plus strand rna viruses and their host interactions birke ... · merkmale von plusstrang rna-viren...
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Plus strand RNA viruses and their host interactions
Birke A. Tews
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Merkmale von Plusstrang-RNA-
Viren
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Life cycle of plus strand RNA viruses
1. Eintritt
2. Genomfreisetzung
3. Translation und
Polyproteinprozessierung
4. RNA Replikation
5. Partikelzusammenbau
6. Freisetzung
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Merkmale von Plusstrang RNA-Viren
Einzelsträngiges RNA-Genom, das direkt als mRNA fungieren kann.
-> das virale Genom ist bereits infektiös (Abgrenzung Retrovirus)
5‘ Ende:
Cap -> Flaviviren, Coronaviren
VPg -> Caliciviren, Picornaviren
Unmodifiziert -> Pestiviren, Hepaciviren
3‘ Ende
Poly-A -> Coronaviren
Unmodifizierte Enden -> Pestiviren, Flaviviren, Hepaciviren
Subgenomische RNAs
Ja: -> Coronaviren, Caliciviren, Ateriviren, Astroviren, Togaviren
Nein: -> Flaviviren, Picornaviren
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Picornaviridae – kleine RNA-Viren
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
- Nicht-umhüllt
- 7-9kb
- 5‘ Vpg & 3‘ poly-A-tail
- IRES
- Ein Polyprotein
Realm: Riboviria
Order: Picornavirales
Family: Picornaviridae
Genus: Aphthovirus
Species: Foot-and-mouth disease virus
Genus: Enterovirus
Species: human enterovirus C (polio)
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Coronaviruses – die größten RNA-Viren
- umhüllt
- 27-32kb
- 5‘ Cap & 3‘ poly-A tail
- Zwei Polyproteine (ribosomal frameshift)
- Subgenomische RNAs für (Struktur-)Proteine
Realm: Riboviria
Order: Nidovirales
Suborder: Cornidovirineae
Family: Coronaviridae
Subfamily: Orthocoronavirinae
Genus: Alphacoronavirus
Species: Human coronavirus 229E
Genus: Betacoronavirus
Species: Severe acute respiratory
Syndrome-related coronavirus
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
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Flaviviridae
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
- Umhüllt
- 10-12kb
- Ein Polyprotein
- Flaviviruses:
- 5‘cap & 3‘ loop
- Hepaciviruses, Pestiviruses
- Naktes, strukturiertes 5‘ &
strukturiertes 3‘ Ende
- IRES
Realm: Riboviria
Order: Unassigned
Family: Flaviviridae
Genus: Flavivirus -> Species: Yellow fever virus
Genus: Hepacivirus -> Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)
Genus: Pestivirus -> Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)
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Caliciviridae
- Nicht-umhüllt
- 7-8kb
- 5‘ VPg & 3‘ poly-A-tail
- Subgenomische RNA
Realm: Riboviria
Order: Unassigned
Family: Caliciviridae
Genus: Norovirus
Species: Norwalk virus
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
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Revers-genetische Systeme
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Revers-genetische Systeme
„einfacher“ als für Negativstrang RNA-Viren.
Einbringen viraler RNA in die Zelle reicht theoretisch aus, um infektiöse Viren zu
bilden.
Klassischer Ansatz:
Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor
In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen
Einbringen der RNA in Zielzellen
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Revers-genetische Systeme
Klassischer Ansatz:
Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor
In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen
- Für Viren mit VPg oder Cap muss dieses in der Reaktion mit eingefügt werden
- Für Viren mit Poly-A-Schwanz muss dieser vom Plasmid kodiert sein, oder
durch Poly-A-tailing angefügt werden
- Für Viren mit „nackten“ Enden ist meist das definierte Ende wichtig.
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Revers-genetische Systeme
Genom hat häufig ausgeprägte Sekundärstrukturen -> toxisch/instabil in
Bakterien
-> cDNA auf mehrere Plasmide aufgeteilt.
Die einzelnen Sequenzen werden vor der in vitro Transkription zu einem DNA-
Molekül zusammengefügt.
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Revers-genetische Systeme
In vivo Herstellung der „genomischen“ RNA durch transfizierte Zellen
- Durch Wahl eines RNA-Polymerase II Promotors wird die RNA mit einem Cap
modifiziert (gut für Viren mit einem VPg oder Cap-Genom)
- Ein Poly-A-Schwanz kann durch entsprechende Signale und die zellulären
Enzyme dafür angehängt werden.
- Für Viren mit exakten Genomenden kann hier durch die Klonierung eines
Ribozyms das exakte 3‘ Ende generiert werden.
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Interaktion mit dem Wirt:
essentielle Wirtsfaktoren
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Life cycle of plus strand RNA viruses
1. Entry ->
Receptors/proteases
2. Uncoating -> pH-shift,
endocytotic pathways,
enzymes
3. Translation and
polyprotein processing
-> ribosome, initiation
factors, elongation
factors, proteases,
chaperones
4. RNA replication
5. Assembly
6. Release/Maturation ->
proteases
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Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
Poliovirus: CD155
Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch
Affen)
Realm: Riboviria
Order: Picornavirales
Family: Picornaviridae
Genus: Aphthovirus
Species: Foot-and-mouth disease virus
Genus: Enterovirus
Species: human enterovirus C (polio)
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Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
Poliovirus: CD155
Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch
Affen)
DNA
Sequenzierung
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Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4
(DPP4, CD26)
Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,
Menschen…Realm: Riboviria
Order: Nidovirales
Suborder: Cornidovirineae
Family: Coronaviridae
Subfamily: Orthocoronavirinae
Genus: Alphacoronavirus
Species: Human coronavirus 229E
Genus: Betacoronavirus
Species: Middle eastern respiratory
syndrome-related coronavirus
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Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4
(DPP4, CD26)
Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,
Menschen…
Protein Massenspektrometrie
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Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4
(DPP4, CD26)
Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,
Menschen…
+
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Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4
(DPP4, CD26)
Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,
Menschen…
Jan-Berend Bosch et al. Cell Res 2013 23:9-169-70
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Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren
MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung
der Membranfusion. Wirtsfaktor TMPRSS2
Alexandra C. Walls et al. PNAS 2017;114:42:11157-11162
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Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren
„Scaffolding“-Funktion
MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung
der Membranfusion
Protease und Virus müssen zusammenkommen
Earnest et al, Plos Pathogens 2017
ZellkulturMaus
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Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren
MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung
der Membranfusion
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Hepatitis C: ein Virus – viele Rezeptoren
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
Realm: Riboviria
Order: Unassigned
Family: Flaviviridae
Genus: Hepacivirus
Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)
1 2 3
Hepatitis C is a viral infection, which is
chronic in 80% of the cases (1) and can lead
to cirrhosis (2) and hepatocellular
carcinoma (3)
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Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren
Hepatitis C Virus
Anfällige Spezies: Mensch (experimentell Schimpansen)
- „Attachment factors“: LDL-R & Glykosaminoglykane
- Rezeptoren: SR-BI & CD81
- Notwendige Eintrittsfaktoren: Claudin-1 & Occludin
Model by Sophana Ung
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Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren
Hepatitis C Virus
Anfällige Spezies: Mensch (experimentell Schimpansen)
- Nur die humane Isoform möglich: CD81 & OCLN
- SR-BI hochexprimiert in Leberzellen
- Weitere nicht-essentielle Faktoren fördern die Aufnahme
Model by Sophana Ung
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Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine
Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?
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Exkurs: miRNA
Winter et al. Nature Cell Biology, 2009
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Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine
Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?
- HCV hat zwei Bindestellen für miR-122 im 5‘ Ende des Genoms
- miR-122 ist hochkonzentriert in der Leber und reguliert Lipid- und
Cholesterolstoffwechselfunktionen und wirkt als Tumorsuppressor
Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198
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HCV ist miR-122 abhängig
Mutierte Bindungsstellen
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Details der Interaktion
Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198
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Details der Interaktion
Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198
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Stabilisierung der IRES
Chahal J et al, Nucleic Acid Research 2019 Volume 47, Issue 10, 04 June 2019, Pages 5307–5324
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miR-122 & HCV
- Stabilisierung der IRES
- Steigerung der Translation
- Schutz der RNA vor Abbau durch Xrn1/2
Kincaid et al, PNAS 2018
Chahal J et al, Nucleic Acid Research 2019
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Wirtsfaktoren zur Persistenzetablierung - Pestiviren
Realm: Riboviria
Order: Unassigned
Family: Flaviviridae
Genus: Pestivirus
Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)
Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)
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BVDV
• Zwei Biotypen: nicht-zytopathogen (ncp), zytopathogen (cp)
– Unterscheiden sich durch ihren Effekt in Zellkultur
– Was ist die biologische Relevanz?
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Pathogenese: BVD / “Mucosal Disease”
• Infektion
– Meist klinisch inapparent
– Fieber
– Durchfall
– Schleimhautläsionen
– Tod
• Infektion in trächtigen Kühen
– Infektion mit ncp Virusen zwischen Tag 40
und 120 führt zur Infektion des Fetus und zur
Geburt persistent infizierter (PI)Tiere
• PI Tiere:
– Haben keine adaptive Immunantwort
– Haben hohe virale Titer im Blut
– Sind das Virusreservoir
• Überinfektion der PI-Tiere mit einem cp
Virus führt zur “Mucosal Disease”.
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Was ist der genetische Unterschied zwischen ncp und cp
Isolaten?
• Marker für cp Viren ist freies NS3 in infizierten
Zellen.
Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)
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Regulierung der NS2-3-Spaltung
• Ncp Viren produzieren NS3 zu
frühen Zeiten der infektion
• Cp Viren produzieren NS3 zu
jedem Zeitpunkt der Infektion
• NS2 ist eine Autoprotease, die
sich selbst abspaltet
• Schlußfolgerung: NS3-
Produktion ist in ncp Viren
streng geregelt
• Was sind die molekularen
Grundlagen für die strenge
Regelung in ncp und die
konstitutive Spaltung in cp
Viren?
T. Lackner et al. J. Virol. 2004;78:10765-10775
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Molekulare Grundlagen – cp Virusgenome
cp Viren enthalten (zelluläre) Sequenzen, die zur NS2-NS3-Spaltung
führen
Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015
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Molekulare Grundlagen – cp Virusgenome
Ausnahme
Regel
Vollständige NS2-3-Spaltung -> kein infektiöses Virus
Insertion einer IRES oder Ubiquitins zwischen NS2 und NS3 -> kein
infektiöses Virus
Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015
Ubiquitin verwandte
Proteine -> Spaltung
durch zelluläre Proteasen
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Molekulare Grundlage – cp Virusgenome
Einige cp Viren haben ungewöhnliche Insertionen
- 90as des 699as „J-domain protein“ (Jiv = J-domain protein interacting
with viral protein, oder DNAJ-C14)
- Jiv ist ein zelluläres Chaperon, das zur Hsp40 Familie gehört
- Die 90as Sequenz hat keine Proteaseaktivität
Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015
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Jiv/Jiv90 erlaubt die Spaltung
- NS2 ist eine Autoprotease
- Jiv90 ein essentieller Kofaktor
Rinck et al. A Cellular J-Domain Protein Modulates Polyprotein Processing and Cytopathogenicity of a Pestivirus, J Virol 2001
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Jiv-negative Zellen sind resistent
- CRISPR/Cas9 induzierte Zerstörung von Jiv90
- Cp-Viren können sich gleichermaßen in ko Zellen und WT Zellen
vermehren
- Ko Zellen sind resistent gegenüber ncp Viren
O. Isken et al. J. Virol. 2019; doi:10.1128/JVI.01714-18
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Die Spaltung in der Infektion
NS3 wird für die Replikation benötigt
NS2-3 wird für den Partikelbau benötigt
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Warum? – Adaptierung an NS2/NS3 alleine
Chimäre aus ncp7 und Ossloss
Je ein Aminosäureaustausch in NS2 und NS3 nötig
Sowohl NS2-3 als auch NS3 bilden einen Komplex mit NS4A
Dubrau et al. Plos Pathogens 2017
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NS4A interagiert unterschiedlich mit NS3 und NS2-3
Einfluss auf Interaktion mit NS4A
Dubrau et al. Plos Pathogens 2017
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Kompakte Interaktion
NS3/NS4A -> RNA
Replikation
Depletion von Jiv in der
Infektion -> keine Spaltung
NS2-3
Veränderte Interaktion
NS2-3/NS4A ->
Partikelzusammenbau
Zeitliche Regulierung der
Infektion
Jiv Depletion reguliert Replikation und Zusammenbau
Dubrau et al. Plos Pathogens 2017
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Warum die zeitliche Regulierung?
Ncp Virus IFN-Antwort unterdrückt -> Foetus
überlebt
Cp Virus IFN-Antwort vorhanden -> Abort
RNA
Npro/Erns
RNA
Npro/Erns
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Take Home?
- Bei Plus-strang RNA Viren ist schon die RNA infektiös
- Wirtsfaktoren sind z.T. verantwortlich für den (Spezies-/Zell-)
Tropismus von Viren
- Und/oder können die Replikation/Partikelproduktion regulieren
- Rezeptoren
- Essentielle Kofaktoren
- Wirtsfaktoren können ganz unterschiedlich sein
- Proteine
- Nukleinsäuren
- Lipide (?? Evtl einen Abschnitt zu Lipoproteinen und HCV
einbringen?
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• Xrn und HCV ausbauen
• NS2-3 und NS4A kürzen Evtl DNAJ14C und Flaviviren?
• Lipoproteine und HCV einbauen?
• Ansonsten anderes Bsp für weitere Kofaktornutzung
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FRAGEN?