Docente: Professora Doutora Sandra Soares

Universidade Fernando Pessoa

Ciências Farmacêuticas

Imunologia

Discentes:

Catarina Oliveira......................n.º 17182Elisabete Ramos......................n.º 13067Isabel Cardeal .........................n.º 14133Maria Sofia Bucho …….………nº 16543

Imunocitoquímica Localização de proteínas numa célula ( ou população de células)

Fundamento da técnica utilização de anticorpos específicos contra proteína (antigénio) que se pretende identificar e localizar

Neste trabalhoidentificar e detectar linfócitos T em sangue periférico

receptores específicos CD3

Princípio da TécnicaPrincípio da Técnica Anticorpo especifico antigénio

Observação microscópica

liga-se

Dois métodos

- Directo (anticorpo primário marcado)

- Indirecto ( anticorpo primário e anticorpo secundário

marcado)

anti – CD3 contém anticorpo que

reconhece

(reconhece o antigénio) anticorpo primário

Princípio da TécnicaPrincípio da Técnica

Utilização :

- anticorpo primário (anti-CD3) para

reconhecimento

- anticorpo secundário biotinilado (anti-anti-CD3)

do antigénio

Enzima ---- Streptavidina peroxidase que reage com a biotina

Liga-se ao substracto cromogénio (DAB)

Coloração castanha

(quando ocorre degradação do substrato

pela enzima)

Material e ReagentesMaterial e Reagentes

Material Reagentes

•Algodão •Álcool

•Lanceta •Solução metanol/acetona (50/50)

•Lâmina •Solução PBS

•Pipeta de Pasteur •Bloqueador das peroxidases endógenas

•Gobelé •Soro proteico (UV protein block)

•Micropipeta de 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl e respectivas pontas

•Anticorpo primário (anti-CD3) Santa Cruz Biotechnology – diluição 1 /10000

•Recipiente para despejos bio-perigosos •Anticorpo secundário biotinilado (biotinylated secondary antibody)

•Microscópio •Streptavidina Peroxidase (HRP)

•Tubo Falcon •Solução de DAB (DAB Chromogen/substract kit high contrast – Scytek Laboratorics)

•Estufa •H2O2 a 3% (Lote 09216)

•Eppendorfs

ProcedimentoProcedimento

ProcedimentoProcedimento

ProcedimentoProcedimento

ProcedimentoProcedimento

ProcedimentoProcedimento

Receptor Linfócito T (CD3)

1º anticorpo (anti-CD3)

2º anticorpo (anti-anti-CD3) biotinilado

Biotina

Avidina Peroxidase

DAB

Cor castanha

ResultadosResultados

Discussão e ConclusãoDiscussão e Conclusão

De acordo com os resultados obtidos, não foi possível identificar a presença de linfócitos T.

Este facto pode estar associado a uma incorrecta execução da técnica, relativamente ao procedimento do esfregaço sanguíneo, que ficou muito espesso.

Discussão e ConclusãoDiscussão e Conclusão

Pode também dever-se a um incumprimento dos tempos de espera relativamente aos reagentes utilizados, nomeadamente dos marcadores.

Uma má coloração das células, constitui também um motivo para a obtenção de tais resultados, pois pode ser difícil ou até mesmo impossível identificar e detectar as células T.

BibliografiaBibliografia

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