podstawy genetyki ii
TRANSCRIPT
Podstawy genetyki II
Metody badawcze genetyki i organizmy modelowe
Podstawowe techniki genetyki molekularnej
2
Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA – manipulacje DNA in vitro
} izolacja i amplifikacja DNA i cDNA } mapowanie i sekwencjonowanie DNA } tworzenie nowych cząsteczek DNA
} przez rekombinację cząsteczek naturalnych } przez syntezę de novo
} wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów } modyfikacje syntezy białek
} ekspresja heterologiczna
} bioinformatyka
3
A co nie jest inżynierią genetyczną? } Inżynieria embrionalna (np. klonowanie)
} Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję
4
Zastosowania } Badania podstawowe } Biotechnologia
Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.
5
Podstawowe techniki } Izolacja DNA ze źródeł naturalnych
} komórki i tkanki } mikroorganizmy hodowane w laboratorium i występujące
naturalnie } antyczny DNA
} cDNA – izolacja RNA i przepisanie na DNA } Chemiczna synteza DNA de novo
6
PCR
© 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458
7
Elektroforeza DNA i RNA
© 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458
8
Hybrydyzacja } Wykorzystanie komplementarności kwasów
nukleinowych do wykrywania określonej sekwencji DNA (Southern) lub RNA (Northern)
© 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458
9
Hybrydyzacja Northern
} Podstawowa metoda badania poziomu ekspresji genu
10
Podstawowe techniki
} Enzymy restrykcyjne } analiza fragmentów DNA
(mapowanie) } klonowanie
11
Wektory } Umożliwiają utrzymanie DNA wprowadzonego do
komórek (transformacja, transfekcja) } wektory autonomiczne – zdolne do replikacji (np.. plazmidy,
wirusy) } wektory integracyjne } wektory ekspresyjne – umożliwiają ekspresję wprowadzonego
genu (autonomiczne lub integracyjne) } wektory kierujące rekombinacją (ang. targeting) – integracyjne } wektory bifunkcjonalne
12
Typowy wektor } Sekwencje zapewniające replikację (w. autonomiczne) } Sekwencje umożliwiające odróżnienie komórek z wprowadzonym
wektorem – markery selekcyjne } Miejsce do wstawienia klonowanego DNA – linker } Opcjonalnie – sekwencje umożliwiające odróżnienie wektora ze
wstawką od wektora „pustego” – marker rekombinacji
13
Klonowanie molekularne } Włączenie danego fragmentu DNA (wstawki) do wektora
autonomicznego
14
Przykłady zastosowań } Poznawanie sekwencji DNA (genów, genomów,
mutantów) } Diagnostyka molekularna } Ekologia i filogenetyka molekularna } Heterologiczna ekspresja białek (dla celów poznawczych i
biotechnologicznych) } „Odwrotna genetyka” – inaktywacja wybranych genów u
organizmów modelowych } Terapia genowa
15
Sekwencjonowanie – metody klasyczne
} Dideoksynukleotydy zatrzymują syntezę na określonych nukleotydach
!3’ ATCGGTGCATAGCTTGT 5’! !5’ TAGCCACGTATCGAACA* 3’!5’ TAGCCACGTATCGAA* 3’!5’ TAGCCACGTATCGA* 3’!5’ TAGCCACGTA* 3’!5’ TAGCCA* 3’!5’ TA* 3’!
Produkty reakcji A
Matryca
16
Tradycyjny odczyt sekwencji } Znakowanie radioaktywne,
osobne reakcje A T C G
+
–
17
CGTAA CGTAAC CGTAACC CGTAACCC CGTAACCCT CGTAACCCTT CGTAACCCTTG CGTAACCCTTGG
• Obecnie stosuje się dideoksynukleotydy wyznakowane fluorescencyjnie – każdy innym kolorem
Sekwencjonowanie automatyczne
18
Sekwencjonowanie automatyczne
19
Postęp techniczny } Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie 14 000
razy } Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła 50 000
razy } Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu
kilku lat } Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne
20
Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe } Tzw. deep sequencing } Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych
odczytów } Pojedyncze odczyty krótkie (25-400 bp) } Zastosowania
} sekwencjonowanie nowych genomów } resekwencjonowanie
} np. analiza zmienności
} badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cDNA
21
Solexa
= 350
Solexa® Ultra-high-throughput DNA Sequencing Platform
22
Pirosekwencjonowanie (454)
The development and impact of 454 sequencing Jonathan M Rothberg & John H Leamon Nature Biotechnology 26, 1117 - 1124 (2008)
• Fragmenty DNA przyłączone do kulek (1 fragment na kulkę), następnie namnożone
• Kulki z DNA umieszczone w studzienkach
• Sekwencjonowanie przez syntezę: dodaje się kolejno 4 nukleotydy, gdy dodany nukleotyd komplementarny, to uwoniony pirofosforan daje reakcję z luminescencją
• Wynik: ~800,000 odczytów po 250-500 bp (~400 megabases)
23
Slides from http://www.illumina.com
Solexa (Illumina)
24
Slides from http://www.illumina.com
Solexa (Illumina)
25
Slides from http://www.illumina.com
Solexa (Illumina)
26
Slides from http://www.illumina.com • Wynik: 80-100 milionów odczytów po
~50 bp (~4Gb)!
Solexa (Illumina)
27
Sekwencjonowanie } Głównym wyzwaniem w sekwencjonowaniu nie jest sam
odczyt sekwencji } Odczytywane fragmenty są krótkie
} do ~700-800 nt (sekw. tradycyjne Sangera) } 200-400 nt (454) } 50-150 nt (Solexa)
} Wyzwaniem jest złożenie długiej sekwencji z tych krótkich fragmentów
28
Genomika
} Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów
} Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka
} Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów } Badanie funkcji zawartych w nich genów
29
Metagenomika } Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie } Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają
się hodować
30
Metagenomika
} Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów
31
Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu
} Tajemnicza UCYN-A } Sinica (cyjanobakteria) } Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów) } Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów } Zdolność asymilacji azotu } Symbioza? – tajemnicza ekologia
32
RNA-seq
33
Sekwencjonowanie nowej generacji – wyzwanie dla bioinformatyki
} Krótkie odczyty (50-150 nt) } pojedyncze } “paired-end”
} Problem identyfikacji i składania sekwencji } Indeksowanie i multipleks
34
Genom człowieka
35
Craig Venter Francis Collins (NIH) 36
37
Czym jest znajomość genomu } Nie jest “odczytaniem księgi życia” } Sama sekwencja nie daje jeszcze zrozumienia, jak
funkcjonują komórki } Ale jest niezwykle cennym narzędziem w badaniach
} Sekwencja nie jest lekarstwem } Ale bardzo pomaga w zrozumieniu mechanizmów chorób i
wynajdywaniu nowych terapii
38
Co genom już dał nauce } Dużo ciekawych i zaskakujących odkryć
} Dlaczego mamy tak mało genów } Jak ewoluował człowiek
} Narzędzie do badania funkcji genów
39
Czy warto badać genomy
40
} Nowoczesne techniki generują bardzo dużo danych } Dwa podejścia
} “hypothesis driven” – dane zbierane dla zweryfikowania jakiejś hipotezy
} “data driven” – dane zbierane bez wstępnych założeń, potem wyszukiwane w nich prawidłowości
Zbieranie danych
41
} Podejście zakładające poszukiwanie prawidłowości w dużych zbiorach danych, zbieranych bez wstępnych założeń, może być produktywne
} Ale niesie też (dobrze znane w literaturze) ryzyko } Lem, S. Cyberiada, Wyprawa szósta: czyli jak Trurl i Klapaucjusz
demona drugiego rodzaju stworzyli, aby zbójcę Gębona pokonać., 1965.
} http://www.portalwiedzy.pan.pl/images/stories/academia_2012/academia_2013/022013/004-008_golik.pdf
TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTATATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACATCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACCTCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAATATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTATGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAAATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTATTCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTGTTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTGTTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCTAACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGATCAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAACAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACATAGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTCACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGTGGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCCATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTCGTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGGAATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATGACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATATGTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTATTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAACTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCCCAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGCAAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTTTGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTCCAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAACTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATATTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAAGAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATTCAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAAAAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT
Co to znaczy?
Mały fragment chromosomu 21 42
Co to znaczy? } Bez teorii ewolucji nie mielibyśmy możliwości poznania
odpowiedzi na to pytanie } Odszukujemy geny podobne do genów już zbadanych } Możemy badać geny przez “odwrotną genetykę” –
tworzenie mutantów u organizmów modelowych } Porównując genomy możemy wnioskować o biologii
organizmu
43
Odwrotna genetyka – od genu do funkcji
Genetyka tradycyjna
Funkcja (mutacja, fenotyp)
Klonowanie genu
Analiza sklonowanego genu
Genetyka „odwrotna”
Gen (z sekwencji całego genomu)
Inaktywacja genu
Analiza uzyskanego fenotypu
44
Odwrotna genetyka – inaktywacja przez rekombinację
45
Inaktywacja warunkowa
46
Odwrotna genetyka – interferencja RNA
Odkrycie roku 2002 – regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello 47
siRNA - jak to działa?
Hannon G.J.: ‘RNA interference’, Nature 418, July 11, 2002
Efekt – degradacja mRNA 48
Zastosowania siRNA
} Badanie funkcji genów (“odwrotna genetyka”) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin
} Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy
nowotworów) – przykład: obniżenie poziomu receptora LDL („zły cholesterol”) u myszy
49
Ekspresja heterologiczna
Wektor ekspresyjny Oczyszczanie białka
50
Fuzje białkowe
} Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie } znaczniki epitopowe } GFP (zielone białko fluorescencyjne)
51
Green Fluorescent Protein- Aequorea victoria
52
GFP
53
wt hPNPaza
-52 hPNPaza
MitoTracker anti-c-myc Nałożenie
Lokalizacja mitochondrialna nadejsprymowanej hPNPazy-myc w komórkach HeLa.
54
Ekspresja heterologiczna w biotechnologii
55
Inżynieria przeciwciał – leki przyszłości } W łańcuchach immunoglobulin obszary zmienne
odpowiadają za rozpoznawanie różnych antygenów, obszary stałe nadają specyficzność gatunkową
} W klasycznych metodach wytwarzania przeciwciał monoklonalnych uzyskiwano przeciwciała zwierzęce
} Klonowanie i ekspresja genów kodujących przeciwciała jest alternatywnym sposobem ich uzyskiwania
} Możliwe jest uzyskiwanie przeciwciał humanizowanych – obszary zmienne z genu przeciwciała zwierzęcego wstawione między obszary stałe przeciwciała ludzkiego
} Humanizowane i rekombinowane ludzkie przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów
56
Terapia genowa } Zastępująca – wprowadzenie genu, którego defekt powoduje
chorobę } Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji,
zwłaszcza dla komórek nie dzielących się } Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi
(np. SCID – gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi – choroba Gauchera)
} Inaktywująca – zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową) } Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (siRNA, modyfikowane
oligonukleotydy) } Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne
leki
57
Organizmy modelowe
Ogólne zasady i przykłady
58
Co to jest model?
? ?
«konstrukcja, schemat lub opis ukazujący działanie, budowę, cechy, zależności jakiegoś zjawiska lub obiektu» Słownik Języka Polskiego PWN
59
Organizmy modelowe
“Les éléments vitaux étant de nature semblable dans tous les êtres vivants, ils sont soumis aux mêmes lois organiques...”
“Podstawowe jednostki życia, mając u wszystkich żyjących istot podobną naturę, rządzone są tymi samymi prawami organicznymi...”
Claude BERNARD (1813-1878)
60
Modele w naukach przyrodniczych } Modele analogii przyczynowej CAM
} Przyczyny i skutki w układzie modelowym i docelowym są takie same. } Nie mogą zaistnieć „jakiekolwiek istotne przyczynowo braki analogii
między modelem a modelowanym zjawiskiem“.*
} Modele analogii hipotetycznej (HAM) } Doprowadzenie do sformułowania hipotez, które mogą mieć ogólne
znaczenie tak dla układu modelowego, jak i docelowego. } Nie dostarczają danych mających bezpośrednie znaczenie dla medycyny
człowieka, jednak polepszając nasze rozumienie zjawisk biologicznych mogą one sugerować możliwe mechanizmy fizjologiczne u człowieka.
61
Mikroorganizmy } Bakterie i bakteriofagi
} Escherichia coli, fag T4, fag λ
} Mikroorganizmy eukariotyczne } drożdże Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe } grzyby nitkowate (Neurospora, Aspergillus) } Chlamydomonas
62
Fenotypy mutacji } Mutanty pokarmowe (auksotrofie)
} prototrof – zdolny do syntezy niezbędnych składników organicznych, wymaga źródła węgla i energii (np. glukoza) i soli nieorganicznych (źródło azotu i mikroelementów)
} auksotrof – niezdolny do syntezy określonego związku, wymaga jego obecności w podłożu } np. mutanty leu, trp, ura, thi,
} Mutanty kataboliczne } niezdolne do wykorzystywania źródła węgla, wykorzystywanego przez
typ dziki } np. mutanty gal, xyl, lac } glukoza zawsze będzie wykorzystywana
63
Fenotypy mutacji } Oporność na antybiotyki i inhibitory
} enzymy rozkładające antybiotyk (np. beta-laktamaza) } pompy usuwające antybiotyk z komórki } mutacje w białkach, na które działa antybiotyk
64
Podłoża hodowlane } Pełne
} zawierają wszystkie składniki nieorganiczne i organiczne } często na bazie ekstraktów biologicznych (ekstrakt drożdżowy, pepton
itp.) } mogą być uzupełniane źródłem węgla (np. glukoza)
} Minimalne } źródło węgla, źrodło azotu (nieorganiczne), sole i mikroelementy } umożliwia wzrost prototrofa, auksotrofy nie rosną o ile nie doda się
odpowiedniego uzupełnienia } np. mutant leu wyrośnie na podłożu minimalnym + leucyna
} Syntetyczne pełne } źródła węgla i azotu, sole + kontrolowany zestaw uzupełnień
(aminokwasy itp.) } umożliwia wzrost wszystkim auksotrofom } warianty typu “drop-out”, np. SC –leu (bez leucyny): wyrosną wszystkie
szczepy, z wyjątkiem auksotrofa leu
65
Selekcja mutantów - repliki
66
Nowoczesny wariant – roboty laboratoryjne
©Singer Instruments, UK
67
Selekcja } Pozytywna (bezpośrednia)
} Na podłożu selekcyjnym wyrastają wyłącznie pożądane mutanty } Np. selekcja mutantów opornych na antybiotyk na podłożu z
antybiotykiem
} Negatywna } Mutanty nie rosną na podłożu selekcyjnym } Np. selekcja mutantów leu na podłożu bez leucyny } Konieczne zastosowanie metody replik
68
“Jeden gen – jeden enzym” } Badania na Neurospora, Beadle & Tatum, 1942
69
Modyfikacje genetyczne } Transformacja
} wprowadzenie DNA do komórki } niektóre bakterie pobierają DNA naturalnie } większość bakterii, a także np. drożdże, a nawet komórki
ssaków w hodowli można “zmusić” do pobrania DNA } metody chemiczne } elektroporacja } metody mechaniczne (“działo genowe”)
} DNA integruje się w genom lub utrzymuje niezależnie (plazmidy)
} Infekcja wirusowa (fagi, wirusy eukariotyczne)
70
Saccharomyces cerevisiae
71
Drożdże jako organizm modelowy } Łatwa hodowla i testy fenotypowe } Fizjologia typowa dla mikroorganizmów } Bezpieczne i nieszkodliwe dla środowiska } Dobrze poznana genetyka klasyczna (analiza tetrad, mapy) } Łatwe manipulacje genetyczne (“odwrotna genetyka”,
plazmidy) } Znana od 1996 sekwencja genomu (12,5 Mb)
72
Fenotypy } pokarmowe } oporności na inhibitory i antybiotyki } defekty cyklu komórkowego } biochemia komórki } ekspresja genów i jej regulacja } oddychanie komórkowe – genetyka mitochondrialna
73
Skąd wzięły się mitochondria? } Teoria endosymbiozy
74
Jak mitochondria traciły swój genom
Wolno żyjące bakterie - 1800-4500 genów
Endosymbiontyczne bakterie (Rickettsia) - 850 genów
Pierwotne mitochondria (Reclinomonas) - 100 genów
Mitochondria „współczesne” - 30-40 genów
75
I jak się to odbywało } Ucieczka DNA do jądra } Przeniesienie genów do jądra za pośrednictwem RNA } Zastąpienie funkcji przez gen pochodzący z genomu
gospodarza } Zastąpienie funkcji przez gen pochodzący z innej linii
} polimeraza RNA, polimeraza DNA – pochodzenie fagowe
76
Genom mitochondrialny S. cerevisiae
• kolisty (?-mapa), wysoce polimorficzny, ~80kb
• mała gęstość genów
• bardzo bogaty w AT (17% GC)
• 8-9 genów kodujących białka; ~10 ORF intronowych, 24 tRNA, 2 rRNA, 1 RNaseP RNA
• 7-8 elementów ori, złożone mechanizmy replikacji
77
Badanie ekspresji mtDNA u drożdży? } Dziedziczenie mitochondrialne odkryto u drożdży (1966) } Istnieje skuteczny system genetyczny pozwalający na
analizę mutantów o zaburzonej funkcji oddychania mitochondrialnego
} Wciąż wiele niewiadomych
glukoza glicerol
Fot. Kamil Lipiński 78
Drożdże jako model dla badania chorób człowieka?
79
Genomy
S. cerevisiae H. sapiens
~1,2 x 107 bp ~3 x 109 bp
~6500 genów ~25 000 genów
~1800 genów wykazuje homologie z genami H. sapiens (30%)
~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S. cerevisiae (13%)
Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych. Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1)
80
Przykładowe drożdżowe modele chorób
} Progerie Wernera i Blooma } Choroby związane z defektami naprawy DNA
(HNPCC, ataksja-telangiektazja) } Ataksja Friedreicha } Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej
(PEO) } Choroby wywołane mutacjami w mtDNA (NARP) } Poszukiwanie leków za pomocą drożdży
81
Zespół Wernera
} Normalny rozwój w dzieciństwie.
} Przedwczesne starzenie rozpoczyna się wraz z wiekiem dojrzewania.
} Niski wzrost, owrzodzenia, zwapnienia.
} Pacjenci dożywają średnio 47 lat. } Przyczyną śmierci z reguły
choroba nowotworowa, albo schorzenia sercowo-naczyniowe.
Przyczyna: mutacje genu WRN kodującego
helikazę DNA z rodziny RecQ
82
Zespół Blooma
} Opóźniony wzrost, karłowatość.
} Zaburzenia pigmentacji skóry. } Predyspozycje do wczesnego
(ok. 25 r. ż.) występowania wielu różnych nowotworów.
} Z reguły nie dożywają 40-50 lat (1/3 nie dożywa 25 lat).
Przyczyna: mutacje genu BLM kodującego
kolejną helikazę DNA z rodziny RecQ
83
Zaburzenia w zespołach Wernera i Blooma } Utrata stabilności genomu
} Zaburzenia w okolicach telomerów (WRN) } Zwiększona częstość wymiany chromatyd siostrzanych
(BLM) } Zwiększona częstość zaburzeń kariotypowych } Zwiększona częstość mutacji genów
84
SGS1 – model drożdżowy } Gen SGS1 jest drożdżowym homologiem genów WRN i BLM. } Fenotyp delecji SGS1:
} zwiększona rekombinacja mitotyczna (zwłaszcza subtelomerowa) } zaburzenia segregacji chromosomów } zaburzenia mejozy
} Białko Sgs1p jest zaangażowane w hamowanie nieuprawnionej rekombinacji i utrzymywanie stabilności genomu.
} Ludzkie geny BLM i WRN częściowo komplementują fenotyp delecji SGS1
85
HNPCC (zespół Lyncha)
} HNPCC - dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z polipowatością
} Około 5% wszystkich raków jelita grubego } Mutacje w genach kodujących białka zaangażowane w
naprawę niedopasowanych nukleotydów (mismatch repair)
} Podwyższona częstość mutacji, zwłaszcza niestabilność traktów z powtórzeniami
} Najczęściej mutacje genów hMSH2 i hMLH1
86
Drożdżowy model HNPCC
W mutantach drożdżowych wzrost spontanicznej mutagenezy
Alfred & Borts (2007) Biochem Soc Trans, 35:1525-28
Dla dokładniejszego zbadania efektu konkretnych mutacji ludzkich stworzono hybrydowe geny, w których fragmenty genu S. cerevisiae zastępuje się pochodzącymi z genów człowieka tak, by zachować funkcję w drożdżach (tzw. humanizowanie drożdży).
87
Ataksja Friedreicha } Choroba układu nerwowego i mięśni
} zaburzenia czucia } obniżone napięcie mięśniowe } kardiomiopatia, deformacje kręgosłupa i stóp
} Autosomalna recesywna; 1/50 000 } Mutacja dynamiczna w genie frataksyny } Akumulacja żelaza w mitochondriach:
} Zaburzenia systemów naprawczych mtDNA } Zaburzenia w oddychaniu } Stres oksydacyjny
Bramwell: Atlas of Clinical Medicine 88
YFH1 – drożdżowy homolog frataksyny } Białko wiążące żelazo } Mitochondrialny magazyn żelaza } Detoksykacja nadmiaru żelaza } Włączanie żelaza do centrów Fe-S
89
YFH1 – drożdżowy homolog frataksyny
} Fenotyp delecji: } defekt oddychania mitochondrialnego } zwiększona wrażliwość na stres oksydacyjny } akumulacja żelaza w mitochondriach: 10-krotnie większe
stężenie od szczepu dzikiego } zależna od żelaza oksydacyjna degradacja centrów Fe-S
} Ludzki gen kompensuje delecję genu drożdżowego
Cavadini i wsp., (2000), Hum Mol Genet, 9:2523-30 90
Drożdże w poszukiwaniu nowych leków
} Systemy homologiczne } Interaktory białek drożdżowych homologicznych do
białek ludzkich } Białka docelowe dla znanych związków
drobnocząsteczkowych
} Systemy heterologiczne } Interaktory białkowe – system dwuhybrydowy } Ekspresja w drożdżach białka (np. ludzkiego) i
poszukiwanie ligandów } np. choroby degeneracyjne związane z agregacją białek:
choroba Alzheimera, Huntingtona itp. } poszukiwanie ligandów toksyn bakteryjnych
91
Wielokomórkowe organizmy modelowe } Arabidopsis thaliana } Drosophila melanogaster } Caenorhabditis elegans } Danio rerio } Gryzonie (mysz, szczur)
92
A. thaliana } Modelowa roślina z rodziny krzyżowych } Czas generacji ~ 6 tygodni
93
Fenotypy } Wzrostowe } Rozwojowe } Fizjologiczne i biochemiczne } Mechanizmy genetyczne } Epigenetyka
94
Genom } Stosunkowo niewielki (~150
Mb), znana sekwencja } Techniki transformacji
genetycznej, wyciszania ekspresji genów itp.
} Łatwa analiza mikroskopowa (przezroczyste siewki)
95
Transformacja Arabidopsis } Transformacja komórek, regeneracja rośliny } Infekcja Agrobacterium
96
Drosophila melanogaster } Jeden z pierwszych organizmów modelowych genetyki,
wciąż używany
97
Drosophila melanogaster } Genom (165 Mb)
98
Drosophila melanogaster } Krótki cykl życiowy (~ 10 dni) } Łatwa i tania hodowla } Liczne potomstwo } Znacząca homologia z
człowiekiem } ok. 50% genów D. melanogaster
ma odpowiedniki u ssaków } ok. 75% ludzkich genów
związanych z chorobami genetycznymi ma odpowiedniki u D. melanogaster
99
Drosophila i biologia rozwoju } Modelowy organizm do badania genów kontrolujących rozwój } Np. geny homeotyczne – genetyczna kontrola i ewolucja planów budowy
100
Geny HOX – regulatory rozwoju
101
Ewolucja genów HOX
Dzięki duplikacjom genów HOX wyewoluowały bardziej złożone plany ciała 102
Caenorhabditis elegans } Nicień, długość ok 1,5 mm, ~1000 komórek } Genom ~100 Mb } Łatwa hodowla, przewidywalne zachowanie } Modyfikacje genetyczne przez wyciszanie RNAi
103
Rozwój C. elegans Znane losy każdej komórki w rozwoju
104
Fenotypy i zastosowania } Rozwój } Apoptoza } Układ nerwowy, behawior
Zaburzenia lokomocji
105
Danio rerio } Model do badania biologii rozwoju kręgowców (łatwa obserwacja
mikroskopowa, przezroczyste jaja) } Znany genom (~1,7�109 bp)
106
Mysz } Modelowy ssak } Genom (~3�109 bp) bardzo podobny do ludzkiego } Możliwe manipulacje genetyczne, w tym ukierunkowane
uszkadzanie genów (“knock-out”) } Szczury preferowane w badaniach neurobiologicznych,
trudniejsze manipulacje genetyczne
107
Myszy transgeniczne } Wprowadzanie nowych sekwencji do genomu
} np. geny reporterowe
} Delecje genów (knock-out) } Wprowadzanie mutacji punktowych
108
Myszy knock-out } Izolacja komórek ES (zarodkowe macierzyste) z blastocysty } Dawcą jest mysz szczepu białego
} Modyfikacja i selekcja komórek ES z knock-out } Wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do blastocysty myszy
szczepu szaregu
109
Myszy knock-out } Blastocysty zawierające zmodyfikowane komórki ES
wszczepia się myszy – matce zastępczej
110
Myszy knock-out } Selekcja chimer z transgenem w linii płciowej
111
Nagroda Nobla 2007 } Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies } Za opracowanie zasad wprowadzania specyficznych
modyfikacji genowych u myszy za pomocą zarodkowych komórek macierzystych
112