Perché fare diagnosi di laboratorio ?

• formulazione di una diagnosi eziologicanon diagnosi di polmonite ma polmonite da adenovirus…

• adozione di una terapia mirata

• individuazione dei casi sentinella in occasione di epidemie

• scopi epidemiologici

Diagnosi eziologica delle malattie virali (approcci)

dimostrazione nel materiale patologico dell’agente

infettivo o suoi componentiDiagnosi diretta

dimostrazione nell’organismo infettato di unarisposta anticorpale specifica

Diagnosi indiretta

diagnosi indiretta

Dimostrazione che è in atto una risposta immune all’agente infettivo

in genere valutando la dinamica anticorpale mediante reazioni sierologiche presenza IgM indice di infezione recente•rivelabili dopo 7-10 giorni dall’infezione•breve permanenza (2-3 mesi)Presenza solo IgG indice di infezione contratta in passato•rivelabili dopo 2-4 settimane dall’infezione •permangono per anni

Diagnosi indiretta

1. dimostrazione di anticorpi specifici della classe M (IgM) in un singolo campione di siero

2. dimostrazione di sieroconversione (negativo positivo) o di incremento del titolo anticorpale di almeno 4 volte in 2 campioni prelevati

• 1° - in fase acuta della malattia• 2°- in fase convalescente (2-3 settimane più tardi)

Diagnosi indiretta - saggi sierologici

• agglutinazione• precipitazione• fissazione del complemento• neutralizzazione• inibizione dell’emagglutinazione (virus emagglutinanti)

• IF immunofluorescenza• RIA radioimmunoassy• test immunoenzimatici ELISA, immunoblot

Inibizione della emagglutinazione

diluizioni scalari del siero in esame

+

quantità standard di unità

emagglutinanti del virus (incubazione)

+

sospensione di globuli rossititolo degli Ab inibenti

emoagglutinantinazione la più alta diluizione del siero capace di prevenire emoagglutinazione

Immunofluorescenza indiretta

cellule infettate da virus

siero in esame

legame

Anticorpi anti IgG o anti IgM umane-fluoreseceinati

ELISA

Test indiretto per le IgG

Ag virale

siero in esame (oppure diluizioni scalari del siero)

anti IgG umane-Enzima

substrato viraggio colore

immunoblot

Diagnosi indiretta: punti critici

• riattivazione di virus latenti

• pazienti immunodepressi

• difficoltà di disporre di un siero “acuto” o “convalescente”

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Isolamento in colture cellulari

allestimento delle colture in vitro

inoculazione del campione

incubazione

identificazione e tipizzazione del virus

Identificazione e tipizzazione dei virus

effetto citopatico (CPE)

caratteristiche antigeniche

sequenze genomiche

•degenerazione cellulare•cellule multinucleate o sincizi•formazione di inclusioni

tipo di cellule sensibilitempo di comparsavelocità di progressione dell’infezione

Inclusioni

Localizzazione• nucleo (adenovirus, herpesvirus)

• citoplasma (virus della rabbia, poxvirus)

• entrambi (CMV, paramixovirus)

Tipo• ammassi virioni (papovavirus)

• viroplasma (poxvirus)

• materiale cellulare proteico (adenovirus)

identificazione e tipizzazione dei virus

effetto citopatico (CPE)

caratteristiche antigeniche

sequenze genomiche

reazioni sierologiche

identificazione e tipizzazione dei virus

effetto citopatico (CPE)

caratteristiche antigeniche

sequenze genomiche•ibridazione con sonde molecolari

•reazioni di amplificazione

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Diagnosi diretta - ricerca degli antigeni

• agglutinazione• precipitazione• fissazione del complemento• neutralizzazione• emagglutinazione (virus emagglutinanti)

• IF immunofluorescenza• RIA radioimmunoassy• test immunoenzimatici: ELISA, immunoblot

Immunofluorescenza diretta

Anticorpi virus specifici -fluoreseceina

materiale patologico

IDENTIFICAZIONE DI ANTIGENE DI CITOMEGALOVIRUS SU LEUCOCITI POLIMORFONUCLEATI DEL LIQUOR MEDIANTE IMMUNOFLUORESCENZA CON ANTICORPO MONOCLONALE ANTI-pp65.

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Quali virus ?

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Quali virus ?

difficilmente o non coltivabili

(HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19, HAV)

a lento sviluppo

(CMV, BKV, JCV)

pericolosi da coltivare

(HIV)

emergenti

(TTV)

difficilmente o non coltivabili

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a lento sviluppo

(CMV, BKV, JCV)

pericolosi da coltivare

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emergenti

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Ibridazione

100 000 - 10 000 genomi

Ibridazione

100 000 - 10 000 genomi

amplificazione ibridazione

10 - 1 genomi

amplificazione ibridazione

10 - 1 genomi

Ibridazione con sonde

Tecniche quantitative

– Per distinguere infezione latente da infezione attiva

– Per il monitoraggio dell’infezione– Per il monitoraggio della terapia– Per valutare il rischio di trasmissione