PRCTICA 33

Microbiologa de los Alimentos y CC.

M. Sc. Csar Julio Cceda Quiroz

PRACTICA N 33

ANALISIS MICROBIOLGICO DE PESCADOS Y DERIVADOSI.INTRODUCCIN

El pescado es un alimento proteico muy putrescible y que no puede conservarse refrigerados durante mucho tiempo. La carne lleva vitaminas B12, riboflavina, cido pantotnico, flico, inacciona y piridoxina. Los pescados grasos adems contienen vitaminas A y D, minerales. El contenido graso vara con la especie y est constituida por triglicridos y fosfolpidos, es pobre en hidratos de carbono. (Pascual, 1999)

En el caso e pescado fresco no suele haber justificacin para un anlisis microbiolgico.A no ser en casos muy concretos y por razones determinadas y especficas debido a que:

Tienen un plazo de comercializacin muy corto, dada su fcil alteracin; este plazo seria ms breve que el tiempo necesario para efectuar el anlisis. (Pascual, 1999)

El pescado capturado en el mar, cuando se vende fresco, no suele estar contaminado con los microorganismos que, habitualmente, reflejan el estado higinico sanitario de los alimentos.

De aqu que los criterios microbiolgicos utilizados en microbiologa alimentara no se adapten al pescado fresco. Por el contrario, es de la mayor utilidad valorar el estado de frescura de estos productos, mediante la inspeccin de los caracteres organolpticos: aspecto, olor, rigidez, piel, escamas, ojo, branquias, ano, vsceras y carne. (Pascual, 1999)

Es distinta la manera de proceder como el pescado transformado: troceado; picado, fileteados, etc., que por las manipulaciones que sufre, puede ser contaminado con microorganismos que, este caso, reflejara su estado higinico-sanitario, por lo que requiere una vigilancia mediante el uso de criterios sanitarios. De igual modo, se controlara el pescado fresco destinado a la congelacin.

En la calidad microbiolgica del pescado y derivados hay que considerar 2 aspectos importantes: el Sanitario y el Econmico. (Pascual, 1999)En el Aspecto Sanitario del pescado presentan riesgos de distinta consideracin para el consumidor, de acuerdo con su naturaleza, hbitat y transformaciones que sufren posteriormente a su captura. Es evidente que el hombre debe estar protegido de estos riesgos mediante el control de la presencia de microorganismos patgenos o sus toxinas.

En el Aspecto econmico, es claro que los pescados son productos perecederos que se alteran fcilmente. Su alteracin se debe a la presencia de una flora saprofita que no presenta riesgos desde el punto de vista sanitario, pero que es responsable de prdidas econmica. (Pascual, 1999)

En estos casos, los recuentos y determinaciones microbiolgicas serian:

Recuento de colonias psicrotrficas (17C3 C).

Investigacin y recuento de Escherichia coli. .(Ver practica N15 ) Investigacin de Salmonella. .(Ver practica N16 ) Investigacin y recuento de Clostridium perfringens. .(Ver practica N 6) Investigacin y recuento de St. aureus enterotoxigenico.(Ver practica N12 )II.OBJETIVOS:

Determinar la calidad microbiolgica del pescado y derivados.

III.MATERIAL Y MTODOS:a. Biolgico:b. Materiales de laboratorio: los de uso comn en el laboratorioc. Medio de cultivo y reactivo Material: Diluyente (Triptona), Cloruro sdico, Agua destilada Solucin Ringer , Medio Agar King ,Agar GSP (Selectivo para Pseudomonas y Aeromonas)IV. TECNICA (Pascual, 1999)a.PREPARACION DE LA MUESTRA

Piel.

Elegir la zona media del cuerpo, midiendo la superficie que se vaya a tomar. Aspticamente, extraer la piel con mnimo de carne. La muestra se introduce en un tubo con tapn de rosca que contenga 10 ml de solucin Ringer y un poco de arena estril. Llevar al Stomacher durante 2 minutos Hacer diluciones.Carne

Tomar aspticamente, un trozo de tejido sin piel, para evitar contaminacin. Diez gramos de carne se maceran en 90 ml de solucin de Ringer durante 5 min. Llevar al Stomacher durante 1 minuto. Hacer diluciones.Branquias

Con material estril, se toma un trozo de branquia y se opera como en el caso de la piel. Hacer diluciones decimales.

Contenido Intestinal

Aspticamente ligar el intestino en sus extremos con pinzas y extraer en el contenido intestinal del asa. Las heces extradas se depositan en un tubo con tampn de rosca y con 10 ml de solucin de Ringer. Homogeneizar en Stomacher durante 1-2 minutos. Hacer diluciones..

b.PREPARACION DE DILUCIONES DECIMALES

Las preparaciones de las diluciones decimales a partir de una muestra tiene por objeto efectuar diluciones progresivas de dicha muestra, para poder recuentos microbianos posteriores.

Pesar, aspticamente, una porcin representativa de la muestra analtica. La cifra de pesada obtenido se multiplica por 9 y el resultado dar el volumen en mililitros de diluyente (TW) que es necesario aadir para obtener la dilucin 1:10. Esta mezcla, homogenizada y/o triturada en triturador homogenizador o triturador de paletas (Stomacher), constituye la suspensin madre y primera dilucin de la serie (1:10) A un tubo que contenga 9ml de agua de TW se transfiere 1ml de la suspensin madre. Mezclar 30 segundos en agitador excntrico. As se obtiene la dilucin 1:100. Desechar la pipeta usada. De la mezcla anterior, y con nueva pipeta estril, se incorpora un mililitro a otro tubo que tenga 9 ml de agua tristona estril (TW). Mezclar 30 segundos en agitador excntrico. As se obtiene la dilucin 1:1000. Desechar la pipeta usada y repetir la operacin en varios tubos, hasta lograr las diluciones deseadas. De esta forma se obtiene la serie de diluciones decimales (10-1 ;10-2 ; 10-3 ; etc.), que servir para iniciar las determinaciones en las que sea necesario obtener recuentos. Los tubos de la serie se mantendrn en frigorfico hasta el comienzo del anlisis, el cual, aun en condiciones de refrigeracin, no debern demorarse ms de dos horas a partir del momento en que se haya preparado la serie de diluciones decimales.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS PSICROTRFICOS: (PASCUAL 1998)Tcnica:

Antes de describir la tcnica hay que decir que se puede utilizar cualquier medio de los que se emplea para el recuento total de aerbios, siempre que la incubacin se realice a 5 C durante 7 a 10 das.

A partir de la serie de diluciones decimales utilizando como diluyente solucin Ringer 1/4, se siembra por duplicado, 0.1 ml de cada dilucin, sobre la superficie bien seca de placas Petri con Agar King y /o Agar GSP. Diseminar cuidadosamente con asa de vidrio estril.

Incubar a 17 C durante 5 das, finalizar la incubacin, se cuentan en las placas de ambos medios, las colonias no puntiformes que hayan crecido. El nmero se multiplica por factor de dilucin de la placa elegida para el recuento. Esta cifra corresponde a 0,1 ml. que al ser multiplicada por 10 da el recuento total de microorganismos psicrotrficos por gramo o ml. del alimento en estudio.

Recuento de microorganismos halotolerantes: La proporcin de sal del Agar de recuento ser 5 g por 100 ml. La incubacin en estufa a 17 3 C durante 5 dasINVESTIGACIN DE E. coliMTODO: CON CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y CONFIRMACIN EN MEDIO SLIDO. (ICMSF) Pesar 25gramos y adicionar a un vaso de homogenizacin y aadir 225ml de diluyente (agua peptonada o agua triptonada).

Realizar diluciones al 1:10, 1:100, 1: 1000, seguir el protocolo microbiolgico. Pipetear 1ml de cada dilucin del homogeneizado de alimento en tubos de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante, utilizando tres tubos por cada dilucin.

Incubar los tubos a 35-37 C durante 24-48 horas.

Pasadas las 24 horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas. Volver a la estufa los tubos gas negativos para su incubacin durante 24 horas ms.

Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestran produccin de gas.

Escoger los tubos para las pruebas de confirmacin y para la determinacin del NMP como se ya se indico en practicas anteriores.

Confirmar los tubos gas positivos de caldo lactosa bilis (2%) , verde brillante seleccionados en el punto anterior, sembrando por estras un asa de cada uno de ellos en Agar Bilis lactosa rojo neutro cristal violeta o Agar Endo . Incubar las placas a 35-37 C. Examinar las placas de Agar bilis lactosa rojo neutro cristal violeta despus de 24 horas y las de Agar Endo despus de 48 horas. La presencia de organismos coliformes se confirma por el crecimiento en el primero de estos medios de colonias de color rojo oscuro con dimetro mayor de 5 mm y en Agar Endo por la formacin de colonias rojas rodeadas por un halo tambin rojo.

Anotar el nmero de tubos confirmados en cada dilucin como positivos de coliformes.

Calcular el NMP de coliformes.

INVESTIGACIN DE Salmonella-Shigella Dentro de la sistemtica analtica para el aislamiento e identificacin del gnero Salmonella se utilizan, habitualmente varias etapas:

Pre-enriquecimiento en medio liquido no selectivo

Enriquecimiento en medio liquido selectivo

Aislamiento diferencial sobre medios slidos selectivos

Confirmacin bioqumica de las colonias sospechosas

Confirmacin serolgica de las colonias sospechosas

Ver practica N 16INVESTIGACIN DE Staphylococcus aureusVer practica N 12

INVESTIGACIN Y RECUENTO DE Clostridium SULFITO REDUCTORESVer practica N 6V.PROTOCOLO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS PSICROTRFICOS: (PASCUAL 2002)

25 gr de muestra

+

225 ml de diluyente

Ringer 1/4

10

Se homogeniza

Serie de diluciones de Ringer 1/4

Agar King y /o Agar GSP.

10 10 10 -4 Incubar por 17 C durante 5 das

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Hacer lectura

INVESTIGACIN DE Staphylococcus aureus (MTODO DE RECUENTO EN PLACA

INVESTIGACION DE SALMONELLA. ISO 65792002

PROTOCOLOS DE AISLAMIENTO:DE E. coli O157:H7 EN ALIMENTOS (FDA, 2001) RECUENTO EN TUBO ANAEROBIO - SULFITOS REDUCTORES

(PASCUAL 1999)

VIREFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

FRAZIER W. C. Y D. C. WESTHOFF. 1990. Microbiologa de los Alimentos. Tercera Edicin. Edit. Acribia S. A. Zaragoza - Espaa

PASCUAL ANDERSON, Mara del Rosario . 2000. Microbiologa Alimentaria Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas. Edit. Das de Santos S.A. Madrid- Espaa

REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS. 1986. Decreto Supremo N 0014-84 S.P. Ministerio de Salud. I.C.M.S.F. 2000. Los Microorganismos de los Alimentos. Vol. I: Su significado y mtodos de enumeracin. 2a edicin. Editorial Acribia, S.A. - Zaragoza (Espaa).

ADAMS M.R. y MOSS M. O. 1995. Microbiologa de los Alimentos. Editorial Acribia. Zaragoza - Espaa

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