Download - PCR 1, Microbiologia
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
1/42
Tecnología del ADN recombinante
•PCR
Juan Alejandro Neira PhD.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
2/42
Definición
• La reacción en cadena dela polimerasa (PCR) es unatécnica que permite replicarentre cientos de miles y
millones de veces, en eltranscurrir de pocas horas e invitro, pequeñas cantidades deADN.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
3/42
PCR
• El aislamiento de grandes cantidades de segmentos específicos deADN puede ser realizado utilizando varias técnicas, una de las cualeses la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
• La PCR está basada en una reacción de síntesis de DNAllevada a cabo in vitro por la enzima Taq Polimerasa, una
polimerasa de DNA resistente a la temperatura.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
4/42
Componentes de la reacción:
• El tampón (buffer)
• Los nucleótidos (dNTP´s)
• Los cebadores (primers)• El ADN (muestra)
• La polimerasa (taq Polimerasa)
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
5/42
La polimerasa Taq.
• Es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombradade esta forma debido a que es producida por la bacteriaThermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fueaislada en el año 1968 por Thomas D. Brock1 A
menudo suele abreviarse como "Taq Pol" (osimplemente como "Taq"), y es frecuentementeutilizada en las técnicas de PCR, un método que seutiliza para amplificar secuencias cortas de ADN.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
6/42
¿Qué componentes son necesarios para la PCR?
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
7/42
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
8/42
Parámetros de la reacción:
• Temperaturas en cada parte del ciclo
• Duración de cada parte del ciclo
• Velocidad de enfriamiento y calentamiento• Número de ciclos
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
9/42
• En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa, o PCR.
• Esta técnica ha invadido de tal forma la Biología Molecular,que hoy en día es muy difícil imaginar esta ciencia sin ella.
• En 1989, Science seleccionó el PCR como el principaldesarrollo científico, y la Taq polimerasa como la molécula delaño.
• En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento elPremio Nobel de Química.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
10/42
• Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" yano es una limitación en la investigación en BiologíaMolecular, ni en los procedimientos de diagnóstico
basados en el estudio del ADN.
• El número de aplicaciones de esta técnica pareceninfinitas, y continúan creciendo sin parar.
• Una de sus posibles aplicaciones se centra en lasecuenciación del ADN de muestras biológicas.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
11/42
Etapas
Desnaturalización
Alineamiento/Unión del cebadorExtensión/Elongación de lacadena
Elongación Final
11
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
12/42
TERMOCICLADOR
30 ciclos repetitivos conformados
cada uno de tres pasos.
Consisten en un bloque que
puede ser programado paracalentarse y enfriarse
rápidamente en determinados
tiempos
¿En donde se lleva a cabo la reacción?
12
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
13/42
Desnaturalización• Dos pequeños fragmentos de ADN, típicamente de 10 pares
de bases, llamados primers, son sintetizados a través de otratécnica.
• Esos primers son pequeños fragmentos de ADN que soncomplementarios a cada una de las extremidades de la
secuencia de ADN de interés.• En un tubo de reacción son adicionados los primers,
nucleótidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina,guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especialresistente al calor llamada Taq polimerasa, que promueve la
síntesis de ADN.• La mezcla es calentada a 95°C lo que provoca la
separación de las dos cadenas de ADN.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
14/42
Desnaturalización
• Ocurre cuando las dos cadenas de ADN se separen. Se llevaa cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
15/42
Alineamiento(anillamiento)
• Enseguida, la mezcla es enfriada hasta 55°C, temperatura enla cual los primers se unirán a las regiones complementarias delas moléculas de ADN que están separadas.
• En este momento, dentro del tubo de reacción, todo el ADNestá en forma de cadena simple, menos las dos pequeñasregiones en las cuales los primers de 20 pares de bases seligarán a los dos lados de la secuencia de ADN.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
16/42
Alargamiento (polimerización)
• La temperatura se eleva entonces hasta 72°C y la Taq polimerasa comienza a sintetizar un nuevo ADN, comenzando por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de los primers se unió al molde de la muestra de ADN. La Taq
polimerasa promueve la síntesis de ADN apenas en la regiónde doble cadena.
• La síntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20
nucleótidos por segundo, y en un minuto es sintetizada unanueva copia del fragmento que se quiere analizar.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
17/42
¿Qué se ha obtenido tras un ciclo dePCR?
• Únicamente una copia de un pequeñofragmento del ADN molde.
El tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su
cantidad original se encuentra disponible para ser
nuevamente replicado en un segundo ciclo.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
18/42
¿Cuántos fragmentos se generandurante la reacción de PCR?
Al final del proceso se obtiene aproximadamente unacantidad de fragmento igual al producto de la cantidadinicial de ADN molde por 2n, siendo n el número deciclos.
Como dato para apreciar la cantidad de copias que segeneran, en el ciclo 20 se ha multiplicado por más de unmillón la cantidad inicial de ADN molde.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
19/42
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
20/42
•
La temperatura es disminuida de nuevo a 55°C yahora los primers se irán a unir a los cuatro sitios
en las dos copias nuevas y también en la moléculaoriginal de ADN. LA temperatura del ciclo es
nuevamente elevada a 72°C y se multiplicanentonces las cuatro cadenas individualizadas.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
21/42
• Estos ciclos son repetidos varias veces, típicamente 30 veces,en un aparato llamado termociclador.
• Al final de 30 ciclos de amplificación existenaproximadamente un millón de copias del segmento de ADNde interés por cada molécula molde original de la muestrainicial. Es así que podemos seleccionar un fragmentoespecífico dentro de todo el ADN.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
22/42
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
23/42
¿Cómo se prepara?
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
24/42
1. Primero se prepara la mezcla de reacción (en cantidadsuficiente para todas las muestras) que contenga todoslos componentes de la PCR, a excepción del ADNmolde.
2. Una vez preparados los tubos de reacción seintroducen en el termociclador.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
25/42
1. Primero se prepara la mezcla de reacción (encantidad suficiente para todas las muestras) quecontenga todos los componentes de la PCR, aexcepción del ADN molde.
2. Una vez preparados los tubos de reacción seintroducen en el termociclador.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
26/42
VENTAJAS
• Técnica específica, sino también muy sensible, pues en principio para practicarla bastaría una sola molécula, por ejemplo, delgenoma humano ~6 picogramos.
• Puede usar como substrato para la reacción al ADN, sin tener que purificarlo de su fuente natural, y es común emplear productos
biológicos diversos. Muchas veces basta una simple ebullición de lamuestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN,dejándolo listo para la reacción.
26(Rodríguez I y cols., 2004)
http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://centros3.pntic.mec.es/cp.la.canal/agua/Gota.gif&imgrefurl=http://repartoadomicilio.blogspot.com/2007/05/punto-de-ebullicin.html&usg=__zMvbbWi-jC-At3D476Vy2jmTTnY=&h=519&w=548&sz=236&hl=es&start=6&um=1&tbnid=6tH81CJkk2KmAM:&tbnh=126&tbnw=133&prev=/images?q=ebullicion&hl=es&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://julianyarac.files.wordpress.com/2009/04/sangre.jpg&imgrefurl=http://julianyarac.wordpress.com/2009/04/04/la-gota-que-derrama-el-vaso-de-agua/&usg=__f2dkhv9CuAS07r--imwVg1VCMSw=&h=400&w=300&sz=9&hl=es&start=7&um=1&tbnid=1X5u6I51x0PzoM:&tbnh=124&tbnw=93&prev=/images?q=sangre&hl=es&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://html.rincondelvago.com/000676176.jpg&imgrefurl=http://html.rincondelvago.com/cavidad-bucal-y-orofaringe.html&usg=__-FnxmTxFJsHu4Ha5GxudjyRiax0=&h=359&w=423&sz=19&hl=es&start=38&um=1&tbnid=j2T7OoLsIIjXOM:&tbnh=107&tbnw=126&prev=/images?q=exudado+de+mucosas&ndsp=20&hl=es&sa=N&start=20&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d7/Human_semen_in_petri_dish.jpg&imgrefurl=http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_semen_in_petri_dish.jpg&usg=__gHJwkPrYEKzqX0HD9QQWHtReBJY=&h=768&w=1024&sz=197&hl=es&start=4&um=1&tbnid=Jxhl1NhkasrxYM:&tbnh=113&tbnw=150&prev=/images?q=semen&hl=es&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://webs.uvigo.es/mmegias/a-imagenes-todas/imagenes/conectivo-irregular.jpg&imgrefurl=http://webs.uvigo.es/mmegias/a-imagenes-todas/conectivo.php&usg=__o756sYJTStQA_7-gHwrdyvDKIEI=&h=300&w=300&sz=90&hl=es&start=82&um=1&tbnid=xb0zEi3zIU77EM:&tbnh=116&tbnw=116&prev=/images?q=tejidos+en+parafina&ndsp=20&hl=es&sa=N&start=80&um=1http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://modaellas.com/wp-content/cabello-04.jpg&imgrefurl=http://modaellas.com/2008/06/como-prevenir-la-caida-del-cabello/&usg=__MDgzUQ4Xl60VbeI09eEI-zPgfKU=&h=328&w=280&sz=11&hl=es&start=18&um=1&tbnid=6yQz2oIT6g2x4M:&tbnh=118&tbnw=101&prev=/images?q=Cabello&ndsp=20&hl=es&sa=N&um=1
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
27/42
Se puede prescindir del uso de radioisótopos, los cuales eranindispensables antes de su invencion (Rodríguez I, 2004)
Proporciona muchas alternativas más rápidas y menoscostosas para muchas aplicaciones de la clonación, en
particular para los organismos en los que se conoce lasecuencia completa del genoma .
Puede producirse enteramente in vitro, sin el uso de células.
Con está técnica se puede seleccionar una secuenciaespecifica de nucleótidos para replicarse en forma selectiva yrápida en grandes cantidades a partir de cualquier muestraque las contenga (Alberts y cols., 2006).
27
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
28/42
DESVENTAJAS
• Debido a que los cebadores tienen que sintetizarse químicamente, la PCRsolo puede utilizarse solo para clonar ADN con secuencias de comienzo yde terminación conocidas.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
29/42
APLICACIONES
•PREDIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
•DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES•AMPLIFICACIÓN DE REGIONES HIPERVARIABLES
•INVESTIGACIONES FORENSES
•
APLICACIONES EN ESTUDIOS EVOLUTIVOS
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
30/42
DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
•INVESTIGACIONES FORENSES
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
31/42
•INVESTIGACIONES FORENSES
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
32/42
Mediante la PCR se pueden amplificar genesde organismos ya extinguidos, como del
mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden
comparar estos genes con los genessemejantes de organismos actuales y poder
reconstruir árboles filogenéticos.El PCR también se ha utilizado para conseguir
el mapa del genoma humano.
•APLICACIONES EN
ESTUDIOS EVOLUTIVOS
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
33/42
Huella digital genética
• Es una técnica forense que permite identificar a una personacomparando su DNA con el de una muestra obtenida, porejemplo, de la escena de un crimen.
• Como la muestra puede ser muy escasa, la PCR permiteaumentar la cantidad de DNA amplificando ciertos segmentos
polimórficos (variables en la población), para luego separarlosmediante electroforesis, lo que se conoce como DNA
fingerprint o huella digital.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
34/42
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
35/42
Test de Paternidad
• Amplificando por PCR fragmentos polimórficos deDNA de la madre, del niño y de él o los presuntos
padres, y separándolo mediante electroforesis, se
puede visualizar una serie de segmentos que tiene elniño, que debe compartir con la madre y padre biológicos.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
36/42
Detección de EnfermedadesHereditarias
• Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR, con los partidores adecuados, y luego sersecuenciado, para así determinar si un individuo
porta alguna mutación que explica la presencia deuna enfermedad o su aparición en el futuro, la que puede ser heredada a sus hijos.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
37/42
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
38/42
COMPARACION DE LA EXPRESION
GENICA
*Imágenes editadasdigitalmente
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
39/42
Clonamiento de Genes
• La PCR es habitualmente usada para amplificar undeterminado gen o un mRNA (representado por un cDNA),que puede introducirse en un vector y luego en un organismo,que al duplicarse también duplicará el gen que nos interesa.
Así podemos tener una cantidad suficiente de un gen o cDNA, por ejemplo, para secuenciarlo o producir a gran escala la proteína que este gen codifica.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
40/42
Mutagénesis
• Con variaciones en la secuencia de los partidores, se puede producir un segmento de DNA que presentediferencia en una o mas bases respecto al DNA
original. Así se puede alterar una proteína paraestudiar o anular su función. Esta mutación puede seren un sitio determinado de un gen (sitio dirigida) o enun lugar al azar de un gen o genoma.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
41/42
Análisis de DNA antiguo
• Con la PCR se puede analizar DNA que tiene milesde años de antigüedad, lo que ha permitido estudiarmuestras obtenidas desde momias y de restos de
animales extintos, como algunos ejemplos.
-
8/15/2019 PCR 1, Microbiologia
42/42
Genotipificacion de polimorfismos
• Mediante el uso de la PCR se puede determinar el genotipo deun individuo para un polimorfismo dado, como unmicrosatélite o un SNP ( single nucleotide polymorphism).
• En este último caso necesitamos dos partidores para un mismo
extremo del segmento, los cuales varían en sólo una base en elextremo 3', lo que generará una amplificación alelo-específica,de acuerdo al alelo del SNP que tenga el individuo en estudio.Estos polimorfismos son muy útiles para estudios
poblacionales y para relacionar un gen o una regióncromosómica con una enfermedad, ya sea mediante estudiosde asociación o ligamiento.