Platelia™ EBV-VCA IgG 1 placă - 96 72937 ANALIZĂ IMUNOENZIMATICĂ PENTRU DETERMINAREA CALITATIVĂ ÎN SERUL UMAN A ANTICORPILOR IgG ANTI VIRUS EPSTEIN-BARR (ANTIGENUL CAPSIDEI VIRALE)

2015/04 1 – DESTINAŢIA TRUSEI Această trusă imunoenzimatică se foloseşte pentru determinarea calitativă a anticorpilor IgG specifici de antigenul capsidei virale a virusului Epstein-Barr (EBV-VCA) în serul uman. Testul PlateliaTM EBA-VCA IgG poate fi utilizat în paralel cu altă serologie Epstein-Barr (PlateliaTM EBV-VCA IgM, PlateliaTM

EBV-EA-D IgG şi PlateliaTM

EB-NA-1 IgG) fiind de ajutor în diagnosticarea mononucleozei infecţioase. 2 – IMPORTANŢA CLINICĂ Detecţia viruslui Epstein-Barr a fost descrisă prima dată în 1964 de către Epstein Achong şi Barr, în urma studiilor efectuate la microscopul electronic pe culturi de limfoblaste de la pacienţi cu limfom Burkitt. După caracteristicile morfologice, EBV face parte din familia herpesviride. Infecţia cu EBV se manifestă printr-un spectru larg de simptome. Majoritatea infecţiilor primare EBV sunt transmise prin salivă, apar în perioada copilăriei şi sunt subclinice. În Statele Unite, 50% din populaţie prezintă anticorpi EBV înainte de vârsta de 5 ani, iar 80% la maturitate. Infecţiile asociate transfuziilor au fost de asemenea raportate. La adulţii tineri, infecţia cu EBV se poate manifesta clinic ca mononucleoză infecţioasă (MI) cu simptome relative, atipice, de faringită în puseu febril, tonsilită, limfadenopatie, stare de rău general, cefalee, mialgie, spleno- si hepatomegalie, erupţie tegumentară şi leucocitoză. Elevii de liceu şi personalul militar sunt adesea citaţi ca populaţie cu incidenţă mare de morbiditate pentru MI. După infecţia primară cu EBV, se cunoaşte că limfocitele B pot continua să păstreze genomul de EBV, ce determină o infecţie latentă care poate dura toată viaţa. Reactivarea infecţiei cu EBV sau creşterea activării EBV a fost documentată la pacienţi imunodeficienţi sau imunodeprimaţi (cum sunt pacienţii cu transplant de organe, cei cu afecţiuni maligne, femeile gravide şi persoanele în vârstă). Mai sunt controverse legate de identificarea definitivă a EBV ca agent etiologic al stărilor clinice caracterizate ca “infecţie cronică cu EBV” sau “mononucleoză cronică”. Virusul Epstein-Barr a fost asociat şi cu patogeneza a două cancere la om, limfomul Burkitt şi carcinomul nazofaringian. Studiile de hibridare a ADN au demonstrat prezenţa genomului EBV în biopsiile prelevate de la pacienţi cu astfel de carcinoame. Limfomul Burkitt a fost prima dată observat în Africa sub-Sahariană, în mod deosebit la copiii africani şi în Noua Guinee. Infecţiile malarice sunt diagnosticate frecvent la pacienţi cu limfom Burkitt şi se consideră a reprezenta un cofactor. Carcinomul nazofaringian se observă în Asia, cu deosebire în sudul Chinei, şi pot avea ca şi cofactori influenţele genetice sau de mediu. Limfoame Burkitt similare cu limfomul Burkitt african au fost recent semnalate la bolnavi cu sindrom de imunodeficienţă umană dobândită (SIDA). S-a sugerat că pacienţii cu SIDA pot avea predispoziţie la infecţi/reactivarea EBV datorită imunodepresiei ce caracterizează starea lor în general. Testarea anticorpilor heterofili este actualmente procedeul cel frecvent utilizat la diagnosticarea unei MI acute. Totuşi, până la 20% dintre pacienţii cu infecţie primară cu EBV nu prezintă pozitivitate pentru anticorpii heterofili. Mai mult, au fost raportate rezultate fals pozitive în proporţie de până la 7% la testările cu teste pe lamă rapide pentru anticorpi heterofili disponibile pe piaţă, datorită în principal erorilor tehnice la raportarea subiectivă a aglutinării eritrocitelor. 3 – PRINCIPIUL TESTĂRII Testele Bio-Rad ELISA se bazează pe capacitatea substanţelor biologice (ex. antigenele) de a fi adsorbite pe suprafeţele din plastic cum sunt cele din polistiren (faza solidă). Trusa PlateliaTM EBV-VCA IgG este de tip ELISA şi utilizează antigene VCA purificate, fixate la faza solidă (godeurile microplăcii). Când antigenele fixate la faza solidă intră în contact cu serul pacientului, anticorpii specifici de antigen, dacă sunt prezenţi, vor lega antigenul de pe faza solidă, formând complexe antigen-anticorp. Excesul de anticorpi este înlăturat prin spălare. Ulterior se adaugă conjugatul, reprezentat de IgG de capră anti-imunoglobuline umane, marcat cu peroxidază din hrean, care se ataşează de complexele antigen-anticorp. Excesul de conjugat este înlăturat prin spălare, apoi se adaugă substratul, tetrametil benzidina (TMB). Dacă în serul pacientului se găsesc anticorpi specifici de antigen, va apărea culoarea albastră. Când reacţia enzimatică este stopată cu H2SO4 1N, conţinutul godeurilor se schimbă in galben. Culoarea, care este direct proporţională cu concentraţia de anticorpi din serul uman, poate fi citită cu un spectrofotometru adecvat sau cu cititorul de microplăci ELISA.

Trusa PlateliaTM EBV-VCA IgG se bazează în principal pe antigenele capsidei virale (VCA) pentru a detecta anticorpii IgG specifici infecţiei cu EBV. Anticorpii sunt detectabili în absenţa anticorpilor heterofili. Crescând de timpuriu în cursul bolii, nivelele de EBV-VCA IgG ating un maxim după 3-4 săptămâni, apoi descresc şi persistă la nivele scăzute toată viaţa. Sensibilitatea, specificitatea şi reproductibilitatea testelor ELISA pot fi comparabile cu alte tehnici de detecţie a anticorpilor, cum sunt imunofluorescenţa, tehnica fixării complementului, hemaglutinarea şi testele radio-imunoenzimatice. 4 – CONŢINUTUL TRUSEI Toţi reactivii sunt destinaţi exclusiv diagnosticului in vitro. Eticheta Natura reactivilor Prezentare

R1 Microplate

Microplaca: 12 barete (8 godeuri fiecare) sensibilizate cu antigenul capsidei virale de EBV purificat (inactivat), păstrate într-o pungă cu un deshidratant

1

R2 Concentrated Washing

Solution (20x)

Soluţie de spălare concentrată (20x) Tampon Tris (pH 7,2 ± 0,2) cu 1% Tween® 20. Conservant: Proclin™ 300 (0,1%)

1 x 50 ml

R3 Non Reactive control

Control nereactiv (uman) pentru anticorpi IgG anti-EBV-VCA. Negativ pentru AgHBs, anti-HIV-1, anti-HIV-2 şi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi pen/strep (0,01%)

1 x 0,4 ml

R4a Positive Control I

Control pozitiv I (uman) pentru anticorpii IgG anti-EBV-VCA. Negativ pentru AgHBs, anti-HIV-1, anti-HIV-2 şi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi pen/strep (0,01%)

1 x 0,4 ml

R4b Positive Control

II

Control pozitiv II (uman) pentru anticorpii IgG anti- EBV-VCA. Negativ pentru AgHBs, anti-HIV-1, anti-HIV-2 şi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi pen/strep (0,01%)

1 x 0,4 ml

R5 Calibrator

Etalon (uman) pentru anticorpii IgG anti-EBV-VCA, cu factorul specific trusei imprimat pe eticheta flaconului. Negativ pentru AgHBs, anti-HIV-1, anti-HIV-2 şi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi pen/strep (0,01%)

1 x 0,4 ml

R6 Conjugate

Conjugat: anticorpi de capră anti-IgG umane / POD (peroxidază) Conservanţi: ProClin™ 300 (0,1%) şi gentamicină.

1 x 16 ml

R7 Diluent I Diluant I: tampon gata de lucru (pH 7,5 ± 0,2). Conservant: ProClin™ 300 (0,1%). 1 x 30 ml R9

Chromogen TMB

Soluţie de Cromogen/Substrat (gata de lucru): Tetrametil benzidină (TMB). Reactivul trebuie să rămână închis când nu este utilizat, în caz contrar în godeurile de reacţie se poate forma un precipitat.

1 x 15 ml

R10 Stopping Solution

Soluţie de stopare: H2SO4 (acid sulfuric) 1N 1 x 15 ml

Foaie de lucru 1 5 – PRECAUŢII, IGIENA ŞI PROTECŢIA MUNCII Precauţii Calitatea rezultatelor depinde de respectarea următoarelor Bune Practici de Laborator: • Nu utilizaţi reactivi expiraţi • Nu amestecaţi reactivii din loturi diferite în timpul efectuării unui test REMARCĂ: puteţi utiliza alte loturi de soluţie de spălare (R2), soluţie cromogen/substrat gata de lucru (R9) şi de soluţie de

stopare (R10) din trusele PlateliaTM EBV-VCA IgM, PlateliaTM EBV-EA-D IgG şi PlateliaTM EB-NA IgG din catalogul nostru, ca şi pentru Diluantul I (R7) din trusele PlateliaTM EBV-EA-D IgG şi PlateliaTM EB-NA-1 IgG.

Contactaţi serviciul nostru tehnic pentru a obţine informaţii detaliate. • Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 minute pentru ca reactivii să ajungă la temperatura camerei • Reconstituiţi reactivii cu grijă, evitând contaminarea • Nu efectuaţi testul în prezenţa unor vapori reactivi (acizi, alcalini, aldehidici) sau a prafului deoarece ar putea altera

activitatea enzimatică a conjugatului. • Utilizaţi sticlărie foarte bine spălată şi clătită cu apă distilată sau de preferat, utilizaţi materiale de unică folosinţă. • Nu lăsaţi microplaca să se usuce între sfârşitul operaţiunilor de spălare şi distribuirea reactivilor. • Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la ionii metalici. În consecinţă, nu permiteţi ca un element metalic să intre în contact

cu variatele conjugate sau soluţii substrat. • Soluţia de cromogen/substrat gata de lucru trebuie să fie incoloră. Apariţia unei coloraţii indică faptul că reactivul este

inutilizabil şi trebuie înlocuit. Păstraţi soluţia la întuneric. • Utilizaţi un vârf de pipetă nou pentru fiecare probă biologică. • Spălarea microplăcii este o etapă esenţială în procedeul de lucru: respectaţi numărul recomandat de cicluri de spălare şi

asiguraţi-vă că toate godeurile sunt bine umplute şi apoi complet golite. Spălările incorecte pot duce la rezultate eronate.

• Niciodată nu utilizaţi acelaşi recipient pentru a distribui conjugatul şi soluţia de developare. • Verificaţi pipetele şi restul echipamentului pentru precizie şi bună funcţionare. • Nu modificaţi procedeul de lucru. INSTRUCŢIUNI DE IGIENA ŞI PROTECŢIA MUNCII Toţi reactivii sunt destinaţi exclusiv diagnosticului in vitro. • Utilizaţi mănuşi de unică folosinţă când manipulaţi reactivii • Nu pipetaţi cu gura • Materialul de provenienţă umană utilizat la prepararea reactivilor a fost testat şi a fost găsit nereactiv pentru antigenul de

suprafaţă al virusului hepatitic B (AgHBs), anticorpii anti-virus hepatitic C (anti-HCV) şi anti-virusul imunodeficienţei umane (anti-HIV1 şi anti-HIV2). Pentru că nici o metodă nu poate garanta absenţa absolută a agenţilor infecţioşi, mânuiţi reactivii de origine umană şi prelevatele clinice ca şi cum ar putea transmite boli infecţioase şi aplicaţi precauţiile de rigoare.

• Orice material, inclusiv soluţia de spălare, care vine în contact direct cu prelevatele şi reactivii ce conţin material de origine umană, trebuie considerat potenţial infecţios.

• Evitaţi stropirea cu probe biologice sau soluţii conţinând probe biologice • Suprafeţele stropite se vor curăţa cu apă de Javel diluat la 10%. În eventualitatea stropirii cu un acid, acesta trebuie întâi

neutralizat cu bicarbonat de sodiu, apoi curăţat cu dezinfectant şi uscat cu hârtie absorbantă. Materialul utilizat pentru curăţare trebuie aruncat într-un container de reziduuri contaminate.

• Probele biologice, reactivii de origine umană ca şi materialele produsele contaminate, trebuie aruncate după decontaminare: - fie prin introducerea în apă de Javel (clor menajer) la o concentraţie finală de 5% hipoclorit de sodiu, timp de 30 minute - fie prin autoclavare la 121ºC timp de minim 2 ore. Autoclavarea pentru cel puţin o oră la 121ºC este metoda cea mai bună pentru inactivarea virusurilor HIV şi a virusului hepatitei B.

ATENŢIE: NU INTRODUCEŢI ÎN AUTOCLAVĂ SOLUŢII CARE CONŢIN HIPOCLORIT DE SODIU! • Manipularea şi eliminarea substanţelor chimice trebuie efectuată în conformitate cu Bunele Practici de Laborator. • Evitaţi orice contact al tegumentelor sau mucoaselor cu soluţia de cromogen / substrat şi cu soluţia de stopare (risc de

toxicitate, iritaţii sau arsuri). • Unii reactivi conţin azidă de sodiu pentru conservare. Azida de sodiu poate reacţiona cu plumbul sau cuprul din construcţia

ţevilor de canalizare determinând producerea de azide metalice explozive. Pentru a preveni acumularea azidelor, spălaţi canalizarea din abundenţă cu apă dacă soluţiile conţinând azide au fost eliminate la chiuvetă după inactivare.

• Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente chimice din acest kit de test, vă rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la www.bio-rad.com.

6 – MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ • Agitator tip vortex • Cititor de microplăci echipat cu filtre de 450 nm (*). • Container pentru deşeurile contaminate • Hipoclorit de sodiu (apă de Javel) şi bicarbonat de sodiu. • Apă distilată. • Cilindri gradaţi. • Mănuşi din plastic de unică folosinţă • Ochelari de protecţie • Hârtie absorbantă • Pipete sau pipete multicanal, automate sau semiautomate, reglabile sau fixe, pentru a măsura şi pipeta 10, 100 şi 1000 μl. • Spălător de microplăci manual, semiautomat sau automat (*). • Eprubete de unică folosinţă. (*) Consultaţi departamentul nostru tehnic pentru informaţii detaliate despre echipamentul recomandat. 7 – RECONSTITUIREA, VALABILITATEA ŞI PĂSTRAREA REACTIVILOR Trusa trebuie păstrată la o temperatură între +2-8ºC. Dacă se păstrează la această temperatură, fiecare componentă a trusei poate fi folosită până la data expirării inscripţionată pe cutie (în afara indicaţiilor specifice). Înainte de utilizare, lăsaţi toţi reactivii să ajungă la temperatura camerei (+21-25ºC). Introduceţi imediat toţi reactivii în frigider la +2-8ºC după utilizare. 1) Reactivi gata de lucru • Reactivul 1 (R1): microplaca Fiecare cadru-suport conţinând 12 barete, se găseşte într-o pungă cu închidere tip nervură de plastic, sigilată. Tăiaţi punga

cu foarfecele sau bisturiul la 0,5-1 cm deasupra nervurii. Deschideţi punga şi scoateţi cadrul. Reţineţi numărul necesar de barete şi reintroduceţi baretele neutilizate imediat în pungă. Închideţi cu grijă punga şi introduceţi-o la +2-8ºC. Astfel păstrate, baretele sunt stabile timp de o lună.

• Reactivul 3 (R3): controlul negativ • Reactivul 4a (R4a): controlul pozitiv I • Reactivul 4b (R4b): controlul pozitiv II

• Reactivul 5 (R5): etalonul • Reactivul 6 (R6): conjugatul • Reactivul 7 (R7): diluantul I • Reactivul 9 (R9): soluţia de cromogen / substrat • Reactivul 10 (R10): soluţia de stopare 2) Reactivi de reconstituit • Reactivul 2 (R2): soluţia de spălare concentrată 20x Diluaţi 60 ml din soluţia de spălare 20x în 1,2 l de apă distilată pentru a obţine soluţia de spălare gata de lucru. Omogenizaţi bine. După diluare, păstraţi soluţia la +2-8ºC timp de 5 zile. 8 – PROBELE BIOLOGICE Recoltaţi probele de sânge conform practicilor curente. Testările se vor efectua pe probe de ser nediluate. Separaţi serul de cheag sau de hematii cât mai repede posibil pentru a evita hemoliza. Hemoliza intensă poate afecta performanţele testului. Probele care prezintă agregate trebuie clarificate prin centrifugare înainte de testare. Particulele de fibrină sau agregatele în suspensie pot duce la rezultate fals pozitive. Probele pot fi păstrate la +2-8ºC dacă testul se efectuează în 5 zile, în caz contrar se congelează la –20ºC timp de mai multe luni. Evitaţi congelările/decongelările repetate. Dacă prelevatele trebuie expediate, acestea trebuie ambalate conform reglementărilor în vigoare referitoare la transportul agenţilor etiologici. NU UTILIZAŢI SERURI CONTAMINATE, HIPERLIPEMICE, ICTERICE, HEMOLIZATE SAU INACTIVATE TERMIC. 9 – PROTOCOLUL DE LUCRU Urmaţi cu stricteţe protocolul de lucru. Utilizaţi serurile de control negativ, cut-off şi pozitiv în fiecare serie de lucru pentru a valida rezultatele testului. Respectaţi următoarele Bune Practici de Laborator: 1. Stabiliţi cu grijă planul de distribuţie şi identificare a probelor. 2. Preparaţi soluţia de spălare diluată (R2) (consultaţi secţiunea 7). 3. Scoateţi cadrul-suport şi baretele (R1) din ambalajul protector. Puneţi numărul dorit de barete sensibilizate cu antigen pe

suportul pentru microplacă. Prevedeţi 3 godeuri pentru etalon, 1 godeu pentru controlul negativ, câte 1 godeu pentru controlul pozitiv I şi pozitiv II şi 1 godeu pentru blancul de reactivi:

4. Toate probele, controalele şi etalonul trebuie omogenizate la vortex înainte de utilizare. Diluaţi probele de testat, etalonul, controalele negativ şi cele două pozitive 1:21 (de ex. 10 μl + 200 μl) cu diluantul I al probei (R7) în eprubete de diluţie sau placă de diluţie.

5. Pipetaţi 100 μl din fiecare soluţie diluată (etalon, controale, proba biologică) în fiecare godeu stabilit în diagrama de placă. Adăugaţi 100 μl din diluantul I al probei (R7) în godeul pentru blancul de reactivi.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B1 S2 B R3 S3 C R4a S4 D R4b S5 E R5 S6 F R5 S7 G R5 S8 H S1 S9 6. Incubaţi microplaca timp de 20 de minute ± 2 minute la temperatura camerei (23 ± 2ºC). 7. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container pentru deşeuri contaminate (care conţine hipoclorit de sodiu) şi

adăugaţi imediat în fiecare godeu minim 300 μl de soluţie de spălare. Aspiraţi din nou. Repetaţi această operaţie de cel puţin 4 ori (în total minim 5 spălări). Dacă este necesar, uscaţi placa întorcând-o cu faţa în jos pe o hârtie absorbantă. Dacă utilizaţi un spălător automat de plăci, urmaţi aceeaşi procedură.

8. Distribuiţi în toate godeurile 100 μl de conjugat (R6). 9. Incubaţi microplaca timp de 20 de minute ± 2 minute la temperatura camerei (23 ± 2ºC). 10. Goliţi toate godeurile prin aspirare şi spălaţi de 5 ori aşa cum este descris mai sus. 11. Distribuiţi rapid în fiecare godeu 100 μl de soluţie cromogen / substrat (R9) 12. Lăsaţi reacţia să se dezvolte la întuneric timp de 10 ± 2 minute la temperatura camerei (23 ± 2ºC). Nu utilizaţi folie adezivă

în timpul acestei incubări. Soluţia de cromogen / substrat îşi va schimba culoarea în albastru în godeurile care conţin nivele detectabile de anticorpi IgG.

13. Adăugaţi 100 μl din soluţia de stopare (R10) în fiecare godeu, în aceeaşi ordine şi cu aceeaşi viteză ca şi la soluţia cromogen / substrat. Omogenizaţi tapotând microplaca. Prin adăugarea soluţiei de stopare, culoarea albastră din godeuri trece în galben.

14. Ştergeţi cu grijă fundul plăcii. Aşteptaţi minim 5 minute apoi citiţi densitatea optică la 450 nm cu ajutorul unui cititor de plăci

în cele 30 de minute care urmează stopării reacţiei (baretele trebuie întotdeauna să fie ferite de lumină înaintea citirii). 15. Verificaţi toate rezultatele înainte de transcriere pentru concordanţa între citire şi planul de distribuţie şi de identificare a

probelor în microplacă. 10- CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR 1) Calculul absorbţiilor medii 1. Media densităţilor optice (DO) a etalonului R5: calculaţi valoarea medie a DO utilizând cele 3 valori individuale ale DO ale lui

R5. Dacă una dintre valori este aberantă, diferind cu mai mult de 15% de la media DO, refaceţi calcului fără valoarea aberantă.

2. Factorul de corecţie – pentru a lua în considerare fluctuaţiile zilnice (temperatură, timp) din timpul testării, pentru fiecare lot de truse este determinat un factor de corecţie care este imprimat pe eticheta flaconului etalonului R5.

3. Valoarea cut-off a etalonului pentru fiecare testare este determinată multiplicând factorul de corecţie cu media DO a etalonului R5 (conform etapei 1).

4. Valoarea ISR – calculaţi raportul de imunitate (Immune Status Ratio, ISR) pentru fiecare probă biologică împărţind valoarea DO a probei la valoarea cut-off a etalonului determinată în etapa 3.

Exemplu: DO obţinute pentru etalonul R5 = 0,380, 0,400, 0,420 DO medie pentru etalonul R5 = 0,400 Factorul de corecţie = 0,5 Valoarea cut-off a etalonului = 0,5 x 0,400 = 0,200 DO obţinută pentru serul pacientului = 0,600 Valoarea ISR = 0,600/0,200 = 3,00 2) Validarea testului 1. Blancul de reactivi (când se citeşte faţă de aer) trebuie să fie < 0,150 la 450 nm: DO RB < 0,150 2. Controlul negativ R3 trebuie să fie ≤ 0,250 la 450 nm (când se citeşte faţă de blancul de reactivi): DO R3 ≤ 0,250 3. Fiecare etalon R5 trebuie să fie ≥ 0,250 la 450 nm (când se citeşte faţă de blancul de reactivi): DO R5 ≥ 0,250 4. Controlul pozitiv R4b trebuie să fie ≥ 0,500 la 450 nm (când se citeşte faţă de blancul de reactivi): DO R4b ≥ 0,500 5. Valorile ISR (raportul de imunitate, Immune Status Ratio) pentru controalele negativ, pozitiv I şi pozitiv II (R3, R4a, R4b)

trebuie să se încadreze între valorile indicate pe fiecare flacon Dacă aceste criterii nu se încadrează în intervalele respective, testul trebuie considerat invalid şi trebuie repetat. 3) Interpretarea rezultatelor Valorile ISR (Immune Status Ratio) se interpretează după cum urmează:

ISR probă Rezultate Interpretare ≤ 0,90

Negativ

Anticorpi IgG anti-EBV-VCA nedetectabili. Aceste persoane se presupun indemne de infecţia cu EBV şi deci susceptibili la o infecţie primară

0,91-1,09 Incert Probele trebuie retestate ≥ 1,10

Pozitiv

Anticorpi IgG anti-EBV-VCA cu nivele semnificative. Indică o infecţie curentă sau în trecut. Persoanele ar putea transmite infecţia cu EBV, dar nu sunt neapărat contagioase.

1. Pentru raportarea rezultatelor obţinute, se recomandă următoarea metodă: Rezultat … obţinut la testarea cu trusa PlateliaTM

EBV-VCA IgG. Valorile obţinute prin alte metode nu sunt interşanjabile. 2. Tabloul cuprinzător al infecţiei cu EBV este dat de coroborarea rezultatelor celor 4 teste serologice EBV-VCA IgM, EBV-

VCA IgG, EBV-EA IgG şi EB-NA IgG. Interpretarea corectă a infecţiei cu EBV se bazează pe valorile tuturor acestor anticorpi şi în mod normal diagnosticul nu trebuie conchis pe baza unui singur test.

3. Probele rămase incerte după retestare ar trebui reanalizate printr-o metodă alternativă, de ex. imunofluorescenţă (IFA). Dacă rezultatele rămân încă ambigue, ar trebui prelevată o nouă probă de

ser. 4. Caracteristicile de performanţă ale acestui produs au fost stabilite utilizând un singur etalon. Dacă se doreşte calibrarea

testării, utilizatorul trebuie să folosească încă alte 2 etaloane pentru a obţine o curbă de etalonare din 3 puncte. 5. Pentru a putea evalua dacă o pereche de probe de la acelaşi pacient prezintă modificarea semnificativă a nivelului de

anticorpi, ambele probe trebuie testate în aceeaşi serie de lucru. Media ISR, atât a probei iniţiale (acută), cât şi a celei secundare (convalescentă), trebuie să fie mai mare ca 1,00 pentru a evalua corect perechea seruri pentru creştere semnificativă a nivelului anticorpilor.

4) Prevalenţa Aproximativ 80-90% din populaţia adultă din SUA este seropozitivă pentru EBV-VCA IgG, cu titruri ce pot varia în funcţie de metoda de testare utilizată. Anticorpii IgG anti-EBV se dezvoltă de timpuriu in MI şi ating maximul în decurs de 3-4 săptămâni de la debut. Titrul va scădea treptat până la o valoare ce va rămâne de-a lungul întregii vieţi. Nivele crescute de anticorpi anti-EBV pot apărea la pacienţi cu carcinom nazofaringian, limfom Burkitt, boala Hodgkin, sarcoidoză şi lupus eritematos diseminat.

5) Limitele testului 1. Procedee de lucru sau practici altele decât cele incluse în această trusă pot duce la rezultate eronate. • Reacţiile nereproductibile sunt frecvent cauzate de:

- spălarea inadecvată a microplăcii - durată de incubare a plăcilor incorectă - contaminarea probelor negative cu ser sau plasmă cu titruri înalte de anticorpi - contaminarea soluţiei de developare cu agenţi oxidanţi (dezinfectant, ioni metalici, etc.) - contaminarea soluţiei de stopare

• Serurile contaminate, icterice, lipemice, hemolizate sau inactivate termic pot determina rezultate eronate şi trebuie evitate. • Performanţele testului au fost stabilite în exclusivitate pentru seruri. 2. Medicul trebuie să interpreteze rezultatele acestui test în contextul clinic şi coroborând cu alte evidenţe de laborator. • Acest test este destinat măsurării anticorpilor IgG în probele pacienţilor. Rezultatele pozitive la nou-născuţi trebuie

interpretate cu grijă, deoarece IgG materne sunt transferate pasiv la făt înainte de naştere. Testările IgM sunt sunt în general indicatori mai utili în infecţiile copiilor sub vârsta de 6 luni. Valorile obţinute cu acest test se doresc a fi doar un ajutor în diagnostic. Fiecare medic trebuie să interpreteze rezultatele în contextul anamnestic, clinic, al examenului fizic şi altor tehnici de diagnostic. Performanţele testului nu au fost stabilite pentru pacienţi cu carcinom nazofaringian, limfom Burkitt sau alte limfadenopatii asociate EBV sau alte afecţiuni asociate infecţiei cu EBV, altele decât mononucleoza infecţioasă. Rezultatele testării cu PlateliaTM EBV-VCA IgG a serurilor de la pacienţii imunosupresaţi trebuie interpretate cu precauţie. Performanţele testului nu au fost stabilite pentru prelevate clinice recoltate în secţiile de pediatrie.

• O creştere semnificativă a titrului de anticorpi indică o stimulare antigenică recentă. Lipsa unei creşteri semnificative a anticorpilor nu exclude posibilitatea unei infecţii cu EBV. Probele recoltate foarte timpuriu în evoluţia infecţiei pot să nu conţină nivele detectabile de IgG. În astfel de cazuri se recomandă să se efectueze o testare pentru IgM sau să se obţină o nouă probă de ser 10-21 de zile mai târziu pentru a fi testată în paralel cu proba iniţială în scopul determinării seroconversiei care indică o infecţie primară.

• Prezenţa anticorpilor EBV IgG poate să nu asigure protecţia pentru boală. Valoarea ISR a unei singure determinări de anticorpi din probă nu se corelează cu severitatea simptomelor clinice în MI.

11 – PERFORMANŢELE 1 – Sensibilitatea şi specificitatea relative bazate pe caracterizarea serurilor Au fost testate 205 probe alese întâmplător de la două populaţii diferite cu ajutorul testului PlateliaTM EBV-VCA IgG şi cu un test IFA comercial. Populaţia studiată a fost compusă din seruri recoltate ambulatoriu de la donatori de sânge de la o universitate mare din California şi de la departamentul de sănătate din estul Statelor Unite. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos. Primul test comercial IFA

Platelia™ EBV-VCA IgM

Rezultate Pozitive Negative Pozitive 193 0 Incerte 1 0 Negative 2 9

Un al doilea test IFA disponibil pe piaţă pentru EBV-VCA IgG a fost utilizat pentru verificarea celor 2 rezultate fals-pozitive la testarea cu primul test IFA. Rezultatul incert în urma testării cu PlateliaTM EBV-VCA IgG este considerat indeterminat şi acel rezultat (1 în total) a fost omis din calculele care urmează pentru stabilirea specificităţii şi sensibilităţii relative: Specificitate: 100% (11/11) Sensibilitate: 100% (193/193) 2 – Repetabilitatea (precizia intra-testare) Testul PlateliaTM EBV-VCA IgG a fost evaluat pentru precizie prin testarea a trei seruri (unul negativ, unul slab pozitiv şi unul pozitiv) de zece ori fiecare, pe aceeaşi placă. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos: Ser n X DS CV % Negativ 10 0,392 0,047 12

Slab pozitiv 10 1,195 0,038 3,2 Pozitiv 10 2,252 0,097 4,3 X = Valoarea medie a ISR DS = Deviaţia Standard CV = Coeficientul de Variaţie

3 – Reproductibilitatea (precizia inter-testări) Testul PlateliaTM EBV-VCA IgG a fost evaluat pentru precizie prin testarea a trei seruri (unul negativ, unul slab pozitiv şi unul pozitiv) de zece ori fiecare, în trei zile diferite. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos: Ser n X DS CV % Negativ 30 0,42 0,064 15

Slab pozitiv 30 1,02 0,054 4,2

Pozitiv 30 2,44 0,149 6,1 CV la probele pozitive este sub 10%. 4 – Reactivitatea încrucişată Următorele 8 probe de ser au fost testate şi au fost negative la testarea cu PlateliaTM EBV-VCA IgG.

12 – BIBLIOGRAFIE 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr. 1964. Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt's Lymphoma.

Lancet. 1: 702-703. 2. Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong. 1965. Studies with Burkitt's Lymphoma. Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4: 69-82. 3. Schooley, R.T. and R. Dolin. 1985. Epstein-Barr Virus (Infectious Mononucleosis). In: Principles and Practice of Infectious

Diseases, 2nd Edition. Mandell, G. L., R. G. Douglas, and J. E. Bennett. (eds). John Wiley and Sons, New York. pp 97 - 982.

4. Sumaya, C.V. 1985. Serological Testing for Epstein-Barr Virus-Developments in Interpretations. J. Inf. Dis. 151 (6): 984-987.

5. Tobi, M., and S.E. Straus. 1985. Chronic Epstein-Barr Virus Disease: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 103 (6(pt.1)): 951-953.

6. Sumaya, C.V. 1986. Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab Mgmt. Oct., 37-46. 7. Birx, D.L., R.R. Redfield, and G. Tosarto. 1986. Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with

Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) or AIDSRelated Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14): 874-879. 8. Ablashi, D.V., et. al. 1985. Firsh International Symposium on Epstein-Barr Virus and Associated Malignant Diseases.

Cancer Res. 45 (8): 3981-3984. 9. Chang, R.S., H. Thompson, and S. Pomerantz. 1985. Epstein-Barr Virus Infections in Homosexual Men with Chronic,

Persistent Generalized Lymphadenopathy. J. Inf. Dis. 151 (3): 459-463. 10. Bakerman, S. 1980. Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp 21-29. 11. Engvall, E. and P. Perlmann. 1972. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies

by Enzyme-labeled Anti-Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 109: 129-135. 12. Engvall, E., and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin

G. Immunochemistry. 8: 871-874. 13. Engvall, E., and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. Peeters. H., ed. Proteins of the

Biological Fluids. Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge, Oxford. Pergamon Press. pp 553 - 556.

Probă EBV ANA CMV VZV HSV1 HSV2 PlateliaTM EBV-VCA IgG

472 – – + + + – Negativ

595 – – – + + – Negativ

617 – – – + + – Negativ

616 – + – + + – Negativ

631 – – – + – – Negativ

632 – – + + – – Negativ

638 – – + + + + Negativ

660 – – – + – – Negativ

14. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein

Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme- Labelled Antigen and Antibody-Coated tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251: 427-434.

15. Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs. 1971. Immunoassay Using Antigen- Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15: 232-235.

16. CDC/NIH Manual. 1993. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3rd edition. Pp. 18-24. 17. Lennette, E.T. 1985. Epstein-Barr Virus. In: Manual of Clinical Microbiology, Fourth Edition. E.H. Lennette, A. Balows, W.J.

Hausler, Jr. and H.J. Shadomy, eds. ASM. 67:728-732. 18. Tishchendorf, P., et. Al. 1970. Development and Persistence of Immunity to Epstein- Barr Virus in Man. J. Infect Dis.

1222:401-409. 19. Evans, A.S. 1971. The Spectrum of Infections with EB Virus: A Hypothesis. J. Infect. Dis. 124:330-337. 20. Niederman, J.C., R.W. McCollum, G. Henle, and W. Henle. 1968. Infectious Mononucleosis, Clinical Manifestations in

Relation to EB Virus Antibodies. Jama 203:205-209. 21. Henle, W. and G. Henle. 1972. Epstein-Barr Virus: The Cause of Infectious Mononucleosis. In: Oncogenesis and

Herpesviruses. I.M. Biggs and L.H. Payne, eds. Int Agency Res. Cancer Sci. #2, Lyon, pp. 269-274

TRINITY BIOTECH USA, 2823 Grits Road, Jamestown, NY, 14701

TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow – Ireland

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax. : +33 (0) 1 47 41 91 33 www.bio-rad.com

2015/04