phuong phap dinh luong protein

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

GVHD: Ts. PHAN NGỌC HÒA

TP. HỒ CHÍ MINH, ngày 11/12/2011

2

MỤC LỤC 1. KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH ............ 5

2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL ...... 6

2.1. Tổng quan ............................................................................................ 6

2.1.1. Lĩnh vực áp dụng .......................................................................... 6

2.1.2. Ưu điểm và hạn chế ...................................................................... 6

2.2. Nguyên tắc chung ................................................................................ 6

2.3. Định lượng nitơ tổng ........................................................................... 8

2.3.1. Vô cơ hóa mẫu (trong tủ Hotte) ................................................... 8

2.3.2. Cất đạm (trong máy cất đạm) ...................................................... 8

2.3.3. Chuẩn độ ........................................................................................ 8

2.4. Định lượng nitơ phi protein ............................................................... 9

3. PHƯƠNG PHÁP BIURET ........................................................................ 9

3.1. Nguyên tắc chung ................................................................................ 9

3.2. Ưu điểm và hạn chế ........................................................................... 10

3.3. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol ....... 10

3.4. Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp

của TCA ......................................................................................................... 10

3.5. Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối với mẫu giàu

lipid ............................................................................................................. 10

3.6. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử

............................................................................................................. 10

3.7. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA ...... 10

4. PHƯƠNG PHÁP LOWRY ...................................................................... 11

4.1. Nguyên tắc chung .............................................................................. 11

3

4.2. Ưu điểm và hạn chế ........................................................................... 11

5. PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING) ... 12

5.1. Nguyên tắc chung .............................................................................. 12

5.2. Phương pháp Bradford ..................................................................... 12

5.2.1. Nguyên tắc ................................................................................... 12

5.3. Phương pháp Udy .............................................................................. 13

5.3.1. Nguyên tắc ................................................................................... 13

5.4. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm ...... 13

6. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS-

SPECTROPHOTOMETRIC) ......................................................................... 13

6.1. Nguyên tắc .......................................................................................... 13

6.2. Ưu điểm và hạn chế ........................................................................ 13

7. PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET

ABSORPTION) ................................................................................................. 14

7.1. Nguyên tắc chung .............................................................................. 14

7.2. Ưu điểm và hạn chế ........................................................................... 14

7.3. Lĩnh vực áp dụng ............................................................................... 14

8. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) ......................... 15

8.1. Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography) ............. 15

8.1.1. Nguyên tắc ................................................................................... 15

8.1.2. Các bước tiến hành tổng quát .................................................... 16

8.1.3. Ưu điểm và hạn chế .................................................................... 16

8.2. Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) .................. 17

8.2.1. Nguyên tắc ................................................................................... 17

4

8.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid

Chromatography – HPLC) ......................................................................... 18

8.3.1. Nguyên lí ...................................................................................... 18

8.3.2. Ưu điểm và hạn chế .................................................................... 19

8.4. Phương pháp sắc ký ái lực – hấp phụ (Affinity Chromatography) .

............................................................................................................. 19

8.4.1. Nguyên tắc ................................................................................... 19

9. PHƯƠNG PHÁP DUMAS ....................................................................... 20

9.1. Nguyên tắc .......................................................................................... 20

9.2. Ưu điểm và hạn chế ........................................................................... 20

Tài liệu tham khảo ............................................................................................... 20

5

Danh mục hình

Hình 1.phức hợp protein-đồng ................................................................................................... 9

Hình 2. đo cường độ màu sắc ở 540 nm .................................................................................... 9

Hình 3. đo cường độ màu ở 750 nm ........................................................................................ 11

Hình 4. phản ứng nhuộm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250 ....................................... 13

Hình 5. cột sắc ký lọc gel ......................................................................................................... 15

Hình 6. sắc ký trao đổi ion ....................................................................................................... 17

Hình 7. tương tác của protein với pha tĩnh và pha động .......................................................... 18

Hình 8. veggies cap .................................................................................................................. 20

Hình 9. quy trình của Phương Pháp Dumas ............................................................................. 20

1. KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH

Để hạn chế những biến đổi có thể xảy ra đối với protein, mẫu nên được thu nhận

nhanh nhất có thể và đặt ngay vào môi trường cách ly ở nhiệt độ thấp (từ 0 đến

4oC). Điều này là tối quan trọng, đặc biệt khi protein được cách li để tiến hành các

phân tích sâu hơn (ví dụ như điện di), môi trường cách ly bao gồm những chất

ngăn ngừa sự tạp nhiễm của vi khuẩn (VD: 0,1 mM sodium azide), bảo vệ protein

khỏi những chất tạo phức (VD: Cu, …) như (VD: Ethylenediaminetetraacetic acid

2 mM), ngăn chặn các thoái hóa protein do các protease nội sinh (VD:

phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM).

Protein cần được phân riêng và tinh chế, nhằm múc đích tách riêng biệt protein, ở

dạng đồng nhất hoặc một nhóm protein phù hợp cho quá trình phân tích sâu hơn,

từ nguyên liệu ban đầu. Có nhiều biện pháp phân riêng và tinh chế protein, cụ thể

như:

o Chiết (Etraction)

o Deproteination

o Lọc (Filtration)

o Ly tâm (Centrifugation)

o Kết tủa bằng muối (Salting-Out)

o Thẩm tách và thẩm tách điện (Dialysis & Electrodialysis)

o Lọc bằng phương pháp sắc ký

6

2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

2.1. Tổng quan

2.1.1. Lĩnh vực áp dụng

Phương pháp Kjeldahl là một kỹ thuật quan trọng trong phân tích thực phẩm, nó

được sử dụng như một tham chiếu để so sánh với các phương pháp khác.

2.1.2. Ưu điểm và hạn chế

2.1.2.1. Ưu điểm

- Sai số không vượt quá 1%

- Khả năng lặp lại kết quả tốt.

- Dễ thao tác.

- Phân tích được tất cả các loại protein thực phẩm.

2.1.2.2. Hạn chế

- Yêu cầu lượng mẫu lớn.

- Thời gian phân tích dài.

- Độ phân giải thấp do tính chọn lọc không cao.

2.2. Nguyên tắc chung

Sự khác biệt chủ yếu giữ các phương pháp Kjeldahl là chất xúc tác được sử

dụng trong quá trình vô cơ hóa mẫu, kỹ thuật cất đạm và chuẩn độ. Tuy có sự

khác nhau nhưng chung nhất phương pháp Kjeldahl bao gồm năm bước:

a) Chuẩn bị mẫu và cân mẫu

b) Bổ sung chất phản ứng

c) Vô cơ hóa mẫu

d) Cất đạm

e) Chuẩn độ

Khối lượng mẫu được lấy có thể biến động từ 0,2 đến 2,0g, phụ thuộc vào

lượng protein trong mẫu đem kiểm nghiệm. Đối với mẫu lượng protein nằm trong

khoảng 5 – 25%, lượng mẫu tối ưu cần lấy là 0,5 – 1,0g.

Trong quá trình tiến hành cần thêm vào mẫu 3 nhóm chất với các chức năng

khác nhau trong quá trình vô cơ hóa mẫu:

a) Sulfuric acid: tác nhân oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2, H2O, bẻ

gãy và chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ thành khí NH3 tự do, sau đó liên

kết với NH3 tạo thành muối (NH4)2SO4.

7

b) Muối (K2SO4, Na2SO4): cần thiết cho quá trình nâng cao nhiệt độ trong

quá trình vô cơ hóa.

c) Các chất xúc tác đẩy nhanh quá trình oxy hóa: bao gồm các kim loại: Hg,

Cu, Se; oxide: CuO, HgO, P2O5, TiO2; peroxide: Hg2O2; muối: CuSO4,

Hg2SO4.

Thủy ngân và oxide thủy ngân là chất xúc tác oxy hóa hiệu quả nhất tuy

nhiên, có thể gây ô nhiễm môi trường, nguy hiểm cho người và đặc biệt có thể

tạo phức hợp với NH3, gây khó khăn cho quá trình cất đạm sau này. Để phân

tách các phức hợp amoniac – thủy ngân, cũng như nitrate và nitrite, dung dịch

natri thiosulfate và salicylic được thêm vào. Tuy khả năng xúc tác kém hơn, và

quá trình vô cơ hóa mẫu chậm hơn so với thủy ngân nhưng đồng thân thiện

với môi trường nên chúng được sử dụng nhiều hơn (đã được phê duyệt bởi

ISO và AOAC). Hiệu quả nhất và thân thiện với môi trường là xúc tác CuSO4.

Qua trình vô cơ hóa mẫu được sử dụng để chuyển hóa nitơ trong hợp chất

hữu cơ thành ion amoni. Sự có mặt của sulfuric acid làm hạn chế nhiệt độ vô

cơ hóa (nhiệt độ sôi của sulfuric acid là 338oC, do đó muối K2SO4 hoặc

Na2SO4 được thêm vào nhằm tăng điểm sôi của hỗn hợp, giảm thời gian phân

hủy các hợp chất hữu cơ, tạo điều kiện phân hủy những hợp chất khó vô cơ

hóa. Nhiệt độ sôi của hỗn hợp tăng gần như tuyến tính với tỷ lệ K2SO4/H2SO4

(g/mL), đạt 383oC vơi tỷ lệ 1:1, ở tỷ lệ 2:1 nhiệt độ đạt 450oC. K2SO4 không

chỉ được thêm vào để tăng nhiệt độ sôi hỗn hợp mà còn hấp thu bớt lượng

H2SO4 để tạo thành KHSO4.

Trong thực phẩm còn bào gồm các hợp chất kháng vô cơ hóa như nitrate,

nitrite, alkaloid, pyridine, chinoline derivative, triazole, pyrazolone,

aminopyrine và antipyrine. Để quá trình vô cơ hóa dễ dàng hơn, ta cần bổ

sung các chất như crom, kẽm, sắt (IV) sulfate, salicylic acid và đường sucrose.

Những mẫu có chất béo với protein sẽ khó vô cơ hóa và dễ tạo bọt hơn so

với các mẫu giàu protein, carbohydrate. Để ngăn chặn sự tạo bọt boiling rod

hoăc chip được sử dụng, thêm một vài giọt hydrogen peroxide hoặc octanol,

hoặc dùng chất tạo nhũ đặc biệt chống tạo bọt. Trong điều kiện bình thường,

chất chống tạo bọt có thể được bỏ qua khi áp dụng làm nóng hai giai đoạn. Ở

giai đoạn đầu, mẫu được đốt thành tro, phải tiến hành cẩn thận nâng nhiệt mẫu

lên đến 200oC. Giai đoạn hai, nâng nhiệt mẫu đến 420oC, bao gồm cả thời gian

8

cần thiết để mẫu được vô cơ hoàn toàn. Sau khi khoáng hóa hoàn thành, phải

làm lạnh nhiệt độ mẫu đến nhiệt độ phòng.

Theo nguyên tắc, protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng

và nitơ phi protein, từ đó tính được nitơ của protein. Định lượng được nitơ protein ta

nhân kết quả này với một hệ số nhất định (VD: 6,25 vì hàm lượng Nitơ trong protein

là 16% , hàm lượng khá cao và ổn định).

Nitơprotein = Nitơtổng – Nitơphi protein

Hệ số cho các nhóm thực phẩm nhất định. Cụ thể như:

2.3. Định lượng nitơ tổng

Nguyên tắc tiến hành:

2.3.1. Vô cơ hóa mẫu (trong tủ Hotte)

Ở nhiệt độ cao, dưới tác dụng của H2SO4 các hợp chất chứa nitơ bị phân hủy và bị

oxy hóa thành CO2, H2O, và NH3. NH3 kết hợp H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4.

2.3.2. Cất đạm (trong máy cất đạm)

Đuổi NH3 ra khỏi muối bằng dung dịch NaOH

(NH4)2SO4 + NaOH Na2SO4 + NH3 + H2O

Lượng NH3 được lôi cuốn bằng máy Parmas, sau đó được dẫn đến erlen có chứa sẵn

lượng thừa H2SO4 đã xác định chính xác nồng độ. NH3 sẽ kết hợp H2SO4 tạo thành

(NH4)2SO4.

NH3 + H2SO4 dư (NH4)2SO4 + H2SO4 dư

2.3.3. Chuẩn độ

Chuẩn độ lượng acid dư bằng dung dịch NaOH qua đó tính được lượng Nitơ có trong

mẫu.

NaOH + H2SO4 Na2SO4 + H2O

Tính toán kết quả.

9

2.4. Định lượng nitơ phi protein

Nguyên tắc tiến hành

Dùng dung môi chiết rút tất cả các dạng nitơ phi protein.

Do trong dịch chiết vẫn còn lẫn vài loại protein, vì vậy ta cần dùng chất kết tủa

protein hòa tan trong quá trình chiết rút.

Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách nhưng phổ biến nhất ta dùng TCA

10%, Pb(CH3COO)2 10 – 15%, CuSO4 10% trong hỗn hợp với NaOH 10% với tỉ lệ

1:1.

Lọc kết tủa protein.

Vô cơ hóa dung dịch phi protein.

Cất đạm.

Chuẩn độ.

Tính toán kết quả.

3. PHƯƠNG PHÁP BIURET


Phương pháp Biuret dựa trên sự hình thành phức màu xanh tím có độ hấp thu cực đại

ở bước sống 540nm của đồng và liên kết amide trong dung dịch kiềm mạnh. Cường

độ màu tỷ lệ thuận với số liên kết peptide trong chuỗi.

Hình 1.phức hợp protein-đồng

Hình 2. đo cường độ màu sắc ở 540 nm

10

3.2. Ưu điểm và hạn chế

Ưu điểm: đơn giản, nhanh chóng

Hạn chế:

o Độ nhạy kém

o Dễ bị nhiễu khi mẫu protein chứa các thiol, DNA, saccharide hoặc chất

béo.

Phản ứng Biuret trải qua một số CẢI BIẾN sau.

3.3. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol

Các thiol (β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, glutathione) có thể được

ngăn chặn trong hầu hết các trường hợp bằng cách thêm vào các chất phản ứng

Biuret là các chalate với EDTA. Tuy nhiên nếu mẫu có dithiothreitol (DTT), ta

cần thêm vào iodoacetamide trước khi thêm các chất phản ứng

3.4. Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp của TCA

Phương pháp này dựa trên việc kết tủa protein bằng cách thêm vào

trichloacetic (nồng độ 5 – 25%) tùy thuộc vào thành phần protein, phân tách kết

tủa ra khỏi dịch mẫu bằng phương pháp lọc, giải kết tủa bằng dung dịch muối

hoặc KOH, xác định protein với phản ứng Biuret.

3.5. Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối với mẫu giàu lipid

Mẫu với tỷ lệ lipid/protein hoặc phospholipid/protein cao có độ đục cao sẽ khó

tiến hành xác định so màu. Vì vậy trước khi tiến hành phản ứng so màu cần phải

tách lipid ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp trích ly (VD: acetone:petroleum ether 1:1).

Mẫu không chứa lipid sẽ được hòa tan vào muối natri deoxycholate 10% hoặc

NaOH. Sau đó xử lí mẫu với các chất phản ứng Biuret.

3.6. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử

Đường khử có khả năng làm gây trở ngại phản ứng Biuret. Do đó, H2O2 được

thêm vào để oxy hóa đường khử. Ngoài ra, tăng thêm 10 lần nồng độ của chất

phản ứng Biuret.

3.7. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA

Độ hấp thu tia cực tím của phức hợp Protein – đồng trong dung dịch đồng

sulfate nhạy gấp 10 – 15 lần so với phản ứng Biuret tiêu chuẩn. Có thể định

lượng được xác định được protein trong dung dịch rất loãng (0,01 – 0,1 mg/mL).

Ellman (1962), đề xuất phương án đo độ hấp thu của phức hợp protein – đồng ở

263nm, sử dụng đồng sulfate 0,04% và dung dịch NaOH 2N. sự lựa chọn bước

11

sóng trong trường hợp mẫu protein có chứa DNA bị giới hạn, do khả năng hấp

thu cao của DNA. Và do đó, Itzhaki và Gill (1964) phát triển thủ tục dựa trên đo

độ hấp thu ở 310 nm, nó an toàn khi sử dụng với mẫu ngay cả khi nồng độ DNA

đạt 0,7 mg/mL trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng.

4. PHƯƠNG PHÁP LOWRY


Phương pháp được phát triển bởi Lowry (1951) dựa trên cơ sở phản ứng màu

của thuốc thử Folin-Ciocalteau với liên kết peptide trong protein, peptide và các acid

amin thơm (tyrosine, tryptophan,histidine) trong môi trường kiềm thích hợp.

Phản ứng tiến hành qua hai giai đoạn cơ bản:

a) Phản ứng Biuret: ion đồng (Cu2+) sẽ tạo phức với protein có ít nhất hai liên

kết peptide.

b) Khử phosphomolybdic acid (thuốc thử Folin): khử Folin bởi phực hợp

protein đồng thành molybdenum blue có độ hấp thu cực đại ở 750 nm.

Hình 3. đo cường độ màu ở 750 nm

Thuốc thử Folin-Ciocalteau có phản ứng với một số chất hóa học khác như

amino acid tự do, các hợp chất thiol, saccharide, lipid, fatty acid, các amin,

EDTA,… . đây là nguyên nhân gây nhiễu cho quá trình định lượng bằng phương

pháp Lowry. Để loại bỏ hoặc hạn chế tác động của những chất gây nhiễu trên, kỹ

thuật phải trải qua các quá trình bổ sung bao gồm: nâng nhiệt trước và sau khi cho

thuốc thử Folin, thêm perhydrate, chloramine-T, SDS, trích với dung môi hữu cơ

để loại bỏ lipid.


Ưu điểm: độ nhạy rất cao (gấp 100 lần so với Biuret và gấp 10 lần so với đo

quang phổ).

12

Hạn chế: dễ bị nhiễu và không thể xác định các protein trong phân tử không

chứa vòng thơm.

5. PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING)

Kỹ thuật này được khuyến nghị chủ yếu dùng cho phân tích protein sữa và để

phân tích định kỳ các sản phẩm thực phẩm có hàm lượng protein rất thấp như: bia,

rượu vang, nước ép rau quả, ….


Cơ sở của phương pháp, khi phản ứng, trong điều kiện cụ thể, với thuốc

nhuộm có chứa nhóm sulfunic acid (– SO3H), các nhóm chức năng đặt biệt là các

nhóm cơ bản trong các chuỗi bên của arginine, lysine, histidine tạo màu trong dung

dịch thuốc nhuộm, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein trong thực phẩm.

Thuốc nhuộm hữu cơ liên kết với protein bằng các liên kết ion, tĩnh điện, hoặc cả van

der Waals. Phản ứng này tối ưu trong môi trường acid mạnh, tạo ra các phức tan hoặc

không tan. Vì vậy nồng độ protein có thể dễ dàng xác định thông qua đo cường độ

màu của dung dịch thuốc nhuộm trước và sau khi thêm protein, hoặc sau khi tách

riêng phức hợp protein-thuốc nhuộm không tan bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm.

Một số thuốc nhuộm như: Amido Black 10B, Coomassie Brilliant Blue G-250,

Orange G, and Acid Orange 12 được sử dụng phổ biến trong phân tích thực phẩm.

Trong đó hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tích hàm lượng

protein trong thực phẩm là Bradford và Udy.

5.2. Phương pháp Bradford

5.2.1. Nguyên tắc

Được phát triển bởi Bradford (1976), thuốc nhuộm được sử dụng là Coomassie

Brilliant Blue G-250 tạo phức với protein trong môi trường kiềm yếu. Có thể tạo kết

tủa ở nhiệt độ thấp (0oC) hoặc sử dụng TCA ở nhiệt độ phòng, hay dùng muối calci

phosphate để đông tụ protein.

13

Hình 4. phản ứng nhuôm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250

5.3. Phương pháp Udy


Được phát triển bởi Udy (1971), thuốc nhuộm được dùng là Acid Orange 12 để

kết tủa phức protein – thuốc nhuộm.

5.4. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm

Ưu điểm: phương pháp này nhanh và đơn giản, thuận tiện cho việc sử dụng

thường xuyên, rất nhạy (nhạy lơn Lowry 2 – 3 lần), ít tốn kém. Màu thường phát

triển chưa đến 5 phút và bền trong 0,5 – 1 h. Ít bị nhiễu bởi các muối, chất đệm

và chất khử như đối với phương pháp Lowry. Không cần phải thao tác khéo léo

cũng như sử dụng các hóa chất ăn mòn như phương pháp Kjeldahl.

Hạn chế: do mỗi loại thuốc nhuộm có ái lực khác nhau đối với một số protein

tinh khiết sẽ phản ứng và liên kết khác nhau, tùy thuộc vào cấu trúc của chúng.

Hầu như phương pháp phải được điều chỉnh với từng loại protein cho mỗi lần áp

dụng. Do đó phương pháp không được áp dụng để định lượng protein tổng trong

các kiểm nghiệm tổng quát.

6. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS-SPECTROPHOTOMETRIC)

6.1. Nguyên tắc

TNBS (2,4,6-trinitrobenzene 1-sulfonic acid) chỉ phản ứng với nhóm amino

đầu tiên của amino acid, peptide và protein trong điều kiện kiềm nhẹ (pH 8 đến 9)

phản ứng kết thúc bởi sự giảm pH.


Độ nhạy cao hơn vài lần so với phương pháp hấp thu tia cực tím, ưu điểm chính là có

tính cụ thể cao, ít bị ảnh hưởng bởi các chất gây nhiễu.

14

7. PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET ABSORPTION)


Các protein có chứa các acid amin thơm, đặc biệt là tyrosine và tryptophan thể

được kiểm nghiệm thành công với kỹ thuật hấp thu tia cực tím. Để hạn chế sự

hấp thu của các acid nucleic, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp để xác

định mật độ quang tại 260nm và 280nm.

o Kalcker (1947) đề xuất một công thức đơn giản để tính toán nồng độ

protein từ các xét nghiệm đo phổ, phương trình của ông có dạng:

Pc (mg/mL) = 1,45 D280 + 0,74 D260

o Whitaker và Graham (1980) đề xuất một phương pháp trực tiếp hơn để

định lượng protein dựa trên sự khác nhau về độ hấp thu, phương trình

có dạng:

Pc (mg/mL) = (A235 to A280) 2.51

Ưu điểm của phương pháp này là ít bị nhiễu do acid nucleotic.


Ưu điểm:

nhanh và đơn giản.

Hạn chế :

Kết quả không chính xác với dung dịch có hơn 20% acid nucleotic hoặc dung

dịch bị đục.

7.3. Lĩnh vực áp dụng

Phương pháp này đặt biệt được khuyến nghị áp dụng để phân tích một loạt

các mẫu có hàm lượng protein tương đối thấp hoặc nồng độ muối amoni cao khiến

các phương pháp khác trở nên không hiệu quả. Thông qua định lượng protein, phương

pháp được dùng để kiểm tra mức độ thủy phân protein.

15

8. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY)

Phương pháp sắc ký thường dùng để tinh sạch protein, sau đó protein được

tinh sạch được phân tích định lượng thông qua các phương pháp khác vi dụ

như đo qua phổ.

8.1. Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography)

Hình 5. cột sắc ký lọc gel

Phương pháp sắc ký điện di được sử dụng thành công để phân tách trực tiếp

protein khỏi các thành phần khác trong dịch chiết thực phẩm. Nó được sử

dụng như một kỹ thuật giúp tiện lợi hơn cho việc phân đoạn sơ bộ các peptide

trước khi chúng được phân tích sâu hơn bằng cách lập bản đồ TLC (sắc ký

bản mỏng) peptide, sắc ký cột trao đổi ion, điện di mao quản và các phương

pháp khác.


Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cở sở đặc điểm khác

nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước. Các hạt được sử dụng để

nhồi cột mang các lỗ có kích thước khác nhau. Những phân tử nhỏ có thể ở cả

bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên

ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh

hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào

được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi

qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. Các phân tử protein càng

nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất cả các lỗ; vì vậy, thời gian chạy

qua cột dài hơn và thời gian hồi lưu muộn hơn. Ngược lại, các phân tử protein

kích thước càng lớn càng có thời gian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn.

16

Đối với mỗi loại cột, các phân đoạn sắc ký được thu ở các nồng độ muối khác

nhau hoặc ở các thời gian hồi lưu khác nhau để thu được từng loại protein được

quan tâm nghiên cứu. Các phân đoạn có hoạt tính protein được quan tâm cao

nhất sẽ được tích lũy và tiến hành tinh sạch bổ sung.

8.1.2. Các bước tiến hành tổng quát

Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không

tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng

cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những

loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là

100µm (0.1mm).

Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽ tăng lên khi các phân đoạn protein được

chạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau. Thông thường một cột sắc ký đơn lẻ không

đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong muốn nào đó dù quá trình

sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó người ta thường phải áp dụng

một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được một phân đoạn chứa một lượng

lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu.


Ưu điểm: phương pháp sắc kỹ lọc gel tương đối đơn giản, khi cột gel được

kết hợp dòng chảy qua quang phổ kế và hệ thống máy vi tính theo dõi quá

trình, phương pháp này sẽ thuận tiện và hữu ích.

Hạn chế: đối với phương pháp lọc gel, thời gian lưu của các acid amin,

protein có chứa vòng thơm trong cột sẽ kéo dài, mà không bị phân tách theo

thứ tự trọng lượng phân tử.

17

8.2. Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography)

Hình 6. sắc ký trao đổi ion


Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một

điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một

điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là

phương pháp sắc ký trao đổi ion.

Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất

định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái

18

dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose

(CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác

với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích

dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký

trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những

protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị

giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động,

những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích.

Hình 7. tương tác của protein với pha tĩnh và pha động

8.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid Chromatography –

HPLC)

8.3.1. Nguyên lí

HPLC dựa trên sự tách biệt thành phần hỗn hợp trong cột tương đối ngắn (15

– 30cm) chứa đầy các vi hạt silica (3 – 10 μm), biến đổi hóa học để có được một

lớp phủ bề mặt với các nhóm chức năng khác nhau. Nguyên tắc hoạt động giống

như phương pháp sắc ký cột với pha động là pha lỏng.

Kỹ thuật sắc ký được áp dụng trong sắc ký lỏng cao áp:

a) sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực hơn pha động

b) sắc ký pha đảo: pha tĩnh kém phân cực hơn pha động

đối với thực phẩm, hầu hết các phân tích được thực hiện theo sắc ký pha đảo

(reversed-phase chromatography – RFC). Sự tách và thu protein trong RFC

thường được thực hiện bằng cách rửa giải với sự tăng nồng độ của các hợp

chất hữu cơ như acetonitril, methanol, tetrahydrofuran, isopropanol. Pha động

thường chứa một lượng thấp trifluoroacetic hoặc phosphoric acid. Với vai trò

19

proton hóa các nhóm silanol còn lại của các chất hỗ trợ silic, và nhóm

carboxyl của các chất rửa giải, cũng như hình thành các cặp ion với các nhóm

amino mang điện tích của các chất được tách ra.


Ưu điểm: hiệu năng cao so với phương pháp sắc ký khí thể hiện rõ khi phân

tích các hợp chất hữu cơ. Các acid amin, peptide, protein chỉ cần hòa tan

trong dung môi thích hợp như dansyl chloride, 2,4-dinitrophenol,

fluorescamine, o-phthalaldehyde. Phân tích tiến hành ở nhiệt độ phòng,

không cần phân hủy hoặc chuyển hóa thành các dẫn xuất dễ bay hơi. Đối với

RFC, cho kết quả tách biệt hoàn toàn các chất , dung môi sử dụng ít độc hại.

Hiệu quả tách và tính chọn lọc rất cao.

Hạn chế: đối với phương pháp RFC, khó dự đoán thời gian lưu đối với các

hợp chất chưa xác định rõ ràng, nói chung thời gian lưu tăng theo kích thước

và độ kỵ nước của phân tử. Tuy nhiên đối với các peptide, protein óc kích

thước lớn hơn, số lượng và vị trí của các bản kị nước trên bề mặt phân tử trở

nên chiếm ưu thế.

8.4. Phương pháp sắc ký ái lực – hấp phụ (Affinity Chromatography)

Tách và tính chế các loại protein đặc thù thường tiêu tốn thời gian và không

hiệu quả. Phương pháp sắc ký ái lức không vấp phải những hạn chế đó. Nó là

quá trình rất cụ thể cho sự hấp phụ chọn lọc sinh học và sau đó phục hồi hợp

chất từ các phối tử cố định.


Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học

chuyên biệt. trong thực hành, cột được điền đầy nhựa sắc ký ái lực, sau đó phủ

lớp protein lên, các thành phần có ái lực với nhựa sẽ bị giữ lại, trong khi các

thành phần đi kèm vượt qua cột mà không bị cản trở. Thành phần bị giữ lại do

tạo phức hợp sẽ được tách rửa bằng cách điều chỉnh độ pH hoặc thêm dung dịch

muối, cột này có thể tái sử dụng.


Có độ chuyên biệt cao như đã nói ở phần mở đâu, điều này là ưu điểm của

phương pháp, tuy nhiên không thể áp dụng với các chất chưa được xác định rõ

ràng.

20

9. PHƯƠNG PHÁP DUMAS

Baptiste Dumas (giữa thế kỹ 19) đề xuất phương pháp, phương pháp được hoàn chỉnh

(1980) với sự ra đời của máy phân tích nitơ (CNAs).

Lĩnh vực ứng dụng: Nhà máy sữa, nhà máy ngũ cốc, bột mỳ, thịt cá, thức ăn chăn

nuôi, thức ăn sẵn, nước uống, sản phẩm thuỷ sản…

9.1. Nguyên tắc

Tương tự như phương pháp Kjeldahl, phương pháp Dumas cũng trải qua giai đoạn vô cơ

hóa mẫu trong buồng đốt (Mẫu được đốt cháy bởi Oxy tinh khiết và có xúc tác chromium

III oxide ) sẽ sinh ra CO2, H2O, N2, N2O,… . Bộ lọc Lecosorb để hấp thu CO2, bộ lọc

Anhydrone để loại nước H2O. Cu ở nhiệt độ cao khử NO2 thành N2. Dòng cuối cùng chỉ

có khí N2 vào hệ thống GC, được phát hiện đầu dò TCD

Hình 8. veggies cap

Hình 9. quy trình của Phương Pháp Dumas


Ưu điểm: khả năng lặp lại kết quả tốt, nhanh chóng

hạn chế: thiết bị đắc tiền

Tài liệu tham khảo

1) Methods of Analysis of Food Components and Additives, edited by Semih Ötles, Ege University, Department of Food Engineering, Izmir, Turkey.

2) Food Chemistry & Analysis, Professor David B. Min ,Food Science & Technology 60.

3) Food Analysis Laboratory Manual, Second Edition, edited by S. Suzanne Nielsen ,Purdue University ,West Lafayette, IN, USA.

4) Kỹ Thuật sinh hóa, Phạm Thị Ánh Hồng, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM.

phuong phap dinh luong protein

Documents