pemeriksaan laboratorium dalam diagnosis hemofilia
TRANSCRIPT
PEMERIKSAAN LABORATORIUM DALAM DIAGNOSIS HEMOFILIA
I Nyoman Wande
Bagian Patologi Klinik
FK Unud/ RSUP Sanglah Denpasar
Pendahuluan
Hemofilia
• Kelainan herediter berupa gangguan pembekuandarah, ditandai dengan manifestasi perdarahan, disebabkan oleh kelainan atau defisiensi faktorkoagulasi.
• Macam-macam hemofilia :
- hemofilia A : def. FVIII
- hemofilia B : def. FIX
- hemofilia C : def. FXI
- acquired hemophilia : karena adanya antiboditerhadap FVIII (tanpa ada defisiensi FVIII) 2
Pola pewarisan hemofilia (A dan B)
Gambar . Skema transfer gen hemofilia dari ibu karier dan bapak menderitahemofilia (Mansouritorghabeh, 2015).
Gambar. Skema pewarisan gen hemofilia dari bapak hemofilia dengan ibu karier(Mansouritorghabeh, 2015).
Faktor koagulasi VIII (FVIII)
• Merupakan glikoprotein• Dikode oleh gen 186.000 bp• Protein faktor VIII dibagi menjadi:
• Rantai berat (A1-A2-B) • Rantai ringan (A3-C1-C2)
• Bentuk aktif FVIII mengandung glycosylated sites-free domain B as. Amino Arg740 untuk Glu1649.
• FVIII: C membentuk kompleks dengan von Willebrand (vWF).
• Waktu paruh F VIII: • Dengan vWF: 12 jam • Tanpa vWF: 2 jam
Perbandingan Faktor VIII dengan vWF
Von Willebrand Factor
Faktor VIII
Fungsi Adesi platelet, stabilitas factor VIII
Pembentukan fibrin clot
Tempat sintesis
Sel endotel, Megakariosit
Hepatosit
Kontrol genetik
Autosomal dominant
X-linked recessive
Hemofilia Normal Rendah
Von Willebrand Disease
Rendah rendah
Gambar skematik dua bentuk yang berbeda darifaktor VIII. (Pisarek et al., 2016)
186 kb
26 ekson
Terletak diregio Xq2.8
8
Gen FVIII
Rentang normal F VIII yaitu berkisar 50%-150% darinilai normal (bervariasi sesuai umur)
FVIII meningkat pada keadaan (Williamson et al., 2011): • Status inflamasi sebagai reaktan fase akut
• Penggunaan kontrasepsi oral
• Kehamilan trimester terakhir
FVIII menurun pada keadaan (Williamson et al., 2011): • Hemofilia A
• Disseminated intravascular coagulation (DIC)
• Acquired factor VIII inhibitor
• Von willebrand disease
• Beberpa wanita karier gen hemofilia (ringan)
Faktor Koagulasi IX (FIX)
• Protein yg tergantung Vit. K, dlm bentuk zymogen yg tdk aktif
• Aktivitasnya berlangsung pada membran fosfolipid, diawali dengan membentuk komplek dg faktorjaringan (TF/VIIa)
• Rentang normal: 70%-120% dari nilai normal
Peningkatan FIX terjadi pada:• Kehamilan• Penggunaan kontrasepsi oral
Penurunan FIX terjadi pada keadaan: • Hemofilia B• Penyakit hati• Penggunaan antagonis vitamin K (warfarin) atau
defisiensi vitamin K• Amyloidosis • Syndrome nefrotik• Alloantibodi pada hemofilia B yang diterapi dengan infus
faktor IX • Autoantibodi terhadap faktor IX pada individu yang
sebelumnya sehat (sangat jarang)
Kaskade koagulasi
Hemofilia A
• Defisiensi faktor VIII 80% dari kasus hemofilia
• Gangguang X-linked
Kadar FVIII sangat rendah
Inversi (± 50%)
Mutasi titik
insersi
delesi
Hemofilia B
• Defisiensi FIX
• Abnormalitas dari gen FIX pada kromosom X: • Delesi (besar atau kecil)
• Mutasi titik
• Mutasi missense
Gambaran klinis penderita hemofilia
Klinis
Hemarthrosis, hematoma
Perdarahan CNS, hematuria
Perdarahan post Op.
Perdarahan pd cabut gigi
Terbentukinhibitor
antibody thdFVIII atau FIX
Bagaimana terjadi perdarahanpada penderita hemofilia?
Haemarthrosis pada hemofilia
berat
Perdarahan pada otot paha
Differential diagnosis
• Hemofilia: • Hemofilia B• Kelainan koagulasi kongeninal lainnya: defisiensi FXI dan FXII• Von Willebrand disease • Aquired inhibitor FVIII• Kombinasi defisiensi kongenital FVIII dan FV
• Hemofilia B: • Hemofilia A• Defisiensi faktor koagulasi tergantung vit. K (didapat/
diturunkan)• Penyakit hati• Overdosis warfarin
Tabel. Klasifikasi klinis hemofilia A dan hemofilia B berdasarkan kadarfaktor koagulasi.Klasifikasi Hemofilia A
Kadar faktor
VIII
Hermofilia B
Kadar faktor
IX
Gambaran klinis
Severe
(berat)
≤ 1% dari
normal
(≤0.01 U/ml)
≤ 1% dari
normal
(≤0.01 U/ml)
1. Spontaneous hemorrhage
from early infancy
2. Frequent spontaneous
hemarthroses and other
hemorrhages requiring
clotting factor
replacement.
Moderat
(sedang)
1-5% dari
normal
(0.01-0.05
U/ml)
1-5% dari
normal
(0.01-0.05
U/ml)
1. Hemorrhage secondary to
trauma or surgery
2. Occasional spontaneous
hemarthroses
Mild
(ringan)
6-30% dari
normal
(0.06-0.30
U/ml)
6-30% dari
normal
(0.06-0.40
U/ml)
1. Hemorrhage secondary to
trauma or surgery
2. Rare spontaneous
hemorrhage
Dikutip dari: Williams Manual of Hematology, sixth edition. 2003 (Lichtman et al., 2003).
Diagnosis dan pemeriksaanlaboratorium pada hemofilia
Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaanhemofilia dilakukan pada (Kitchen and McCraw, 2000):
• Bayi laki-laki, riwayat keluarga (+), dengan atau tanpa gejala• Remaja atau dewasa asimtomatik perdarahan yang
berlebihan pada saat trauma atau tindakan.• Individu asimtomatik pemanjangan APTT.
Diagnosis pasti hemofilia: • Assay kadar FVIII atau IX • Assay cytogenetic
Algoritme diagnosis laboratorik hemofilia
Pemeriksaan penyaring
hemostasis
APTT memanjang PPT normal
APTT dari campuran plasma pasien dan plasma normal
Tes substitusi
Tidak terkoreksiTerkoreksi
Asai faktor
Inhibitor
Pemeriksaan yang mendukung diagnosis hemofilia:
Pemeriksaan penyaring: CT, PT, APTT
Mixing test
Differential APTT
Pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX
Pemeriksaan inhibitor FVIII atau FIX
1. Pemeriksaan penyaring hemostasis:
1. Masa pembekuan (clotting time): melihatdefisiensi FVIII dan FIX
2. Masa prothrombin plasma (prothrombin time/ PT): Jalur ekstrinsik dan jalur bersama (Faktor II, V, VII, X) memanjang jika 10% dibawah normal
3. Masa tromboplastin partial teraktivasi (activated partial thromboplastin time/ APTT): defisiensijalur intrinsik, terutama FVIIImemanjang jikaFVIII < 25%
2. Mixing test
• Membedakan defisiensi faktor koagulasidengan adanya inhibitor.
Tujuan
• Dilakukan dengan mencampur plasma pasien dengan plasma normal denganperbandingan 1:1, kemudian diinkubasi.
Metode
• APTT memanjang inhibitor faktor VIII
• Koreksi APTT defisiensi atau tidakmenyingkirkan inhibitor apabila klinis sesuai
Interpretasi
3. Differential APTT
Tujuan: untuk menentukan jenis defisiensi faktorsebelum assay faktor
200 µL adsorbed
plasma200 µL plasma
pasien
Masing-masingdilakukan
pemeriksaan APTT
200 µL aged plasma
Skema pemeriksaan differential APTT
Tabel Interpretasi pemeriksaan differential APTT
Plasma normal Adsorbed plasma
(F I,V,VIII,XI,XII)
Aged plasma
(F II,VII,IX,X,XI,XII)
Kelainan
Terkoreksi Terkoreksi Tidak terkoreksi < FVIII
Terkoreksi Tidak terkoreksi Terkoreksi < FIX
Terkoreksi Terkoreksi Terkoreksi < FXI,XII
Tidak
terkoreksi
Tidak terkoreksi Tidak terkoreksi Inhibitor
4. Pemeriksaan FVIII atau FIX
• Tujuan pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX: 1. Menegakkan diagnosis defisiensi faktor
2. Menilai beratnya gangguan/defisiensi
3. Monitor terapi pengganti
4. Mendeteksi karier
Metode pemeriksaan: 1. one-stage assay
2. two-stage assay
3. chromogenic substrate assay
One-stage
-Berdasarkankemampuan plasma pasien dalammengoreksiperpanjangan APTT dari plasma def.FVIII
Chromogenicsubstrate
-Prinsip mirip fase I two-stage method. Setelah terbentukFxa, Fxa diukurmenggunakansubstratkromogenikspesifik.
Two-stage
-Fase Ireagen (FV, CaCl₂, fosfolipid, serum) + plasma standar/plasma penderita (FVIII) Fxa
- Fase IIditambahkan plasma substrat (FII & fibrinogen) terbentukbekuanKecepatan terbentuknyabekuan tergantungjumlah Fxa, Fxatergantung FVIII.
Metode Pemeriksaan FVIII
21
Metode One-Stage Assay
Memerlukan plasma defisien FVIII, reagen APTT, plasma standar, plasma normal.
Alat yang dipakai koagulometer
Interpretasi hasil menggunakan kurva standardengan kertas grafik semilogaritmic atau double logaritmic.
22
Pemeriksaan FVIII
1. Plasma kontrol dan plasma pasien dibuatpengenceran 1:10, 1:20, 1:40 dengan lar.dapar
2. Ambil 100 µL plasma yg telah diencerkan + 100 µL plasma defisien FVIII + 100 µL reagen APTT inkubasi pada 37⁰C selama 5’
3. Tambahkan 100 µL CaCl₂ yang telah diinkubasipada 37⁰C
4. Catat lama waktu terbentuk bekuan
5. Hasil dari plasma pasien maupun kontrol diplotpada kurva standar.
23
24Interpretasi pengukuran kadar FVIII²⁰
5. Pengukuran kadar inhibitor FVIII atau FIX
Inhibitor FVIII diperiksa dengan mencampur plasma pasien dengan plasma normal dengan perbandinganyang sama + FVIII inkubasi. Bila plasma sampelmengandung inhibitor, FVIII akan cepat dinetralkan.
Satuan: BU inhibitor FVIII yang menginaktifkansetengah dari jumlah awal kadar FVIII dalam normal pooled plasma
Metode yang sering dipakai: metode Bethesda modifikasi Nijmegen.
• Metode pemeriksan inhibitor FIX sama dengan inhibitor FVIII
Bethesda vs Nijmegen Assays
Test
mixtureControl
mixture
FVIII
Deficient
Plasma
Patient
Plasma
Buffered
Normal
Plasma
pH 7.4
50/50 Mix
Incubate
2hr 37o C
Factor VIII activity assay
Calculate inhibitor activity (NBU/ml)
Test
Mixture
Control
Mixture
Imidazole
Buffer
pH 7,4
Patient
Plasma
Normal
PooledPlasma
50/50 Mix
Incubate
2hr 37o C
Factor VIII activity assay
Calculate inhibitor activity (BU/ml)
Nijmegen-Bethesda AssayClassical Bethesda Assay
Slide concept courtesy of Drs HW Verbruggen and Piet Meijer, ECAT Foundation
26
10
100
0 0.50 1.00 1.50 2.00
Bethesda Units (BU)
Re
sid
ua
l A
cti
vit
y (
%)
2.50
100
7570
61
50
40
3228
251 BU =
amount of
inhibitor that
inactivates
50% of FVIII
in NPP
2 BU = amount of
inhibitor that
inactivates 75%
of FVIII in NPP
10
100
0 0.50 1.00 1.50 2.00
Bethesda Units (BU)
Re
sid
ua
l A
cti
vit
y (
%)
2.50
100
7570
61
50
40
3228
25
10
100
0 0.50 1.00 1.50 2.00
Bethesda Units (BU)
Re
sid
ua
l A
cti
vit
y (
%)
2.50
100
7570
61
50
40
3228
25
10
100
0 0.50 1.00 1.50 2.00
Bethesda Units (BU)
Re
sid
ua
l A
cti
vit
y (
%)
2.50
100
7570
61
50
40
3228
25
10
100
0 0.50 1.00 1.50 2.00
Bethesda Units (BU)
Re
sid
ua
l A
cti
vit
y (
%)
2.50
100
7570
61
50
40
3228
25
10
100
0 0.50 1.00 1.50 2.00
Bethesda Units (BU)
Re
sid
ua
l A
cti
vit
y (
%)
2.50
100
7570
61
50
40
3228
25
10
100
0 0.50 1.00 1.50 2.00
Bethesda Units (BU)
Re
sid
ua
l A
cti
vit
y (
%)
2.50
100
7570
61
50
40
3228
25
100
7570
61
50
40
3228
251 BU =
amount of
inhibitor that
inactivates
50% of FVIII
in NPP
1 BU =
amount of
inhibitor that
inactivates
50% of FVIII
in NPP
2 BU = amount of
inhibitor that
inactivates 75%
of FVIII in NPP
2 BU = amount of
inhibitor that
inactivates 75%
of FVIII in NPP
Grafik semilogaritmik untuk menghitung Bethesda Unit
Ringkasan
• Hemofilia: kelainan perdarahan kongenital yang terjadi olehkarena adanya penurunan atau tidak adanya faktor VIII ataufaktor IX secara fungsional.
• Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan hemofiliapada:
• Bayi laki-laki riwayat hemofilia (+) gejala (-) atau gejala (+) • Remaja atau dewasa asimtomatik yang mengalami perdarahan
yang berlebihan pada saat trauma • Individu asimtomatik yang mengalami pemanjangan APTT.
• Diagnosis lab penderita hemofilia: • pemeriksaan penyaring: (clotting time (CT), PT, APTT)• Mixing test• Differential APTT • Pemeriksaan FVIII, FIX, • Pemeriksaan inhibitor FVIII dan inhibitor FIX.