pcr 1, microbiologia

8/15/2019 PCR 1, Microbiologia

1/42

Tecnología del ADN recombinante

•PCR

Juan Alejandro Neira PhD.


2/42

Definición

• La reacción en cadena dela polimerasa (PCR) es unatécnica que permite replicarentre cientos de miles y

millones de veces, en eltranscurrir de pocas horas e invitro, pequeñas cantidades deADN.


3/42

PCR

• El aislamiento de grandes cantidades de segmentos específicos deADN puede ser realizado utilizando varias técnicas, una de las cualeses la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

• La PCR está basada en una reacción de síntesis de DNAllevada a cabo in vitro por la enzima Taq Polimerasa, una

polimerasa de DNA resistente a la temperatura.


4/42

Componentes de la reacción:

• El tampón (buffer)

• Los nucleótidos (dNTP´s)

• Los cebadores (primers)• El ADN (muestra)

• La polimerasa (taq Polimerasa)


5/42

La polimerasa Taq.

• Es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombradade esta forma debido a que es producida por la bacteriaThermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fueaislada en el año 1968 por Thomas D. Brock1 A

menudo suele abreviarse como "Taq Pol" (osimplemente como "Taq"), y es frecuentementeutilizada en las técnicas de PCR, un método que seutiliza para amplificar secuencias cortas de ADN.


6/42

¿Qué componentes son necesarios para la PCR?


7/42


8/42

Parámetros de la reacción:

• Temperaturas en cada parte del ciclo

• Duración de cada parte del ciclo

• Velocidad de enfriamiento y calentamiento• Número de ciclos


9/42

• En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la técnica de

reacción en cadena de la polimerasa, o PCR.

• Esta técnica ha invadido de tal forma la Biología Molecular,que hoy en día es muy difícil imaginar esta ciencia sin ella.

• En 1989, Science seleccionó el PCR como el principaldesarrollo científico, y la Taq polimerasa como la molécula delaño.

• En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento elPremio Nobel de Química.


10/42

• Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" yano es una limitación en la investigación en BiologíaMolecular, ni en los procedimientos de diagnóstico

basados en el estudio del ADN.

• El número de aplicaciones de esta técnica pareceninfinitas, y continúan creciendo sin parar.

• Una de sus posibles aplicaciones se centra en lasecuenciación del ADN de muestras biológicas.


11/42

Etapas

Desnaturalización

Alineamiento/Unión del cebadorExtensión/Elongación de lacadena

Elongación Final

11


12/42

TERMOCICLADOR

30 ciclos repetitivos conformados

cada uno de tres pasos.

Consisten en un bloque que

puede ser programado paracalentarse y enfriarse

rápidamente en determinados

tiempos

¿En donde se lleva a cabo la reacción?

12


13/42

Desnaturalización• Dos pequeños fragmentos de ADN, típicamente de 10 pares

de bases, llamados primers, son sintetizados a través de otratécnica.

• Esos primers son pequeños fragmentos de ADN que soncomplementarios a cada una de las extremidades de la

secuencia de ADN de interés.• En un tubo de reacción son adicionados los primers,

nucleótidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina,guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especialresistente al calor llamada Taq polimerasa, que promueve la

síntesis de ADN.• La mezcla es calentada a 95°C lo que provoca la

separación de las dos cadenas de ADN.


14/42

Desnaturalización

• Ocurre cuando las dos cadenas de ADN se separen. Se llevaa cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.


15/42

Alineamiento(anillamiento)

• Enseguida, la mezcla es enfriada hasta 55°C, temperatura enla cual los primers se unirán a las regiones complementarias delas moléculas de ADN que están separadas.

• En este momento, dentro del tubo de reacción, todo el ADNestá en forma de cadena simple, menos las dos pequeñasregiones en las cuales los primers de 20 pares de bases seligarán a los dos lados de la secuencia de ADN.


16/42

Alargamiento (polimerización)

• La temperatura se eleva entonces hasta 72°C y la Taq polimerasa comienza a sintetizar un nuevo ADN, comenzando por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de los primers se unió al molde de la muestra de ADN. La Taq

polimerasa promueve la síntesis de ADN apenas en la regiónde doble cadena.

• La síntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20

nucleótidos por segundo, y en un minuto es sintetizada unanueva copia del fragmento que se quiere analizar.


17/42

¿Qué se ha obtenido tras un ciclo dePCR?

• Únicamente una copia de un pequeñofragmento del ADN molde.

El tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su

cantidad original se encuentra disponible para ser

nuevamente replicado en un segundo ciclo.


18/42

¿Cuántos fragmentos se generandurante la reacción de PCR?

Al final del proceso se obtiene aproximadamente unacantidad de fragmento igual al producto de la cantidadinicial de ADN molde por 2n, siendo n el número deciclos.

Como dato para apreciar la cantidad de copias que segeneran, en el ciclo 20 se ha multiplicado por más de unmillón la cantidad inicial de ADN molde.


19/42


20/42

•

La temperatura es disminuida de nuevo a 55°C yahora los primers se irán a unir a los cuatro sitios

en las dos copias nuevas y también en la moléculaoriginal de ADN. LA temperatura del ciclo es

nuevamente elevada a 72°C y se multiplicanentonces las cuatro cadenas individualizadas.


21/42

• Estos ciclos son repetidos varias veces, típicamente 30 veces,en un aparato llamado termociclador.

• Al final de 30 ciclos de amplificación existenaproximadamente un millón de copias del segmento de ADNde interés por cada molécula molde original de la muestrainicial. Es así que podemos seleccionar un fragmentoespecífico dentro de todo el ADN.


22/42


23/42

¿Cómo se prepara?


24/42

1. Primero se prepara la mezcla de reacción (en cantidadsuficiente para todas las muestras) que contenga todoslos componentes de la PCR, a excepción del ADNmolde.

2. Una vez preparados los tubos de reacción seintroducen en el termociclador.


25/42

1. Primero se prepara la mezcla de reacción (encantidad suficiente para todas las muestras) quecontenga todos los componentes de la PCR, aexcepción del ADN molde.

2. Una vez preparados los tubos de reacción seintroducen en el termociclador.


26/42

VENTAJAS

• Técnica específica, sino también muy sensible, pues en principio para practicarla bastaría una sola molécula, por ejemplo, delgenoma humano ~6 picogramos.

• Puede usar como substrato para la reacción al ADN, sin tener que purificarlo de su fuente natural, y es común emplear productos

biológicos diversos. Muchas veces basta una simple ebullición de lamuestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN,dejándolo listo para la reacción.

26(Rodríguez I y cols., 2004)

http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://centros3.pntic.mec.es/cp.la.canal/agua/Gota.gif&imgrefurl=http://repartoadomicilio.blogspot.com/2007/05/punto-de-ebullicin.html&usg=__zMvbbWi-jC-At3D476Vy2jmTTnY=&h=519&w=548&sz=236&hl=es&start=6&um=1&tbnid=6tH81CJkk2KmAM:&tbnh=126&tbnw=133&prev=/images?q=ebullicion&hl=es&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://julianyarac.files.wordpress.com/2009/04/sangre.jpg&imgrefurl=http://julianyarac.wordpress.com/2009/04/04/la-gota-que-derrama-el-vaso-de-agua/&usg=__f2dkhv9CuAS07r--imwVg1VCMSw=&h=400&w=300&sz=9&hl=es&start=7&um=1&tbnid=1X5u6I51x0PzoM:&tbnh=124&tbnw=93&prev=/images?q=sangre&hl=es&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://html.rincondelvago.com/000676176.jpg&imgrefurl=http://html.rincondelvago.com/cavidad-bucal-y-orofaringe.html&usg=__-FnxmTxFJsHu4Ha5GxudjyRiax0=&h=359&w=423&sz=19&hl=es&start=38&um=1&tbnid=j2T7OoLsIIjXOM:&tbnh=107&tbnw=126&prev=/images?q=exudado+de+mucosas&ndsp=20&hl=es&sa=N&start=20&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d7/Human_semen_in_petri_dish.jpg&imgrefurl=http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_semen_in_petri_dish.jpg&usg=__gHJwkPrYEKzqX0HD9QQWHtReBJY=&h=768&w=1024&sz=197&hl=es&start=4&um=1&tbnid=Jxhl1NhkasrxYM:&tbnh=113&tbnw=150&prev=/images?q=semen&hl=es&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://webs.uvigo.es/mmegias/a-imagenes-todas/imagenes/conectivo-irregular.jpg&imgrefurl=http://webs.uvigo.es/mmegias/a-imagenes-todas/conectivo.php&usg=__o756sYJTStQA_7-gHwrdyvDKIEI=&h=300&w=300&sz=90&hl=es&start=82&um=1&tbnid=xb0zEi3zIU77EM:&tbnh=116&tbnw=116&prev=/images?q=tejidos+en+parafina&ndsp=20&hl=es&sa=N&start=80&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://modaellas.com/wp-content/cabello-04.jpg&imgrefurl=http://modaellas.com/2008/06/como-prevenir-la-caida-del-cabello/&usg=__MDgzUQ4Xl60VbeI09eEI-zPgfKU=&h=328&w=280&sz=11&hl=es&start=18&um=1&tbnid=6yQz2oIT6g2x4M:&tbnh=118&tbnw=101&prev=/images?q=Cabello&ndsp=20&hl=es&sa=N&um=1


27/42

Se puede prescindir del uso de radioisótopos, los cuales eranindispensables antes de su invencion (Rodríguez I, 2004)

Proporciona muchas alternativas más rápidas y menoscostosas para muchas aplicaciones de la clonación, en

particular para los organismos en los que se conoce lasecuencia completa del genoma .

Puede producirse enteramente in vitro, sin el uso de células.

Con está técnica se puede seleccionar una secuenciaespecifica de nucleótidos para replicarse en forma selectiva yrápida en grandes cantidades a partir de cualquier muestraque las contenga (Alberts y cols., 2006).

27


28/42

DESVENTAJAS

• Debido a que los cebadores tienen que sintetizarse químicamente, la PCRsolo puede utilizarse solo para clonar ADN con secuencias de comienzo yde terminación conocidas.


29/42

APLICACIONES

•PREDIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

•DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES•AMPLIFICACIÓN DE REGIONES HIPERVARIABLES

•INVESTIGACIONES FORENSES

•

APLICACIONES EN ESTUDIOS EVOLUTIVOS


30/42

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES



31/42



32/42

Mediante la PCR se pueden amplificar genesde organismos ya extinguidos, como del

mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden

comparar estos genes con los genessemejantes de organismos actuales y poder

reconstruir árboles filogenéticos.El PCR también se ha utilizado para conseguir

el mapa del genoma humano.

•APLICACIONES EN

ESTUDIOS EVOLUTIVOS


33/42

Huella digital genética

• Es una técnica forense que permite identificar a una personacomparando su DNA con el de una muestra obtenida, porejemplo, de la escena de un crimen.

• Como la muestra puede ser muy escasa, la PCR permiteaumentar la cantidad de DNA amplificando ciertos segmentos

polimórficos (variables en la población), para luego separarlosmediante electroforesis, lo que se conoce como DNA

fingerprint o huella digital.


34/42


35/42

Test de Paternidad

• Amplificando por PCR fragmentos polimórficos deDNA de la madre, del niño y de él o los presuntos

padres, y separándolo mediante electroforesis, se

puede visualizar una serie de segmentos que tiene elniño, que debe compartir con la madre y padre biológicos.


36/42

Detección de EnfermedadesHereditarias

• Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR, con los partidores adecuados, y luego sersecuenciado, para así determinar si un individuo

porta alguna mutación que explica la presencia deuna enfermedad o su aparición en el futuro, la que puede ser heredada a sus hijos.


37/42


38/42

COMPARACION DE LA EXPRESION

GENICA

*Imágenes editadasdigitalmente


39/42

Clonamiento de Genes

• La PCR es habitualmente usada para amplificar undeterminado gen o un mRNA (representado por un cDNA),que puede introducirse en un vector y luego en un organismo,que al duplicarse también duplicará el gen que nos interesa.

Así podemos tener una cantidad suficiente de un gen o cDNA, por ejemplo, para secuenciarlo o producir a gran escala la proteína que este gen codifica.


40/42

Mutagénesis

• Con variaciones en la secuencia de los partidores, se puede producir un segmento de DNA que presentediferencia en una o mas bases respecto al DNA

original. Así se puede alterar una proteína paraestudiar o anular su función. Esta mutación puede seren un sitio determinado de un gen (sitio dirigida) o enun lugar al azar de un gen o genoma.


41/42

Análisis de DNA antiguo

• Con la PCR se puede analizar DNA que tiene milesde años de antigüedad, lo que ha permitido estudiarmuestras obtenidas desde momias y de restos de

animales extintos, como algunos ejemplos.


42/42

Genotipificacion de polimorfismos

• Mediante el uso de la PCR se puede determinar el genotipo deun individuo para un polimorfismo dado, como unmicrosatélite o un SNP ( single nucleotide polymorphism).

• En este último caso necesitamos dos partidores para un mismo

extremo del segmento, los cuales varían en sólo una base en elextremo 3', lo que generará una amplificación alelo-específica,de acuerdo al alelo del SNP que tenga el individuo en estudio.Estos polimorfismos son muy útiles para estudios

poblacionales y para relacionar un gen o una regióncromosómica con una enfermedad, ya sea mediante estudiosde asociación o ligamiento.

pcr 1, microbiologia

Documents