porazdelitev klavulanske kisline med vodo in … · porazdelitev klavulanske kisline med vodo in...

48
Kristjan Kogovšek PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN ORGANSKIM TOPILOM Diplomsko delo Maribor, september 2013

Upload: others

Post on 01-May-2020

16 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Kristjan Kogovšek

PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN ORGANSKIM TOPILOM

Diplomsko delo

Maribor, september 2013

Page 2: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system
Page 3: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim

topilom

Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Kristjan Kogovšek

Študijski program: visokošolski strokovni študijski program I. stopnje

Kemijska tehnologija

Predvideni strokovni naslov: diplomirani inženir/inženirka kemijske tehnologije (VS)

Mentor: doc. dr. Aljana Petek

Komentor: red. prof. dr. Željko Knez

Maribor, september 2013

Page 4: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system
Page 6: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

I

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal/a sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Web of Knowledge (apps.isiknowledge.com)

Gesla: Število referenc

clavulanic acid and fermentation and biosynthesis 293

clavulanic acid and extraction and organic solvent 231

Vir: COBIB-COBISS (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid)

Gesla: Število referenc

klavulanska kislina IN fermentacija 2

klavulanska kislina IN biosinteza 2

Skupno število pregledanih člankov: 15

Skupno število pregledanih knjig: 7

Za iskanje uporabite baze, kot npr.:

Thomson Reuters Web of Knowledge (apps.isiknowledge.com)

COBIB - COBISS (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid)

Maribor, september 2013 Kristjan Kogovšek

podpis

Page 7: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

II

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici doc. dr. Aljani Petek in somentorju red. prof. dr. Željku Knezu za pomoč in vodenje diplomskega dela.

Page 8: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

III

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

Povzetek

Diplomsko delo prikazuje študijo klavulanske kisline (KK) iz obstoječe literature. Ta je pomemben betalaktamski antibiotik in učinkuje proti bakterijam, katere so zmožne razviti odpornost proti tem antibiotikom. Učinkuje na način, da ireverzibilno acilira serinsko OH skupino v aktivnem mestu encima s posnemanjem normalnega substrata. Vendar je v primerjavi s široko spektralnimi antibiotiki njena uporaba omejena. Kot posledica tega se ne uporablja kot samostojno antibakterijsko sredstvo, največkrat služi kot dodatek drugim širokospektralnim antibiotikom, ki ne delujejo ob prisotnosti -laktamaze.

Naravno proizvaja klavulansko kislino mikroorganizem Streptomyces clavuligerus z biokemijskim postopkom-fermentacijo. Velik vpliv na proizvodnjo kisline imajo: količina ogljika, dušika, fosfatov, prekuzorji in način delovanja bioreaktorjev. Pridobljeno klavulansko kislino porazdelijo iz filtrirane in nakisane fermentacijske brozge v organsko topilo z ekstrakcijo. Primerna topila so: etilacetat, butil acetat, 2-butanol, n-butanol in metil izobutil keton. Ekstrakcija je bila izvedena z etil acetatom, ki kljub temu, da ima manjši porazdelitveni koeficient (K=0,65) od n-butanola (K=1,85), ima večjo selektivnost za klavulansko kislino kakor za amoksicilin, topnost vode je v njem manjša in ima nižje vrelišče, s čimer je olajšan proces koncentriranja vzorca. Iz organske faze jo nato lahko ločijo z uparevanjem topila, kar povzroča večje stroške in razgradnjo KK. Hirata in sodelavci

6 poročajo o postopku priprave čistega in stabilnega kalijevega klavulanata z

direktnim obarjanjem klavulanske kisline iz organske faze s kalijevim 2-etil heksanoatom. Pri optimizirani kombinaciji koncentracij (15 mg/mL KK in 0,3 M kalijevega 2-etil heksanoata) so dosegli velik izkoristek (69 %).

Ključne besede: klavulanska kislina, biosinteza, fermentacija, ekstrakcija

UDK: 663.953.031.4(043.2)

Page 9: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

IV

Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Abstract

Thesis shows the study of clavulanic acid (CA) in the existing literature. This is an important beta-lactam antibiotic and is effective against bacteria, which are able to develop resistance to this antibiotic. It works in such a way that irreversible acylated serine OH group in the active site of lactamase by mimicking the normal substrate. However, in comparison with broad-spectrum antibiotics, its application is limited. As a result, it is not been possible to use clavulanic acid as a solely administered antibacterial product and is most often co-formulated with other broad-spectrum antibiotics, which do not work in the presence of -lactamase.

Naturally is clavulanic acid produced by organism Streptomyces clavuligerus in biochemical process - fermentation. Significant impact on the production of acid are: the amount of carbon, nitrogen, phosphate, precursors and operation mode of the bioreactor. Obtained clavulanic acid is distributed from the filtered and acidified fermentation broth into an organic solvent by extraction. Suitable solvents are ethyl acetate, butyl acetate, 2-butanol, n-butanol and methyl isobutyl ketone. Extraction was carried out with ethyl acetate, which, although it has a smaller partition coefficient (K = 0.65) from n-butanol (K = 1.85), has a greater selectivity for the clavulanic acid as amoxicillin, the solubility of water in the it is smaller and has a lower boiling point, making it easier for the process of concentrating the sample. Solvent can be separated from organic phase via evaporation, and that can cause higher operating costs and decomposition of CA. Hirata at.el

6 report a

method for production of pure and stable potassium clavulanate using direct precipitation of clavulanic acid from organic phase using potassium 2-ethyl hexanoate. The optimal concentration (15 mg/mL KK and 0.3 M potassium 2-ethyl hexanoate) gives high yield (69 %).

Key words: clavulanic acid, biosynthesis, fermentation, extraction

UDK: 663.953.031.4(043.2)

Page 10: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

V

Kazalo

1 Uvod ............................................................................................................................... 1 2 Klavulanska kislina ........................................................................................................ 2 3 Proizvodnja klavulanske kisline ..................................................................................... 4

3.1 Biosinteza klavulanske kisline ................................................................................ 4 3.2 Fermentacijski postopek ......................................................................................... 7

4 Vplivi na proizvodnjo klavulanske kisline ................................................................... 10 4.1 Vpliv izvora ogljika .............................................................................................. 10 4.2 Vpliv izvora dušika ............................................................................................... 11 4.3 Vpliv izvora fosfatov ............................................................................................ 12 4.4 Vpliv prekurzorjev ................................................................................................ 13 4.5 Vpliv načina delovanja bioreaktorja ..................................................................... 13

5 Stabilnost klavulanske kisline ...................................................................................... 14 6 Porazdelitev klavulanske kisline iz fermentacijske brozge v organsko topilo ............. 15 7 Izolacija klavulanske kisline iz fermentacijske brozge ................................................ 17

7.1 Analizne metode ................................................................................................... 17 7.2 Postopek optimizacije ........................................................................................... 18 7.3 Opažanja................................................................................................................ 20

8 Zaključek ...................................................................................................................... 23 9 Literatura ...................................................................................................................... 24 10 Priloge .......................................................................................................................... 25

10.1 Teoretični opis in način čiščenja ........................................................................... 25 10.2 Analizne metode dela ............................................................................................ 29

Page 11: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

VI

Seznam tabel

Tabela 6-1: Porazdelitveni koeficient klavulanske kisline za različna topila19

.................... 16

Tabela 7-1: Rezultati obarjanja6 ............................................................................................ 21

Tabela 7-2: Pogoji za obarjanje klavulanske kisline iz izdelka Clavulin6 ............................ 21

Page 12: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

VII

Seznam slik

Slika 2-1: Struktura klavulanske kisline, penicilina, cefalosporina5 ...................................... 2

Slika 2-2: Primerjava gram- pozitivne in gram-negativne bakterije17

.................................... 2

Slika 2-3 : Mehanizem ireverzibilne inaktivacije β-laktamaze s klavulansko kislino.3 ......... 3

Slika 3-1: Biosintezna pot klavulanske kisline4 ...................................................................... 6

Slika 7-1: Blokovna shema procesa z osnovnimi informacijami. ........................................ 19

Slika 7-2: Reakcija med klavulansko kislino in kalijevim 2-etil heksanoatom6 .................. 20

Page 13: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

VIII

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

µ ionska moč

kd konstanta hitrosti reakcije razpadanja

K porazdelitveni koeficient

COP koncentracija klavulanske kisline v organski fazi

CAP koncentracija klavulanske kisline v vodni fazi

d dielektrična konstanta

S topnost

ε brezdimenzijska dielektrična konstanta

Y(%) izkoristek

m(exp) eksperimentalno določena masa

m(t) teoretično določena masa

M molska masa

CA koncentracija topljenca v topilu A

CB koncentracija topljenca v topilu B

β selektivnost

Y delež v ekstraktni fazi

X delež v rafinatni fazi

t(r) retenzijski čas

K, kapacititveni faktor

I kvantno število

B gostota magnetnega polja

E energija

h Planckova konstanta

frekvenca

Kratice

KK klavulanska kislina

CAS klavaminatna sintetaza

PKH proklavaminska kislina amidinohidrolaza

DNK polideoksiribonukleinska kislina

RNK poliribonukleinska kislina

MIK metil iso-butil keton

HPLC visoko ločljivostna tekočinska kromatografija

NMR nuklerarna magnetna resonanca

TLC tankoplastna kromatografija

Page 14: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

IX

TMS interna referenca

BLS β -laktam sintetaza

β beta

Page 15: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system
Page 16: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

1

1 Uvod

Klavulanska kislina je učinkovina iz skupine zaviralcev β-laktamaze in se uporablja v kombinaciji s penicilinskimi antibiotiki. Pomaga pri premagovanju bakterijske odpornosti proti tem antibiotikom. Naravno jo proizvaja mikroorganizem Streptomyces clavuligerus. Iz fermentacijske brozge jo ločimo z uporabo organskega topila, katero je z vodo nemešljivo.

Cilj diplomskega dela je bilo na osnovi že znane literature preučiti, katero je najbolj primerno topilo za ekstrakcijo, ki mora imeti naslednje lastnosti: ne sme reagirati s klavulansko kislino, omogoča hitro vzpostavljanje ravnotežja, po gostoti se razlikuje od vode ter topnost kisline v njem naj bo velika. Podrobno smo obdelali postopek ekstrakcije iz fermentacijske brozge in opisali vse metode, s katerimi so avtorji analizirali dobljene produkte s prej omenjenim postopkom. Diplomsko delo tudi opisuje klavulansko kislino, postopke njenega pridobivanja in vplive na pridobivanje te kisline. Klavulanska kislina je sestavni del najpogosteje uporabljenih antibiotikov, zato je opisano tudi njeno delovanje v antibiotikih.

Page 17: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

2

2 Klavulanska kislina

Klavulanska kislina je pomemben ß-laktamski antibiotik. V to skupino vključujemo peniciline, cefalosporine in njune derivate, te so antibiotične učinkovine, ki imajo v svoji kemijski zgradbi β-laktamski obroč

1.

Struktura klavulanske kisline je podobna strukturi penicilina. V kislini je za penicilin značilen žveplov atom zamenjan s kisikovim. Kot posledica tega je, da imajo vsi derivati klavulanske kisline oksazolidinski obroč

5. To je prikazano na spodnji sliki.

Slika 2-1: Struktura klavulanske kisline, penicilina, cefalosporina5

ß-laktami delujejo na osnovi inhibicije biosinteze peptidoglikana v bakerijski celični steni in tako zavirajo njeno rast, kar posledično povzroči smrt bakterije

2.

Zaradi pogoste uporabe β-laktamskih zdravil, so nekatere bakterije razvile odpornost proti njim. Te bakterije proizvajajo encim β-laktamazo, ta pa s cepitvijo β-laktamskega obroča izniči učinek antibiotika

2. ß-laktamaze so lahko plazmidskega ali kromosomskega izvora.

Nahajajo se kot oksoencimi v stafilokokih in periplazemskem prostoru aerobnih in anaerobnih po Gramu negativnih bakterijskih sevov

16.

Gram-pozitivne in Gram-negativne bakterije imajo podobno notranjo, toda zelo različno zunanjo strukturo

5,17 .

Slika 2-2: Primerjava gram- pozitivne in gram-negativne bakterije17

Page 18: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

3

ß-laktamaze imajo klinično pomembno vlogo pri vrsti infekcij, katere so: vnetje srednjega ušesa, sinusov, žrela, pnevmonitis, infekcije v trebuhu, meningitis. To je omejilo klinično uporabo večine ß-laktamskih antibiotikov pri omenjenih boleznih

16.

Z zaviralci ß-laktamaz je mogoče ohraniti prednosti starejših antibiotikov, saj se tako lahko bojujejo proti ß-laktamazam in jih tako premagajo

18. Zaviralci so po strukturi podobni ß-

laktamskim antibiotikom, tako kot je podobna klavulanska kislina. Klavulanska kislina reagira z ß- laktamazo kot samomorilski substrat. Ireverzibilno acilira serinsko OH skupino v aktivnem mestu s posnemanjem normalnega substrata. Njena intrinzična protibakterijska aktivnost pa je zelo šibka

3. To je prikazano na sliki 2-3.

Slika 2-3 : Mehanizem ireverzibilne inaktivacije β-laktamaze s klavulansko kislino.3

Kot posledica se klavulanska kislina ne uporablja kot samostojno antibakterijsko sredstvo, ampak največkrat služi kot dodatek drugim širokospektralnim antibiotikom, ki ne delujejo ob prisotnosti laktamaze, saj je klavulanska kislina prvi in najširše preizkušen zaviralec β-laktamaz. Kot dodatek antibotikom se uporablja sol klavulanske kisline, ki jo imenujemo kalijev klavulanat

15.

Zdravila – antibiotiki, ki vsebujejo klavulansko kislino, pa so naslednji:

AMOKSIKLAV ali BETAKLAV:

Je kombinacija amoksicilina in klavulanske kisline. Kislina je proizvedena iz glive streptomyces clavuligerus, ima šibek antibakterijski učinek, vendar deluje kot močan ireverzibilen inhibitor β-laktamaz. Z encimi tvori obstojne neaktivne komplekse in tako prepreči, da bi razgradili amoksicilin. Amoksiklav ima širok spekter delovanja. Učinkuje na mikroorganizme, občutljive za amoksicilin in na odporne proti njemu. V tej skupini so: s. aureus, s. epidermidis, e. coli…

16.

Klavulanska kislina nastopa v antibiotiku amoksiklav kot:

- kompetitivni ireverzibilni zaviralec ß-laktamaz,

- ima večjo afiniteto do vezave na encim kot antibiotiki,

- z encimi tvori obstojne neaktivne komplekse ter preprečuje razkrajanje amoksicilina,

- fizikalno in kemijsko je združljiva z amoksicilinom,

- obstojna v vodni raztopini,

- ima podobne kinetične lastnosti kot amoksicilin,

- aditivna toksičnost z amoksicilinom je kar najmanjša,

- ima malo nezaželenih učinkov16

.

Page 19: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

4

3 Proizvodnja klavulanske kisline

Naravno jo proizvaja mikroorganizem Streptomyces clavuligerus. Izolirali so ga med

presejalnim testom (laboratorijski postopek, kjer se s selekcijo išče bakterije, ki ustrezajo

določenim kriterijem (rezistentnost na določene antibiotike, proizvod močnejših

antibiotikov ...)), s katerim so iskali proizvajalce ß-laktamov s povečano odpornostjo proti

ß-laktamazam5.

Streptomyces clavuligerus so izbrali za test, ker proizvaja cefamicin C (cefamicin C je

skupina iz vrst β-laktamskih antibiotikov, so pa zelo podobni cefalosporinom med katere

jih včasih tudi uvrščamo), njegovo sposobnost proizvodnje klavulanske kisline so odkrili

šele, ko so preživele seve ponovno testirali še za proizvodnjo inhibitorjev ß-laktamaze.

Odkritih je bilo še veliko drugih vrst, ki proizvajajo klavamske metabolite, (metabolit je

snov, ki nastane pri metabolizmu; metabolizem je presnova ali vrsta biokemijskih procesov,

sinteze in razgradnje, ki oskrbuje organizem z lastnimi snovmi in energijo), kateri so po

strukturi podobni klavulanski kislini v tem, da vsebujejo ß-laktamski in oksazolidinski

obroč5. Vendar je klavulanska kislina s svojo 3R, 5R stereo kemijo edina iz družine

klavamskih metabolitov, ki vsebuje lastnosti inhibicije ß-laktamaze. Vse ostale oblike

imajo 3S, 5S stereo kemijo in zaradi tega ne inhibirajo ß-laktamaz, čeprav pa nekateri

delujejo antibakterijsko oziroma kot fungicidi4 .

3.1 Biosinteza klavulanske kisline

Naravna biosintezna pot je prikazana na sliki 3.1. Po raziskavah je bilo ugotovljeno, da na

tej poti nastopajo trije intermediati, ki nastanejo iz reakcije kondenzacije piruvata in

arginina, kot neposrednih prekurzorjev KK. Prvi intermediat je metabolit, ki vsebuje

gvanidinsko skupino. Metabolit je v obliki neciklične spojine in je bil izoliran s pomočjo

Sakaguchijeve barvne reakcije (Sakaguchijeva reakcija poteka med α naftolom in

koncentriranim natrijevim hipokloritom, pri tem nastane rdeče obarvanje, saj gre za

premeščanje iz 1-sulfata), ki je pokazala, da spojina vsebuje gvanidinsko skupino. Drugi

intermediat je deoksigvanidino proklavaminska kislina, je monociklična -laktamska

spojina in nastane iz karboksietil arginina s sklenitvijo -laktamskega obroča s pomočjo

encima -laktam sintetaza (BLS). Deoksigvanidino proklavaminska kislina je nato

hidrolizirana s pomočjo encima klavaminatna sintetaza (CAS). CAS je molekularna

deoksigenaza, ki vsebuje železo in njeno delovanje je odvisno od 2-ketoglutarata. Po

zgradbi je podobna hidroksilacijskim encimom. Produkt je tretji gvanidinski intermediat in

vsebuje hidroksilno skupino. Kisik za to skupino izhaja iz molekularnega kisika4.

Gvanidino proklavaminska kislina je nato spremenjena v proklavaminsko kislino s pomočjo

amidinohidrolaze, ki odstrani gvanidinsko skupino na koncu argininskega dela molekule.

Za reakcijo je odgovoren encim poimenovan proklavamininska kislina amidinohidrolaza

(PKH). PKH-jeva funkcija je, da katalizira spremembo gvanidinske proklavaminske kisline

v proklavaminsko kislino.4

Proklavaminska kislina je ena prvih znanih intermediatov v biosintezni poti klavulanske

kisline, katero so izolirali ob ekstrakciji klavulanske kisline iz micelij S. clavuligerus.

Strukturna podobnost med proklavaminsko kislino in klavaminsko kislino je pripeljala do

Page 20: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

5

iskanja encima, ki bi bil zmožen katalizirati prehod med obema spojinama. Na ta način je

bil odkrit CAS4.

Proklavaminska kislina reagira v klavamininsko kislino v dvodelni reakciji s sodelovanjem

prehodnega intermediata dihidroklavaminska kislina. Oba dela reakcije sta katalizirana s

CAS. Za potek katalize je potrebno dodati železo, molekularni kisik ter 2-ketoglutarat kot

kosubstrat (substrat je podloga oziroma snov na katero deluje katalizator). Pokazalo se je,

da obstajata dve različici encima, ki se med sabo le malo razlikujeta, tako po kinetičnih

zmožnostih kot po teži. Ena vrsta CAS služi za izgradnjo klavulanske kisline, druga pa pri

nastanku katerega od drugih klavamov4.

Klavaminska kislina ima enak -laktamski in oksazolidinski obroč kot klavulanska kislina,

a se od nje razlikuje v stereokemiji obročev. S tem je podobna ostalim klavamom, ki so bili

izolirani iz S. clavuligerus in ostalih vrst Streptomyces. Zaradi podobnosti v zgradbi in

stereo kemiji med klavaminsko kislino in ostalimi klavami se je pokazalo, da si delijo

sintezno pot vsaj do proklavaminske kisline, saj je enak proklavaminat v klavamih kot

klavulanski kislini. Klavaminska kislina je skupen intermediat za biosintezo klavulanske

kisline in drugih klavamov. Prisotnost CAS tako pokaže, da je klavaminska kislina

intermediat v eni ali obeh biosinteznih poteh, s čimer ima enako vlogo kot pri nastanku

klavulanske kisline. Preobrazba klavaminske kisline v klavulansko zahteva preobrat v

stereokemiji obročev in spremembo stranske amino skupine v hidroksi skupino5.

Prevod izrazov na Sliki 3.1:

pyruvate – piruvat,

L-arginine – L-arginin,

N2-(2-carboxyethyl)-arginine - N2-(2-karboksietil)-arginin,

β-lactam synthetase – β-laktam sintetaza,

deoxyguanidinoproclavaminate – deoksigvanidinoproklavaminska kislina,

clavaminate synthase – klavaminska kislina sintetaza,

guanidinoproclavaminate – gvanidino proklavaminska kislina,

proclavaminate amidinohidrolase – proklavaminska kislina amidinohidrolaza, proclavaminate – proklavaminska kislina,

dihydroclavaminate – dihidroklavaminska kislina,

clavaminate – klavaminska kislina,

clavaldehyde – klavaldehid,

clavulanic acid dehydrogenase – klavulanska kislina dehidrogenaza,

clavulanic acid – klavulanska kislina,

other clavams – ostali klavami.

Page 21: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

6

Slika 3-1: Biosintezna pot klavulanske kisline4

Page 22: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

7

3.2 Fermentacijski postopek

Hranila so hrana v gojiščih, ta so prilagojena določenemu mikroorganizmu. Uporabljamo jih pri industrijski fermentaciji, te se spreminjajo od organizma do organizma. Vedno je prirejena na bakterijo, plesen ali glivo, ki jo uporabljamo pri postopku. Iz hranil mikroorganizem črpa potrebno energijo za izvajanje biosintez. Ob izvoru energije za sinteze, hranila potrebujejo še za izvorne materiale za biosintezo celičnih struktur, izgradnjo produktov celičnega metabolizma, vzdrževanje celičnih funkcij in dodatne materiale za popravilo in razmnoževanje celic. Nekateri mikroorganizmi potrebujejo le gojišča z enostavnimi komponentami (NH3, glukoza…), medtem ko drugi potrebujejo gojišča s kompleksnejšimi molekulami, ki so že podobne intermediatom ali produktom celičnih metabolitov. Glavne vrste polimernih molekul v celičnih strukturah so: lipidi (maščobe), polisaharidi (škrob, celuloza…), polideoksiribonukleinska kislina in poliribonukleinska kislina (DNK in RNK) in proteini

5.

Standardni industrijski fermentacijski proces za pridelavo sekundarnih metabolitov se lahko razdeli v tri faze. Tudi postopek pridelovanja klavulanaske kisline se deli na:

•Prva faza je izdelava inokuluma (suspenzija hraniv in aktiviranega mikroorganizma, ki proizvaja željen produkt) in se izvaja z zaporednim namnoževanjem seva v primernih posodah.

•Druga faza večinoma poteka v enem bioreaktorju in je stopnja v kateri se antibiotiki mikrobiološko sintetizirajo.

•Tretja faza je izolacija produkta.

Priprava inokuluma (namnožen mikro organizem)

Pri povečevanju proizvodnje igrajo pomembno vlogo fiziološke in genetske lastnosti seva. Proizvodnja klavulanske kisline iz S. clavuligerus je zelo odvisna od inokuluma

5.

Pomembnost kvalitete inokuluma za uspešnost fermentacijskega procesa je že dolgo poznana. Optimalen začetek rastne faze (faze rasti: lag, log, stacionarna, odmiranje) po nanosu inokuluma v bioreaktor je zelo pomemben, saj ta določa količino produkta in ob neoptimalnem začetku faze izpade daleč pod možnim. Za pridobivanje zadovoljive kvalitete inokuluma so potrebni naslednji kriteriji

5:

Inokulum mora biti v zdravi in aktivni obliki ob nanosu, da se tako minimalizira lag

faza fermentacije.

Inokulum mora biti v primerni morfološki obliki.

Mora biti brez nečistoč.

Inokulirana biomasa mora zadržati sposobnost ustvarjanja produkta.

Kot tudi druge industrijsko pomembne streptomicete in glive, je tudi S. clavuligerus zmožen nespolnega sporeliranja (tvorjenja spor). Zato se kot kal prve stopnje razvoja inokuluma največkrat uporablja suspenzija spor (spora je neaktivna oblika celice, ki lahko v hibernaciji preživi leta, desetletja…). Čista kultura (kolonija, kjer so vse celice kolonije istega seva, istega mikroorganizma) vegetativnih spor se pri industrijski pridelavi nato v večih stopnjah namnoži ter prenaša v večje posode, kjer se ustvari zadostna mera inokuluma, da se tega lahko nanese v proizvodni reaktor. Slabost uporabe vegetativnih spor je, da se težko ohrani neoporečnost kulture zaradi morfoloških diferenciacij, ki se pojavijo pri rasti te vrste mikroorganizma

5.

Pri industrijski pridelavi antibiotikov se je čas za inokulacijo v fermentacijski bioreaktor dolgo časa določal po načelu skupnih starosti inokulumov. Vendar pri tem postopku večkrat nastanejo slabo ponovljivi sistemi zaradi nestalne koncentracije biomase in variirajoče

Page 23: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

8

metabolne aktivnosti kulture v času inokulacije. Te variacije se lahko zmanjšajo in s skrbnim opazovanjem in kontroliranjem aktivnosti v posodi, v idealnem primeru z vsakim fermentacijskem ciklom, se lahko poveča proizvodnost fermentacije. Da povečamo izkupiček fermentacijskega procesa ni dovolj samo da nadzorujemo okolje v katerem so mikroorganizmi izpostavljeni. Potrebno je prav tako kontrolirati metabolno aktivnost kulture (spremembo porabe določenih primarnih substratov ali preskok iz rastne v proizvodno fazo). Eden od postopkov, ki nam to omogoča je tako imenovana analiza izhodnih plinov (off-gas analysis), ki nam daje pomembne podatke o stanju seva. Je zanesljiva in dovolj odporna, da se lahko uporablja v okolju industrijskega obrata. Prav tako nanjo ne vpliva prisotnost trdnih substratov, odporna pa je tudi na večino fizikalno-kemičnih sprememb rastnega medija (gojišča)

5.

Neves je 2001 raziskoval vpliv predkultur (namnožen mikroorganizem, druga beseda za

inokulum) na fermentacijo KK. Poizkus je zasnoval tako, da je fermentacijske postopke

razdelil v skupini A in B. Poizkus je izvajal v velikosti testnega obrata. V fermentorje A so

inokulirali micelje, ki so bili na koncu eksponentne faze rasti. Fermentorje B so inokulirani

z micelji, ki so bili že v stacionarni fazi rasti. Proizvodnja v fermentorjih A je ves čas

presegala proizvodnjo v fermentorjih B in je dosegla maksimum pri približno 70 urah

fermentacije, nato padla, ter se pri 140 urah v fazi odmiranja izenačila s proizvodnjo

fermentorjev B. Za optimizacijo postopka se je naknadno uporabilo več različnih

inokulumskih mešanic miceljev iz A in B, katerim se je dodatno spreminjalo fermentacijske

čase. Izkoristek proizvodnje se je v najboljšem primeru povečal za do 22% in sicer pri

uporabi miceljev iz konca rastne faze (A) in fermentacijskem času 96 ur. Na podlagi

raziskave se je nato predlagal nov način gojenja inokuluma pri katerem se je dal večji

povdarek na opazovanje metabolne aktivnosti predkulturnega seva s pomočjo off-gas

analize. Ta način gojenja zagotovi večje razmnoževanje v vsaki šarži namnoževalnega

postopka in omogoča boljšo produktivnost fermentacije kot pri starejših metodah

proizvodnje KK. Sanchez in Brana (1996) sta v poročilu omenila, da gostota celic vpliva na proizvodnjo antibiotikov v S. clavuligerus. Avtorja sta opisala, da se biosintezne poti aktivirajo hitro po prvotnem razmnoževanju spor in da gostota teh znotraj inokuluma vpliva na čas in hitrost aktivacije. Aktivacijo se pospeši z višjo gostoto inokuluma ali rastjo spor na gojiščih, na katerih se je predhodno že namnoževalo spore in micelje S. Clavuligerus. Po toplotni obdelavi so se deli takšnega gojišča dodali inokulumu z nizko gostoto celic in pokazalo se je, da so se biosintezne poti hitreje aktivirale. Enak vpliv je imel dodatek gojišč za namnoževanje različnih vrst celic Streptomyces ali Bacillus, kar kaže na to, da signal za aktivacijo biosinteznih poti za S. clavuligerus ne proizvajajo samo one same. Pri molekularni analizi gojišč se je pokazalo, da za aktivacijo ni bila odgovorna samo ena molekula. Frakcije so vsebovale več aminokislin, od katerih je vsaka s svojo koncentracijo pripomogla k aktivaciji. Kasneje se je pričelo efekt posnemati s tem, da se je kemijsko določenim gojiščem dodalo aminokisline in peptide v koncentracijah, ki so bile primerljive s temi, ki so bile najdene v aktivirajočem gojišču

5.

Optimizacija seva

Optimiranje seva je pomemben del optimizacije procesa pri mikrobiološkem fermentacijskem postopku

5, ker:

Omogoča zmanjšanje stroškov saj je namen vzgojiti sev s povečano proizvodnostjo

(meri se kot procent povečanja izkupička šarže).

Omogoči uporabo cenejših surovin

Page 24: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

9

Proces poenostavi ali olajša, npr. nastali proizvod je lažje izolirati iz fermentacijske

zmesi

Omogoča sevu, da proizvaja pri določenih pogojih, npr. sobni temperaturi ali pri manjši

koncentraciji kisika

Proizvodnja KK se izvaja v industrijskem merilu s fermentacijo S. clavuligerus. Sev, ki bi bil zmožen proizvajati večje količine KK je nastal iz naravnega seva S. clavuligerus v večletnem postopku. Biokemična analiza produktov seva je pokazala, da so izboljšani sevi še zmožni proizvajati cefamicin C in klavame druge orientacije. Ti so pri industrijski proizvodnji KK nezaželjeni in velik interes je ugotoviti, ali uničenje biosinteznih poti za proizvodnjo nesorodnega cefamicin C-ja ali sorodnih 5S klavamov poveča proizvodnjo KK v industrijskem, visoko specializiranem sevu

5.

Z rekombinatorno združitvijo sevov, ki vsebujejo biosintezne gene ces1 ali ces2 so pridobili nov sev, ki je vseboval kombinacijo obeh genov in je imel za 60% do 100% večjo proizvodnost klavulanske kisline v primerjavi z naravnimi sevi (Perez-Redondo 1999). Townsend (2001) je opisoval metodo za povečanje proizvodnosti KK z vstavljanjem gena orf2, ta je modificiran sev S. clavuligerus iz biosintezne poti KK iz naravnega seva S. clavuligerus in s spremembo fermentacijskih pogojev, še posebaj koncentracije D-glicerolaldehid-3-fosfata, substrata pri izdelavi N-(2-karboksietil) arginin sintetaze, za katero je orf2, povečal izkupiček fermentacije

5.

Deaktivacija zaviralnih regulatornih genov ali povečano delovanje promotorskih genov lahko prav tako poveča proizvodnjo sekundarnih metabolitov. Paradkar je opazil 2 do 3-kratno povečanje proizvodnje KK pri dodatku promotorskih regulatornih genov v naravni sev (Paradkar 1998, Perez-Llarena 1997, Perez-Redondo 1998).

Drug pristop je, da onesposobimo poti, ki uporabljajo ključne prekurzorje, intermediate, kofaktorje ali se potegujejo za zaloge energije v S. clavuligerus. Deaktivacija klavamske sintezne poti v S. clavuligerus, ki si s sintezno potjo klavulanske kisline deli skupen intermediat (klavaminsko kislino) je pokazala povečan izkupiček v izdelavi klavulanske kisline

5.

S. clavuligerus lahko ob komercialno pomembni klavulanski kislini proizvaja še vsaj 21 sekundarnih metabolitov. Spremembe v sestavi gojišča in koncentraciji posamičnih surovin na le-tem imajo lahko odločilne posledice za akumulacijo metabolitov med in po procesu

5.

Page 25: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

10

4 Vplivi na proizvodnjo klavulanske kisline

4.1 Vpliv izvora ogljika

Najpogostejši izvor ogljika pri proizvodnji KK s S. clavuligerus so lipidi (Butterworth 1984). Ogljikovi hidrati so najenostavnejši izvor energije za rast in proizvodnjo sekundarnih metabolitov. Vendar hitra razgradnja glukoze in drugih ogljikovih hidratov zmanjša stopnjo biosinteze antibiotika. Po poročilih nekateri izvori ogljika inhibirajo proizvodnjo penicilina v P. crysogenum (Revilla 1984) in sintezo cefalosporina v S. clavuligerus (Aharonowitz in Demain 1978). Uporaba izvora ogljika z nizko topnostjo, kot npr. olje, je tako dober način da se izognemo takojšnji razgradnji substrata, ki tvori izvor ogljika. Dodajanje olja k rastnemu mediju je smiselno tudi iz energijskega vidika, saj olje vsebuje približno 2,4 krat več energije kot glukoza enake teže (Stowel 1985). Olja so v prednosti glede ogljikovih hidratov tudi v volumnih, saj bi npr. porabili 1,24 L sojinega olja, da bi fermentorju dodali 10 kcal energije, za enako količino energije pa bi porabili 5 L glukoze, ob predpostavki, da mešamo 50 % (w/w)

5.

Slabosti uporabe olja za izvor ogljika so, da je količina oljnega ostanka večja kot pri ogljikovih hidratih (ki je največkrat nič) (Stowell 1985) in da je poraba kisika pri prebavi olja večja kot ta pri ogljikovih hidratih. Ostanki olja povečajo viskoznost končnega medija in potrebujejo dodatne postopke čiščenja in izolacije produkta. Zaradi nezmožnosti S. clavuligerus, da učinkovito uporablja enostavne ogljikove hidrate (kot je npr. glukoza) in ker ti povečajo sekundarni metabolizem drugih prisotnih mikroorganizmov, je najpogostejši izvor ogljika lipid

5.

Large je 1998 raziskoval vpliv olja, ki vsebujejo C16 in C18 nenasičene in nasičene maščobne kisline in spremenjeno obliko škroba, kot izvor ogljika v fermentacijskem mediju. Poročilo vsebuje proizvodnjo klavulanske kisline (KK) v primerjavi z viskoznostjo medija. Rezultati podajajo, da je bila proizvodnja KK 80 mg/L za nedoločen lipid

5.

Lee in Ho sta 1996 opisala, da so olja palme in olja s palmovimi primesmi in njihove oleinske in sterinske maščobe primerne kot glavni izvor ogljika za rast in proizvodnjo KK

s S. clavuligerus. Vendar se oleinske kisline niso uporabljale za rast. Naključen mutant, ki je bil izbran ker proizvaja večje količine cefamicina C, je prav tako proizvajal večje količine KK, če so v reakcijskem mediju bila prisotna olja

5.

Maranesi je 2005 preučeval uporabo rastlinskih olj pri proizvodnji KK s S. clavuligerus ATCC 27064 (industrijska številka seva). Medij, ki je vseboval sojino olje in škrob kot izvor ogljika in energije, je dal najboljši izkoristek. V nadaljevanju so raziskovali vpliv na proizvodnjo ob uporabi medija, v katerem so škrob nadomestili z glicerolom in spreminjali koncentracijo sojinega olja (16, 23 in 30 g/L). Največjo proizvodnost so dosegli v mediju, ki je vseboval 23 g/L sojinega olja (722 mg/L v 120 urah), največji izkupiček pa je bil v mediju, ki je vseboval 30 g/L (753 mg/L v 130 urah). Tudi nadomestitev olj z jedilnimi koruznimi in sončničnimi olji je dala podobno dobre rezultate v proizvodnosti in izkupičku. Avtorji so prišli do spoznanja, da je dostopno rastlinsko olje zelo perspektivno za proizvodnjo KK, saj se počasi spremeni v glicerol in maščobne kisline, ki so glavni izvor ogljika in energije za mikroorganizme

5.

Ortiz je 2007 raziskoval vpliv različnih derivatov sojinih olj kot izvorov dušika in sočasen vpliv izvorov dušika in ogljika na prizvodnjo KK s S. clavuligerus. Prva dva poizkusa sta bila narejena v mešalnih posodah, od katerih se je v eni nahajala raztopina sojine moke v drugi pa sojini proteini, ki so bili izolirani iz gojišča s koncentracijo 1,6 g/L čistega dušika.

Page 26: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

11

Proizvodnost KK v posodi s sojino moko je bila približno dva krat večja kot ta z izoliranimi sojinimi proteini. Izvedli so še dodatne poizkuse o vplivu različnih koncentracij sojine moke (kot izvoru dušika) in sojinega olja (kot izvoru ogljika) na proizvodnjo KK. Največjo proizvodnjo KK, 906 mg/L, so dobili ob koncentracijah: sojina moka 40 g/L in sojino olje 16 g/L

5.

Romero je 1984 poročal o zaviralnem učinku na biosintezo KK, če so v mediju prisotni glicerol, glutaminska kislina, amonij in fosfat v koncentracijah, ki presegajo 165 mM, 20 mM, 20 mM, 10 mM. Ob odsotnosti glicerola pa se ni proizvedla KK, namesto tega se je proizvajal samo cefamicin C, eden metabolitov S. clavuligerus. Tako so dakazali, da je glicerol nepogrešljiv za biosintezo KK

5.

Elson in Oliver sta 1978 pokazala, da se glicerol, ki se ga je naneslo direktno v fermentacijski medij, uporablja predvsem za izgradnjo β-laktamskega obroča KK, kar sta dokazala z uporabo

13C izotopa. Podatek namiguje na to, da skelet β-laktamskega obroča

KK nastane direktno iz glicerola, brez spreminjanja položaja katerega od ogljikovih atomov

5.

Chen je 2003 pokazal, da je pri šaržni proizvodnji dovajanje glicerola in ne ornitina ključno za količino sintetizirane KK. Chen je 2002 raziskoval vpliv vnašanja glicerola med proizvodnjo KK s S. clavuligerus. Poročilo kaže, da je glicerol od 10-20 g/L povečal proizvodnjo KK s S. clavuligerus v mešalnih posodah. Biosinteza je trajala do 132 ur, z dovajanjem glicerola se je proizvodnja povečala na 270 mg/L v primerjavi z 115 mg/L, ki so nastali brez dodajanja glicerola. V šaržni fermentaciji se prične razgradnja KK pri 72 urah. Z vnosom glicerola v šaržno fermentacijo se ne samo poveča proizvodnost KK na 280 mg/L, produkt prav tako ostane stabilen do 130-te ure fermentacije

5.

Saudagar in Singhai (2007) sta raziskovala fermentacijsko proizvodnjo KK s S. clavuligerus MTCC 1142. Raziskovala sta vpliv vsake komponente gojišča posebej (izvor dušika, izvor ogljika, koncentracija inokuluma) in okoljske dejavnike, kot je vpliv pH, na proizvodnjo KK. S pomočjo metode 1,25 ortogonalne množice sta optimizirala koncentracije sojine moke, sojinega olja, dekstrina, ekstrakta plesni in K2HPO4. Poizkušala sta povečati sintezo KK z manipulacijo prekurzorskih reakcij, ki tvorijo C3 in C5 prekurzorja, z dodajanjem arginina, ornitina, prolina, valina, leucina, izoleucina, piruvične kisline in α-ketoglutarata k fermentacijskem mediju. Dodatno nanašanje 0,1 M arginina in 0,1 M leucina na že optimirano gojišče je povečalo izkupiček KK za še 1,1 mg/mL (za arginin) in 1,384 mg/mL (za leucin) v primerjavi z 0,14 mg/mL, kar je bil izkupiček pred optimizacijo

5.

4.2 Vpliv izvora dušika

Gojišče, namenjeno gojenju S. clavuligerus, lahko vsebuje od 0,1 do 10 % (w/v) kompleksnih izvorov dušika. Ti so ekstrakt plesni, koruzni sirup, rastlinske beljakovine, beljakovine iz semen. Beljakovine iz sojinih semen so najpomembnejša hranila za proizvodnjo KK (Butterworth 1984). Gouveia je 1999 preučeval vpliv izvora dušika v reakcijskem mediju na proizvodnjo KK. Uporabljal je seve industrijske šaržne pridelave KK in dva umetna in dva kompleksna fermentacijska medija, od katerih so vsi vsebovali derivate sojinih semen. Da bi se podatki kasneje lahko primerjali, so vsa gojišča vsebovala 4,0 g celokupnega dušika/L. Raziskava je pokazala, da je proizvodnja KK pri uporabi umetnega medija dosegala vrednosti, ki so višje od teh navedenih v literaturi. Ob uporabi kompleksnega medija pa se je pokazalo, da se je pri uporabi proteinskih ekstraktov iz sojinih kalčkov proizvodnja KK zvišala na 920 mg/L, kar je dva krat višje, kot pri uporabi sojine moke in veliko višje kot vrednosti za proizvodnost KK na kompleksnem mediju, ki

Page 27: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

12

so bile podane v literaturi (300 - 500 mg/L). Spoznanje avtorjev je bilo, da se s povišanjem koncentracije dušika poviša tudi proizvodnost KK, ne glede na vrsto gojišča

5.

Gouveia je 2001 obravnaval sestavo gojišča za proizvodnjo KK s S. clavuligerus. Poročilo je pokazalo, da je med štirimi javno dostopnimi izvori dušika (koruzni sirup vsebuje 4% w/w skupnega dušika, beljakovinski ekstrakt sojinih kalčkov vsebuje 15% skupnega dušika, ekstrakt plesni vsebuje 12,8% skupnega dušika) največji izkupiček KK prinesel ekstrakt sojinih kalčkov

5.

Mayer in Deckwer sta 1996 preučevala proizvodnjo KK v gojišču, ki vsebuje glicerol, sojino moko ali ekstrakt sojine moke. Opažanja so pokazala, da sta se rast in proizvodnja KK dogajali sočasno in da je proizvodnja KK v stacionarni fazi ostala enaka ali upadla. Čeprav je bila rast na gojišču, ki je vseboval ekstrakt sojine moke tri krat večja, se je KK pričela proizvajati šele v stacionarni fazi

5.

Wang je 2005 raziskoval vpliv sestave fermentacijskega medija za proizvodnjo KK s S. clavuligerus z uporabo tako matematične metode vrednotenja deleža podatkov in največjega odziva. Rezultati postopka vrednotenja deleža podatkov so pokazali, da so prah sojine moke, FeSO4 • 7H2O, in ornitin najpomembnejši deli sestave medija (z verjetnostjo nad 85%). Metoda največjega odziva je bila bolj uporabna in je pokazala, da so optimalne koncentracije za prah sojine moke, FeSO4 • 7H2O in ornitin v fermentacijskem mediju 38,102 g/L, 0,395 g/L in 1,177 g/L in dajo izkupiček 672 mg/L . Proizvodnja se je povečala za 50%, če se je uporabljal sev S. clavuligerus v fermentacijskem mediju

5.

Visser-Luirink je 2006 pisal o fermentaciji KK z uporabo amonijevih soli. Odkrita je bila povečana proizvodnost KK, kadar je bila koncentracija amonija med celotnim procesom 50 mg/L ali več. Vendar je morala biti koncentracija amonija dovolj nizka, da se prepreči utišanje proizvodnje sekundarnih metabolitov in škodljivost amonijevih ionov. Koncentracija neporabljenega amonija v fermentacijski zmesi se je uravnavala z dodajanjem amonijevih soli. Dodatno se lahko koncentracija amonija zmanjša s spremembo temperature ali pH, kar privede do povečanja rasti in tako se poraba amonija poveča

5.

4.3 Vpliv izvora fosfatov

Fosfat je pomembno, rast-določujoče hranilo in vpliva na sintezo antibiotikov različnih biosinteznih skupin. Pri industrijski proizvodnji antibiotikov je zelo pomembna rast-določujoča koncentracija neorganskega fosfata. Fosfati s koncentracijami 0,3-300 mM načeloma pospešujejo rasti celic, a koncentracije 10 mM in nad zavirajo biosintezo večine antibiotikov (Martin 1976). Fosfat ne vpliva samo na sintezo antibiotika, po večih urah porabe povzroči, da se proizvodne celice, ki ne rastejo več, spreobrnejo nazaj v rastoče celice, ki ne proizvajajo produkta (Liu 1975)

5.

Fosfat ima pomembno vlogo pri proizvodnji klavulanske kisline. Vsebnost fosfata v mediju določa proizvodnjo cefamicina C in KK. Aharonowitz uin Demain sta 1978 poročala, da se proizvodnja KK pri koncentracijah fosfata, ki so večje ali enake od () 100 mM, v fermentacijskem mediju zmanjša za 80% in da se proizvodnja cefamicina zmanjša za 50% pri koncentracijah fosfata, ki so večje ali enake () 50 mM, prav tako v fermentacijskem mediju. Romero je 1984 opisal podoben zaviralni učinek visokih koncentracij fosfata pri proizvodnji s S. clavuligerus. Rodriguez je 2000 pisal o vplivu topnega fosfata na fermentacijski proces proizvodnje KK in njenih soli. V začetni fazi so držali koncentracijo topnega fosfata med 150 in 600 mg/L, po začetni fazi pa med 20 in 150 mg/L s tem, da so dodajali in odvzemali topen fosfat iz medija. Podobne rezultate so dobili Kranjc in Racman (1997) in Gupta (1998)

5.

Page 28: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

13

4.4 Vpliv prekurzorjev

Townsend in Ho sta 1985 raziskovala vpliv aminokislin na proizvodnjo klavulanske kisline.

Ugotovila sta, da se ornitin in arginin, aminokislini v sečnem ciklu, porabita več kot ostale

aminokisline, ki so primerne za izdelavo KK. Dodatno sta odkrila, da nastane

oksazolidinski obroč KK popolnoma iz amiokislin sečnega cikla, torej ornitina na začetku

in arginina na koncu. Eksperimenti z označevanjem z izotopi so natančno opisali

mehanizem vezave C3 in C5 sestavnih delov. C3 in C5 dela sta pridobljena iz primarnega

metabolizma in sprožita biosintezo KK. Sedaj so primarni metabolni prekurzorji za C3 in

C5 intermediate dobro poznani in vemo, da izhajajo iz glicerola in arginina/ornitina. Če

celica med fermentacijo vzdržuje celični metabolizem s tem, da se ves čas hrani z

glicerolom, to poveča proizvodnjo KK5.

Biosinteza klavulanske kisline se prične s kondenzacijo arginina in C3 prekurzorja.

Nadaljuje se z nizom reakcij, katerih produkt je proklavaminska kislina, ki se nato

preobrazi v klavaminsko kislino in nato v dokončno klavulansko kislino (Townsend in Ho,

1985, Valentine 1993, Stirling in Elson 1979). Nastanek C3 prekurzorja je hitrost določujoč

korak v biosintezi KK, saj dodajanje arginina ne pospeši proizvodnje KK (Ives in Bushell,

1997). Fang je 1996 opazil porast proizvodnje -laktamov, če kulturam dodamo

koncentracije lizina nad 10 mM. Dodatna prednost je bila, da se količina biomase ni

spremenila, četudi se je proizvodnja -laktamov povečala s povišanjem koncentracije

lizina5.

Ives in Bushell sta 1997 vnašala različne aminokisline v kemično neaktivne kulture S.

clavuligerus in sta prišla do spoznanja, da dodajanje aminokislin iz družine aspartatov (ki

so derivati piruvata) zmanjšajo porabo C3 prekurzorjev. Lizin je član družine aspartatskih

aminokislin. Raziskave so potrdile, da C3 prekurzor določa stopnjo proizvodnosti in da

izhaja C3 prekurzor iz piruvata. Če se konstantno dovajajo aminokisline aspartatov, te

zmanjšajo porabo piruvatov in omogočijo, da se celična rast in proizvodnja KK vršita

istočasno. Lizin, ki je prisoten v mediju, prepreči biosintezo lizina v mikroorganizmu, in

tako prepreči porabo piruvata za izgradnjo lizina5.

4.5 Vpliv načina delovanja bioreaktorja

Pri proizvodnji sekundarnih metabolitov se uporablja več različnih vrst bioreaktorjev, kot so šaržni, semišaržni in kontiunuirni bioreaktor. Semišaržni bioreaktor se uporablja bolj pogosto kot ostali modeli zaradi večje proizvodnje in enostavnejšega obratovanja. Kontrolirani vtok sestavin v semišaržnem bioreaktorju določa hitrost rasti celic, trajanje stacionarne faze in preprečuje inhibicijo substrata ali utišanje proizvodnje metabolita med postopkom

5.

Kontinuirni bioreaktor ima boljši izkoristek kot šaržni ali semišaržni bioreaktor zaradi boljšega časovnega izkoristka, saj odpadejo zastoji zaradi polnjenja ali praznenja bioreaktorja in ob pripravi in sterilizaciji le-tega. Vendar pri procesu, ki se vrši dalj časa v kontinuirnem bioreaktorju velikokrat pride do spremembe seva, ki zmanjšajo proizvodnost procesa. Ob tem je možnost kontaminacije v kontinuirnem bioreaktorju večja kot pri šaržnem ali semišaržnem

5.

Page 29: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

14

5 Stabilnost klavulanske kisline

Kot tudi drugi -laktamski antibiotiki je klavulanska kislina v svoji neobdelani obliki kemično nestabilna. Več avtorjev je raziskovalo stabilnost KK v pufernih vodnih raztopinah pri različnih pH (Haginaka 1981; Mayer in Deckwer 1996; Bersanetti 2005).

Haginaka je 1981 raziskoval stabilnost KK pri 35C in ionski moči () 0,5 pri različnih pH in je opazil, da je konstanta hitrosti reakcije razpada zelo odvisna od pH. KK je bila najbolj stabilna pri pH 6,39. Preučevali so tudi katalitični učinek različnih pufrov pri konstantnem pH in ionski moči. Ugotovitve so pokazale, da se konstanta hitrosti reakcije razpada (kd) povečuje s povečanjem koncentracije pufra (pufer je raztopina, ki se ji ob dodatku močne kislina ali močne baze pH bistveno ne spremeni). Konstanta hitrosti reakcije razpada (kd) je v veliki meri odvisna od pH. Logaritmična krivulja kd v odvisnosti od pH je parabola in ima minimum pri pH 6,4 in se strmo viša, tem bolj se približujemo kislemu ali bazičnemu koncu spektra. KK je približno 10-krat manj stabilna kot penicilin G pri neutralnih pH, pet- krat manj stabilna v alkalnih raztopinah, je pa enako stabilna pri kislih pogojih

5.

Temperatura ima močan vpliv na razpad KK. Na osnovi poskusov je Bersanetti poročal, da je stabilnost antibiotika pri 20C in ionski moči () 0,5 najvišja pri pH okoli 6,0. Razpad se pogosteje pojavlja v bazičnem mediju kot v kislem. Avtorji so pokazali odnos med konstanto hitrosti hidrolize KK v vodnih raztopinah in pH v razponu med pH 2 in pH 10. Odkritja kažejo, da ionska moč nima vpliva na stopnjo hidrolize v tem razponu

5.

Preiskovali so stabilnost KK in vitro ( in vitro je proces ali poskus poteka v nadzorovanem okolju v živem tkivu ali celicah, izoliranih iz organizma) in in vivo ( in vivo je proces ali poskus poteka v celotnem živem organizmu). Ugotovitve so pokazale, da je konstanta hitrosti reakcije inaktivacije (inaktivacija je postopek s katerim se uniči ali zaustavi aktivnost) v in vivo vzorcih za 2 do 10-krat večja kot ta v in vitro. Razlog je bil ta, da medtem ko je bila v in vitro vzorcih za razpad klavulanske kisline odgovorna samo kislinsko katalizirana hidroliza, kar je pokazala odvisnost konstante hitrosti reakcije razpada od pH, so v in vivo vzorcih bili prisotni še dodatni mehanizmi za razpad KK. Ti so delovali v stacionarni fazi gojenja kultur v mediju ekstrakta sojine moke

5.

Bersanetti je 2005 preučeval kinetiko razpadanja klavulanske kisline in odkrival najboljše pogoje (temperaturo in pH), pri katerih bi se KK izolirala iz fermentacijskega medija. Hitrost razpadanja KK je preučeval pri temperaturah 10, 20, 25, 30 in 40C in pH pri vrednostih 6,2 in 7,0, kar je razpon, pri katerem je bila odkrita najnižja stopnja razpada KK. Konstante hitrosti reakcije razpada so bile določene ob predpostavki, da reakcija sledi kinetiki psevdo-prvega reda. Uporabljala se je KK v vodni raztopini ali ta, ki je bila prisotna v kulturi medija. Konstanta hitrosti hidrolize kot funkcija temperature je sledila Arrheniusovi enačbi pri obeh pH. Rezultati so pokazali, da kinetika prvega reda razloži kinetiko hidrolize in da se lahko za izračun odnosa med konstanto hitrosti hidrolize in temperaturo uporablja Arrheniusova enačba pri obeh pH. Klavulanska kislina je v fermentacijski zmesi veliko manj stabilna kot v vodni raztopini in v zdravilih, ki so dostopna v prodaji. Prav tako je bilo ugotovljeno, da je KK bolj stabilna pri pH 6,2 kot pri 7,0, ne glede na izvor KK

5.

Lynch in Yang sta 2004 raziskovala učinek akumulacije KK v biomasi in proizvodnjo KK v šaržnih kulturah. Opisala sta, da je hitrost razpada enaka hitrosti proizvodnje KK po začetni stopnji dodatnega razpada. Rezultati so pokazali, da se klavulanska kislina proizvede in razpade znotraj sevov S. clavuligerus. Proizvodi razpada se ponovno uporabljajo v organizmu pri dodatni izdelavi antibiotika

5.

Page 30: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

15

6 Porazdelitev klavulanske kisline iz fermentacijske brozge v organsko topilo

Izolacija klavulanske kisline (ki je zelo nestabilna biokemijska substanca) iz fermentacijske brozge zahteva niz korakov, zaradi visoke vsebnosti primesi, ki so značilne za bioprocese. Ob koncu fermentacije brozgo očistimo s filtriranjem ali centrifugiranjem, s tem odpravimo micelje, ostanke celic in netopne delce. Sledi najbolj pomemben korak, ta je direktna ekstrakcija KK z organskim topilom. Pri ekstrakciji z vodo nemešljivim organskim topilom pride do porazdelitve klavulanske kisline iz očiščene fermentacijske brozge (vodne faze) v organsko topilo (organsko fazo). Iz organske faze (ekstrakta), bogate s klavulansko kislino, jo nato nadalje izoliramo z različnimi postopki

19.

Zaradi nizkih stroškov in učinkovitosti je solventna ekstrakcija najbolj razširjena tehnika za ločevanje antibiotikov. Veliko patentov opisuje ekstrakcijo klavulanske kisline v organska topila. Ekstrakcija KK v organska topila je močno odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti, kot so topnost, polarnost in dielektrična konstanta

19.

L.M. Brites s soavtorji v članku opisuje pogoje, postopke in dobljene rezultate pri ekstrakciji klavulanske kisline iz fermentacijske brozge z različnimi organskimi topili: butil acetatom, etil acetatom, metil izobutil ketonom, 2-butanolom in n-butanolom

19.

Uporabili so klavulansko kislino iz fermentacijske brozge, ki je produkt glive Streptomyces clavuligerus ATTCC 27064. Brozga je bila pridobljena v bioreaktorju, ki je deloval pri opisanih pogojih, ti pa so bili: 28°C, pH 6,8. Pred ekstrakcijo so fermentacijsko brozgo predhodno obdelali s centrifugiranjem, da je brozga bila bistra, pH so nato znižali (3,5 – 4,0), pri tem se je oboril del topnih trdnih snovi in proteinov, ki so jih odstranili s ponovnim centrifugiranjem in filtriranjem

19.

Koncentracijo klavulanske kisline so določali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), po njeni reakciji z imidazolom, sicer bi prisotnost drugih snovi lahko vplivala na UV analizo. HPLC je bil opremljen z fotodiodnim detektorjem, s kolonami z reverzno fazo pri temperaturi 28°C, s pretokom 2,5 mL/min in umerjen s faramcevtskim izdelkom Clavulin. Mobilna faza je bila 0,1 M KH2PO4 puferna raztopina z 6% metanolom, uravnana na pH 3,2 s fosforno kislino

19.

Določen volumen predhodno pripravljene fermentacijske brozge so nato močno mešali z določenim volumnom organskega topila, da se je vzpostavilo ravnotežje. Po ločitvi faz so določili ravnotežno koncentracijo klavulanske kisline v organski fazi COP (zgornja faza, manjša gostota) in v vodni fazi CAP (spodnja faza, večja gostota). Iz razmerja teh dveh koncentracij so določili porazdelitveni koeficient klavulanske kisline K=COP/CAP in je za različna topila prikazan v Tabeli 6-1, skupaj z lastnostmi topil, kot so dielektrična konstanta (d), polarnost, topnost v vodi (S) in molska masa (M)

19.

Page 31: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

16

Tabela 6-1: Porazdelitveni koeficient klavulanske kisline za različna topila19

Organsko

topilo

K d

( vakuum-1

)

S

(g/100g H2O)

M

(g/mol)

Butil

acetat

0,19 5,01 0,7 116,60

Etil

acetat

0,56 6,02 8,5 88,10

Metil

izobutil

keton

0,32 13,11 1,9 100,16

2-butanol 0,91 15,80 9,0 74,12

n-butanol 1,38 17,51 12,5 74,12

Iz tabele je razvidno, da je porazdelitveni koeficient KK obratno sorazmeren z molsko maso topila. Vpliv d na K ni mogoče enostavno teoretično povezati. Čeprav ima n-butanol večji porazdelitveni koeficient za KK kot etil acetat, je etil acetat boljše topilo za ekstrakcijo zaradi manjše topnosti vode in nižjega vrelišča. Ugotovljeni optimalni pogoji za ekstrakcijo klavulanske kisline z etil acetatom so pH 1,63 s koeficientom porazdelitve 0,73 in 35,6% izkoristkom

19.

Pri nizki vrednosti pH imajo beta-laktamski antibiotiki, vljučno s klavulansko kislino, običjano protonirano karboksilno skupino. Posledica tega je, da so slabo topni v vodi in jih lahko ekstrahiramo v organsko topilo. Klavulanska kislina je šibka kislina s pKa=2,5 in samo nedisociirana kislina se lahko ekstrahira z organskim topilom

19.

Page 32: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

17

7 Izolacija klavulanske kisline iz fermentacijske brozge

Proizvodnja KK poteka s fermentacijo, ki ji sledijo fizikalno-kemični postopki izolacije in

čiščenja KK. Te stopnje obsegajo različne tehnike, kot so filtracija in centrifugiranje za

ločitev celic, temu sledi ekstrakcija in/ali adsorpcijske tehnike za nadaljne čiščenje

antibiotika. Z neposredno ekstrakcijo z organskim topilom se KK prenese v organsko fazo

in tako nadalje očisti. Iz organske faze jo lahko ločimo z uparevanjem topila, kar pa

predstavlja večje stroške in večjo razgradnjo KK zaradi njene nestabilnosti.

Postopek z obarjanjem KK s kalijevim 2-etil heksanoatom neposredno iz organske faze

priporočajo Hirata in sodelavci, zaradi ekonomske učinkovitosti kot tudi stabilnosti in

čistosti produkta6.

Za optimizacijo procesa so avtorji izvajali poskuse s tremi različnimi viri klavulanske

kisline:

• kalijev klavulanat iz farmacevtskega izdelka Clavulin ®, ki ga proizvaja Smith Kline

Beecham laboratorij (sestavljen iz 625 mg amoksicilina in 125 mg kalijevega klavulanata)

• klavulanska kislina / celuloza z 37% teže klavulanske kisline, ki jih dobavlja Gist

Brocades, zdaj DSM proti infekcijska, Delft, Nizozemska

• klavulanska kislina iz fermentacijske brozge s Streptomyces Clavuligerus ATCC 27064.

Fermentacijski medij je bil sestavljen iz glicerolne raztopine in izoliranih sojinih proteinov

(beljakovin) Supro 783 (Solae Company), dopolnjen z ornitinom, mineralnimi solmi

(NH4)2SO4 in KH2PO4. V nekaterih primerih je kulturni medij (gojišče) vseboval sojino

olje namesto ornitinina in PROSAN sojino moko namesto proteinov (supro 783). Na koncu

fermentacije so pH brozge povečali na 6,2 z dodatkom 18N fosforne kisline in jo ohladili

na temperaturo med 11 in 20°C ter filtrirali skozi polisulfonsko mikro filtracijsko

membrano s premerom por 0,2 µm. Pronico iz tega koraka so uporabili za ultrafiltracijo.

Vzorec fermentacijske brozge so posušili v centrifugi (SpeedVac) in nato so raztopili v

devterijevem oksidu za analizo NMR6.

7.1 Analizne metode

Koncentracijo klavulanske kisline so iz fermentacijski brozge določili s tekočinsko

kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z imidazolno reakcijo. Vzorce so analizirali z

uporabo HPLC sistema, opremljenega z fotodiodnim detektorjem in 3,9 x 300 mm C18-µ

Bondapak analitsko kolono. Naprava je delovala pri 28ºC in hitrosti pretoka 2,5 mL / min.

Standardne raztopine pripravimo iz farmacevtskega izdelka Clavulin ®.

Analizo s tankoplastno kromatografijo (TLC) so izvedli na TLC plastičnih ploščah s Si

gelom in spirali z različnimi mešanicami topil. Plošče so obsevali z ultravijolično svetlobo

pri 254 nm. To kromatografsko tehniko so uporabili za določanje lastnosti spojin, ki so jih

ločili in za izbiro najprimernejše kromatografske tehnike.

NMR spektre so posneli na Bruker ARX400 9,4 T spektrometru, ki deluje na 400,35MHz

za 1H in 100,10MHz za

13C kanal. Vsi NMR podatki so bili pridobljeni pri 25ºC, z uporabo

TMS kot interno referenco ter devterijev oksid kot topilo6.

Page 33: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

18

7.2 Postopek optimizacije

Postopek je na spodnji sliki 7-1, katera prikazuje shemo procesa in smo jo načrtovali za lažji predgled operacij, ki so jih avtorji izvajali med poskusom določitve optimizacije.

Poskusi s Clavulin ® so bili izvedeni6 v dveh različnih skupinah, katerih cilj je opredeliti

vpliv koncentracije KK v organskem topilu in koncentracije kalijevega 2-etil heksanoata na

direktno reakcijo obarjanja kalijevega klavulanata. Tablete (surovina) so raztopili v

destilirani vodi (topilo 1) in zmes so filtrirali skozi 0,45 µm membrane. Vodno raztopino

klavulanske kisline so nakisali z H2SO4 na pH 2,0 (pri tem pH je klavulanska kislina v

molekularni obliki) in stresali z etil acetatom (topilo 2). To topilo je bilo izbrano, ker je

voda mnogo manj topna v tem topilu kot v n-butanolu. Etil acetat so ločili in preostalo

vodno raztopino ponovno ekstrahirali dvakrat z etil acetatom (topilo 2). Organske frakcije

so združili in sušili z ustreznim sušilnim sredstvom in koncentrirali v rotacijskem

uparjalniku do ustrezne koncentracije6.

Koncentrirano raztopino klavulanske kisline in etil acetata so prenesli v stekleni reaktor,

kjer so vsebino mešali s propelerskim mešalom, s hitrostjo 250 vrtljajev na minuto. Reaktor

je bil obdan z vodnim plaščem, skozi katerega je krožila termostatirana voda 15°C in s tem

vzdrževala vsebino pri tej temperaturi. V raztopino so dodali po kapljicah (1 kapljica v 120

s) kalijev 2-etil heksanoat (topilo 3) in raztopino mešali 1 uro. Izpadle produkte so filtrirali

in očistili z izopropanolom in acetonom (topilo 4). Pridobljene kristale so sušili v vakuumu

24 ur pri sobni temperaturi in jih stehtali6.

Page 34: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

19

razstapljanje

surovina

topilo1

filtriranje

nakisanje

stresanje

topilo 2

ekstrahiranje

topilo 2

sušenjein

koncentriranje

termostatiranjein

mešanjemešanjefiltriranje

topilo3

topilo4

cišcenje sušenje

koncni produkt

Slika 7-1: Blokovna shema procesa z osnovnimi informacijami.

Page 35: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

20

Dobitek kristalov (Y) so izračunali z enačbo:

Y(%) = m(exp) /m(t) X 100 (1)

m(exp) je masa, dobljena eksperimentalno in m(t) je teoretična masa za 100% konverzijo.

Pogoji, pri katerih so bile najboljše vrednosti v poskusih z Clavulin ®, so bili uporabljeni za

klavulansko kislino iz fermentacijske brozge6.

7.3 Opažanja

Ekstrakcija tekoče-tekoče, je bila izvedena s topilom etilacetat, ki kljub temu da vsebuje nižji porazdelitveni koeficient (0,65) od n-butanola (1,85), ima večjo selektivnost za klavulansko kislino kakor amoksicilin, topnost vode je v njem manjša in ima nižje vrelišče, s čimer je olajšan proces koncentriranja ter s tem večja prednost obarjanja KK s soljo.

Predhodni rezultati so pokazali, da izkazuje etilacetat dobro selektivnost za KK, ki daje

srednji izkoristek v primerjavi z drugimi topili, predvsem z n-butanolom (boljši izkoristek

reakcije). Sicer, pa je velika prednost etilacetata ta, da zelo slabo topi vodo. Prisotnost vode

namreč povzroča nadaljnje obarjanje z heksanoatnimi solmi6.

Reakcija med KK in kalijevo 2-etil heksanoatno soljo, katere produkt je kalijev klavulanat,

je predstavljena na sliki 7-2.

Slika 7-2: Reakcija med klavulansko kislino in kalijevim 2-etil heksanoatom6

Kalijev klavulanat, ki je bil pridobljen iz obarjanja Clavulina® pri eksperimentih od 1A do 5A, je bil v stabilni trdni kristalinični obliki bledo rumene barve. Pri eksperimentih od 6A do 8A so nastala olja, ki so jih analizirali s pomočjo TLC in

1H- NMR spektrov, kjer so

analize pokazale da je bila KK prisotna v svoji kisli obliki. Ti rezultati so prikazani v tabeli 7-1.

Page 36: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

21

Tabela 7-1: Rezultati obarjanja6

Eksperiment Eksperimentalna masa

kalijevega klavulanata

(mg)

Teoretična masa

kalijevega klavulanata

(mg)

Izkoristek (%)

Prva kombinacija

1A 40,19 133,38 30,00

2A 62,56 133,98 46,69

3A 37,35 334,96 11,15

4A 154,86 334,96 46,23

Druga kombinacija

5A 148,49 200,97 73,89

6A Olje 200,97 0,00

7A Olje 486,94 0,00

8A Olje 486,94 0,00

Tabela 7-2: Pogoji za obarjanje klavulanske kisline iz izdelka Clavulin6

Eksperiment Masa

klavulanske

kisline (mg)

Volumen

vodne

raztopine

(ml)

Volumen

organske

faze (ml)

Koncentracija

klavulanske

kisline v

organski

raztopini

(mg/ml)

Koncentracija

kalijevega 2-

etilheksanoata

(M)

Volumen

kalijevega 2-

etilheksanoata

(ml)

Prva

kombinacija

1A 250 40 120 5 0,5 1,15

2A 250 40 120 5 2,0 0,30

3A 625 100 300 25 0,5 2,85

4A 625 100 300 25 2,0 0,75

Druga

kombinacija

5A 375 60 180 15 0,3 2,85

6A 375 60 180 15 0,7 1,25

7A 875 140 420 35 0,3 6,60

8A 875 140 420 35 0,7 2,85

V prvi skupini (opisano v tabeli 7-2) je prikazano zvišanje oz. povečanje začetne koncentracije KK (5-25 mg/mL), ko je ta v kombinaciji z 0,5 M kalijevim 2-etil heksanoatom, s čimer se je prispevek oz. izkoristek obarjalne reakcije precej znižal. Z zvišanjem koncentracije kalijevega 2-etil heksanoata na 2,0 M in enakih spremembah koncentracij KK (5-25 mg/mL) ni bilo kakšne spremembe pri izkoristku reakcije. Opaziti je bilo tudi, da ima koncentracija kalijevega 2-etil heksanoata močnejši vpliv pri višji koncentraciji KK (25 mg/mL), s čimer se je sam izkoristek reakcije izboljšal. Najboljši

Page 37: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

22

doprinos (46,49%) je bil v tej skupini pri poskusu z nižjo koncentracijo KK (5 mg/mL) in višjo koncentracijo kalijevega 2-etil heksanoata (2,0 M).

V drugi skupini so najboljši izkoristek reakcije (73,89%) dosegli pri poskusu 5A, v kombinaciji s KK s koncentracijo 15 mg/mL in kalijevega 2-etil heksanoata s koncentracijo 0,3 M. Takšen rezultat (73% izkoristek) potrjuje tudi patent, kjer pa ni točnih podatkov o samem poteku procesa obarjanja.

Nenazadnje, povečanje koncentracije kalijevega 2-etil heksanoata iz 0,3 M na 0,7 M (pri čemer vzdržujemo koncentracijo KK pri 15 mg/mL), vodi do nastanka emulzij namesto oborine. Do nastanka emulzij prihaja prav tako v primeru, ko je bila koncentracija KK zvišana iz 15 mg/mL na 35 mg/mL, pri obeh znanih koncentracijah kalijevega 2-etil heksanoata (0,3 in 0,7 M). Tako lahko ugotovimo, da v tej skupini, če povečamo koncentracijo ene ali druge komponente, le-to vodi do nestabilne obarjalne reakcije, le-to pa vodi do nastanka emulzij.

Med vsemi preučevanimi kombinacijami komponent, so bili najboljši izkoristki reakcij 73,89% in 46,69%, dobljeni pri poskusih 5A in 2A. Na podlagi teh rezultatov so bili tudi povzeti eksperimenti za obarjanje kalijevega klavulanata iz fermentacijske brozge

6.

Page 38: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

23

8 Zaključek

Študija literature je pokazala, da je klavulanska kislina pomenben β-laktamski antibiotik. To je vrsta penicilinskih antibiotikov, ki pomagajo pri premagovanju bakterij, katere so že razvile odpornosrt proti tem antibiotikom. Na način, da klavulanska kislina zavira ali omejuje nastajanje laktamaze, penicilin pa jih ubije. To kislino se pridobiva z biosintezo in fermentacijo, na pridobivanje pa vplivajo: ogljik, dušik, fosfati, prekurzorji in delovanje bioreaktorja.

Ogljikovi hidrati so najenostavnejši izvor energije za rast in proizvodnjo sekundarnih metabolitov, največja proizvodnja je bila dosežena pri uporabi sojinega olja. Izvori dušika so ekstrakt plesni, koruzni sirup, rastlinske beljakovine, in beljakovine iz sojinih semen. Ugotovitve so pokazale, da se je ob uporabi sojinih kalčkov proizvodnja povečala za dvakratno vrednost, kot pri uporabi sojine moke. Fosfati so pomembno rast določujoče hranilo in vplivajo na sintezo. Ugotovili so, da fosfati s koncentracijami 0,3 do 300 mM pospešujejo rast, a izkazalo se je, da se že pri koncentraciji 10mM in več zavira biosinteza antibiotikov. Pri proučevanju vpliva prekurzorjev je bilo ugotovljeno naslednje, če celica med fermentacijo vzdržuje celični metabolizem s tem, da se ves čas hrani z glicerolom, se proizvodnja močno poveča. Izbira delovanja bioreaktorja je zelo pomembna in ugotovili so, da ima kontinuirni največji izkoristek glede na proizvodnjo.

Pri ekstakciji klavulanske kisline iz fermentacijske brozge so bila uporabljena naslednja topila kot so: butil acetat, etil acetat, metil izobutil keton, 2-butanol in n-butanol. S temi topili so bili določeni porazdelitveni koeficienti. Pri izbiri najboljšega ekstrakcijskega topila, igra najbolj pomembno vlogo strošek za odstranjevanje vode iz procesa. Pri ekstrakciji klavulanske kilsine iz fermentacijske brozge je uporabno topilo n-butanol, vendar pa ima slabo lastnost, da je voda v njem zelo topna in posledica tega je, da se zmanjšuje končno izločanje klavulanske kisline. Zato je kot ekstrakcijsko topilo največkrat v uporabi etil acetat. Za katega velja, da pri optimalnih pogojih, to je vrednosti pH pri 1,63 vsebuje vrednost ekstrakcije 36,5% in ima vrednost porazdelitvenega koeficienta 0,73.

Iz organske faze lahko nadalje ločimo KK z uparevanjem topila, kar pa predstavlja večje stroške in razgradnjo kisline zaradi njene nestabilnosti. Postopek z obarjanjem klavulanske kisline s kalijevim 2-etil heksanoatom neposredno iz organske faze priporočajo Hirata in sodelavci, zaradi ekonomske učinkovitosti kot tudi stabilnosti in čistosti produkta. Proces so optimirali in kombinirana koncentracija 15mg/mL klavulanske kisline in 0,3M kalijevega 2-etil heksanoata omogoča zelo dobro čiščenje. Ta reakcija daje visok izkoristek kalijevega klavulanata iz fermentacijske brozge, ki znaša 69,53%.

Pri tej metodi se izognemo nastajanju toksičnih ali higroskopskih soli klavulanske kisline.

Obarjanje je zelo obetavni proces, saj na koncu procesa ni potrebno izhlapevati topila. S tem se preprečuje razgradnja nastalega produkta. Tako na koncu dobimo zelo čist produkt- kalijev klavulanat.

Page 39: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

24

9 Literatura

1. Wikipedija, Betalaktamski antibiotik. http://sl.wikipedia.org/wiki/Betalaktamski antibiotik

(dostop 26.8.13)

2. S.J. Coulthurst, A.M.I. Barnard, G.P.C. Salmond, Regulation and biosynthesis of

carbapenem antibotics in bacteria, Nat. Rev. Microbiol. 3 (2005) 295-306.

3. Lemke L.T. Williams A. D. Roche F. V. Zito S.W. Foye's principles of medicial

chemistry. 6 izdaja. Baltimore, Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters

Kluwer business, 2008.

4. Jenson SE, Paradkar AS. Biosynthesis and molecular genetics of clavulanic acid.

Antonie van Leeuwenhoek 75:125–33, 1999.

5. Saudagar PS, Survase SA, Singhal RS. Clavulanic acid: A review. Biotechnology

Advances 26, 335-351, 2008.

6. D.B. Hirata, J.H.H.L. Oliveira, K.V. Leăo, M.I. Rodrigues, A.G. Ferreira, M. Giulietti,

M. Barboza, C.O. Hokka, Precipitation of clavulanic acid from fermentation broth with

potassium 2-ethyl hexanoate salt. Separation and Purification Technology 66, 598–605,

2009.

7. Al Mahdawi D. Ločevanje lipidnih razredov s tankoplastno kromatografijo in

ekstrakcijo na trdni fazi. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in

kemijsko tehnologijo, 2011.

8. Knez Ž. Škerget M. Termodifuzijski separacijski procesi. Maribor: Univerza v

Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2003.

9. Beranek M. Pobežin G. Priročni slovar tujk. 1. Izd. Ljubljana: Cankarjeva založba,

2005.

10. Dolanc D. Nmr spektroskopija. www.shrani.si/f/46/6n/1ZfrMHtL/nmrspektroskopija.doc

(dostop 10.8.2013)

11. Plantan N. Validacija metode za določanje bisfenola a v izcedni vodi s tekočinsko

kromatografijo visoke zmogljivosti. Nova Gorica: Univerza v Novi Gorici Fakulteta za

znanosti o okolju, 2012.

12. Brodnjak Vončina D. Analizna kemija II. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za

kemijo in kemijsko tehnologijo, 2006.

13. Svete J. Preparativna organska kemija. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za

kemijo in kemijsko tehnologijo, 1999.

14. http://projekti.gimvic.org/2003/2c/naravnabarvila/metoda_ekstrakcije.htm (dostop

7.7.2013)

15. Lek, Ljubljana – Zg-AMK, REN-1136-D-9408-s)

16. Lek, Amoksiklav. Ljubljana – SM389-AMK-711-D-8808-s – Gorenjski tisk, Kranj)

17. http://micro.digitalproteus.com/morphology2.php (dostop 12.5.2013)

18. Kranjc P. Organska kemija 2. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje

in matematiko.

19. Brites LM, Oliveira JH, Barboza M. Effect of physicochemical properties of solvents on

clavulanic acid extraction from fermentation broth. Latin American Applied Research

42, 65-70, 2012.

Page 40: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

25

10 Priloge

10.1 Teoretični opis in način čiščenja

EKSTRAKCIJA

Ekstrakcijska metoda se uporablja za čiščenje oziroma ločevanje snovi iz zmesi ali raztopine. Ta temelji na porazdelitvi med dve fazi, kateri se ne topita druga v drugi. Odvisna pa je od razlik v topnosti spojin v ekstrakcijskem topilu v posameznih fazah. Spojine, ki nastopajo v fazah so lahko polarne ali nepolarne. Pri izbiri primernega ekstrakcijskega topila moramo upoštevati topnostno pravilo, ki temelji na dejstvu, ki pravi: podobne snovi se raztapljajo v podobnih topilih, polarne spojine se raztapljajo v polarnih topilih in nepolarne spojine se raztapljajo v nepolarnih topilih

13-16 .

Spojine so lahko v trdnem, plinastem in tekočem agregatnem stanju. Dva najpogostejša ekstrakcijska primera postopkov, ki se uporabljata za izluževanje ali čiščenje spojin sta:

Ekstrakcija trdno-tekoče

Ekstrakcija tekoče-tekoče

Ekstrakcija trdno-tekoče

Postopek ekstrakcije trdno-tekoče je uporaben za ločevanje in izolacijo spojin iz trdnih vzorcev. Če želimo pri postopku ekstrakcije trdno-tekoče biti kar se da najbolj učinkoviti ali uspešni, je pomembno, da je spojina, katero hočemo izolirati (očistiti), dobro topna v topilu, ki smo ga izbrali, obenem pa bi želeli, da nečistoče ostanejo neraztopljene ali netopne. Ko je ekstrakcija končana, želeno spojino izoliramo z različnimi separacijskimi postopki. Suspenzijo moramo filtrirati in filtrat upariti in ga s tem postopkom skoncentriramo

13.

V nasprotnem primeru, kadar želimo izbrati takšno topilo, katero bo učinkovalo tako, da se bodo v njem raztopile samo nečistoče v trdnem vzorcu z raztapljanjem v izbranem topilu medtem ko spojina v njem ni topna. Po končanem ekstrakcijskem postopkom to spojino izoliramo s pomočjo filtracije pri znižanem tlaku. Ekstrakcijo izvedemo na način, da vzorec suspendiramo z uporabo primernega topila z mešanjem, nato pa s filtriranjem ločimo trden preostanek iz raztopine

13.

Ekstrakcija tekoče-tekoče

Ekstrakcija tekoče-tekoče je ločitvena metoda, ki temelji na različni topnosti faznih komponent zmesi v topilu. Raztopina zmesi je v kontaktu s topilom,ki sta mešljiva v malem razmerju ali pa se med seboj ne mešata. Pri tem nastaneta dve fazi, ki ju ločimo s fizikalnim postopkom in odstranimo ekstrahirano komponento iz topila. Ekstrahirana prvotna raztopina zmesi se imenuje rafinatna faza, s pomočjo topila na novo nastala raztopina pa ekstraktna faza

8.

Page 41: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

26

Slika A1: Potek ekstrakcije tekoče-tekoče

8

Cilj ekstrakcije je prenos topljenca iz enega v drugo topilo. Največkrat se za to uporablja kombinacija vode in nepolarnega organskega topila, katerega predstavniki so: estri, etri, ogljikovodiki in klorirani ogljikovodiki. V kakšnem merilu bo ekstrakcija učinkovita je odvisno od porazdelitvenega koeficienta in števila ekstrakcij. Porazdelitveni koeficient je odvisen od razlike med ravnotežno koncentracijo topljenca v topilu A (CA) in ravnotežno koncentracijo topljenca v topilu B (CB)

13.

K = CA/CB (A1)

Pri izbiri topila, ki ga potrebujemo za izvedbo ekstrakcije moramo upoštevati naslednje: da ne reagira s spojino katero ekstrahiramo, da imata obe topili čim večjo razliko v gostoti, da se da po stresanju fazi v čim krajšem času ločiti. Pomembno je izbrati takšno topilo, katero ima dokaj primerno vrelišče, kajti vrelišče ima pomembno vlogo, ker ga je potrebno po končani ekstrakciji odpareti in s tem odstraniti, da bi to najlažje storili so za to najprimernejša topila v območju vrelišča med 30°C in 150°C

8.

V organski kemiji se največkrat uporablja kombinacija vode in nepolarnih topil, s tem se dosežejo naslednji učinki:

selektiven prenos organske spojine iz vodne v organsko fazo tako da, ostanejo

polarne in ionske komponente raztopljene v vodi.

Odstranijo se polarne in ionske spojine, poleg njih tudi kislinske in bazne primesi v

raztopinah z organskimi spojinami v nepolarnih topilih13

.

Ekstrakcija tekoče-tekoče se uporablja za ločevanje tekočih zmesi, kadar je to edina najučinkovitejša razpoložljiva metoda in poleg tega tudi metoda ki je najbolj ekonomična. Če želimo imeti čim bolj ekonomičen in kar se da najbolj varen proces ekstrakcije izberemo topila, ki morajo imeti lastnosti kot so:

Topnost komponente katero ekstrahiramo mora biti dovolj velika, s tem dosežemo

primernejšo porazdelitev in s tem tudi visoko selektivnost ß za komponento A, ki je

definirana: ß = (Ya/Yb)/(Xa/Xb). V tej enačbi predstavlja X delež ene in druge

komponente z indeksi (a,b) v rafinatni fazi, Y pa predstavlja deleže v ekstraktni fazi.

Mešljivost med topilom in nosilcem mora biti čim nižja.

Velika razlika v hlapnosti med topilom in ekstrahirano komponento, kar omogoča

lahko ločljivost topila iz ekstraktne faze.

Page 42: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

27

Težja in lažja faza naj imata čim večjo razliko v gostoti, kar omogoča lažje

ločevanje.

Za preprečevanje nastanka težko ločljivih emulzij je dobro upoštevati dovolj veliko

razliko v gostoti in površinski napetosti med fazama.

Čim nižji parni tlak pri delovni temperaturi, kar preprečuje nastajanje izgub zaradi

uparevanja topila.

Mora imeti nizko viskoznost.

Ne sme povzročati korozije.

Mora imeti dobro termično in kemično obstojnost.

Čim nižja cena.

Toksičnost naj ima čim nižjo.

Mora biti negorljiv.

Zaradi tega ker, solventna ekstrakcija temelji na sistemih, kateri imajo porazdelitveni koeficient (K) nižji od ena ima le ta visoko vrednost. Solventen ekstrakcije na podlagi procesa ločevanja razdelimo glede na možne interakcije med topilom in topljencem na

8:

Fizikalni tip ekstrakcije

Kemijski tip ekstrakcije

Pri fizikalnem tipu ekstrakcije odstranjujemo topljenec iz ekstrakta s fizikalnimi metodami, največkrat z destilacijo. Relativna mešljivost obeh faz se spreminja glede na koncentracijo topljenca. Porazdelitveni koeficient ima vrednost okoli ena. Tak sistem uporabljajo pri separacijah aromatskih od alifatskih ogljikovodikov.

Kemijski tip ekstrakcije ima visok porazdelitveni koeficient (do 10⁴), boljšo kinetiko ter večjo kapaciteto ekstraktne faze. Interakcije med topilom in topljencem, katere se pojavljajo pri tem tipu ekstrakcije jih ločimo z nasprotnimi kemijskimi interakcijskimi metodami, ki je kontaktiranje z vodno fazo z različnim pH. Tak sistem ekstrakcije se uporablja za

8:

- pridobivanje cinka, urana, vanadija

- ostale hidrometalurške procese

EKSTRAKCIJSKI POSTOPKI TEKOČE-TEKOČE

Pri izvajanju ekstrakcijske metode za primer kadar ločujemo med seboj tekoče komponente v zmesi tekočin si lahko pomagamo z različnimi poznanimi postopki, ti pa so:

enostopenjska ekstrakcija

večstopenjska ekstrakcija s križnim tokom oziroma protitokom

večstopenjska ekstrakcija s protitokom in obtokom ekstrakta

porazdelitev protitoka z uporabo dveh topil

Page 43: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

28

ENOSTAVNA ENOSTOPENJSKA EKSTRAKCIJA

Slika A2: Enostavna enostopenjska ekstrakcija8

Za izvedbo tega ekstrakcijskega postopka moramo na začetku dovesti zmes začetne raztopine F in topilo v mešalno cono, kjer obe komponenti dobro premešamo. Z mešanjem vzpostavimo porazdelitveno ravnotežje. Ko je ravnotežje doseženo v ločevalnem delu ekstraktorja, le tega zapustita ekstraktna in rafinatna faza. Na čim lažje premešavanje obeh tekočih faz najbolj vpliva viskoznost faz, ki pa naj bi bila čim nižja. Površinska napetost med fazama je odvisna od razlike v gostoti. Fazi med seboj ločujemo s centrifugiranjem. Na hitrejšo ločitev faz najbolj vpliva razlika v gostoti, katere pomen je, da čim manjša je fazna viskoznost, tem večja je medfazna površinska napetost. Ekstraktna faza je sestavljena iz komponente A in topila, lahko pa tudi vsebuje ostanke nosilca. Rafinatno fazo sestavljajo nosilec, ostanek topila in komponenta A. Ta postopek se lahko uporablja za šaržno in kontinuirno delovanje

8.

Page 44: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

29

10.2 Analizne metode dela

Kromatografija

Kromatografija je separacijski proces, pri katerem najprej ločimo posamezne komponente v vzorcu, zaznavamo pa jih z ustrezno detekcijo. Komponente preiskovanega vzorca se ločujejo na osnovi fizikalnih in kemijskih lastnostih in razlike v fizikalnih interakcijah mobilne in stacionarne faze. Molekule prehajajo med fazama, vendar v stacionarni fazi mirujejo, v mobilni pa se premikajo. Ločevanje poteka na osnovi, da mobilna faza s seboj prenaša komponente vzorca, katere nanesemo na kolono, te pa se porazdelijo med obe fazi. To se ponavlja in poteka do konca kolone, kjer posamezne komponente ločeno izhajajo iz kolone. Izhodne komponente se zaznava s specifičnimi detektorji, ki ustvarijo signalni zapis. Signali so kromatografski vrhovi, celotna krivulja pa kromatogram. Ploščina pod vrhom signala je sorazmerna s koncentracijo, podaja pa kvantitativno informacijo.

Retenzijski čas je čas, v katerem se snov pri danih pogojih premika skozi kolono. Definiramo ga kot čas, v katerem se komponenta zadržuje v koloni in je enak za vsako organsko substanco pri izbranih pogojih. S primerjavo teh časov z retenzijskimi časi znanih spojin, lahko ugotovimo kvalitativno sestavo vzorca. Dve komponenti sta ločeni, takrat ko se njuna retenzijska časa razlikujeta. Ta je sestavljen iz dveh delov: časa v katerem je molekula v mobilni fazi in ko je v stacionarni fazi.

( ) ( ) ( ) (A2)

Časovno razmerje med t(m) in t(s) je lastnost, ki podaja termodinamsko povezavo med topljencem v določenem sistemu. To pa imenujemo kapacitivni faktor.

( ) ( ) (A3)

Kapacitivni faktor ima vrednost, katera se lahko spreminja med nič in neskončnostjo. Vrednost nič pomeni, da je topljenec prešel nazadržan skozi kolono, vrednost neskončno pa, da se je topljenec med prehodom skozi kolono popolnoma vezal in ga pri teh pogojih ni možno eluirati

12.

TANKOPLASTNA KROMATOGRAFIJA

Tankoplastna kromatografija je separacijska tehnika, kjer ločevanje poteka na tanki plasti stacionarne faze, to nanesemo na podlogo. Komponente stacionarne faze so anorganske ali organske. Med anorganske sodijo: silikagel, aluminijev oksid, silikati … Med organske pa: celuloza, poliamid …

Stacionarno fazo nanesemo na stekleno, aluminijasto oziroma plastično ploščo. Vzorce dodamo na stacionarno fazo od 1 cm do 2 cm od spodnjega roba plošče s pomočjo kapilar ali mikropipet. Ploščo damo v kromatografsko celico z mobilno fazo. Mobilna faza vsebuje organsko topilo, katero se z vodo ne sme mešati. Na svoji poti nese komponente vzorca, ki smo jih nanašali po stacionarni fazi. Kadar sta stacionarna in mobilna faza pravilno izbrani, se nanešen vzorec loči med potovanjem mobilne faze po plošči navzgor. Ko prispe do določene višine se ločevanje prekine, ploščo pa posušimo. Ločene komponente so na plošči vidne kot večje ali manjše lise, katere se opazi pri vidni svetlobi

7.

Page 45: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

30

TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI (HPLC)

HPLC se zelo pogosto uporablja kot ena izmed tehnik tekočinske kromatografije. Pri tem stacionarno fazo sestavlja veliko število majhnih delcev velikosti 3-20 µm. To zagotavlja, da je ločevanje čim bolj učinkovito. Mobilno fazo s pomočjo visokega tlaka potiskamo skozi stacionarno fazo, katera je nameščena v koloni. Z visokim tlakom zagotovimo, da je konstanten pretok. HPLC sistem je osnovan iz specializiranih enot. Te se posamezno uporablja, lahko pa so integrirane v sestavo. HPLC je sestavljen iz enot sistema, ki so predstavljene na sliki

11:

- rezervoar za mobilno fazo,

- črpalka,

- avtomatski injektor,

- termostatirana komora s kromatografsko kolono,

- detektor in

- instrument za zapis signala (računalnik s programsko opremo).

Slika A3: Shema HPLC sistema11

Med posameznimi enotami se vzpostavi kroženje mobilne faze, katero omogoča sistem malih cevi. Te so sestavljene iz nerjavečega materiala ali polimera polieter in odporne na visok tlak ( do 400 barov). Vse te komponente predstavljajo dva dela in sicer separacijski ter detekcijski del. Prvi je namenjen za separacijo in drugi za detekcijo. Separacijski del je sestavljen iz črpalke, injektorja in kromatografske kolone, detekcijskega pa iz enega ali večjih detektorjev in instrumenta s katerim zapišem dobljeni signal

11.

Črpalka mora zagotavljati konstanten in stabilen pretok mobilne faze, kajti od tega je odvisna natančnost analize. S pomočjo injektorja zagotovimo kakovostno ponovljivost med posameznimi doziranji. Kolona je najbolj pomemben del sistema, saj tu potekajo ključni separacijski procesi. S pomočjo detektorja pa substance, ki so bile ločene, na koloni postanejo vidne. Te vidne komponente pa posnamemo z instrumenti za zapis signala

12.

Page 46: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

31

NMR SPEKTROSKOPIJA

Nuklearna magnetna resonanca (NMR) se uporablja kot spektroskopska tehnika v organski kemiji. NMR spektri prikažejo največ podatkov o zgradbi molekul. Z njo se največkrat preučuje strukturo organskih spojin, s to metodo se lahko opazuje jedra atomov vodika, ogljika ter drugih najpogosteje zastopanih elementov v organskih molekulah. Z nadaljnim razvojem spektrometrov je prišlo do večje zmogljivosti le teh. S tem je omogočeno opazovanje velikega števila jeder. Njeno uporabnost so začeli uporabljati na drugih področjih kemije. Njena uporaba je mogoča pri elementih, ki imajo magnetna aktivna jedra, le teh pa je zelo veliko število. Prednost te metode je , da omogoča opazovanje prisotnosti atomov določenih elementov v molekulah, količino teh atomov, odnose med njimi in z drugimi atomi ter še celo vrsto stvari, kot so dinamični pojavi v molekulah itn

10.

Jedrski spin in resonanca

Jedra atomov imajo pozitiven naboj, nekatera imajo tudi spin. V fiziki spin predstavlja vrtenje nabitega delca,ta pa ima za posledico nastanek magnetnega polja.

Slika A4: Jedrski spin, ta predstavlja vrtenje jedra, s tem nastane magnetno polje10

.

Smer spina in magnetnega momenta je poljubna, to pomeni, da je energija orientacije v prostoru enaka. To se spremeni če delec postavimo v zunanje magnetno polje z magnetno gostoto B. Atomski magnetek se v zunanjem polju orientira vzporedno oziroma nasprotno z gostoto magnetnega polja B , lahko pa tudi pravokotno. Ta energijska stanja ali položaji so odvisni od spinskega kvantnega števila I

10.

Slika A5: Prikaz energijskih stanj, njihovo število pa je odvisno od kvantnega števila10

Page 47: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

32

Razliko energij za jedro s spinskim kvantnim številom 1/2 opisuje naslednja enačba:

Bh

hE

2

(A4)

V enačbi predstavlja ν frekvenco elektromagnetnega valovanja s katerim se vzbuja atomska jedra , h je Planckova konstanta, B pa gostota zunanjega magnetnega polja.

NMR spekter

Za NMR spektroskopijo obstajajo dve vrsti instrumentov. Obema je skupno, da v močno magnetno polje postavimo vzorec z magnetno aktivnimi atomskimi jedri. Nato polje obsevamo z elektromagnetnim valovanjem ustrezne frekvence. Atomska jedra v vzorcu vzbudimo z močnim kratkim radio frekvenčnim valovanjem. Vzbujena jedra se umirjajo in oddajajo različne frekvenčne signale, ki jih jedra oddajajo. Te pa tuljava sprejema. Umirjajoče signale atomskih jeder se zapiše v spomin računalnika in obdela s Fourierovo transformacijo. Ta postopek omogoča pretvorbo zapisa nihanja iz časovne domene v frekvenčno. Iz njihovega časovnega zapisa nihanja dobimo frekvenčni zapis nihanja, kar imenujemo spekter

10.

Slika A6: primer spektra, ki nastane pri NMR spektroskopiji10

Kemijski premik

Kemijski premik je mesto kjer se pojavi resonanca v spektru za določeno jedro atoma v okolju. Ta premik je svojevrsten, prikazuje pa molekulsko strukturo

10.

Površina signalov

S površino spektralnih signalov primerjamo število ekvivalentnih protonov, od katerih je ta površina odvisna. Spekter ima lahko tri vrhove imenovane triplet, dva vrhova imenovana dublet in en vrh imenovan monoplet. Pojavi se lahko tudi večje število vrhov, ki jih imenujemo multiplet. Signali nam povedo koliko vodikovih protonov ima sosednja skupina

10.

Priprava vzorcev

Vzorci za NMR spektroskopijo so raztopine, kajti snemanje spektrov trdnih snovi pri teh pogojih ni mogoče. Spektri trdnih snovi so drugačni, saj jih snemamo pod posebnimi pogoji. Običajno želimo posneti spekter preiskovane spojine brez , da bi bili v spektru prisotni še intenzivni vrhovi topila.

1H spektre snemamo z uporabo topila, ki ne vsebujejo

tega izotopa. Primer takega topila, katero ne vsebuje vodika tetraklorometan.

V praksi se malo uporablja, je zelo slabo polaren in zato slabo topilo. Najpogosteje se uporabljajo topila, katera vsebujejo vodik, ki je prisoten v obliki vodikovega izotopa

2H

(devterirana topila). Pripravijo se na način, da se protij v določeni meri zamenja z devterijem. V tako pripravljenih topilih je prisoten še vedno majhen delež protija. To se

Page 48: PORAZDELITEV KLAVULANSKE KISLINE MED VODO IN … · Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom IV Partitioning of clavulanic acid in water- organic solvent system

Porazdelitev klavulanske kisline med vodo in organskim topilom

33

največkrat opazi v spektru kot majhen vrh pri značilnem kemijskem premiku, ta je odvisen od topila.

S prisotnostjo devterija v topilu se zagotovi stabilnost magnetnega polja in s tem kemijskih premikov. To je posebno pomembno pri daljših snemalnih časih, npr. pri snemanju

13C

spektrov. Da je polje stabilno, imajo spektrometri posebno funkcijo, katera izkorišča resonanco devterijevih jeder

10.