practica 12 identificacion de bacterias x pb micro

7/31/2019 Practica 12 Identificacion de Bacterias x PB Micro

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UNIVERISIDAD NACIONAL AUTNOMA DE

MXICO

FES ZARAGOZAMEDICO CIRUJANO.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIAIDENTIFICACION DE BACTERIAS POR PRUEBAS

BIOQUIMICAS

CABALLERO GONZALEZ ANDREA ALEJANDRACALDERON RAMIREZ MARIANA ITZEL

CASTILLO JAIMES ELSA ATENASCASTILLO MEJIA VALERY LARETHDE LA PEA GUTIERREZ VALERIA

MIGUEL SANTIAGO EDGAR

OCHOA CONTRERAS ERICK CESAR


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OBJETIVO

Identificar losmicroorganismos que

crecieron el los agaresmediante pruebasbioqumicas toando en cuenta

sus caractersticas


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Pruebas

Bioqumicas


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Introduccin

A partir de losmedios selectivosde la practicaanterior se debenrealizar pruebas

bioqumicas parala identificacinde los gneros y

especies aisladas


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IntroduccinLas caractersticas

morfolgicas delas colonias en losmedios de cultivo

selectivos, latincin de Gramaplicada a los

microorganismosinicia ladiferenciacin de

gnero y especie


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IntroduccinLas pruebasbioqumicas son de

vital importancia

para diferenciarentre una especie ygnero patgeno,

de los nopatgenos, pormedio de

reacciones


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Pruebas bioquimicas

Agar TSIAgar LIA

Citrato de SimmonsPrueba catalasa

Caldo ureaMedio mio

Prueba de catalasa


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AGAR TSI


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Medio universalmenteempleado para ladiferenciacin deenterobacterias, en base a lafermentacin de glucosa,

lactosa, sacarosa y a laproduccin de cido

sulfhdrico


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FUNDAMENTO

En el medio de cultivo,el extracto de carne y lapluripeptona, aportanlos nutrientesadecuados para el

desarrollo bacteriano.La lactosa, sacarosa y

glucosa son los hidratos


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El tiosulfato de sodio es elsustrato necesario para la

produccin de cidosulfhdrico, el sulfato dehierro y amonio, es la

fuente de iones Fe3+ , loscuales se combinan con el

cido sulfhdrico y


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El rojo defenol es el

indicadorde pH, y el

cloruro desodiomantiene el

balance


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Por fermentacin de

azcares, se producencidos, que se detectanpor medio del indicadorrojo de fenol, el cual vira alcolor amarillo en medio

cido


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El tiosulfato de sodio sereduce a sulfuro de

hidrgeno el que reaccionaluego con una sal de hierro

proporcionando el tpicosulfuro de hierro de colornegro.


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Formula en gramos por litroExtracto de carne 3.0

Pluripeptona 20.0Cloruro de Sodio 5.0

Lactosa 10.0

Sacarosa 10.0Glucosa 1.0Sulfato de hierro y

amonio

0.2

Tiosulfato de sodio 0.2Rojo de fenol 0.025

Agar 13.0 =


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SiembraA partir de un cultivopuro, sembrar en TSI,picando el fondo yextendiendo sobre lasuperficie del medio.


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IncubacinA 35-37C durante 24horas, en aerobiosis.


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Resultados1-Pico alcalino/fondocido (pico rojo/fondo

amarillo): elmicroorganismo

solamente fermenta laglucosa.


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3-Pico alcalino/fondo alcalino(pico rojo/fondo rojo): el

microorganismo es nofermentador de azcares.

4-La presencia de burbujas, oruptura del medio de cultivo,

indica que el microorganismo


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5-El ennegrecimiento delmedio indica que el

microorganismo producecido sulfhdrico.


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MicroorganisPico /fondo Produccin Produccin


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Microorganismo

Pico /fondo Produccinde gas

Produccinde acidoSulfihidrico

E.coli A/A + -K.pneumoniae

A/A + -

P. mirabilis K/A + +S.typhimurium

K/A - +

S. enteritidisK/A + +

S. flexneri K/A - -

P.aeruginosa

K/K - -


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Agar LIA

A A Li i


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Agar Agar LisinaHierro)

En el medio de cultivo, lapeptona y el extracto de

levadura aportan losnutrientes para el desarrollobacteriano. La glucosa es el

hidrato de carbonofermentable, y la lisina es elsustrato utilizado paradetectar la resencia de las


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Agar LIA

El citrato de hierro y amonio,y el tiosulfato de sodio, sonlos indicadores de laproduccin de cido

sulfhdrico.


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El purpura de bromocresol,es el indicador de pH, el

cual es de color amarillo apH igual o menor a 5.2, yde color violeta a pH igual o

mayor a 6.8.

Es muy utilizado par


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PROCEDIMIENTO

Inocular la cepa haciendouna puncin central hasta

el fondo del tubo y estra ensuperficie.

Se deja incubar a una

temperatura de 37c por 24


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produccin de H2S

prueba positiva :

ennegrecimiento del medio

Prueba negativa: no hayformacin de precipitadonegro


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D i i d l


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Desaminacion de lalisina

Prueba positiva: pico rojizo

Prueba negativa: pico

purpura


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D b il i d


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Descarboxilacion dela lisinaReaccion positiva: Fondo ysuperficie del medio de

color purpura

Reaccion negativa : fondoamarillo


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microorga Color en el Color en Ennegrecimi


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microorganismo

Color en elpico de laflauta

Color enbase deltubo

Ennegrecimiento delmedio

Salmonellatyphimurium

Purpura Purpura Positivo

Salmonellaenteriditis

Purpura Purpura Positivo

Providencia spp.

Rojo Amarillo Negativo

Klebsiella

pnemonia

Purpura Purpura Negativo


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CITRATODE

SIMMONS

CITRATO DE


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CITRATO DESIMMONS

FUNDAMENTOEl citrato de sodio es una sal

acido ctrico, compuestoorgnico simple que se

encuentra como uno de losmetabolitos del ciclo de loscidos tricarboxilicos (ciclo de


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Algunas bacterias puedenobtener energa de fuentes

distintas de lafermentacin de loshidratos de carbono, con elcitrato como nica fuentede carbono.


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La medicin de estacaracterstica es importante

para identificar muchosmiembros de la familia

enterobacteriaceae.


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Cualquier medio usado paradetectar la utilizacin del

citrato por las bacterias quese van a probar, debe carecerde protenas e hidratos de

carbono como fuente decarbono.


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La utilizacin del citrato por labacteria que se va a probar se

detecta en el medio de citratopor la produccin desubproducto alcalinos..


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El medio contiene citratode sodio, que es un anin

como nica fuente decarbono, y fosfato deamonio como nica fuentede nitrgeno


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Las bacterias que pueden utilizarel citrato tambin pueden extraer

nitrgeno de la sal de amonio,con produccin de amoniaco(NH+) lo que produce la

alcalinizacin del medio porconversin del NH +, a hidrxido

de amonio


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.El indicador es el azul debromotimol que es

amarillo por debajo de pH6 y azul por encima de pH7.6


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Fosfato de amoniodihidrgenado

1 g

Fosfato dipotasico 1g

Cloruro de sodio 5gCitrato de sodio 2g

Sulfato de

magnesio

0.20 g

Agar 15 gAzul de

bromotimol

0.08 g


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RESULTADOS

La prueba positiva estarepresentada por la

produccin de color azuloscuro en el termino de 24 a48 hrs, que indica que elorganismo en prueba ha sidocapaz de utilizar el citrato en

el medio con formacin de


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La prueba

tambien debeconsiderarsepositiva sin que


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microorganis citrato Color del


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microorganismo

citrato Color delmedio

Klebsiellapneumoniae

Positovo Azul

S.typhimurium

Positivo Azul

Escherichiacolli

Negativo Verde

s. Flexneri Negativo Verde


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CALDO

UREA


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Es un medio de cultivo en tubos seutiliza para detectar la actividad de la

ureasa, enzima bacteriana quehidroliza a la urea convirtindola en dosmolculas de amonaco que finalmenteforman carbonato de amonio.

CALDO UREA


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Los microorganismos que tiene la

enzima ureasa hidrolizan la urea,liberando amoniaco y produciendoun cambio de color de rojo -

rosado en el medio.


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Extracto deLevadura..................................0.1

Fosfato de Potasio,Monobsico.................9.1Fosfato de Potasio,

Dibsico.......................9.5Urea,Difco...............................................

Frmula Ingredientes

por litro.

i i


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RpidaEjm.:Proteus

mirabilis

Retardada

Ejm.:Klebsiellapneumon

iae

rea positiva


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rea negativa

Ej.:Escherichia coli


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Bacterias urea + rpida: Proteus yProvidencia

Bacterias urea + retardada: Klebsiella,Citrobactery Enterobacter.

Bacterias urea negativa: Escherichia coli,Salmonella, Shigella

PRUEBA DE CATALASA


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PRUEBA DE CATALASA

La catalasa es una enzima quedescompone el perxido dehidrogeno en agua y oxigeno .

Qumicamente es una hemoproteina

de estructura similar a lahemoglobina, salvo por que loscuatro tomos de hierro de sumolcula estn en estado oxidado en

lugar de estado reducido


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Excepto los estreptococos,

la mayora de las bacteriasaerobias y anaerobiasfacultativas tienenactividad catalasa.


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El perxido de hidrogenose forma como uno de

los productos finales de

oxidacin delmetabolismo aerobio de

los hidratos de carbono.


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Si se permite que seacumule, resulta letal para la

clula bacteriana. La catalasaconvierte el perxido dehidrogeno en agua y oxigeno

segn la siguiente reaccin.

R i


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Reaccin

2H2O2 2H2O + O2( BURBUJAS DE GAS)

La prueba de la catalasa se

usa con mucha frecuenciapara diferenciar los miembrosde la familia Micrococos delos miembros de la familia

estreptococos

R ti


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Reactivos

Perxido de hidrogeno al 3%almacenado en frascos colorcaramelo en frio.

Un cultivo de 18 a 24 hrs delmicrorganismo por probar

P di i t


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Procedimiento

perxido de hidrgeno al 3% en un tubode ensayo previamente esterilizadotomamos una asada de la muestra de la

cepa del microrganismo a estudiar

Introducir al tubo de ensayo, la muestra

solamente debe acercarse a la muestra dela solucin liquida de perxido dehidrogeno y debemos observar la reaccinde esta.

Res ltados


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Resultados

La aparicin rpida y sostenida deburbujas o de efervescenciaconstituye una reaccin positiva.

Como algunas bacterias tienenenzimas distintas de la catalasa quepueden descomponer el perxido dehidrogeno la formacin de unaspocas burbujas pequeas despus e20 segundos no se considera unresultado positivo.


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La prueba se considera como positivasi observamos burbujas de

oxgeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp.


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MEDIO MIO

MOVILIDAD INDOL ORNITINA

MEDIO MIO (MOVILIDAD


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MEDIO MIO (MOVILIDADINDOL ORNITINA)

El medio MIO se utiliza para a

identificacin de enterobacteriassobre la base de movilidad, laproduccin de ornitina

descarboxilasa y de indol

FUNDAMENTO


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FUNDAMENTO

En este medio las peptonas proporcionan lafuente de carbono y nitrgeno. El extracto delevadura provee las vitaminas y cofactores

requeridos para el desarrollo. La dextrosaproporciona la fuente de energa. El agar esadicionado para demostrar la movilidad. El

prpura de bromocresol acta como indicadorde cambios de pH facilitando la deteccin dela descarboxilacin de la lisina

FORMULA EN GRAMOS PORLITRO


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Extracto de levadura 2.0g

Peptona de gelatina 10.0g

Peptona de casena 10.0g

L-ornitina 5.0g

Dextrosa 1.0g

gar 2.0g

Purpura de Bromocresol 0.02g

LITRO


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Este medio se inocula por picadura y se

incuba de 18 a 24 horas a unatemperatura de 35 grados


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RESULTADOS

Primero se leen las reaccionesde movilidad y de ornitinadescarboxilasa antes deagregar el reactivo de Kovacs

para la prueba de indolLa movilidad se demuestrapor un enturbiamiento delmedio o por crecimiento que

difunde mas all de la lnea deinoculacin

La reaccin positiva a laornitina est dada por un


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ornitina est dada por uncolor prpura del medio. Laornitina negativa produce un

color amarillo en el fondoque puede ser purpura alfinal

Para la prueba de indol seaaden de 3 a 4 gotas dereactivo de Kovacs y se agitasuavemente el tubo. La

aparicin del color del colorrosa o rojo se interpretacomo prueba positiva a indol


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Prueba catalasaen

tubo plasmacitratado

Fundamento


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Fundamento

Staphylococcus aureus posee dostipos de coagulasa:* Una endocoagulasa o coagulasaligada ocuando se mezcla una

suspensin bacteriana con plasmacitratado u oxalatado.

Constitucin


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Constitucin

Coagulasa en tubo:

Colocar volmenes iguales de plasma

citratado y de cultivo de caldo deStaphylococcus mezclar suavemente eincubar durante 4hs a 37C controlando

cada 30min, si se produce la coagulacin.

Resultados


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ResultadosPositivo: coagulo total, parcial:

cualquier grado de coagulacin

Negativo: suspensinhomognea (Staphylococcus

epidermidis u otro organismo


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MATERIAL


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MATERIAL1 tubo con agar TSI1 tubo con agar LIA

1 tubo con Citrato de Simmons1 tubo plasma citratado

1 tubo con caldo urea


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1 tubo con Peroxido deHidrogeno

MicroscopioReactivos para la tincion

de GramMechero

Asa Bacteriolo ica

PROCEDIMIENTO


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PROCEDIMIENTO

1.-tomar colonias aisladas de lasplacas de agar sangre y agarchocolate. Observar si hay hemolisis;

reportar la presencia de estreptococosy confirmar con H2O2 para descartarestafilococos. Hacer frotis y teir por

tcnica de Gram


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2.- si hay desarrollo en agar EMB;sembrar en los tubos de pruebasbioquimicas siguiendo el

procedimiento de su practicaexudado faringeo


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3.- los tubos de LIA y TSI sesiembran por estria simple ypicadura


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4. si se obtiene desarrollo enlas cajas de agar S-110

efectuar la prueba decoagulasa (plasma citratado)


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5.- de un Diagnostico condiscusin de los resultados

obtenidos.

BIBLIOGRAFIA


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BIBLIOGRAFIA

Koneman Elmer W.DIAGNSTICO

MICROBIOLGICO EditorialMdica Panamericana, 2004- 1432 pginas

v Matthew J Lynch Mtodos

practica 12 identificacion de bacterias x pb micro

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