PCR

Marcela Cárdenas Tueme1500792

PCR Amplifica pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces

PCR

Determinación de paternidad

Estudios de expresión genética

Secuenciación directa de secuencias

amplificadas

Detección de mutaciones

Seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades

Diagnóstico de enfermedades

Ciencia forense: identificación

de restos biológicos.

Metodología básica

Extracción de ácidos nucleicos:• Procesamiento de la muestra• Extracción de ácidos nucleicos• Precipitación de los ácidos nucleicos

Comprobación de la extracción

DNA diana

Amplificación por medio de PCR• Desnaturalización• Alineamiento• Elongación

Preparación de la “MASTER” de PCR:• Primers• Polimerasa• dNTPs• Buffer de amplificación

Detección e interpretación:• Análisis electroforético• Análisis secundario de restricción o

hibridación

Componentes de

la Reacción

dNTP(sustratos para polimerizar al nuevo DNA)

• Concentraciones entre 20 y 200µM resultan en un balance óptimo entre rendimiento, especificidad y fidelidad.

• Los cuatro dNTP deben ser usados en concentraciones equivalentes.

Primers • Tamaño ideal: 18-30 nucleótidos de longitud.

• Extremo 3’: Debe ser una G o una C• Tm: 50-65% °C• Contenido GC: 40-60%• Autocomplementariedad: Debe de

ser evitada, para evitar los dímeros de primer.

• 100% de apareamiento con el molde.

Polimerasa • Un rango de concentración para polimerasa es entre 1 y 2.5 unidades por 100 µL de reacción.

Concentración Magnesio • El alineamiento de los primers, la temperatura de disociación de las cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidad del producto, la formación de dímeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima.

• La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unión con el templado, los primers y los dNTPs.

• Los PCR deben contener 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre el total de la concentración de dNTP.

Buffer para PCR • Buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl

• 50 mM de KCl, tween 20 o laureth 12

• Desnaturalización del DNA

• 95°C por 30 segundos• 97°C por 15 segundos

Desnaturalización

• Hibridación de los primers.• La temperatura de

alineamiento óptima es 5°C por debajo de la Tm de los primers.

Alineamiento

•La polimerasa inserta los nucleótidos complementarios.

•El tiempo de extensión depende de la longitud y la [] de la secuencia blanco.

•Tiempo de extensión de 1 minuto es suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud.

Extensión

PCR

Número de Ciclos

• Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo.• Repetir el ciclo varias veces permite obtener

un experimento de amplificación. Millones de copias del fragmento de interés.

• Demasiados ciclos incrementan la cantidad y complejidad de productos no específicos; sin embargo pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento del producto.

Número de ciclos

Cantidad de DNA

0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 102411 204812 409613 819214 1638415 3276816 6553617 13107218 26214419 52428820 1048576

Relación entre cantidad de DNAy el número de ciclos

PCR anidada

• Es un tipo de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación.

• Se utilizan cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada.

• Cuando se tiene el primer amplicón, se unen los cebadores y se amplifica de nuevo, dentro del amplicón inicial.

• Ventaja brinda alta sensibilidad y especificidad. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores.

• Desventaja no nos permite cuantificar la muestra.

PCR in situ

• Consiste en una reacción de PCR en células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación.

• En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de DNA blanco y luego detección mediante hibridación in situ con sondas de DNA/RNA.

• De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma.

PCR múltiple

• PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia.

• Se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, para amplificar simultáneamente varios segmentos de DNA.

• Ventajas información sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos.

Q-PCR

• Es utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de DNA.

• Utiliza los mismos reactivos que un PCR normal, se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo.

• Se usa un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.

• Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.

• En las técnicas basadas en fluorocromos el DNA, se une al fluorocromo (SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real.

• Ventaja Utiliza cebadores normales para su realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas.

Q-PCR, técnicas de fluorocromos

Q-PCR, técnicas de sondas

• Utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador forward y el reverse.

• Si la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Sin embargo si la sonda está dañada no.

• Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.