SESPI e DIAGNOSI

MOLECOLARE

Azienda Ospedaliera di CosenzaU.O.C. Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare

Direttore Dott.ssa Cristina Giraldi

Dr. Maria Vittoria Mauro

Corso di formazione teorico-pratico“OTTIMIZZAZIONE DELLA FASE PREANALITICA:

QUALITA’ DEL CAMPIONE BIOLOGICO”15 OTTOBRE 2010

Quali possibili metodi per una

diagnosi rapida nella sepsi?

TECNICHE TRADIZIONALIRIVISITATE

Paziente critico settico

Emocolture: diagramma di flusso

Paziente “settico”

Mediamente 12-36 h>80% entro 24 h

Esecuzione dei prelievi Identificazione ed antibiogramma

Invio al laboratorio Crescita su piastra

Incubazione delle bottiglie Semina su terreno

Emocoltura positiva Colorazione di GramReferto preliminare scritto

Risultato diagnostico60-84 h

Quali possibili metodi per una

diagnosi rapida?

TECNICHE TRADIZIONALIRIVISITATE

NUOVETECNOLOGIE:DIAGNOSTICA MOLECOLARE

Paziente critico settico

campione DNA free

Isolamento DNA

DNA

Test molecolare: Polimerase Chain Reaction

Miliardi di molecole identiche

Specifiche regioni di DNA microbico vengono identificate e

“copiate” numerose volte

Organizzazione del laboratorio per l’esecuzione del test SeptiFast

LightCycler SeptiFast Test

• Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi molecolare di sepsi

• Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante l’utilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence ResonanceEnergy Transfer)”

La procedura del test SeptiFast si basa sui seguenti passaggi :

• LightCycler SeptiFast

Test

1. Lisi meccanica di 1,5 ml di sangue-EDTA

2. Estrazione del DNA

3. Amplificazione in Real-Time PCR del DNA target

attraverso 3 reazioni parallele: G+ G- F

•Analisi di Melting per l’identificazione di specie

• Generazione di un Report mediante SIS (SeptiFast Identification

Software)

La temperatura alla quale le sonde si dissociano dal prodotto di PCR è specifica per la sequenza in esame

Gram (-)• Escherichia coli• Klebsiella (pneumoniae, oxyt.)• Serratia marcescens• Enterobacter (cloacae, aerog.)• Proteus mirabilis• Pseudomonas aeruginosa• Acinetobacter baumanii• Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+)• Staphylococcus aureus• CoNS• Streptococcus pneumoniae• Streptococcus spp.• Enterococcus faecium• Enterococcus faecalis

Fungi• Candida (albicans,

tropicalisparapsilosis)

• Candida (krusei, glabrata)

• Aspergillus (fumigatus)

MRSA (mecA)

VRE (van A, B)

Sample

IDENTIFICA 25 PATOGENI: 85-95% DEI CASI DI SEPSI

LightCycler SeptiFast Test

Riduzione dei tempi della diagnosi eziologica

EMOCOLTURA TRADIZIONALE:

8 ml x 2 nell’adulto1-3 ml x 2 nei bambini < 6 anni 0.5-1 ml x 2 nei neonati

TEST AMPLIFICAZIONE SEPSI (SEPTIFAST):

1,5 ml in K-EDTA

I prelievi devono essere trasportati immediatamente al laboratorio

Conservazione del campione per Septifast: Fino a 4 ore a +15/+25°C Fino a 3 giorni a +4/+8 °C, alternativamente Fino a 3 giorni a -15/-25 °C

Consente una diagnosi in tempo reale nel caso di sepsi grave

Conferma il risultato ottenuto dall’emocoltura

sinergia del test colturale e del test molecolare

gold standard per la diagnosi di infezioni del circolo ematico

DIAGNOSI DI SEPSI:EMOCOLTURA + DIAGNOSI MOLECOLARE

L’emocoltura finalizzata ad un referto rapido e la diagnostica molecolare

comportano un processo di riorganizzazione della Microbiologia

finalizzato al miglioramento continuo della “qualità totale dell’assistenza”

GRAZIE