polifenoli kao antitrombocitni agensi u prevenciji ... · - pnmk - mnmk - vitamin c - dijetarni...
TRANSCRIPT
fPolifenoli kao antitrombocitni agensi u prevencijikardiovaskularnih bolesti – in vitro i ex vivo ispitivanja
Aleksandra Konić Ristić, Tatjana Srdić-Rajić, Nevena Kardum, S ć G ćIvan Stanković, Marija Glibetić
Kardiovaskularne i maligne bolesti predstavljaju najznačajniji uzrok obolevanja i umiranja u svetu
Prospektivne epidemiološke studije (NHS HPFS EPIC DASH ) i meta analize
j j
Prospektivne epidemiološke studije (NHS, HPFS, EPIC, DASH...) i meta-analize
Ishrana bogata voćem, povrćem i integralnim žitaricama povezana je sa smanjenim rizikom od nastanka hroničnih bolesti.j
FITOHEMIKALIJE
Trombociti kao ciljno mesto delovanja fitohemikalija
- krvne ćelije bez jedra j j k ć lij di k id blik i č ik 2 5 - najmanje krvne ćelije, diskoidnog oblika i prečnika 2-5 µm.
- prosečan životni vek :7-10 dana, - optimalan broj :150 - 450 x 109/L krvi
Fiziološki uslovi
- HEMOSTAZA
Patološki uslovi
- TROMBOZA
Aktivna uloga u patogenezi :
Ateroskleroze – interakcija sa monocitima Ateroskleroze interakcija sa monocitima Inflamacije –... neutrofilima Malignih bolesti – ...malignim ćelijama Imunskoj funkciji limfocitima Imunskoj funkciji – ...limfocitima Sekrecija hemokina, proinflamatornih činilaca i formiranje mikropartikula trombocitnog porekla
Struktura trombocita
- receptori za - adhezioni receptori
neaktivirani, “mirujući” trombociti
fiziološke agoniste - aktivacioni markeri
aktivirani trombociti
Povećana aktivacija i preosetljivost trombocita:
• hiperholesterolemija (Broijersen i sar. 1998), • hipertenzija (Nityanand i sar 1993) • hipertenzija (Nityanand i sar.1993), • pušenje (Nowak i sar. 1987), • dijabetes (Manduteanu i sar. 1992),
t b lički i d (V d th i 2008)• metabolički sindrom (Vaduganathan i sar., 2008)
Biomarker akutnih KV događaja Biomarker rizika za nastanak KVB
Racionalizuje evaluaciju antitrombocitnih agenasa u primarnj Racionalizuje evaluaciju antitrombocitnih agenasa u primarnj sekundarnoj i tercijarnoj prevenciji KVBsekundarnoj i tercijarnoj prevenciji KVB
Promena aktivacionog statusa trombocita u fiziološkim stanjima:- postprandijalna lipemija (Broijersen i sar., 1998)- postprandijalna glikemija (Hyson i sar., 2003)- stanja fizičkog i mentalnog stresa (Kratz i sar., 2006; Ledenborger i sar., 2004)
Povoljno delovanje sastojaka namirnica na funkciju tombocita:
- ekstrakt paradajza
EFSA Evropsko regulatorno telo za bezbednost hrane (eng European Food Safety Authority )
- masna riba- PNMK- MNMK
- vitamin C- dijetarni izvori
-polifenoli- dijetarni izvori
EFSA - Evropsko regulatorno telo za bezbednost hrane (eng. European Food Safety Authority )
„Smanjenjenje aktivacije i agregacije trombocita delovanjem namirnica ili njihovih sastojaka“
POTENCIJALNI MEHANIZAM DELOVANJA U OČUVANJU KARDIOVASKULANOG ZDRAVLJA (EFSA Journal ,2011)
Analiza većeg broja aktivacionih markera trombocita
Metoda: Protočna citometrija
g j
Procenat ćelija koje eksprimiraju aktivacioni marker
Gustina aktivacionog markera na ćelijama (MFI)
Analiza interakcije trombocita sa drugim ćelijama
Primena različitih agonista u različitim koncentracijama
A li k k i i i i i k t k l kti ij * Analizom uzoraka pune krvi minimizira se ekstrakorporalna aktivacija*
**Krueger LA, Barnard MR, Frelinger AL, 3rd, Furman MI, Michelson AD. Immunophenotypic analysis of platelets. Curr Protoc Cytom. 2002;Chapter 6:Unit 6 10.Barnard MR, Krueger LA, Frelinger AL, 3rd, Furman MI, Michelson AD. Whole blood analysis of leukocyte-platelet aggregates. Curr Protoc Cytom. 2003 ;Chapter 6:Unit 6 15.
Ptotočna citometrija (metoda)Ptotočna citometrija (metoda)Ćelijski markeri/korišćena mAt:1.Identifikacija populacije trombocita (pan-trombocitni marker)
- CD61 (integrin β 3, GPIIIa)/anti-CD61 mAt
2. Aktivacija trombocita (aktivacioni markeri) - CD62P (P-selektin)/anti-CD62 mAb ( )
-- agregacija trombocita sa leukocitimaagregacija trombocita sa leukocitima-- aterosklerozaateroskleroza- GPIIb-IIIa (integrin –Rc za fibrinogen)/PAC-1
- agregacija trombocita sa drugim trombocitimaagregacija trombocita sa drugim trombocitimatrombozatromboza- trombozatromboza
3. Agregacija sa monocitima i neutrofilima- CD11b+CD61+/MAC-1; anti-CD61 mAb –
identifikacija trombocit/neutrofil agregata- identifikacija trombocit/neutrofil agregata- CD14+CD61+/anti-CD14 mAb anti-CD61mAB-
- identifikacija trombocit/monocit agregataU bazalnom statusu– hiperhiper--aktivacija trombocitaaktivacija trombocitaU bazalnom statusu hiperhiper aktivacija trombocitaaktivacija trombocita
Nakon ex vivo delovanja agonsta funkcije trombocita (ADP i AA)– hiperhiper--reaktivnost trombocitareaktivnost trombocita
Polifenoli- najbrojnija i najzastupljenija grupa biološki aktivnih, sekundarnih metabolita biljaka- prisutni u većini namirnica biljnog porekla (voće, povrće, žitarice, leguminoze, pojedina biljna ulja, p su u eć a ca b j og po e a ( oće, po će, a ce, egu o e, pojed a b j a u ja,vina i biljni čajevi). -najznačajnija grupa nenutritivnih sastojaka namirnica i najznačajniji dijetarni antioksidansi
Fenolne kiseline
Derivati hidroksi benzojeve kiseline Derivati hidroksi cimetne kiseline
C6-C1Dijetarni polifenoli
FlavonoidiFlavonoli Flavoni Flavanoni Izoflavoni
C6-C3-C6
ProantocijanidiniKatehini
Flavanoli
O
OH
OH
HO
OH
O
OH
OH
HO
OH
Antocijani
KurkuminoidiStilbeniLignani C6-C3-C3-C6
C6-C2-C6C6-C3-C-C3-C6
Uticaj polifenola i njihovih dijetarnih izvora na funkciju trombocita
I faza : predklinička ispitivanja – skriningI faza : predklinička ispitivanja skrining
II faza: dijetarne interventne studije
III faza: ispitivanje potencijalnih mehanizama
Osnovne karakteristike polifenola: Definisani eksperimentalni uslovi (agensi) in vitro
- Intenzivan metabolizam
- Mala bioraspoloživost
... Definisani eksperimentalni uslovi (agensi) in vitro1. Skrining studije: aglikoni i ekstrakti2. Mehanizam delovanja: aglikoni i metaboliti
U fiziološkim koncentracijamaU fiziološkim koncentracijama
Najveći stepen naučne zasnovanostiRandomizovane, kontrolisane, duplo-slepe dijetarne interventne studije
- procena dijetarnog unosaprocena dijetarnog unosa- procena izloženosti dijetarnom sastojku (nivo metabolita u plazmi i urinu)
Uticaj polifenola na funkciju trombocita – dijetarne interventne studije (Ostertag i sar., 2010)
- čokolada, kakao i epikatehin (9/25)čokolada, kakao i epikatehin (9/25)- armanjak konjak
- mešavina jagodastog i bobičastog voća
- grožđe, vino i procijanidini
- kvercetin- dijetarni izvori kvercetina
- izoflavoni
“Skrining” antitrombocitnog delovanja suvih ekstrakata biljaka:
kopriva mirođija šarplaninski čaj kelj nar japanska jabukakopriva(Urtica dioica L.)
mirođija(Aenetum graveolens L.)
šarplaninski čaj(Sideritis scardica L.)
kelj(Brassica oleracea L.
var. acephala)
nar(Punica granatum L.)
japanska jabuka(Diospyros spp.)
Kriterijumi za odabir:i t i h i (t di i l i i )
Ispitivani uzorci Ukupni fenoli (mg GAE/g)Ekstrakt koprive 69 44 ± 0 03- prisutne u ishrani (tradicionalne namirnice)
- nedovoljno podataka o njihovom biološkom delovanju- sadrže polifenole kao bioaktivne sastojke
Ekstrakt koprive 69,44 ± 0,03Ekstrakt mirođije 58,07 ± 0,11Ekstrakt šarplaninskog čaja 156,66 ± 0,01Esktrakt kelja 42,60 ± 0,06
Eksperimentalni uslovi: Ekstrakt nara 45,50 ± 0,02Ekstrakt japanske jabuke 5,62 ± 0,45
Eksperimentalni uslovi:- konc. 200µg/ml- arahidonska kiselina kao agonist- kod zdravih ispitanika i ispitanika sa metaboličkim sindromomStatistička obrada:-Vilkoksonov test označenih rangova
Antitrombocitno delovanje metabolita kvercetina (i sulforafana):- kvercetin-3-glukuronida;- 3’-metil-kvercetin-3-glukuronida;- kvercetin-3’-sulfata; 20 µM
Uticaj ispitivanih metabolita na ekspresiju P-selektina i GPIIb-IIIa
kvercetin 3 sulfata;- sulforafan-cistein-glicina
Uticaj ispitivanih metabolita na ekspresiju P selektina i GPIIb IIIa
--“Screening” “Screening” antitrombocitnog delovanja ekstrakata
Kopriva(Urtica dioica L )
Mirođija(A t l L )
Šarplaninski čaj(Sid iti di L )
Kelj(Brassica oleracea L
Nar(P i t L )
Japanska jabuka(Di )(Urtica dioica L.) (Aenetum graveolens L.) (Sideritis scardica L.) (Brassica oleracea L.
var. acephala)(Punica granatum L.) (Diospyros spp.)
--“Screening” “Screening” antitrombocitnog delovanja metabolita pojedinih bioaktivnih komponenata
//
- kvercetin-3-glukuronid;- 3’-metil-kvercetin-3-glukuronid;- kvercetin-3’-sulfat;- sulforafan-cistein-glicin
Humani metaboliti kvercetinakvercetinaFlavonoida prisutnog u svim svim ispitivanim ekstraktima
Humani metabolit sulforafanasulforafanaIzotiocijanata koji nastale iz glkozinolata pirstunog u ekstraktu
keljakelja
Biljke koje su odabrane za dalje ispitivanje u okviru RCT:Biljke koje su odabrane za dalje ispitivanje u okviru RCT:MMirođija, kopriva i šarplaninski čajirođija, kopriva i šarplaninski čaj
RezultatiMaterijal i metode
Ispitivanje uticaja jednokratne konzumacije čajeva od koprive, mirođije i šarplaninskog čaja na aktivaciju trombocita i njihovu agregaciju sa monocitima i neutrofilima eut o a
Dizajn: randomizirana, kontrolisana studija paralelnog dizajnaIspitanici: osobe sa metaboličkim sindromom (ATPIII); n=80I t ij 200 l č j (2 biljk )Intervencija: 200 ml čaja (2 g suve biljke)Kontrolna intervencija: 200 ml tople vode
Analizirani parametri:- ekspresija P-selektina- ekspresija GPIIb-IIIa-TMA (%)
u bazalnim uslovima nakon ex vivo delovanja agonista:- ADP (0,5µM)-TMA (%)
- TNA (%) - ADP (20µM)- arahidonska kiselina (250µg/ml)
Statistička obrada:Statistička obrada:-Vilkoksonov test označenih rangova (p≤0,05)-Man-Vitnijev U test (p≤0,0167)
Akutni efekat čajeva od koprive mirođije i šarplaninskog čaja na funkciju trombocitaAkutni efekat čajeva od koprive mirođije i šarplaninskog čaja na funkciju trombocita
- jednokratna konzumacija biljnih čajeva:-- utiče na utiče na ekspresiju P-selektinaut če aut če a e sp es ju se e t a- ne utiče na ekspresiju GPIIb-IIIa- ne utiče na agregaciju trombocita sa monocitima- ne utiče na agregaciju trombocita sa neutrofilima
- inhibira inhibira ekspresiju P-selektina- u bazalnim uslovima- nakon ex vivo delovanja ADP-aU optimalnim i suboptimalnim koncentracijama
MirođijaU optimalnim i suboptimalnim koncentracijama
--inhibira inhibira ekspresiju P-selektina - nakon ex vivo delovanja ADP-a
Kopriva
ju optimalnim koncentracijama
- ne utiča na nijedan od analiziranih parametara funkcije
Šarplaninski čajanaliziranih parametara funkcije trombocita
Rezultati Zaključak
Antitrombocitno delovanja ispitivanih biljnih ekstrakata ukazuje naAntitrombocitno delovanja ispitivanih biljnih ekstrakata ukazuje napotencijalni značaj ovih biljaka kao sastavnog dela optimalne dijete u
očuvanju kardiovaskularnog zdravlja i prevenciji nepovoljnog uticajafaktora sredine na trombocite uključujući i uticaj neodgovarajuće dijete ifaktora sredine na trombocite, uključujući i uticaj neodgovarajuće dijete i
nepravilnog režima ishrane.