamina

VII. DISCUSION:

VIII. CONCLUSIONES:

Con la experiencia llegamos a la conclusión de que notablemente el zumo de frutas con mayor cantidad de vitamina C de los zumos de diferentes frutas utilizadas es la naranja con un porcentaje de 9.68 %, lo que nos hace llegar a la conclusión de que no influye la acides de la fruta para la determinación de contenido de Vitamina C.

El contenido de ácido ascórbico (vitamina C) en los jugos de frutas puede variar por pérdidas durante el procesado y almacenamiento.

La determinación del ácido ascórbico nos permite inferir sobre el valor nutritivo del alimento.

A diferencia de otras vitaminas el humano no sintetiza vitamina C y tenemos que tomarlas de frutas principalmente, ya que es necesario para el ser humano, se necesita 60mg diarios en adultos.

El método por titulación visual con 2,6 diclorofenol indofenol es un método rápido y seguro para determinar el porcentaje de ácido ascórbico (vitamina C) en los zumos de frutas.

practica nº bioquimica

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