parte uno tesis edali diciembre 2010

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA AGRÍCOLA

ANÁLISIS PROTEÓMICO DE LA RESISTENCIA INDUCIDA POR MICORRIZACIÓN AL PATÓGENO FOLIAR Sclerotinia sclerotiorum EN FRIJOL

(Phaseolus vulgaris L.)

T E S I S

PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRA EN

RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

I.BQ. EDALHÍ QUINTERO ZAMORA

GUASAVE SINALOA DICIEMBRE DEL 2010

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL

UNIDAD SINALOA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALSECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

CARTA CESIÓN DE DERECHOS

En la Ciudad de Guasave Sinaloa el día .lQ del mes diciembre del año 2010, el (la) que

suscribe Edalhí Quintero Zamora alumno (a) del Programa de Maestría en Recursos Naturales

y Medio Ambiente con número de registro B081126, adscrito a CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa,

manifiesta que es autor (a) intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la dirección de el Dr.

Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza y el Dr. Sergio Medina Godoy y cede los derechos del

trabajo intitulado "Análisis proteómico de la resistencia inducida por micorrización al patógeno foliar

Sc/erotinia sc/erotiorum en frijol (Phaseolus vulgaris L.)", al Instituto Politécnico Nacional para su

difusión, con fines académicos y de investigación.

Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos del

trabajo sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser obtenido

escribiendo a la siguiente dirección yo [email protected], [email protected],

[email protected]. Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento

correspondiente y citar la fuente del mismo.

Edot \h( Q..¡l~o -Z.Edalhí Quintero Zamora

Nombre y firma

SIP-13-BIS

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALSECRETARIA DE INVESTIGACiÓN Y POSGRADO

ACTA DE REGISTRO DE TEMA DE TESISY DESIGNACIÓN DE DIRECTORES DE TESIS

Guasave, Sinaloa a ~ de Noviembre del 2010

El Colegio de Profesores de Estudios de Posgrado e Investigación de CIIDIR-Sinaloa en su sesiónExtraordinaria No. 19 celebrada el día 12 del mes de Noviembre conoció la solicitudpresentada por el (la) alumno(a):

Quintero Zamora

Con registro: ~~~--~~~--~~

Apellido paterno Apellido materno

Aspirante de:

1.- Se designa al aspirante el tema de tesis titulado:"Análisis proteómico de la resistencia inducida por micorrización al patógeno foliar Sclerotiniasc/erotiorum en frijol (Phaseolus vulgaris L.)".

De manera general el tema abarcará los siguientes aspectos:La identificación de proteínas diferenciales relacionadas a la resistencia sistémica inducida en frijolasociadas a la simbiosis micorrízica arbuscular con el hongo Glomus intraradices

2.- Se designan como Directores de Tesis a los Profesores:Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza y Dr. Sergio Medina Godoy

3.- El trabajo de investigación base para el desarrollo de la tesina será elaborado por el alumno en:Las instalaciones del CIIDIR-Sinaloa

que cuenta con los recursos e infraestructura necesarios.

4.- El interesado deberá asistir a los seminarios desarrollados en el área de adscripción deltrabajo desde la fecha en que se suscribe la presente hasta la aceptación de la tesis porla Comisión Revisora correspondiente:

Directores de Tesis

Dr.Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza

Aspirante Presidente del Colegio

I.BQ. Edalhí Quintero Zamora Dr. J«<~ntiel Montoya el 1DI R - 1PNUNIOAD SINALOA

OIRECCION

-------------------------------------------

SIP-14-BISINSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALSECRETARíA DE INVESTIGACiÓN Y POSGRADO

ACTA DE REVISIÓN DE TESIS

En la Ciudad de Guasave, Sin. siendo las 17:00 horas del día 6 del mes de

diciembre del 2010 se reunieron los miembros de la Comisión Revisora de Tesis, designadapor el Colegio de Profesores de Estudios de Posgrado e Investigación de CIIDIR-SINALOA

para examinar la tesis titulada:"Análisis proteómico de la resistencia inducida por micorrización al patógeno foliar Sc/erotinia sc/erotiorum

en frijol (Phaseolus vulgaris L.)".

Presentada por el alumno:Quintero Zamora

Apellido paterno Apellido materno

aspirante de:MAESTRIA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

Después de intercambiar opiniones los miembros de la Comisión manifestaron APROBAR LATESIS, en virtud de que satisface los requisitos señalados por las disposiciones reglamentariasvigentes.

LA COMISiÓN REVISORA

Directores de tesis

Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza

Adolfo Dagobe

PRESIDENTE DEL COLEGIO DE PROFESORES

------:D=-r.-;¡¡~f-org----7l:"~:-on--:7tl~L.,-1 :-:"Mo'O"":n-:-'toy=a=-<---.;.tn-·-----tCII O 1R - 1P NUNIOAU ~INALúA

DIRfCCION

El hombre encuentra a Dios detrás de cada puerta que la ciencia logra abrir…

Albert Einstein.

Dedicatoria Te dedico mi trabajo de tesis a ti mamá Librada, porque siempre te entusiasmaron mis

logros y sé que esta vez no es la excepción. Gracias por formar parte de tu esencia y porque

no habrá una persona más admirable para mí en la vida que tú. Yo sé que eres el angelote que

alguna vez alguien dijo que me seguía...solo espero encontrarte otra vez, en algún lugar…te

quiero mucho má…

El presente trabajo se llevó a cabo en el Departamento de Biotecnología Agrícola en

el Laboratorio de Alimentos Funcionales del Centro Interdisciplinario de Investigación para

el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico

Nacional (IPN) bajo la dirección del Dr. Sergio Medina Godoy y el Dr. Ignacio Eduardo

Maldonado Mendoza. Para este proyecto se recibió el financiamiento por parte del Consejo

Estatal de Ciencia y Tecnología del Estado de Sinaloa (CECYT, Convocatorias 2008 y

2009) y la Secretaria de Investigación y Posgrado del IPN (Proyectos: 20090022,

20100318). La autora agradece al CIIDIR Unidad Sinaloa por su apoyo en infraestructura

para la realización de la presente investigación así como a CONACYT, COFAA-IPN e IPN

por las becas otorgadas (Beca CONACYT y PIFI).

A G R A D E C I M I E N T O S

Primero que nada gracias Dios por estar siempre muy cerquitita de mí y nunca

abandonarme. Te agradezco el haber puesto en mi camino a todas aquellas personas que han

sido mi compañía y que me han ayudado en la realización de este trabajo. Quiero dejar

constancia de todas ellas y agradecerles con sinceridad su participación.

Muchísimas gracias Dr. Sergio Medina Godoy por haberme aceptado como su alumna

de maestría, por haber puesto todos los medios para que yo hiciera mi tesis bajo su dirección y

por su ayuda para que yo asistiera a tres congresos en los que presente mi trabajo. Doc. Sergio

también le agradezco sus enseñanzas, el tiempo invertido y la cordialidad con la que siempre

me apoyó. Y aún más, gracias por su amistad, sus consejos y sus palabras para levantar mi

ánimo. Un especial agradecimiento a usted Dr. Ignacio E. Maldonado Mendoza por su

colaboración como director de esta tesis. Le agradezco Dr. Nacho sus enseñanzas, sus

valiosas sugerencias y el tiempo invertido para la revisión de mi tesis. Gracias a mi comité

tutorial por la revisión de mi tesis: Dra. Melina López Meyer le agradezco su especial interés

en mi trabajo y todas las aportaciones brindadas. Dr. Wenceslao Valenzuela Quiñónez le

agradezco su colaboración para el desarrollo de esta tesis. Dr. Dagoberto Armenta

Bojórquez, gracias por sus valiosas clases. Gracias Dr. José Ángel López Valenzuela el haber

proporcionado el software PDQuest para llevar a cabo el análisis de imágenes de este trabajo.

También agradezco enormemente tu ayuda M.C. Luz Isela Peinado Guevara en el uso de

este software y en el análisis de los resultados, de igual manera agradezco tus enseñanzas y

sugerencias en las metodologías aplicadas en el análisis proteómico. Muchas gracias M.C.

Arlene Guadalupe Mora Romero por proporcionar las muestras de hojas de frijol de dos

líneas de frijol colonizadas y no colonizadas con G. intraradices indispensables en la

realización de este trabajo. Gracias también M. C. Hugo Galindo Flores por ayudarme a

resolver mis dudas y compartir sus conocimientos conmigo.

Este trabajo de tesis también es resultado de personas que participaron indirectamente,

las cuales me demostraron su aprecio y cariño. Un millón de gracias a todos ustedes familia y

amigos por los momentos llenos de risas, lágrimas, sueños, secretos, anhelos y hasta de enojo.

Blanca Elvira te agradezco enormemente tu amistad desde que fuimos niñas. Hemos

compartido muchas etapas de nuestra vida juntas, en la que me has contagiado de tu alegría y

de tu espíritu de lucha. Gracias también Victor y Glenda, porque juntos recorrimos

muchísimas horas de camino, las cuales pudieron haber sido muy aburridas y cansadas, pero

con ustedes fueron superdivertidas. A ti Odeta mi amiga a primera vista, un millón de gracias

por todos los momentos compartidos. Por las riso-terapias que me hicieron tanto bien en los

momentos de estrés y por tu contribución a mi trabajo de tesis al acompañarme a sacar mis

geles durante la noche y vivir esos momentos de miedo en el CIIDIR conmigo. Mil gracias

por las muchas molestias dadas y tu como si nada negra…también les agradezco a Eymer,

Cindy y Libna porque estuvieron presentes en esos momentos tan importantes de mi trabajo

y su apoyo fue incondicional, gracias por su amistad. Muchísimas gracias también a ti Lucky

por todas las cosas que has hecho por mí. Sobre todo gracias por nuestros arrebatos, porque

gracias a ellos nos divertimos mucho, espero que surjan más y a ti Raquel gracias por tu

apoyo, porque aunque tranquila siempre has sido parte del show y nuestra gran amiga. Paola

no podías faltar tu, aunque ha sido poco el tiempo que hemos compartido en esta vida, han

sido momentos llenos de buena vibra y de sabios consejos, gracias por brindarme tu amistad y

por considerarme tu hermanita. Gracias también a mis compañeros de generación: Karla,

Dámaris, Leonardo, Breydi, Magda, Carmen, Rocío y Nataly y del lab: Luis Daniel,

Damian, Alejandro, Claudia María y Claudia Moreno.

Gracias mamá y papá porque su ilusión en la vida ha sido convertir a mis hermanos y

a mí en personas de bien. Porque ustedes sin escatimar esfuerzo alguno, han sacrificado gran

parte de su vida en formarnos y educarnos. Porque ni con las riquezas más grandes del mundo

podré pagarles la familia que tengo. Gracias por todo su apoyo en esta meta de mi vida.

Por último quiero agradecer a mis grandísimos amores: a ti Moisés y a nuestro hijo

Luis Diego. Porque al mirar sus ojos crecen en mi ilusiones de vivir, de alcanzar sueños que

tenemos en común. Gracias por que sin el amor de ustedes no lo hubiera logrado. Perdonen

mis ausencias y mis momentos de frustración y enojo. Los amo, lo saben.

He llegado al final de este camino y en mi han quedado marcadas huellas profundas de

éste recorrido. Son profesores sus palabras y sabios consejos. Son amigos sus sonrisas. Son

madre tu mirada y tu aliento. Son padre tu trabajo y esfuerzo. Son esposo e hijo sus abrazos y

besos. Sin ustedes esto no sería porque, cada uno de ustedes en algún momento de la vida hizo

algo por mi e influyó en mi destino…gracias por participar :)

ÍNDICE RESUMEN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I

ABSTRACT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II

ÍNDICE DE CUADROS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III

ÍNDICE DE FIGURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV

GLOSARIO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI

I. INTRODUCCIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

II. ANTECEDENTES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1. El frijol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.1. Azufrado Higuera. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.2. Azufrado Regional 87. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2. Interacciones planta-microorganismo en la rizosfera. . . . . . . . . . . . . . 5

2.2.1. Micorrizas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.2.2. Bioprotección por hongos micorrízicos arbusculares. . . . . . . . . 9

2.2.2.1. Posibles mecanismos de bioprotección. . . . . . . . . . . . . 10

2.2.2.2. Bioprotección por hongos micorrízicos arbusculares en frijol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

13 2.3. Glomus intraradices. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.4. Proteómica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.4.1. Análisis de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.5. Resistencia sistémica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.5.1. Resistencia sistémica adquirida (RSA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.5.2. Resistencia sistémica inducida (RSI). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.5.3. Resistencia inducida por micorrización (RIM). . . . . . . . . . . . . . 23

2.6. Métodos de genómica y proteómica empleados en el estudio de la interacción planta-microorganismo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

24 III. JUSTIFICACIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

IV. HIPÓTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

V. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.1. Objetivo general. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.2. Objetivos específicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

VI. MATERIALES Y MÉTODOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

6.1. Tejido Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

6.2. Estandarización del método de extracción de proteínas. . . . . . . . . . . 36

6.2.1. Método A de extracción con Fenol (Fenol-A). . . . . . . . . . . . . . 36

6.2.2. Método B de extracción con Fenol (Fenol-B). . . . . . . . . . . . . . 37

6.2.3. Método A de extracción con Ácido Tricloroacético/Acetona (TCA-A). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

37

6.2.4. Método B de extracción con Ácido Tricloroacético/Acetona (TCA-B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

38

6.3. Cuantificación de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

6.4. Protocolo de limpieza de proteínas para 2D-SDS-PAGE. . . . . . . . . . . . 39

6.5. Separación de proteínas por punto isoeléctrico [Isoelectroenfoque (IEF)]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

39

6.6. Separación de proteínas por peso molecular (SDS-PAGE). . . . . . . . 40

6.7. Adquisición y análisis de imágenes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

6.8. Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas. . . . . . 41

VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

7.1. Estandarización del método de extracción de proteínas. . . . . . . . . . . . 43

7.2. Electroforesis bidimensional (2D-SDS-PAGE). . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

7.3. Análisis proteómico de plantas colonizadas con G. intraradices vs. no colonizadas en dos líneas de frijol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49

7.3.1. Extracción en hojas de frijol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

7.3.2. Perfil de proteínas inducido en hojas de frijol. . . . . . . . . . . . . . 50

7.4. Interpretación del papel funcional de las proteínas implicadas en la simbiosis micorrízica arbuscular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

61

7.4.1. Análisis proteómico en hojas de plantas de frijol de la línea Az. Higuera susceptible y Az. Regional 87 tolerante a S. sclerotiorum en asociación con G. intraradices. . . . . . . . . . . . . . . . . .

63

VIII. CONCLUSIONES. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

IX. RECOMENDACIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

X. BIBLIOGRAFÍA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

Quintero-Zamora, 2010 I

RESUMEN

En los últimos años se han reportado diversos estudios sobre la resistencia inducida

por micorrización al ataque de patógenos, en éstos se han determinado los cambios de

expresión de genes y proteínas que ocurren en las raíces de plantas colonizadas por hongos

micorrízicos arbusculares. Recientemente, se han iniciado estudios para entender cómo

afecta esta interacción a la parte aérea de la planta. En nuestro grupo de investigación se

llevó a cabo el estudio del efecto de la micorrización con Glomus intraradices en la

tolerancia al moho blanco causado por Sclerotinia sclerotiorum en tres variedades de frijol.

Los resultados obtenidos muestran una resistencia inducida con G. intraradices a S.

sclerotiorum en dos de las tres variedades probadas. Para identificar proteínas diferenciales

en la parte aérea de variedades de frijol con capacidad contrastante para inducir la

tolerancia a patógenos por colonización micorrízica, en el presente trabajo primeramente se

evaluaron cuatro diferentes métodos de extracción de proteínas ya reportados para otros

tejidos vegetales. La comparación cuantitativa de extractos de proteínas reveló que el

método de extracción con ácido tricloroacético-acetona fue el mejor en cuanto a cantidad y

calidad de proteínas resueltas en el análisis 2D-SDS-PAGE. Posteriormente, se realizó un

análisis proteómico comparativo entre plantas de frijol de las variedades Azufrado Higuera

(susceptible a S. sclerotiorum, cuando es colonizada con G. intraradices) y Azufrado

Regional 87 (tolerante a S. sclerotiorum, cuando es colonizada con G. intraradices)

colonizadas y no colonizadas con el hongo G. intraradices. El análisis del perfil proteico de

dos variedades de frijol a estudiar en las diferentes condiciones, mostró un promedio de

200 proteínas en un rango de pH 4-7 y una masa molecular de 10 a 100 kDa. El análisis

proteómico (colonizada vs. no colonizada) de la variedad Az. Higuera, reveló cinco

proteínas diferenciales, las cuales disminuyeron su expresión en plantas colonizadas. En

cambio, la variedad Az. Regional 87 reveló una proteína que sólo se encuentra en la

condición colonizada, once aumentan su expresión relativa y dos la disminuyen en cuanto a

plantas colonizadas vs. no colonizadas. Los resultados de identificación mediante

espectrometría de masas, muestran once proteínas cuya función se conoce, una con función

desconocida y dos proteínas no reportadas en tejidos vegetales. Tripsinógeno y

transcetolasas fueron reguladas de manera contrastante entre las variedades. La mayoría de

las proteínas diferencialmente inducidas están relacionadas a fotosíntesis.

Quintero-Zamora, 2010 II

ABSTRACT

In recent years, there have been several studies on mycorrhiza-induced resistance to

pathogen attack, in which changes of expression of genes and proteins that occur in the

roots of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)-colonized plants have been determined.

Recent studies have begun to deal with the question of how this interaction affects plant

shoots. In our research group, the effect of mycorrhiza colonization with Glomus

intraradices on the induction of tolerance to white mold caused by Sclerotinia sclerotiorum

in three varieties of beans have been investigated. Results showed an induced tolerance to

S. sclerotiorum in colonized plants in two out of the three varieties tested. In order to

identify differential proteins between AMF-colonized and non colonized plants, first, four

protein extraction methods reported for other plant tissues were evaluated. Quantitative

comparison of protein extracts revealed that trichloroacetic acid-acetone extraction method

was the best in terms of quantity and quality of proteins resolved by 2D-SDS-PAGE

analysis. Subsequently, we conducted a comparative proteomic analysis of shoots of the

varieties Azufrado Higuera and Azufrado Regional 87. Azufrado Higuera showed

susceptibility to S. sclerotiorum, when colonized with G. intraradices, whereas Azufrado

Regional 87 was able to induce tolerance to this pathogen, when colonized with the AMF.

Protein profile analysis of these two bean varieties under colonized and non colonized

conditions showed an average of 200 proteins in the range of pH 4-7 and molecular mass of

10 to 100 kDa. Proteomic analysis on Az. Higuera, revealed five differential proteins that

showed decreasing expression in AMF-colonized plants. Instead, the variety Az. Regional

87 revealed a protein found only in colonized plants, whereas eleven increased their relative

expression, and two showed a decrease in relative expression in colonized vs. non-

colonized plants. Identification by mass spectrometry showed eleven proteins whose

function is already known, whereas putative function of one of them is currently unknown,

and two proteins have not been reported in plant tissues. Trypsinogen and transketolases

were regulated in a contrasting manner between the two varieties. Most of the induced

proteins are related to photosynthesis.

Quintero-Zamora, 2010 III

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1 Rendimientos de extracción de proteínas de hojas de plantas

mediante cuatro diferentes métodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

44

Cuadro 2 Proteínas (spots) resueltas por cada uno de los diferentes

métodos de extracción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49

Cuadro 3 Valores obtenidos por el software PDQuest en pixeles, así

como el promedio y desviación estándar de estos para las

diferentes condiciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

54

Cuadro 4 Relación de densidad de proteínas expresadas diferencialmente

en hojas de plantas de frijol Az. Higuera. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

57

Cuadro 5 Relación de densidad de proteínas expresadas diferencialmente

en hojas de plantas de frijol Az. Regional 87. . . . . . . . . . . . . . . .

57

Cuadro 6 Proteínas diferenciales como resultado de la colonización con

HMA en hojas de plantas de frijol variedad Az. Higuera. . . . . .

59

Cuadro 7 Proteínas diferenciales como resultado de la colonización con

HMA en hojas de plantas de frijol variedad Az. Regional 87. . .

60

Quintero-Zamora, 2010 IV

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Esquema de los diferentes pasos involucrados en un análisis de

proteómica comparativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

16

Figura 2 Plantas de frijol de la variedad Az. Regional 87, mantenidas en

estantes cubiertos con mallas antiáfidos bajo condiciones de

invernadero. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

34

Figura 3 Plantas de frijol de las variedades Az. Regional 87 y Az. Higuera,

cultivadas bajo condiciones controladas en cámaras de

crecimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

35

Figura 4 Curva estándar para determinar la concentración de proteína. . . . . 44

Figura 5 Análisis por SDS-PAGE de proteínas extraídas por diferentes

métodos de extracción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

45

Figura 6 Análisis 2D-SDS-PAGE de proteínas de hojas de frijol con el

método de extracción con Fenol-A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47


método de extracción con Fenol-B. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47


método de extracción con TCA-A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

48


método de extracción con TCA-B. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

48

Figura 10 Análisis mediante electroforesis en gel desnaturalizante (SDS-

PAGE) de proteínas extraídas de hoja mediante el método de

extracción TCA-A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

50

Figura 11 Geles preparativos bidimensionales (2D-SDS-PAGE) de plantas

de frijol (Phaseolus vulgaris) línea Az. Regional 87 colonizadas

con Glomus intraradices. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51


de frijol (Phaseolus vulgaris) línea Az. Regional 87 no

colonizadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51

Quintero-Zamora, 2010 V


de frijol (Phaseolus vulgaris) línea Az. Higuera colonizadas con

Glomus intraradices. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

52


de frijol (Phaseolus vulgaris) línea Az. Higuera no colonizadas. . .

52

Figura 15 Gel maestro comparativo entre las proteínas de la línea de frijol

Az. Higuera, colonizadas con G. intraradices vs. no colonizadas,

obtenido en el programa PDQuest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

55

Figura 16 Gel maestro comparativo entre las proteínas de la línea de frijol

Az. Regional 87, colonizadas con G. intraradices vs. no

colonizadas, obtenido en el programa PDQuest. . . . . . . . . . . . . . . .

56

Quintero-Zamora, 2010 VI

GLOSARIO

Arbustivo tipo I. Las variedades arbustivo tipo uno se caracterizan por tener

floración y maduración uniformes, lo que en parte se debe a su hábito de

crecimiento compacto y en algunos casos a su respuesta neutral al fotoperíodo,

aunque su potencial de rendimiento es menor que otros tipos (II, III, IV).

Bioprotección. Protección conferida a las plantas, contra estrés biótico o abiótico,

por microorganismos benéficos como hongos micorrízicos arbusculares o

rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal.

Elicitor. Son moléculas del patógeno o sustancias químicas, que actúan como

receptores de las plantas, activando en ellas respuestas de defensa.

Fotobionte. Todo organismo capaz de absorber la energía de luz y transformarla en

energía química.

Hábito de crecimiento. Las plantas se clasifican por su hábito de crecimiento en

erectas (plantas con tallos de crecimiento erecto), rastreras (plantas cuyos tallos

crecen tendidos sobre la superficie del suelo) y trepadoras (plantas que interfieren

con el cultivo, con tallo de crecimiento oblicuo). De acuerdo con el hábito de

crecimiento que presentan sus plantas, los cultivares de fríjol son agrupados en

cuatro tipos principales: Hábito de crecimiento determinado arbustivo (Tipo I),

hábito de crecimiento indeterminado arbustivo (Tipo II), hábito de crecimiento

indeterminado postrado (Tipo III) y hábito de crecimiento indeterminado trepador

(Tipo IV).

Hifa. Elementos filamentosos cilíndricos característicos que en conjunto forman el

micelio de la mayoría de los hongos.

Quintero-Zamora, 2010 VII

Micorriza. Asociación simbiótica que se establece entre raíces de una planta y un

hongo micorrízico.

Preacondicionamiento o “priming”. Estado fisiológico causado en plantas por

algunos compuestos o microorganismos benéficos, en el cual la planta se potencía

contra diferentes tipos de estrés como el ataque de un patógeno.

Resistencia sistémica. Estado fisiológico de aumento de la capacidad defensiva en

plantas, dado por un elicitor de manera local y la señal es transportada a zonas

distales de la planta.

Simbiosis. Asociación de dos o más organismos de distintas especies, en la que

todos salen beneficiados.

Susceptible. Que no tiene capacidad para resistir enfermedades ocasionadas por

organismos patógenos.

Tolerante. Que tiene capacidad para resistir enfermedades ocasionadas por

organismos patógenos.

Virosis. Son todas aquellas patologías provocadas por virus en plantas.

Quintero-Zamora, 2010 1

I. INTRODUCCIÓN

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es originario de América, es una especie

dicotiledónea anual perteneciente a la familia de las fabáceas, antiguamente conocida como

familia de las papilionáceas. El frijol es la leguminosa de grano más consumida y estudiada

en el mundo por ser una de las fuentes principales de proteínas, así como formar parte

importante de los hábitos alimentarios de la población. Su mayor área de producción se

encuentra concentrada en Asia donde se localiza cerca del 50% de la producción mundial y

en el Continente Americano el cual participa aproximadamente con un 25%. La producción

de frijol en el mundo se concentra en 129 países de los cinco continentes. Entre los países

productores de la leguminosa destacan la India con un 26%, Brasil 23%, Myanmar 17%,

Estados Unidos con 8%, y México en quinto lugar con un 8%. Estas naciones, junto con

China, contribuyeron con el 80% producido, según la FAO (2008). En México, los

principales estados productores de frijol son Zacatecas, Durango y Chihuahua, en el ciclo

primavera-verano; y Nayarit y Sinaloa en el ciclo otoño-invierno. En Sinaloa en el ciclo

agrícola otoño-invierno 2009 se sembraron 94,650.07 hectáreas (ha), obteniendo un total de

162,344.21 toneladas (t) de grano, lo cual representa la mayor superficie sembrada del país

en ese ciclo (SAGARPA, 2009). Por lo que el cultivo de frijol ocupa un lugar importante en

la economía del estado.

La producción de frijol común es afectada por factores bióticos y abióticos. Los

factores bióticos incluyen: plagas, enfermedades y malezas. Los factores abióticos

incluyen: calor, sequía, suelos ácidos, baja fertilidad del suelo y salinidad (Rodríguez,

1996). Dentro de los factores bióticos también existen microorganismos en el suelo que

actúan principalmente en la rizosfera. Estos microorganismos interaccionan de diferente

manera con las plantas; en algunos casos actúan como patógenos y en otros establecen

interacciones benéficas con las mismas (Azcón-Aguilar y Barea, 1996; Peterson et al.,

2004). Dentro de las interacciones benéficas microorganismo-planta más importantes están

la simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno y la simbiosis con hongos micorrízicos

arbusculares (HMA). Ambos tipos de interacción se pueden llevar a cabo con plantas

leguminosas y ambas corresponden a asociaciones complejas lo cual requiere de una

participación coordinada entre los organismos que interactúan (Gamalero et al., 2004).


La interacción de la micorriza arbuscular (MA) es una asociación mutualista que se

establece entre un grupo de hongos pertenecientes al filo Glomeromycota y la gran mayoría

de las plantas (Schuessler et al., 2001). Aproximadamente el 80% de todas las especies de

plantas terrestres pueden formar este tipo de asociación. En esta simbiosis, el hongo provee

fósforo, nitrógeno y otros nutrimentos poco móviles a la planta y la planta a cambio le

brinda carbohidratos al hongo (citado en Hause et al., 2002). Además de las ventajas

nutricionales que la asociación brinda a las plantas, se ha observado que la colonización

micorrízica confiere tolerancia a patógenos tanto de raíz (Bodker et al., 2002; Colditz et al.,

2005; Elsen et al., 2008) como de parte aérea (Liu et al., 2007; Galindo-Flores, 2008;

Mora-Romero, 2008).

En base a la resistencia inducida por micorrización (RIM) al ataque de patógenos,

en los últimos años se han reportado diversos estudios donde se han determinado los

cambios de expresión de genes y proteínas que ocurren en las raíces de plantas colonizadas

por HMA (Salzer et al., 2000; Liu et al., 2003; Whipps, 2004; Colditz 2004, 2005; Liu et

al., 2007). Sin embargo, pocos son los estudios encaminados a entender cómo afecta esta

interacción la parte aérea de la planta (Liu et al., 2007; Fiorilli et al., 2009). Se ha sugerido

que la micorrización promueve la resistencia a patógenos mediante la acumulación de

proteínas en estado inactivo, de tal manera que una vez enfrentada la planta colonizada con

HMA con el patógeno, éstas proteínas son activadas y la respuesta de defensa es mucho

más rápida e intensa. Se ha planteado que en el establecimiento de la asociación MA deben

participar señales moleculares que se intercambien entre la planta y el hongo (Salzer y

Boller, 2000). Se ha encontrado que en plantas colonizadas con HMA se produce una

respuesta transitoria, similar a la producida por patógenos, de acumulación de proteínas

relacionadas a patogenicidad, la cual es atenuada a medida que avanza la colonización

(Dumas-Gaudot et al., 2000).

En el Laboratorio de Interacción Microorganismo-Planta del Departamento de

Biotecnología Agrícola del CIIDIR-Sinaloa, se llevó a cabo el estudio del efecto de la

micorrización con Glomus intraradices en la tolerancia al moho blanco causado por

Sclerotinia sclerotiorum en tres variedades de frijol por Mora-Romero (2008). Los

resultados obtenidos muestran una tolerancia inducida por micorrización con G.

intraradices a S. sclerotiorum en dos de las tres variedades probadas.


En el presente trabajo de tesis de maestría se planteó realizar un análisis proteómico

comparativo entre plantas de frijol colonizadas y no colonizadas con el hongo G.

intraradices. Este estudio permitirá sentar las bases para el entendimiento del mecanismo

molecular de la comunicación sistémica que se desencadena en una planta de frijol cuando

es colonizada con un hongo micorrízico y con ésto entender el mecanismo de tolerancia

inducida por micorrización en respuesta al ataque por patógenos.


II. ANTECEDENTES

2.1. El frijol

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una planta anual, herbácea, intensamente

cultivada desde zonas tropicales hasta templadas. Se le conoce con diferentes nombres:

poroto, haricot, caraota, judía, aluvia, habichuela y otros. El frijol es una de las especies de

la familia de las leguminosas más producidas y consumidas a nivel mundial, el grano

presenta alto contenido de proteínas, vitaminas y minerales para la dieta del humano

(Broughton et al., 2003). En México, en el año agrícola 2009, se sembraron

aproximadamente un millón 676 mil ha del cultivo de frijol, ocupando el tercer lugar en

superficie sembrada, después del sorgo y del maíz (SAGARPA, 2009). La producción de

frijol en nuestro país empezó en el año de 1943, con la primera colecta de germoplasma

nativo, mismo que ha sido recombinado con germoplasma exótico, razón por la cual existen

cultivares muy diversos, tanto por características agroecológicas como por demanda de

consumo (Rosales-Serna et al., 2005). De 1943 al 2000, el Instituto Nacional de

Investigación Forestal, Agrícola y Pecuaria (INIFAP) liberó 120 variedades mejoradas

(Rosales-Serna et al., 2003, 2004).

En cuanto a las variedades utilizadas para el presente trabajo, existe también

variabilidad entre ellas.

2.1.1. Azufrado Higuera

Azufrado Higuera (CCZT 10163) es producto de la cruza entre Canario DIVEX

8130 y Royal Red, realizada en 1981, en el Centro Internacional de Agricultura Tropical

(CIAT), a través del programa de intercambio de germoplasma y cruzas entre INIFAP y el

CIAT; este material fue introducido en 1982 al Campo Agrícola Experimental Valle del

Fuerte (Salinas-Pérez et al., 1995). Bajo las condiciones del Valle del Fuerte se hicieron

selecciones en forma individual y masiva hasta la sexta generación filial (F6), siendo su

nomenclatura CCZT 10163-4-2-CB-(10)-M-M. Azufrado Higuera adquirió de Canario-

Divex 8130 (originario del Perú), su ciclo vegetativo intermedio, adaptación y color de

grano amarillo intenso; mientras que de Royal Red (originario de EUA) su hábito de

crecimiento determinado arbustivo tipo I, tolerancia a virosis, tamaño y uniformidad de


color de grano, con un peso de cien semillas que varía de 43.5 a 55.3 gramos, propiedad por

la cual se distingue de las demás variedades dentro de su clase comercial (Salinas-Pérez et

al., 1998). En cuanto a su capacidad de rendimiento, esta variedad ha rendido desde 2,500 a

3,300 kg ha-1. Azufrado Higuera manifiesta sus más altos rendimientos en el Norte de

Sinaloa, con una alta calidad de grano, propiedades por las cuales se distingue dentro de las

demás variedades dentro de su calidad comercial e inclusive ha penetrado en el mercado de

exportación generando una alta demanda tanto en el mercado interno como exterior. Esta

variedad es resistente a royas, tolerante a virus, pero susceptible al moho blanco causado

por S. sclerotiorum, sin embargo puede escapar a la enfermedad por su hábito de

crecimiento el cual no es rastrero (Salinas-Pérez y Rodríguez-Cota, 2008).

2.1.2. Azufrado Regional 87

Azufrado Regional 87 nomenclatura II 8 Fr Mo-5-3-M-M y registro FRI-043-

150228, es un cultivar logrado por la cruza entre Canario 101 y Azufrado 200, realizada en

el Campo Experimental del Valle del Fuerte (INIFAP-CEVAF) durante el ciclo otoño –

invierno 1979-80, seleccionándose hasta F6, adquiriendo de canario 101 su ciclo vegetativo

precoz, amplia adaptación y potencial de rendimiento, mientras que de Azufrado 200 su

hábito de crecimiento arbustivo tipo I, tolerante a virosis y tipo de grano amarillo claro

(azufrado). Su peso promedio es de 34.2 g por 100 semillas, con un rendimiento promedio

observado de 2,400 kg ha-1. Azufrado Regional 87 fue liberado en 1988, es resistente a

roya, tolerante a virosis, susceptible a la antracnosis, tizón común y al moho blanco aunque

puede escapar a esta enfermedad debido a su hábito de crecimiento determinado semierecto

(Salinas-Pérez et al., 1989).

2.2. Interacciones planta-microorganismo en la rizosfera

La rizosfera es el volumen de suelo que está influenciado directamente por las raíces

de las plantas, las cuales liberan gran cantidad de exudados y producen una estimulación

muy significativa en la actividad y densidad microbiana (citado en Gamalero et al., 2004).

Los microorganismos interaccionan de diferente manera con las plantas; en algunos casos

actuando como patógenos, y en otros estableciendo interacciones mutualistas, es decir

beneficiosas para ambos. Dentro de las interacciones planta-microorganismo benéficas se


encuentran la simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno y la simbiosis MA (Deguchi et

al., 2007). Los principales nutrientes que aportan estos microorganismos simbióticos a la

planta huésped son los macronutrientes fósforo (P) y en menor medida nitrógeno (N). Esta

simbiosis tiene una influencia importante en la fisiología de la planta e incluso en la

función del ecosistema.

2.2.1. Micorrizas

La palabra micorriza proviene del griego “myco”, hongo y “rhiza”, raíz; y

literalmente puede traducirse como “raíz fungosa”. El término fue utilizado por primera vez

en 1985 para describir la simbiosis entre raíces de las plantas y los hongos del suelo

(Munyanziza et al., 1997). Existen dos tipos de micorrizas, las ectomicorrizas, en las que el

tejido fúngico micelial coloniza la raíz de la planta de manera extracelular y las

endomicorrizas o micorrizas arbusculares, en donde las hifas que invaden el tejido radical

penetran las células de la raíz para establecer una simbiosis intracelular (Bonfante, 2003;

Peterson et al., 2004).

La micorriza arbuscular (MA) es una simbiosis que se presenta entre un grupo de

hongos y las raíces de las plantas. Estos hongos pertenecen a un filo nuevo, descrito de

manera independiente: el Glomeromycota (Schuessler et al., 2001). Hasta ahora se

encuentran clasificados en cuatro subórdenes: Archaeosporales, Paraglomerales,

Diversisporales y Glomerales. Ocho géneros de HMA han sido reconocidos basados

principalmente en características morfológicas de esporas asexuales. Estos géneros,

Glomus, Paraglomus, Sclerocystis, Scutellospora, Gigaspora, Acaulospora, Archaeospora

y Entrophospora incluyen aproximadamente 150 especies (Peterson et al., 2004). Sólo

algunas familias de las plantas superiores no son capaces de formar este tipo de asociación,

tales como miembros de la familia Brassicaceae, Caryophyllaceae, Urticaceae y

Amaranthaceae (Bouwmeester et al., 2007). Trabajos realizados en el Laboratorio de

Ecología Molecular del CIIDIR-Sinaloa indican que ciertas especies de la familia

Amaranthaceae se han encontrado colonizadas con HMA (Maldonado-Mendoza,

comunicación personal).

Los registros fósiles más antiguos indican que dicha simbiosis tiene más de 460

millones de años, lo cual los ubica en el período Devónico. Esto ha llevado a considerar la


compleja coevolución de las plantas y estos hongos asociados como un mecanismo para

que las plantas acuáticas hayan podido colonizar el ambiente terrestre. Esta asociación tan

antigua se manifiesta en la amplia distribución de la simbiosis pues se estima que hasta el

80% de las plantas terrestres pueden asociarse con HMA.

Las micorrizas arbusculares constituyen una asociación que se forma con la mayoría

de las especies de plantas de interés agrícola. Durante la simbiosis, la planta hospedera

recibe nutrientes minerales del suelo tomados por el hongo (principalmente fósforo),

mientras que éste obtiene compuestos de carbono derivados de la fotosíntesis (Brundrett et

al., 1996). Esta simbiosis se considera de tipo mutualista, en la cual el hongo es un

simbionte de tipo obligado, es decir que no puede completar su ciclo de vida sin la planta y

requiere siempre asociarse a ella para completar su ciclo de vida. Esto implica que no puede

ser cultivado in vitro de manera pura, siempre debe estar asociado a algún hospedero

vegetal.

El proceso de formación de la simbiosis MA comienza cuando la raíz secreta

algunas sustancias que promueven la germinación de las esporas del hongo en el suelo. Las

hifas que forman el micelio crecen hasta encontrar el área de la rizosfera de una planta

hospedera. Cuando la hifa alcanza la epidermis de la raíz se forma una estructura de anclaje

denominada apresorio. A partir de éste, la hifa empieza a crecer penetrando las células de la

epidermis de la raíz hasta alcanzar las células corticales internas. En estas células, el

extremo distal de las hifas es invaginado dentro de la célula vegetal cortical sin causar la

ruptura de la membrana vegetal. Posteriormente se ramifica abundantemente para formar

unas estructuras denominadas arbúsculos, que son las estructuras donde se realiza el

intercambio de nutrientes entre el hongo y la planta. Los arbúsculos están envueltos por

membranas de origen vegetal y fúngica denominada por el espacio peri-arbuscular. La

transferencia de nutrientes entre los simbiontes se lleva a cabo en los arbúsculos y

particularmente a través de la membrana peri-arbuscular vegetal (Peterson et al., 2004;

Harrison, 2005). Dentro de la raíz colonizada, en el micelio interno, algunos hongos

micorrízicos forman vesículas, las cuales son estructuras que contienen reservas lipídicas,

que le sirven al hongo para responder a la falta de nutrientes si la planta es de ciclo anual o

al final de su ciclo de vida usando toda esa energía acumulada para la producción de

esporas. Estos hongos además forman una red micelial externa en donde se encuentran


hifas especializadas en la absorción de nutrientes en el suelo. Es en el micelio externo

donde la mayoría de las especies forman esporas asexuales las cuales son estructuras de

reproducción y de resistencia. A la fecha, no se ha demostrado la existencia de fases

sexuales en estos organismos.

Actualmente son bien conocidos los efectos beneficiosos de las MA, las

investigaciones muestran que los HMA dirigen la diversidad y productividad de sus plantas

hospederas en diferentes ecosistemas. Uno de los principales beneficios comprende la

mayor absorción de elementos poco móviles en el suelo como el fósforo, cobre y zinc por

parte de las plantas colonizadas por HMA en comparación con las no colonizadas (Smith y

Read, 1997). A cambio de recibir algunos nutrientes minerales, la planta le brinda al hongo

una fuente de carbono en forma de glucosa y otros carbohidratos de tipo hexosa, para que

este pueda desarrollarse y completar su ciclo de vida. El fósforo es el nutrimento mejor

estudiado en esta asociación, ya que es el más importante para que esta asociación se lleve

a cabo. Junto con el nitrógeno, es de los nutrientes que la planta requiere en mayores

cantidades. Concentraciones bajas de fósforo favorecen la asociación micorrízica

arbuscular, en cambio concentraciones elevadas del mismo en el suelo pueden inhibir la

formación de la asociación. El hongo capta fósforo en forma de fosfato, que es la manera

asimilable del fósforo para la planta en el suelo, lo acumula en su micelio, lo transporta y

transloca a la planta. Recientemente también se encontró que los HMA también podrían

participar mejorando el metabolismo de nitrógeno en la planta (Leigh et al., 2009). Gracias

al uso más eficiente que hacen las plantas colonizadas con HMA de los nutrientes del suelo,

permiten disminuir el uso de fertilizantes químicos y reducir por consiguiente los

problemas de contaminación que el uso excesivo de fertilizantes conlleva. Por otra parte,

las plantas colonizadas con HMA son capaces de hacer un mejor uso de los fertilizantes

orgánicos, bien sea debido a la producción de fosfatasas por parte de los mismos hongos, lo

cual hace biodisponible el fósforo presente en el suelo (Dodd et al., 1987; Joner y Johansen,

2000), o bien gracias a la asociación existente entre las hifas de los HMA y los

microorganismos que participan en la mineralización de la materia orgánica (Azcón-

Aguilar y Barea, 1992). También son conocidos los efectos de las MA en la formación de la

estructura del suelo, a través de su papel en la constitución de agregados de suelo estables

al agua, en los que el micelio externo de los HMA tiene una notable participación (Miller y


Jastrow, 2000). Esto se logra a través de la producción de una glicoproteína llamada

glomalina, la cual por sus características químicas favorece la agregación de las partículas

de suelo (Rillig, 2004).

A pesar de que existe una gran información sobre esta simbiosis, aún se desconocen

detalles sobre los mecanismos de adaptación de estos hongos, así como su relación con

otros microorganismos y aspectos fundamentales de su biología.

2.2.2. Bioprotección por hongos micorrízicos arbusculares

Los HMA tienen un impacto significativo en la salud y nutrición mineral del

fotobionte y aunque los mecanismos moleculares sean en gran parte desconocidos, ha sido

demostrado que los HMA pueden translocar el fosfato del suelo a la raíz de la planta (citado

en Maldonado-Mendoza et al., 2001). Las micorrizas constituyen una asociación

multifuncional con las plantas, cuyos beneficios van más allá de los aspectos nutricionales.

Además de las ventajas nutricionales que un hongo micorrízico arbuscular confiere a la

planta, existe evidencia en la literatura que indica que esta asociación aumenta la habilidad

del fotobionte para tolerar diferentes tipos de estrés tanto abióticos como bióticos (Pozo y

Azcón-Aguilar, 2007).

Los HMA protegen a las plantas del déficit hídrico (Ruiz-Lozano y Azcón, 1995) y

también existen diversos estudios sobre la bioprotección conferida por HMA a las plantas

ante el ataque de patógenos. El control biológico de patógenos agronómicamente

importantes ha sido consistentemente demostrado en muchos casos. Estos incluyen especies

de hongos patógenos del suelo como: Aphanomyces, Fusarium, Phytophthora, Pythium,

Rhizoctonia, Sclerotinia, Sclerotinium, Verticillium entre otras. Incluso el impacto de los

HMA como agentes de biocontrol ha sido demostrado también para especies de nemátodos

como Heterodera, Meloidogyne, Pratylenchus, y Radopholus. Sin embargo, la bioproteción

conferida por HMA no es efectiva para todos los hongos patógenos de plantas, y el nivel de

control biológico conferido por la colonización de HMA es específico de la especie de

planta y aislados específicos de HMA. La simbiosis MA puede mejorar la resistencia o

tolerancia del huésped para patógenos de raíz, aunque el grado de mejoramiento varía

(citado en Harrier y Watson, 2004).


La reducción de la enfermedad entre las plantas hospederas colonizadas por HMA

es el resultado de un complejo mecanismo de interacciones entre planta, patógeno y hongo

micorrízico. Por lo que distintos mecanismos alternativos han sido propuestos.

2.2.2.1. Posibles mecanismos de bioprotección

Se han propuesto algunos posibles mecanismos para explicar la bioprotección

conferida por HMA. Uno de ellos sugiere que la bioprotección se debe a una mejora del

estatus en los nutrientes minerales de la planta. El incremento en crecimiento de la planta,

seguido de la colonización de la raíz por HMA, es normalmente debido a una mejora del

estado de nutrición mineral de la planta. Dependiendo del aislado de hongo micorrízico y

de la planta huésped, la colonización del sistema radicular por HMA puede incrementar la

nutrición por fósforo y otros nutrientes minerales (Clark y Zeto, 2000). La susceptibilidad

de la planta huésped a infecciones por patógenos puede también ser influenciada por el

estado nutricional del huésped y el estado de fertilidad del suelo (Bødker et al., 1998). Sin

embargo, hay trabajos en donde la mejora de nutrientes en plantas colonizadas con HMA,

en particular fósforo no tiene un efecto en la bioprotección contra especies de patógenos

como S. sclerotiorum y X. campestris (Galindo-Flores, 2008; Mora-Romero, 2008). Por lo

tanto, la mejora por nutrición mineral en simbiosis micorrízica no aclara la bioprotección

conferida por HMA a sus plantas hospederas (Harrier y Watson, 2004). La alteración en la

morfología del sistema radicular de las plantas por la colonización de HMA es otro

mecanismo propuesto. Sin embargo, Norman et al. (1996) demostró que la alteración

inducida con un HMA a la estructura de la raíz en plantas de fresa no se encontró

directamente involucrada en la bioprotección contra Phytophthora fragariae Hickman. La

relación entre la colonización con el HMA y el tiempo de vida de la raíz es dependiente de

la especie, y pocos resultados han sido publicados. Hodge et al. (2000) trabajando en

Plantago lanceolata L. encontraron que el tiempo de vida de la raíz no es afectada por la

inoculación con HMA. Black (1997) observó que el tiempo de vida de la raíz de trébol

(Trifolium repens L.) se incrementa cuando las raíces fueron colonizadas con un HMA.

Cualquier cambio en la longevidad de la raíz resultante de la colonización por HMA puede

estar vinculado a los cambios en la morfología de la raíz como se describe anteriormente.

Cuando los HMA colonizan el sistema radicular de la planta se observan cambios


morfológicos, así como también un aumento en la lignificación de pared celular de la planta

huésped como resultado de la elevación del metabolismo fenólico, traduciéndose en un

incremento en la bioprotección contra patógenos. Otro mecanismo comprende la

competencia por sitios de colonización e infección por los HMA en relación a los hongos

patógenos del suelo y nemátodos parásitos de plantas que ocupan los mismos sitios en la

raíz y por lo tanto compiten directamente desde el punto de vista espacial cuando la

colonización está ocurriendo al mismo tiempo (Smith, 1988). Aunque los HMA y

patógenos colonicen al mismo tejido huésped, comúnmente se desarrollan dentro de

diferentes células de la raíz, indicando la competencia por espacio (Azcón-Aguilar y Barea,

1996). El número de sitios de infección en un sistema de raíces particular determinará el

alcance del ingreso del patógeno. Vigo et al. (2000) reportaron que el número de sitios de

infección se reduce en los sistemas de raíces colonizadas por HMA y que la colonización

por el HMA no tiene efecto perceptible sobre la propagación de la necrosis. Esto sugiere

que el número de sitios de colonización del HMA es importante para infecciones

subsecuentes por patógenos. Un mecanismo adicional podría involucrar modificaciones de

las poblaciones microbianas del suelo. Las plantas colonizadas por HMA difieren de las no

colonizadas en la composición de la comunidad microbiana de la rizosfera. El número de

bacterias anaerobias facultativas como Pseudomonas fluorescens y diferentes especies de

Streptomyces varían dependiendo de la interacción entre la planta hospedera y el HMA

específico (Marschner et al., 1997). El establecimiento de la comunidad de la rizosfera

altamente específica puede tener un impacto importante en el subsecuente establecimiento

de organismos patogénos de plantas.

Aunque la colonización micorrízica se considera normalmente como benéfica para

la planta, la reacción de la planta puede ser positiva o negativa, dependiendo de parámetros

genéticos y ambientales (Taylor y Harrier, 2001).

Uno de los mecanismos más importantes que se ha propuesto es el de la activación

de respuestas de defensa de la planta por HMA. Varios genes y productos de las enzimas

correspondientes, tales como metabolitos involucrados en respuestas de defensa en plantas

han sido ampliamente estudiados en la simbiosis MA y han mostrado ser expresados parcial

y temporalmente. Esto incluye fitoalexinas, deposición de callosa, glicoproteínas ricas en

hidroxiprolina, fenoles, peroxidasas, quitinasas, β-1-3 glucanasas y proteínas PR


relacionadas a patogénesis (citado en Harrier y Watson, 2004). La bioprotección conferida

por HMA en sistemas de raíces de plantas hospederas, es tanto localizada como sistémica.

El establecimiento de la simbiosis MA puede predisponer a la planta a responder más

rápidamente al ataque de patógenos. Cordier et al. (1998) y Pozo et al. (2002) demostraron

que la resistencia inducida contra el patógeno Phytophthora parasitica en raíces

colonizadas con HMA de tomate se debió a respuestas de defensa localizadas en células

conteniendo arbúsculos y respuestas de defensa sistémica en raíz en sitios tanto colonizados

como sitios no colonizados.

Existe evidencia experimental que la asociación MA confiere bioprotección contra

fitopatógenos de raíz. Los HMA tienen la habilidad de inducir resistencia sistémica contra

nemátodos en raíz. La presencia de G. intraradices ejerce un efecto protector contra

Radopholus similis y Prathylenchus coffea en plantas colonizadas de plátano (Musa sp.) y

en raíces transformadas de zanahoria afectando negativamente la reproducción de P.

coffeae (Elsen et al., 2003; 2008).

También, se ha reportado que esta asociación simbiótica induce resistencia contra

patógenos de parte aérea. Existen genes que se expresan de manera diferencial en la parte

aérea de plantas de Medicago truncatula colonizadas con el HMA G. intraradices y no

colonizadas. El análisis de los perfiles de transcripción indican la inducción sistémica de

genes involucrados con mecanismos de respuesta a estrés o patógenos en planta, además de

la disminución significativa de unidades formadoras de colonias de plantas de M.

trúncatula colonizadas con G. intraradices y retadas con el patógeno foliar Xanthomonas

campestris; lo cual sugiere que las plantas micorrizadas pueden mejorar la resistencia a

enfermedades (Liu et al., 2007). En un estudio posterior de la interacción entre el HMA G.

intraradices y el patógeno foliar X. campestris en plantas de tomate, se obtuvieron

resultados que muestran una inducción de tolerancia por micorrización contra mancha

bacteriana, esto comparado con plantas no micorrizadas (Galindo-Flores, 2008).

La bioprotección de plantas colonizadas con HMA es el resultado de complejas

interacciones entre la planta, el patógeno y el HMA. Hay numerosos mecanismos

propuestos para conferir esta bioprotección, pero se ha sugerido que la bioprotección

efectiva es el resultado acumulativo de todos estos mecanismos trabajando separadamente,

y/o juntos (Harrier y Watson, 2004). El desafío para desarrollar más sistemas de producción


sustentables en el futuro incluye obtener un mejor entendimiento de los mecanismos

involucrados en las interacciones planta hongo y patógeno y los factores del ambiente que

en conjunto dictan la escala y tiempo de su expresión. Más aún, el entendimiento de estas

interacciones permitirá un mejor empleo como biocontrol de los HMA.

2.2.2.2. Bioprotección por hongos micorrízicos arbusculares en frijol

Mora-Romero (2008) reportó un estudio del efecto de la micorrización con G.

intraradices en la bioprotección de las variedades de frijol (P. vulgaris) A-55, Az. Regional

87 y Az. Higuera contra S. sclerotiorum. Ensayos en hojas desprendidas y en planta

completa demostraron que la respuesta de bioprotección por la colonización de frijol con

HMA depende de la variedad de frijol estudiada. Las variedades de frijol Az. Regional 87 y

A-55 mostraron mayor tolerancia al patógeno en plantas colonizadas con G. intraradices

que en plantas no colonizadas. Sin embargo, no se observó la misma respuesta en la

variedad Az. Higuera.

La tolerancia de las plantas de frijol de las tres variedades se evaluó primero

comparando el comportamiento de los tejidos de las plantas de frijol ante S. sclerotiorum

bajo condiciones de no micorrización, donde no se observaron diferencias significativas en

respuesta al patógeno. Las tres variedades de frijol probadas resultaron susceptibles a S.

sclerotiorum bajo esta condición. A la fecha, no existen reportes de variedades de frijol

resistentes a S. sclerotiorum, lo cual podría deberse al hecho de que los programas de

mejoramiento genético de variedades no consideran las condiciones de micorrización.

Al comparar la respuesta de una variedad colonizada con G. intraradices y no

colonizada se observó que las lesiones ocasionadas por S. sclerotiorum fueron menores en

las variedades Az. Regional 87 y A-55 sin embargo la variedad Az. Higuera no mostró

inducción de tolerancia. Es posible que el programa de mejoramiento para la obtención de

esta variedad, se enfocara en aspectos de rendimiento y alta calidad de grano y tal vez la

inducción de tolerancia de esta variedad por micorrización se haya perdido durante el

proceso de mejoramiento. La no inducción de tolerancia de Az. Higuera también podría

relacionarse al bajo porcentaje de colonización obtenido para esta variedad en planta

completa (23%). Puede ser posible que exista un nivel mínimo requerido de colonización

para que se presente la tolerancia y que dependa de la variedad. Sin embargo, no existen


reportes que sustenten si la bioprotección sistémica contra S. sclerotiorum depende del

grado de colonización con HMA o si es suficiente un porcentaje mínimo de colonización

para encender el mecanismo de bioprotección (Mora-Romero, 2008).

Es por esto, que experimentos posteriores resultan necesarios para entender el

mecanismo de bioprotección que se induce por micorrización. La expresión diferencial de

proteínas en las variedades Az. Regional 87 (tolerante) y Az. Higuera (susceptible); las

cuales responden de diferente manera al ataque de S. sclerotiorum cuando están

colonizadas con HMA, nos permitirá visualizar proteínas posiblemente involucradas con

el mecanismo de bioprotección por HMA. Si aprendemos en que consiste el mecanismo,

podremos entender mejor sus implicaciones en el mejoramiento genético para buscar la

resistencia a S. sclerotiorum en un cultivo tan importante en nuestro país, como lo es el

frijol.

2.3. Glomus intraradices

El HMA G. intraradices es una especie cosmopolita que se ha utilizado en muchos

estudios de micorrizas arbusculares. G. intraradices forma esporas redondeadas (entre 40 y

190 µm de diámetro) en el interior de las raíces de la planta hospedadora. La pared es de

tipo amorfo y reacciona con el reactivo de Melzer, presentando una capa externa

evanescente y una o dos capas internas laminadas de color más oscuro. El grosor de la

pared varía entre 3 y 15 µm y se extiende hacia el pedúnculo de la espora en forma de tubo.

El color de la espora puede variar desde amarillo hasta marrón claro. A pesar de que las

esporas de G. intraradices se forman en el interior de la raíz, pueden encontrarse también

grupos de esporas en el suelo, provenientes de la disgregación de una raíz (Schenck y

Smith, 1982) o formadas en el micelio externo.

2.4. Proteómica

La mayoría de las funciones biológicas que ocurren en los organismos vivos son

mediadas por proteínas. El proteoma es modificado en función de factores bióticos y

abióticos, entre algunos se pueden mencionar estados de enfermedades o de desarrollo,

daños por insectos, tipos de células y tejidos, estrés ambiental y condiciones de suelo,

etcétera (Chinnasamy, 2005). De aquí la necesidad de un área enfocada en el estudio


funcional de las proteínas como lo es la proteómica, término sugerido por Marc Wilkins, en

1994. La proteómica es definida como el análisis sistemático y la documentación de todas

las especies de proteínas y sus modificaciones post-traduccionales en un organismo, tejido,

célula u organelo a un tiempo o condición específica de desarrollo o crecimiento dado

(Rose et al., 2004; Chinnasamy, 2005; Chen y Harmon, 2006).

El desarrollo de las ciencias denominadas “omicas” como es el caso de la

proteómica ha permitido su aplicación al entendimiento de distintas problemáticas actuales,

incluyendo las concernientes a la agricultura, entre las que se encuentra la interacción

planta-microorganismo.

El objetivo de la proteómica comparativa no es el de identificar el conjunto entero

de proteínas en una muestra en particular, sino de caracterizar diferencias entre poblaciones

de proteínas diferentes (Figura 1) (Rose et al., 2004). Tradicionalmente, la proteómica se

basa en la combinación de electroforesis bidimensional (2D-SDS-PAGE) permitiendo la

separación de proteínas desnaturalizadas de acuerdo a su punto isoeléctrico (primera

dimensión) y peso molecular (segunda dimensión), y de métodos de identificación basados

en espectrometría de masas (Bestel-Corre et al., 2004).

2.4.1. Análisis de proteínas.

El análisis proteómico de los tejidos vegetales, son típicamente mas problemáticos

que con otros organismos ya que implica un número de desafíos prácticos. Además de

tener concentraciones bajas de proteínas, los tejidos vegetales son a menudo ricos en

proteasas y en materiales que interfieren seriamente con la separación y análisis

multifactorial de la proteína, incluyendo pared celular y almacenamiento de polisacáridos,

lípidos, compuestos fenólicos y una amplia variedad de metabolitos secundarios (Granier,

1988; Tsugita y Kamo, 1999). Tales contaminantes son un problema particular para la

electroforesis bidimensional (2D-SDS-PAGE), dando por resultado en los geles después de

la electroforesis rayas horizontales (que las proteínas no se logren separar en base a su

punto isoelétrico) y verticales (que las proteínas no se logren separar en base a su peso

molecular), manchas y una reducción en el número de puntos resueltos de la proteína.


Extracción de proteínas

Separación en2D SDS-PAGE

Generación de péptidos

Hidrólisis con

Tripsina

Espectrometría de masas

Huella peptídica(Peptide mass fingerprinting)

Etiqueta peptídica(Secuencia de aminoácidos)

Relación masa/carga (m/z)

Inte

nsid

ad re

lativ

a %

Figura 1. Esquema de los diferentes pasos involucrados en un análisis de

proteómica comparativa.


La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-SDS-PAGE) es una

herramienta muy utilizada en proteómica para la separación y cuantificación de proteínas.

La identificación de proteínas de manera rápida y masiva es factible debido a los avances

en espectrometría de masas. MALDI–TOF–MS (por sus siglas en inglés, Matrix-Assisted

Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) y LC–MS/MS (por sus

siglas en inglés, Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Electrospray) son

métodos sensibles y precisos para caracterizar e identificar perfiles de proteínas. Junto con

la técnica de 2D–SDS-PAGE, estas herramientas se pueden utilizar para visualizar y

comparar mezclas complejas de proteínas, además de obtener información acerca de las

proteínas individuales implicadas en respuestas biológicas específicas (Adessi et al., 1997;

Finnie et al., 2002).

Recientemente, las metodologías en electroforesis 2D-SDS-PAGE han tenido

avances; mediante el desarrollo de protocolos para el procesamiento de muestras y del uso

de tiras de gel de gradiente de pH inmovilizado para llevar a cabo el isoelectroenfoque

(IEF, separación de proteínas por su punto isoeléctrico) de las proteínas. Estos avances han

permitido obtener proteínas separadas en cantidades micropreparativas para su

caracterización e identificación mediante espectrometría de masas y el análisis cuantitativo

de proteínas expresadas diferencialmente. Sin embargo, el aislamiento de proteínas sigue

siendo un reto respecto a la resolución en el análisis exacto de proteínas. Lo anterior debido

a la presencia de contaminantes que afectan el rendimiento en la 2D-SDS-PAGE. La

extracción de proteínas de tejidos vegetales puede ser particularmente un desafío debido a

la alta relación carbohidratos/proteínas en la mayoría de los tejidos vegetales (Thelen,

2007). Aunque varios métodos de análisis por 2D-SDS-PAGE de plantas y semillas han

sido reportados para una variedad de cultivos, no existen reportes en tejidos de plantas de

frijol. La mayoría de los estudios de proteómica en tejidos vegetales, utilizan una

estrategia básica de la precipitación de la proteína con ácido tricloroacético (TCA) y

acetona seguidos por la resolubilización en un amortiguador específico para el

isoelectroenfoque (IEF) que contiene agentes caotrópicos (urea, tiourea) y detergentes [3-

(cloroamido propil)-dimetilamonio-1-propanosulfato (CHAPS), Tritón X-100] (Santoni y

Bellini, 1994). Bajo la anterior estrategia se aumenta la concentración de la proteína y se

ayuda a remover los contaminantes, aunque algunos contaminantes poliméricos son


coextraídos a menudo. Esto es un problema particular con los tejidos que son ricos en

compuestos tales como polisacáridos y polifenoles solubles de la pared celular

(Saravanan y Rose, 2004).

Se ha desarrollado un protocolo alternativo con el cual las proteínas se solubilizan

en solución saturada de fenol, con o sin el detergente aniónico dodecil sulfato de sodio

(SDS); y se precipitan posteriormente con acetato de amonio y metanol, seguida por la

resolubilización en el amortiguador para IEF (Hurkman y Tanaka, 1986; Meyer et al.,

1988). Este método ha mostrado su eficacia para la obtención de proteínas con la

contaminación mínima, se ha utilizado para extraer las proteínas de las hojas verdes de

plantas de olivo, que contienen grandes cantidades de polifenoles, dando por resultado un

aumento substancial en la calidad de las proteínas resueltas mediante 2D-SDS-PAGE

(Wang et al., 2003). Estos dos protocolos se han utilizado en estudios proteómicos de un

número de diversas especies y tejidos de planta. Sin embargo, la compatibilidad de éstos

con la 2D-SDS-PAGE depende de la muestra analizada.

Debido a que la mayoría de los estudios de proteómica publicados de tejidos

vegetales, utilizan un procedimiento en el cual las proteínas se precipitan con TCA y

acetona, o bien un método basado en la solubilización de proteínas con soluciones saturadas

de fenol, Saravanan y Rose (2004) reportaron los resultados de poner en contraste estas

estrategias de una manera sistemática con métodos alternativos contra distintos tejidos

vegetales. Para tratar esto, el protocolo basado en método de fenol propuesto por Hurkman

y Tanaka (1986) fue combinado con un protocolo basado en precipitación con TCA

propuesto por Santoni y Bellini (1994) para proteínas de tejidos de tomate. Sus resultados

muestran que el método de extracción con fenol dio un mayor rendimiento y una mayor

intensidad y resolución de proteínas (spots en el gel) en 2D-SDS-PAGE, particularmente

con los extractos de los tejidos que contenían niveles de polisacáridos solubles. Los

diferentes métodos también generaron diferencias notables en los patrones de spots de

proteínas en geles de electroforesis bidimensionales. La estrategia de espectrometría de

huella de masa péptidica (peptide mass fingerprinting) fue utilizada para identificar los

polipéptidos que eran comunes a los múltiples métodos de extracción evaluados o que

estaban presentes únicamente en un método. Los autores sugieren que el protocolo de

solubilización con fenol es altamente eficaz con tejidos más recalcitrantes y que una


combinación de métodos de TCA y de fenol es mejor en 2D-SDS-PAGE en base al análisis

proteómico de la mayoría de los tejidos vegetales evaluados (raíces, tallos, hojas y flores de

tomate; tejido de aguacate, banana y naranja).

Sarma et al. (2008) publicaron un método de extracción con fenol modificado, este

método no solo mejoró la resolución y reproducibilidad de 2D-SDS-PAGE sino también

acortó el tiempo de análisis. La aplicabilidad del método fue demostrada usando varios

tejidos de soya. La precipitación se llevó a cabo por fenol alcalino y acetato de

amonio/metanol durante 2 a 3 horas a -80°C, se usó etanol para el lavado final de la

proteína precipitada. El reactivo ditiotreitol (DTT) fue usado en todas las soluciones desde

el principio, mejorando considerablemente la solubilidad de las proteínas precipitadas. La

solubilización fue mejorada más a fondo mediante el uso de una mezcla de detergentes y

desnaturalizantes en altas concentraciones junto con grandes cantidades de DTT en el

amortiguador IEF.

En el caso de los geles bidimensionales (2D-SDS-PAGE), la identificación de las

proteínas o manchas conduce a la creación de mapas de referencia, que definen las

proteínas expresadas por un organismo o tejidos en condiciones determinadas. Las

proteínas pueden ser identificadas por diversos procedimientos, entre los que se incluyen

la secuenciación del extremo N-terminal, detección con anticuerpos específicos,

composición de aminoácidos, o co-migración con proteínas conocidas. Debido a su

rapidez y elevada sensibilidad, la espectrometría de masas se ha convertido en el método

de detección para la identificación de proteínas a gran escala y el primer paso para el

estudio del proteoma de distintos organismos. También permite la caracterización de

modificaciones post-traduccionales que presentan relevancia fisiológica, tales como

glicosilación y fosforilación. El análisis de las proteínas mediante espectrometría de

masas ha sido posible gracias al desarrollo de varios métodos de ionización suave para

convertir biomoléculas grandes, polares y no volátiles en iones en fase gaseosa. Los

espectrómetros de masa están formados al menos por una fuente de iones, un analizador

de masas y un detector que mide la relación masa/carga (m/z) de los iones en fase

gaseosa.

Los espectrómetros de masas tienen en común que miden la relación m/z de iones

gaseosos haciendo uso de campos eléctricos y/o magnéticos. La medida exacta de este valor


para las moléculas gaseosas ionizadas del analito (ion molecular) dará información sobre su

masa molar (peso molecular). Si además se induce la fragmentación del ión molecular, cada

fragmento iónico será detectado con su propio valor de m/z (McLafferty et al., 1993). El

conjunto de fragmentos formados es característico de cada analito y depende de su

estructura química (“huella dactilar”). Por lo tanto, del análisis de los fragmentos obtenidos

se obtiene información sobre la estructura química del analito en cuestión, en nuestro caso

de interés, la identificación de proteínas.

2.5. Resistencia sistémica

Las plantas son expuestas a muchas formas de estrés, como el ataque de herbívoros

y patógenos, o condiciones adversas a luz, agua, temperatura, nutrientes o sales. La

percepción de señales de estrés seguido resulta en la biosíntesis de una o más moléculas de

señalización secundaria como jasmonatos, etileno y acido salicílico. La producción de estas

hormonas genera una transducción de señales que lleva a una cascada de eventos para la

adaptación fisiológica de la planta a condiciones de estrés (citado en Memelink, 2009).

La resistencia sistémica es un “estado fisiológico de aumento de la capacidad

defensiva“, inducido por estímulos ambientales específicos, donde las defensas

constitutivas de la planta son potenciadas contra subsecuentes desafíos bióticos. Este

aumento del estado de resistencia es efectivo contra un amplio rango de patógenos y

parásitos, incluyendo hongos, bacterias, virus, nemátodos, y hasta insectos herbívoros

(Vallad y Goodman, 2004; Chinnasamy, 2005; Walters y Heil, 2007).

Las dos formas más claras y definidas de resistencia sistémica son resistencia

sistémica adquirida (RSA) y resistencia sistémica inducida (RSI), las cuales pueden ser

diferenciadas con base en la naturaleza del inductor de la resistencia y la vía de regulación

involucrada.

2.5.1. Resistencia sistémica adquirida (RSA)

Es producida en plantas después de la expresión de la respuesta hipersensible, es

decir, después de que el tejido vegetal al ser atacado de manera local por un patógeno

desata una serie de mecanismos locales, incluyendo la producción de especies reactivas de

oxígeno, que causan inclusive la muerte celular programada, para contener el ataque de un


patógeno. Como respuesta a esta infección local, la planta responde con una cascada de

señales dependientes de ácido salicílico, el cual se acumula inicialmente en el sitio mismo

de la infección. Posteriormente, un compuesto de origen desconocido se mueve en el

floema y transporta la señal a lugares distales de la planta. Entonces, el ácido salicílico se

acumula en la región distal y es convertido a metil salicilato el cual puede servir como una

señal a plantas vecinas. Proteínas con actividades antimicrobianas tales como β-1,3-

glucanasa, quitinasas, proteínas ricas en cisteína y proteínas PR (proteínas relacionadas a

patogénesis) aparecen en la porción distal de la planta y seguramente participan en la

resistencia sistémica ante ataques de patógenos posteriores (Vallad y Goodman, 2004).

La RSA se asocia con un aumento en los niveles de acido salicílico (AS), y se

caracteriza por la activación coordinada de un grupo de proteínas específico relacionados a

patogénesis (PR), muchas de las proteínas del grupo codifican para proteínas PR con

actividad antimicrobiana (Van Loon et al., 2006). Estudios con plantas mutantes y

transgénicas que son perjudicadas en la percepción del AS demostraron el papel central de

esta fitohormona en la RSA (Loake y Grant, 2007; Vlot et al., 2008). La proteína NPR1

(non-expressor of PR genes-1) es un importante co-activador transcripcional de expresión

de genes PR, una vez que ésta es activada por la acción de ácido salicílico (Dong, 2004).

Además de AS, la hormona gaseosa etileno se encuentra implicada en RSA.

Verberne et al. (2003) demostraron que la percepción de etileno se requiere para el inicio

de RSA, el cual es activado una vez infectado tabaco con el virus del mosaico de tabaco.

Además Truman et al. (2007) demostraron que el ácido jasmónico (AJ) juega un papel

importante en RSA en mutantes en la señalización de ácido jasmónico, al retar estas plantas

mutantes con una cepa virulenta de Pseudomonas syringae. Sin embargo, otras mutantes en

señalización de AJ mostraron una activación normal en los niveles de RSA (Attaran et al.,

2009; Cui et al., 2005; Pieterse et al., 1998; Ton et al., 2002). Por lo que el papel exacto

del AJ en RSA necesita aún ser definido en estudios posteriores (Citado en Van der Ent et

al., 2009).

2.5.2. Resistencia sistémica inducida (RSI)

La RSI se ha definido como un estado fisiológico identificado por el mejoramiento

de la capacidad de defensa a patógenos en respuesta a la interacción de un rango de


organismos no patogénicos y agentes de biocontrol. Las defensas innatas de la planta se

potencian contra el subsecuente ataque de patógenos y parásitos, incluyendo bacterias,

virus, hongos, nemátodos y hasta insectos herbívoros. La RSI es fenotípicamente similar a

la RSA, la cual es activada por un patógeno virulento, no virulento, algún microorganismo

no patogénico o de manera artificial por algún químico (Vallad y Goodman, 2004). A

diferencia de la RSA, la RSI no involucra la acumulación de proteínas relacionadas con

patógenos o AS (Pietersen et al., 1996) y en cambio, es regulada por AJ y etileno dos

grupos de fitoreguladores de naturaleza volátil.

La RSI es disparada por microorganismos benéficos y es efectiva contra diferentes

tipos de ataques, confiriendo una resistencia de amplio espectro. La fitohormona AJ y sus

derivados llamados jasmonatos son los reguladores de esta respuesta sistémica (Van der Ent

et al., 2009).

La RSI se produce por la interacción de la planta con algunas bacterias que

colonizan las raíces pero que no causan enfermedad. A estas bacterias se les denomina

bacterias promotoras de crecimiento o PGPR (por sus siglas en inglés, plant growth

promoting rhizobacteria). A diferencia de la RSA, la RSI no involucra la acumulación de

proteínas relacionadas a patogénesis (PR) o de AS. La interacción con PGPR induce la

síntesis de manera transitoria de AJ y etileno, los cuales, de alguna manera transportan una

señal a las zonas distales de la planta para encender un estado de protección (Vallad y

Goodman, 2004).

La activación de RSI en plantas micorrizadas pareciera involucrar una señal móvil

inducida por la micorriza. Sin embargo, poco se conoce sobre la señal concerniente a la

inducción de RSI posterior al establecimiento de la simbiosis (Hause y Fester, 2005). Sin

embargo, el AJ, el cual se ha encontrado que juega un papel importante para el

establecimiento de la simbiosis, podría ser un candidato apropiado, considerando su

participación en el movimiento a larga distancia en otros fenómenos, como en la respuesta

a daño mecánico (Noval et al., 2007).

La proteína NPR1 reguladora de defensa en RSA, también ha sido implicada en la

RSI (Dong, 2004; Pieterse y Van Loon, 2004). Mutantes en plantas del género Arabidopsis

mostraron bloqueada su habilidad para expresar RSI una vez colonizadas las raíces con

PGPR (Hossain et al., 2008; Stein et al., 2008; Segarra et al., 2009). Sin embargo, el papel


de la proteína NPR1 en RSI podría ser diferente que en RSA. Sin embargo, los mecanismos

moleculares por los que NPR1 ejerce su función no han sido delucidados (Van der Ent et

al., 2009).

2.5.3. Resistencia inducida por micorrización (RIM)

Se conoce muy poco de los mecanismos moleculares responsables de la RIM. Sin

embargo, se ha propuesto que comparte mecanismos con la resistencia sistémica inducida

por rizobacterias promotoras de crecimiento (Verhagen et al., 2004), la hipótesis

establecida dice que la simbiosis micorrízica dispara un estado de pre-acondicionamiento o

“priming” que actúa de manera sistémica a lo largo de toda la planta, no únicamente en los

tejidos en donde se lleva a cabo la interacción. Este pre-acondicionamiento enciende un

mecanismo de alerta que le permite a la planta tolerar de mejor manera un ataque por

patógenos foliares (Pozo y Azcón Aguilar, 2007).

Cuando una planta pre-acondicionada es atacada por herbívoros, patógenos, o bien,

sometida a estrés abiótico, ésta responde activando genes de defensa celular de una manera

más rápida e intensa que las plantas no preacondicionadas (Beckers y Conrath, 2007;

Goellner y Conrath, 2008).

A partir de estudios con rizobacterias promotoras de crecimiento, se ha hipotetizado

que el pre-acondicionamiento podría estar asociado con la acumulación de proteínas de

señalización en estado inactivo. Una vez que se lleva a cabo una exposición subsecuente al

ataque por un patógeno, un segundo evento de señalización podría activar las proteínas en

cuestión, amplificando de esta manera la señal y llevando a una activación del sistema de

defensa de una manera mucho más rápida e intensa (Beckers y Conrath, 2007). La

posibilidad de responder de manera más expedita a un ataque por patógenos sin la

necesidad de encender los mecanismos de defensa antes de enfrentarse al patógeno,

representaría una ventaja para la planta. Es posible que los mecanismos de pre-

acondicionamiento inducidos por rizobacterias y los inducidos por la micorrización

arbuscular compartan algunos de sus elementos.


2.6. Métodos de genómica y proteómica empleados en el estudio de la interacción

planta-microorganismo

En estudios recientes del proteoma de la raíz de M. truncatula después de la

infección con el patógeno Oomycete Aphanomyces euteiches, se identificaron proteínas que

se regulan después de la infección con dicho patógeno (Colditz et al., 2004). Dieciséis

proteínas fueron expresadas diferencialmente con respecto a la condición infectada con el

patógeno. La mayoría de las proteínas inducidas pertenecen a la familia de la clase 10 de

proteínas relacionadas a patogénesis (PR10). Tres de estas proteínas también fueron

inducidas por aplicación exógena de ácido abscisíco (ABA). Otras tres de estas

proteínas inducidas por el patógeno disminuyen su expresión en estrés por sequía. Esto

sugiere que las proteínas tipo PR10 desempeñan un papel fundamental durante las

adaptaciones de la raíz a diversas condiciones de estrés.

Un segundo estudio acerca del proteoma de la raíz de M. truncatula se llevó a cabo.

Como primer estrategia se analizaron mediante proteómica comparativa dos líneas de M.

truncatula las cuales muestran un aumento (línea F83.005-9) o disminución (línea F83.005-

5) a la susceptibilidad al patógeno A. euteiches comparadas con la línea A-17 (línea

susceptible) analizada anteriormente por Colditz et al. (2004). Varias proteínas fueron

identificadas como diferencialmente inducidas después de retadas con el patógeno

mostrando un aumento en su acumulación en la línea más resistente. Entre estas

proteínas, se identificaron dos subunidades del α-proteosoma, las cuales pudieran estar

implicadas en el mecanismo que lleva a un aumento de resistencia a la enfermedad.

Como segunda estrategia, la mejora de resistencia de la planta hacia A. euteiches fue

estudiado en la línea A-17 (línea susceptible) la cual mostró un efecto bioprotector de

simbiosis micorrízica preestablecida. Los análisis del proteoma revelaron la inducción

de patrones de proteínas similares a las encontradas en las accesiones de M. truncatula

con un nivel de resistencia alto a A. euteiches. Además, se analizaron plantas de M.

truncatula susceptibles al patógeno después de la aplicación exógena (ABA) antes de la

infección de la raíz. Los resultados mostraron niveles de expresión elevados del grupo

de proteínas relacionadas a patógenesis (PR10) las cuales fueron previamente

identificadas como reguladas después de la infección con A. euteiches. Estos resultados


sugieren un aumento de susceptibilidad a la infección causado por la aplicación de ABA

(Colditz et al., 2005).

Castillejo et al. (2004) en el estudio del proteoma de raíces de una línea tolerante y

una susceptible de plantas de chícharo (Pisum sativum) en la interacción con el parásito

jopo de las habas (Orobanche crenata) demostraron cambios en el perfil proteómico. En

respuesta a la inoculación, en la línea susceptible se obtuvieron 34 proteínas suprimidas en

su expresión, una con un aumento en su expresión y tres proteínas diferenciales de manera

cualitativa fueron inducidas. De este grupo de proteínas los autores lograron identificar

siete y correspondieron al metabolismo de los carbohidratos y a la ruta de transporte

electrónico mitocondrial. Estos incluyen una fructokinasa, una fructosa bifosfato aldolasa y

una ferredoxin-NADP reductasa, una enoyl-CoA hidratasa putativa y un precursor

mitocondrial de la oxidasa-2 alternativa. Para la línea resistente pocos cambios fueron

observados en respuesta a O. crenata. Quince proteínas aumentaron su expresión y tres

disminuyeron, una proteína cualitativa fue encontrada en el control sin infectar. Ocho

proteínas fueron identificadas. Estas incluyen dos glutamino sintetasas de raíz, la isovaleril-

CoA deshidrogenasa, tres precursores de peroxidasas 43 y dos precursores de glucan endo-

1,3-β-glucosidasa.

En el curso temporal de la interacción simbiótica en raíces de plantas de frijol

colonizadas con G. mosseae, cubriendo todos los estados de desarrollo de la simbiosis, se

detectaron cambios moderados en la expresión de genes relacionados con respuestas de

defensa en plantas, tales como quitinasa, β-1,3-glucanasa y fenilalanina amonio-liasa (PAL)

en comparación con plantas no colonizadas como control (Morh et al., 1998).

Algunos genes de respuesta y de la biosíntesis del AJ son expresados en células que

contienen arbúsculos. Además, las raíces colonizadas con HMA presentan un incremento

en el nivel de AJ endógeno (Hause et al., 2002; Hause et al., 2007), por lo que es posible

especular que el AJ pudiera funcionar como una señal endógena en la resistencia inducida

por micorrización. Otras hormonas como el ABA muestran la inducción o represión de

algunos genes en micorrizas arbusculares y pueden también afectar la resistencia de la

planta a elicitores (Hause et al., 2007).

Estudios a nivel de análisis transcripcional se han enfocado en describir genes que

se expresan de manera diferencial en plantas colonizadas con HMA frente a patógenos de


raíz con el objeto de generar información que permita elucidar los mecanismos de la

resistencia observada por micorrización (Salzer et al., 2000; Liu et al., 2003; Whipps, 2004;

Liu et al., 2007). Aunque en menor abundancia, se han realizado también algunos trabajos

en raíz utilizando proteómica comparativa para identificar proteínas relacionadas con el

mecanismo de resistencia (Colditz et al., 2004; 2005).

Aunque la expresión global de genes a nivel transcripcional (transcriptómica)

proporciona información importante respecto a los estados tempranos de transcripción del

genoma, los niveles de mRNA no siempre son consistentes con la abundancia de proteínas

(citado en Rose et al., 2004). En comparación con el nivel de mRNA, el nivel de proteína

integra procesamientos post-transcripcionales y post-traduccionales que modulan la

cantidad, localización y eficiencia del producto final en la célula. La conjunción de estudios

de proteómica con transcriptómica permite un mejor conocimiento del papel que estos

genes juegan en la simbiosis y en el mecanismo de inducción sistémica (Rose et al., 2004;

Chen y Harmon, 2006).

Fontana et al. (2008) llevaron a cabo un estudio mediante la técnica de hibridación

sustractiva, la cual aisla secuencias tags expresadas, representando genes que son

expresados diferencialmente en diferentes poblaciones de RNAm. El estudio se llevó a

cabo en plantas de Platanus acerifolia tratadas con cerato-platanina. La cerato-platanina es

una proteína fitotóxica secretada por el ascomiceto Ceratocystis platani, el cual es un

patógeno virulento en plantas de plátano. Ellos demostraron que cuando las hojas de

plátano son tratadas con la proteína fitotóxica, Ceratocystis ya no puede crecer en ella y

hay sobreexpresión de la proteína transcetolasa. Además, sus resultados muestran un

incremento en el metabolismo del carbono. Algunas proteínas involucradas en la

fotosíntesis tales como la ferredoxina A, la ribulosa 1-5,bifosfato carboxilasa y algunas

enzimas cloroplásticas del fotosistema I y II se encontraron expresadas diferencialmente en

este estudio.

Shoresh y Harman (2008) analizaron el perfil proteómico de hojas de plántulas de

maíz colonizadas con el hongo Trichoderma harzianum el cual es empleado como agente

de biocontrol contra varios patógenos de suelo. T. harzianum induce cambios en el

proteoma de hojas de plántulas de maíz (Zea mays). Se identificaron 91 proteínas, de 114

inducidas y 30 proteínas, de 50 cuya acumulación disminuyó en las hojas. Una gran


cantidad de proteínas inducidas en esta asociación estan involucradas en el metabolismo de

aminoácidos, metabolismo de carbono, fotosíntesis (fructoquinasa, fructosa bifosfato

aldolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, oxalato oxidasa,

β-glucosidasa), entre otras.

El perfil de expresión de genes en hojas y raíces de plantas de tomate (Solanum

lycopersicum) colonizadas con el HMA G. mosseae ha sido reportado previamente (Fiorilli

et al., 2009). Mediante el empleo de microarreglos, los autores reportan 362 genes

sobreexpresados y 293 genes cuya expresión fue reprimida en raíces, también se detectó

una modulación importante de genes de parte aérea; 85 genes sobreexpresados y 337 genes

reprimidos. La mayoría de los genes de respuesta en ambos tejidos estuvieron relacionados

con metabolismo primario y secundario, defensa, respuesta a estímulo, organización

celular, modificación de proteínas, y regulación transcripcional.

El análisis del perfil de expresión de células corticales conteniendo arbúsculos

empleando una metodología de microdisección laser permitió la identificación de seis

genes expresados diferencialmente. Los resultados sugieren que el metabolismo de auxinas

y ABA está involucrado en la formación y/o funcionamiento de arbúsculos (Fiorilli et al.

2009).

El análisis por electroforesis bidimensional ha demostrado ser muy útil para revelar

modificaciones de proteínas en raíces relacionados con la micorriza arbuscular (Samra et

al., 1997; Bestel-Corre et al., 2002; Chinnasamy, 2005; Colditz et al., 2005; Valot et al.,

2005), o bien del hongo en sistemas monoxénicos de raíces transformadas de zanahoria

colonizados con G. intraradices (Simoneau et al., 1994; Dumas-Gaudot et al., 2004).

Samra et al. (1997) detectaron por 2D-SDS-PAGE, proteínas relacionadas con la

simbiosis durante estadíos tempranos del establecimiento de la micorriza arbuscular entre

G. mosseae y raíces de Pisum sativum, sin embargo en este estudio no se identificó su

identidad por análisis de espectrometría de masas. Benabdellah et al. (2000) evaluaron

usando esta misma estrategia cambios inducidos por la formación de micorrizas

arbusculares (G. mosseae) en el patrón de polipéptidos de la membrana plasmática en raíz

de tomate. Ellos encontraron una reducción en la regulación de algunos polipéptidos

constitutivos y la síntesis de nuevos polipéptidos o endomicorrizinas. Sin embargo, solo se

identificó una proteína con regulación negativa, la subunidad tipo V de la H+-ATPasa


vacuolar, la cual podría estar relacionada con una disminución en el nivel de síntesis de la

membrana vacuolar y a su vez con el papel de la vacuola en el mantenimiento de la

homeostasis iónica en el citosol. El mismo trabajo muestra en una comparación de los

cambios inducidos por dos diferentes niveles de colonización por HMA encontrando que 16

polipéptidos fueron desplegados diferencialmente en ambos estados de colonización, sin

embargo éstos no fueron identificados.

Bestel-Corre et al. (2002) estudiaron perfiles de proteínas de raíz realizando un

análisis de curso temporal en plantas de M. truncatula inoculadas con el HMA G. mosseae.

En respuesta a la colonización por HMA se encontraron dos polipéptidos que

disminuyeron, 12 polipéptidos que aumentaron su acumulación y 41 fueron polipéptidos

inducidos solamente en la condición de plantas colonizadas con respecto al control. Dentro

de estos polipéptidos se encontraron proteínas involucradas en respuesta a defensa contra

patógenos, como peroxidasa y proteína inhibidora de poligalacturonasa; proteínas

involucradas en la fisiología de la raíz, como una proteína tipo miosina cadena pesada (la

cual podría participar en la reorganización del citoesqueleto en células colonizadas) y

proteínas implicadas en vía respiratoria mitocondrial, como una serina hidroximetil-

transferasa y citocromo-c-oxidasa.

Valot et al. (2005) identificaron mediante proteómica comparativa subcelular 25

proteínas de membrana cuya expresión fue significativamente alterada por la simbiosis MA

en raíces de M. truncatula inoculadas con el hongo G. intraradices. Valot et al. (2006)

reportaron dos estrategias complementarias por espectrometría de masas, basada en un

sistema automatizado de cromatografía líquida masas/masas (LC-MS/MS) con un fuerte

intercambio catiónico y; SDS-PAGE y cromatografía de fase reversa combinado con un

análisis sistemático LC-MS/MS. Esto permitió la identificación de proteínas relacionadas

con MA en fracciones de membrana plasmática de raíz de M. truncatula inoculada con el

hongo G. intraradices.

La estrategia del empleo de sistemas monoxénicos ha permitido la identificación de

nuevos polipéptidos en raíces transformadas de tomate durante el desarrollo de micorrizas

arbusculares (Simoneau et al., 1994) y la identificación de proteínas extraradicales de

hongo se ha llevado a cabo en un sistema de raíces transformadas de zanahoria colonizadas

con G. intraradices (Dumas-Gaudot et al., 2004). Este trabajo permitió la identificación de


proteínas secretadas por HMA, entre las cuales se incluyen proteínas del metabolismo

celular central como: una óxido reductasa y un precursor de la ATP sintasa-β mitocondrial;

además de una proteína tipo NmrA (por sus siglas en inglés: nitrogen metabolite repression

in Aspergillus nidulans), el cual es un represor de la transcripción involucrado en la

regulación del metabolismo de nitrógeno en Aspergillus nidulans y una proteína de choque

térmico, cuya función consiste en proteger a la célula a estrés térmico y también podría

interactuar con otras proteínas en el plegado y translocación de polipétidos en los diferentes

compartimentos celulares.

Pozo et al. (2002) estudiaron la capacidad de dos HMA (G. mosseae y G.

intraradices) para inducir la resistencia sistémica y localizada al hongo fitopatógeno

Phytophthora parasitica en raíces de tomate utilizando un sistema experimental de raíces

divididas, realizando análisis bioquímicos de algunas enzimas relacionadas a defensa a

partir de extractos de proteínas de las raíces. Las plantas de tomate respondieron de manera

diferencial a la inoculación con los dos hongos al ser infectados con el patógeno; los

autores describieron nuevas isoformas de proteínas relacionados a defensa como quitinasa,

quitosanasa, β-1,3-glucanasa y superóxido dismutasa inducidas localmente en la parte

colonizada con el hongo micorrízico y observaron ciertos efectos sistémicos como los

resultados obtenidos en la actividad lítica contra la pared celular del patógeno, concluyendo

en la existencia de una RSI mediada por la micorrización.

A pesar de que ya existe evidencia experimental de la expresión diferencial de genes

en hojas de plantas colonizadas con HMA con respecto a las no colonizadas (Taylor y

Harrier, 2003; Liu et al., 2007), y a la fecha se han publicado trabajos de expresión

diferencial de proteínas en hojas infectadas y no infectadas con patógenos foliares o de

parte aérea (Bestel-Corre et al., 2004; Colditz et al., 2004; Whipps, 2004; Chinnasamy,

2005), aún no se ha estudiado la expresión diferencial de proteínas de hojas de plantas de

frijol colonizadas con HMA y no colonizadas.

Entre los trabajos relacionados con la expresión diferencial de genes en hojas de

plantas colonizadas con HMA con respecto a las no colonizadas se encuentra el trabajo de

Taylor y Harrier (2003). Estos autores emplearon la estrategia de despliegue diferencial de

ARNm en tejido de hojas de plantas de tomate colonizadas y no colonizadas con el HMA

G. mosseae, encontrando cinco ADNc regulados diferencialmente. En años recientes, se ha


documentado que la micorrización reduce los síntomas causados por fitoplasmas (Lingua et

al., 2002) y por Alternaria solani (Fritz et al., 2006; de la Noval et al., 2007) en tomate. Liu

et al. (2007) estudiaron el impacto de la asociación micorrízica arbuscular sobre la

interacción de la planta con bacterias patógenas foliares. Empleando plantas de M.

truncatula infectadas con la bacteria foliar X. campestris pv. alfalfae se confirmó que las

plantas colonizadas con HMA presentaron un aumento en la tolerancia al patógeno aéreo.

Esta respuesta inducida por la micorrización correlacionó a su vez, con la alteración

diferencial de la expresión de algunos genes. En este trabajo, empleando microarreglos de

ADN se identificaron 468 genes cuya expresión aumentó y 131 genes cuya expresión

disminuyó en hojas de plantas colonizadas con HMA con respecto a hojas de plantas no

colonizadas. Aproximadamente el 25% de los genes inducidos en hojas de plantas

colonizadas con HMA pudieron asociarse in silico con proteínas involucradas en

mecanismos de defensa descritos en otros sistemas, sugiriendo que la micorrización podría

estar induciendo un mecanismo de defensa en la parte aérea de las plantas.

Actualmente en nuestro grupo se han llevado a cabo estudios a nivel transcripcional

en hojas de plantas de tomate colonizadas con HMA como resultado de la infección por el

agente patógeno X. campestris, donde se ha encontrado un efecto bioprotector en plantas de

tomate colonizadas con G. intraradices independientemente de su estado nutricional

fosforado (Galindo-Flores, 2008). También, se han conducido estudios en plantas crecidas

bajo condiciones controladas (16 hr luz/25 °C y 8 hr oscuridad/20 °C), donde se han

identificado mediante análisis bidimensional de proteínas y espectrometría de masas,

proteínas diferencialmente expresadas en hojas de plantas de tomate colonizadas con G.

intraradices comparadas con plantas no colonizadas. En ese trabajo, se detectaron 27

proteínas expresadas diferencialmente de la comparación de las plantas colonizadas y no

colonizadas, de las cuales 22 fueron identificadas por espectrometría de masas. La mayoría

de las proteínas identificadas disminuyeron su expresión en la condición colonizada y

fueron proteínas relacionadas a la fotosíntesis y al estado celular de óxido-reducción,

mientras que dos proteínas aumentaron su expresión y estuvieron relacionadas una con la

síntesis de auxina y la otra es una germina (Peinado-Guevara, 2010 en revisión). Las

auxinas también se han reportado en raíces de plantas colonizadas con HMA (Hause et al.,

2007; Ludwig-Muller y Guther, 2007), sin embargo el papel funcional de estas proteínas se


desconoce. Las proteínas tipo germina participan en muchos procesos que son importantes

para el desarrollo y defensa de la planta. Éstas han sido implicadas en el fortalecimiento de

la pared celular y resistencia al ataque de patógenos y estrés abiótico (Bernier y Berna,

2001; Godfrey et al., 2007; Gucciardo et al., 2007; Park et al., 2004). En otro estudio, se

llevó a cabo la comparación de las plantas colonizadas con G. intraradices y no

colonizadas y además ambas infectadas con el patógeno foliar X. campestris pv vesicatoria.

Se detectaron 27 proteínas expresadas diferencialmente, 23 de ellas aumentaron en la

condición colonizada con HMA e infectada con el patógeno con respecto al control. De las

proteínas inducidas trece se lograron identificar por espetrometría de masas. Siete proteínas

son proteínas relacionadas a fotosíntesis, las cuales aumentan su expresión en la condición

colonizada con HMA e infectada con patógeno. También se lograron identificar dos

chaperonas y las restantes estuvieron reacionadas a otras funciones moleculares (Peinado-

Guevara, 2010 en preparación). Finalmente, en experimentos realizados por Mora-Romero

(2008) se ha observado un fenómeno de bioprotección sistémico contra el patógeno S.

sclerotiorum en variedades de frijol al momento de estar colonizadas con el hongo G.

intraradices. Se ha demostrado que esta capacidad de bioprotección es específica de la

variedad de frijol empleada. Los resultados de dos variedades contrastantes: Az. Higuera

(susceptible en condiciones de micorrización) y Az. Regional 87 (tolerante en condiciones

de micorrización) nos impulsan a emplear la proteómica comparativa, para la identificación

de proteínas que pudieran estar involucradas en el mecanismo de defensa inducido por

micorrización y tratar de explicar más a fondo este fenómeno.


III. JUSTIFICACIÓN

Si bien existen diversos estudios para determinar los cambios de expresión de genes

y proteínas que ocurren en las raíces de las plantas colonizadas con HMA, pocos son los

estudios que se han realizado para entender los mecanismos moleculares involucrados en la

MA y cómo ésta afecta la expresión génica en la parte aérea de la planta.

La identificación de las proteínas expresadas específica o diferencialmente en

plantas colonizadas por HMA permitirá entender la complejidad de la interacción planta-

hongo. Dado que aún cuando la interacción se manifiesta de manera local dentro de los

tejidos de la raíz, el efecto es sistémico alterando de manera global la fisiología de la

planta.

Para esto se propone identificar aquellas proteínas relacionadas a la simbiosis MA

relacionadas a la inducción de tolerancia en el tejido foliar de dos variedades de frijol

mediante proteómica comparativa. Para esto, se emplearán las variedades Az. Regional 87

y Az. Higuera, las cuales responden diferencialmente al ataque de S. sclerotiorum cuando

están colonizadas con G. intraradices.

Por lo anterior, este trabajo tiene como finalidad aumentar el conocimiento respecto

a la interacción frijol-HMA. En parte por la importancia de este cultivo en la región, y por

otra parte desde un punto de vista básico para conocer específicamente las proteínas que

puedan estar funcionando como mensajeros, o como parte del mecanismo de la inducción

de la defensa sistémica por micorrización en plantas. El conocimiento de los mecanismos

inducidos por el establecimiento de la asociación MA en la parte aérea de frijol, permitirá

aprovechar los beneficios de dichos mecanismos en el futuro, empleando la inducción

controlada de resistencia a patógenos de importancia económica.


IV. HIPÓTESIS

• La colonización radical por HMA induce la resistencia a patógenos en plantas de

frijol dependiendo de la variedad y se encuentra mediada por la expresión

diferencial de proteínas en parte aérea.

• El comportamiento diferencial entre las variedades Azufrado Regional 87 y

Azufrado Higuera colonizadas con G. intraradices con respecto a resistencia al

patógeno S. sclerotiorum, permitirá establecer los mecanismos moleculares

relacionados a la resistencia inducida por la simbiosis.

V. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general

• Identificar proteínas diferenciales en hoja relacionadas a la resistencia que se induce

en frijol en respuesta a la simbiosis con el hongo Glomus intraradices.

5.2. Objetivos específicos

• Estandarizar la técnica de extracción de proteínas en hojas de plantas de frijol.

• Identificar las proteínas diferenciales presentes en la parte aérea de plantas de frijol

de las variedades Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera en respuesta a la

colonización con Glomus intraradices, mediante electroforesis bidimensional y

espectrometría de masas.

• Determinar las rutas metabólicas o mecanismos moleculares que están siendo

inducidas en la parte aérea de la planta por micorrización en frijol.


VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Tejido vegetal

Se utilizó material criopreservado a -70 °C de hojas de plantas colonizadas con G.

intraradices y no colonizadas de dos variedades de frijol (Az. Regional 87 y Az. Higuera),

todo el material es proveniente de experimentos realizados por Mora-Romero (2008). La

estandarización del método de extracción se llevó a cabo con hojas de plantas de frijol de la

variedad Az. Regional 87 sin colonizar. Las plantas se tomaron del experimento fisiológico

preliminar en hoja desprendida realizado por Mora-Romero (2008). El material se preparó

de la siguiente manera: las semillas fueron desinfectadas en etanol al 70% durante 2 min,

seguido por 2 min de inmersión en hipoclorito de sodio al 0.5% y enjuagadas de tres a

cuatro veces con agua destilada estéril, sembradas en macetas de plástico, utilizando como

sustrato Peat Moss. Ocho días posteriores a la germinación las plantas fueron trasplantadas

a macetas individuales. Las plantas fueron fertilizadas semanalmente con 50 ml de solución

nutritiva de Hoagland (Ca(NO3)2·4H2O 2.5 mM, KNO3 2.5 mM, MgSO4·7 H2O 1 mM ,

Na-FeEDTA 50 μM, KH2PO4 20 μM, H3BO3 10 μM, Na2MoO4·2H2O 0.2 μM,

ZnSO4·7H2O 1.0 μM, MnCl2·4H2O 2.0 μM, CuSO4·5H2O 0.5 μM, CoCl2·6 H2O 0.2 μM,

HCl 3N 25.0 μM, MES Amortiguador 0.5 mM) (Millner y Kitt, 1992), regadas con agua

corriente según se requería y mantenidas bajo condiciones de invernadero, cubiertas con

malla antiáfidos durante diez semanas. Las plantas fueron crecidas de enero a marzo de

2007 (Figura 2).

Figura 2. Plantas de frijol de la variedad Az. Regional 87, mantenidas en estantes cubiertos con mallas antiáfidos bajo condiciones de invernadero (tomado de Mora-Romero, 2008).


Para llevar a cabo el análisis mediante proteómica comparativa se utilizaron

muestras de hojas de plantas de dos variedades de frijol (Az. Regional 87 e Higuera)

colonizadas con G. intraradices y no colonizadas. Las muestras provienen del crecimiento

y colonización de plantas de frijol para el experimento en planta completa, donde las

semillas de dos variedades de frijol (Az. Regional 87 y Az. Higuera) fueron desinfectadas

bajo el mismo procedimiento anterior, sembradas en macetas de plástico, utilizando como

sustrato vermiculita-arena (1:1; v/v), esterilizado a 121 °C, en autoclave, durante 1 hora a

15 lb de presión. Ocho días después de la germinación cada planta fue inoculada con

aproximadamente 500 esporas de G. intraradices contenidas en un ml de agua, y

trasplantadas a macetas individuales. Las plantas fueron fertilizadas semanalmente con 50

ml de solución nutritiva de Hoagland (2x) (composición completa de Hoagland con 20 μM

de fosfato de potasio) (Millner y Kilt, 1992), y regadas con agua corriente según se

requería. Las plantas fueron crecidas bajo condiciones controladas en cámaras de

crecimiento BINDER (Fotoperíodo: 18/8 hr luz/oscuridad; temperatura: 25/18 °C) (Figura

3) durante el período de abril a mayo. A las ocho semanas después de la adición de esporas

se midió el porcentaje de colonización con G. intraradices, obteniendo para la variedad Az.

Regional 87 un 23% y para Az. Higuera un 20% ((± 10 desviación estándar: DS).

Figura 3. Plantas de frijol de las variedades Az. Regional 87 y Az. Higuera, cultivadas

bajo condiciones controladas en cámaras de crecimiento (tomado de Mora-Romero, 2008).


6.2. Estandarización del método de extracción de proteínas

Se compararon cuatro diferentes métodos de extracción de proteínas en hojas de

plantas de frijol de la variedad Az. Regional 87. Se analizaron tres muestras biológicas por

duplicado. El método que resultó más eficiente con respecto a la solubilización de proteínas

y su compatibilidad con el análisis 2D-SDS-PAGE para la subsecuente identificación por

LC-MS/MS, es el que se tomó para llevar a cabo la extracción de hojas en plantas de frijol

colonizadas con G. intraradices y no colonizadas de las variedades Az. Regional 87 y Az.

Higuera. Una vez extraídas las muestras anteriormente mencionadas, se llevó a cabo

mediante proteómica comparativa la identificación de proteínas diferenciales presentes en

la parte aérea de la planta en respuesta a la micorrización con G. intraradices, mediante

electroforesis bidimensional para posteriormente identificar las proteínas diferenciales

mediante espectrometría de masas. Finalmente, determinamos las rutas metabólicas o

mecanismos moleculares que están siendo inducidas en la parte aérea de la planta por

micorrización en frijol.

Los métodos de extracción de proteínas son descritos en el apartado siguiente:

6.2.1. Método A de extracción con Fenol (Fenol-A)

Se pulverizó en presencia de nitrógeno líquido aproximadamente 250 mg de tejido

de hoja de planta de frijol congelado, empleando un molino (Retsh MM 301, Haan

Alemania) a una velocidad de 30 oscilaciones/segundo por 5 min. El tejido pulverizado se

resuspendió en 500 µl de amortiguador buffer de extracción (polivinilpolipirrolidona

(PVPP) 1% (p/v), sacarosa 0.7 M, KCl 0.1 M, Tris-HCl pH 8.0 al 0.5 M, EDTA 50 mM, 2-

mercaptoetanol 0.4% (v/v) y coctel de inhibidor de proteasas 1 mM). La mezcla fue

homogenizada en frío durante 15 min usando como homogenizador el equipo Disperser

T10 Basic (IKA, Staufen, Suiza). Se adicionó un volumen igual de fenol saturado con Tris-

HCl 0.1 M a pH 7.5 y se volvió a homogenizar por 15 min en frío. Se centrifugó a 10,000 x

g por 30 min a 4 °C. Se removió la fase superior de fenol y se volvió a extraer con

amortiguador de extracción. Las proteínas precipitaron en la fase final de fenol con cinco

volúmenes de acetato de amonio 0.1 M en metanol toda la noche a -20 ºC y se obtuvo la


pastilla por centrifugación a 10,000 x g por 30 min. Finalmente se resuspendió en 100 µl de

urea-tiourea (7M-2M) (Hurkman y Tanaka, 1986).

6.2.2. Método B de extracción con Fenol (Fenol-B)

Aproximadamente 250 mg de tejido pulverizado como se describió anteriormente se

resuspendió en 500 µl de amortiguador de extracción consistiendo de Tris-HCl (pH 8.8) 0.1

M, conteniendo DTT 50 mM, EDTA 10 mM, coctel de inhibidor de proteasas 1 mM. Se

homogenizó durante 15 min usando el Disperser T10 Basic (IKA). Después se centrifugó a

10,000 x g durante 10 min a 4 °C, el sobrenadante clarificado se combinó en una relación

1:1 con fenol Tris-saturado (pH 7.5) y se mezcló con un vortex a velocidad media, a

temperatura ambiente de 20 a 30 min, y se centrifugó a 10,000 x g por 10 min a 4 °C. La

fracción acuosa superior extraída anteriormente se combinó otra vez en una relación 1:1

con fenol Tris-saturado (pH 7.5), se mezcló con vortex a velocidad media, a temperatura

ambiente de 20 a 30 min, y se centrifugó a 10,000 x g por 10 min a 4 °C. Las dos fases de

fenol fueron combinadas y re-extraídas con Tris-HCl (pH7.5) 100 mM con DTT 10 mM.

Después, 4 volúmenes de metanol 100% conteniendo acetato de amonio 100 mM y DTT 10

mM (refrigerado a -70 °C) se agregó a las fracciones fenólicas agrupadas y precipitadas por

2 a 3 h a -70 °C y entonces centrifugadas a 10,000 x g por 10 min a 4 °C. Las proteínas se

lavaron 2 ó 3 veces con metanol 100% conteniendo acetato de amonio 100 mM y DTT 10

mM con centrifugación a 10,000 x g por 10 min y después con varios volúmenes de etanol

frío al 90% (v/v) con DTT 10 mM y centrifugado a 10,000 x g por 10 min. La pastilla fue

disuelta en urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 5% (p/v), triton X-100 2% (v/v), DTT 100 mM,

y anfolitos pH 3-10 al 1% (v/v) y agitada con vórtex a velocidad media por una hora a

temperatura ambiente. Las soluciones de las proteínas fueron clarificadas por

centrifugación a máxima velocidad (Sarma et al., 2008).

6.2.3. Método A de extracción con Ácido Tricloroacético/Acetona (TCA-A)

Aproximadamente 250 mg de hoja de tejido pulverizado como se describió

anteriormente se resuspendió en 500 µl de amortiguador de extracción

(Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v), KCl 0.1 M, Tris-HCl pH 8.0 al 0.5 M, EDTA 50

mM, 2-mercaptoetanol 0.4% (v/v) y coctel de inhibidor de proteasas 1 mM). La mezcla se


homogenizó usando el Disperser T10 Basic (IKA) durante 15 min y se centrifugó a 10,000

x g por 30 min a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante y las proteínas se precipitaron

agregándole cuatro volúmenes de acetona fría conteniendo TCA 10% (p/v) y 2-

mercaptoetanol 2% (v/v). La mezcla fue homogenizada y las proteínas fueron precipitadas

en congelación a -20 °C durante toda la noche. Se recuperó la pastilla por centrifugación a

10,000 x g por 30 min. Finalmente, se resuspendió en urea-tiourea (7 M-2 M) (Saravanan y

Rose, 2004).

6.2.4. Método B de extracción con Ácido Tricloroacético/Acetona (TCA-B)

Aproximadamente 250 mg de tejido pulverizado como se describió anteriormente se

homogenizó con 500 µl de solución que contenía TCA 10% (p/v) en acetona con 2-

mercaptoetanol 0.07% (v/v), coctel de inhibidor de proteasas 0.001 M usando el Disperser

T10 Basic (IKA) durante 15 min. Las proteínas totales fueron precipitadas durante toda la

noche a -20 °C. La pastilla se recuperó por centrifugación a máxima velocidad durante 30

min a 4 °C. Se resuspendió en 1 ml de amortiguador lisis (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS

2% (p/v), Tritón 2% (v/v), anfolitos 0.2% (v/v) [pH 3–10] y TBP 4 mM). El material

insoluble se removió por centrifugación a máxima velocidad por 20 min a 4 °C, y se

almacenó el sobrenadante a -70 °C hasta su uso en el análisis 2D–SDS-PAGE (Cascardo et

al., 2001).

6.3. Cuantificación de proteínas

Una vez resuspendida la pastilla se cuantificó empleando el reactivo de Bradford

(Sigma, San Louis, MO, EUA). Para esta cuantificación se realizó una curva estándar con

tres repeticiones. Se obtuvo la absorbancia de la mezcla del reactivo con la proteína a 595

nm en un espectrofotómetro (Thermospectronic, Genesis Spectrophotometer Spectronic).

Se preparó una curva estándar con concentraciones de proteínas conocidas (rango de 0.25 a

1.40 mg/ml) con albúmina de suero bovino (Sigma, San Louis, MO, EUA), corridas en

paralelo con soluciones de proteínas desconocidas para analizar cuantitativamente las

proteínas, al mismo tiempo se corrió un blanco como control de la reacción.

Una vez obtenida la concentración de la muestra se calculó el rendimiento (mg/250

mg de tejido) promedio para cada método de extracción. A los resultados se les realizó un


análisis de varianza con una P<0.05, para observar si había diferencias significativas entre

los métodos en cuanto a rendimiento de proteína.

6.4. Protocolo de limpieza de proteínas para 2D-SDS-PAGE

Antes de realizar la electroforesis bidimensional todas las muestras fueron tratadas

con el kit de limpieza 2-D Clean Up Kit (Amersham Biosciences, no. de catálogo 80-6484-

51) el cual consistió en el siguiente procedimiento:

Se transfirieron 80 µg de muestra de proteína en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Se le

agregó 300 µl de solución precipitante (Amersham Biosciences, no. de catálogo 80-6484-

51) se mezcló bien por vórtex. Se incubó en hielo durante 15 min. Posteriormente, se

agregaron 300 µl de solución co-precipitante (Amersham Biosciences, no. de catálogo 80-

6484-51) a la mezcla anterior (mezcla de proteínas y precipitante) y se mezcló con vórtex a

baja velocidad. Se centrifugó a 4 °C, a 12,000 x g por 5 min. Se observó la formación de

una pequeña pastilla en este paso. Se removió con mucho cuidado el sobrenadante por

decantación o pipeteo. Después se agregaron 40 µl de solución de co-precipitado sobre la

pastilla y se colocaron los tubos en hielo durante 5 min. Se volvió a centrifugar a 4 °C, y

12,000 x g durante 5 min. Se agregaron 25 µl de agua destilada desionizada estéril (a 4 °C)

sobre la pastilla. Se agitó en vórtex cada tubo durante 5-10 seg. Posteriormente, se agregó 1

ml de amortiguador de lavado (wash buffer, Amersham Biosciences, no. de catálogo 80-

6484-51) (almacenado a –20 °C) y 5 µl de aditivo de lavado (wash aditive, Amersham

Biosciences, no. de catálogo 80-6484-51). Se agitó con vórtex hasta que la pastilla estuvo

completamente dispersa. Se incubó a -20 °C durante 30 min (se agitó la suspensión

mediante vortex de 20 a 30 seg cada 10 min). Se centrifugó a una velocidad de 12,000 x g

durante 5 min. Cuidadosamente se removió y descartó el sobrenadante. Se secó la pastilla

por no más de 5 min. Finalmente se resuspendió la pastilla en 130 µl de amortiguador de

IEF (De-streak Rehydration Solution no. de catálogo 17-6003-19 de GE Healthcare) para

continuar con la rehidratación e hidratación de las tiras.

6.5. Separación de proteínas por punto isoeléctrico [Isoelectroenfoque (IEF)]

En esta etapa de estandarización se realizó la separación de proteínas en escala

analítica. Se tomaron 80 µg de proteínas en 125 µl de amortiguador IEF (De-streak


Rehydration Solution) adicionando anfolitos de rango de pH 3-10 al 1.0% (p/v) y se

homogenizó. Se empleó esta muestra para rehidratar tiras de gel de poliacrilamida en

gradiente inmovilizado pH 3-10 (Ready Strip IPG Strip, 7 cm, BioRad). La rehidratación

consistió en 14 h a 50 V/20 ºC. Después de la etapa de rehidratación, las proteínas se

enfocaron en el sistema Protean IEF Cell (BioRad) aplicando un total de 22,000 V/h. Las

tiras tratadas se almacenaron a -70 °C hasta su aplicación en la segunda dimensión. En una

primera etapa se realizó en formato analítico lo que nos permitió identificar las zonas de pH

y peso molecular donde se observaron diferencias, posteriormente se emplearon tiras de

IPG Strip de 17 cm con el objetivo de tener suficiente proteína para identificación. Se

utilizó un marcador de peso molecular (2D-SDS-PAGE Standards, BioRad, Cat. no. 161-

0320), el cual se separó en paralelo a las muestras.

6.6. Separación de proteínas por peso molecular (SDS-PAGE)

El paso de la primera a la segunda dimensión involucró dos etapas: primero, la

reducción, y segundo la alquilación de los grupos sulfhidrilos. Las tiras de IPG fueron

equilibradas adicionando 2.0 ml de amortiguador de equilibrio (urea 6 M, SDS 2% (p/v),

Tris/HCl 0.05 M pH 8.8, glicerol 20% (v/v), DTT 2% (p/v) para reducir los grupos

sulfhidrilos se agitó durante 15 min. Posteriormente, se decantó y se adicionó el

amortiguador de equilibrio II (urea 6 M, SDS 2% (p/v), Tris/HCl 0.05 M, pH 8.8, glicerol

20% (v/v), iodo-acetamida 2.5% (p/v)) con agitación durante 15 min, para alquilar los

grupos sulfhidrilos. Se agitaron las tiras con el amortiguador I y II para correr en una

segunda dimensión.

Las proteínas resueltas y equilibradas, se separaron en base a su peso molecular en

geles desnaturalizantes en condiciones reductoras (SDS-PAGE). Se utilizó un marcador de

peso molecular (BenchMark 10 a 220 kDa (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA)). La corrida

electroforética se realizó en una cámara vertical (Mini Protean Tetra Electrophoresis

System, Bio-Rad) a temperatura ambiente y 70 V, por 4 horas y en buffer de electroforesis

1X (Tris base, 25mM, glicina 192 mM, SDS 0.1% (p/v)). Para visualizar las manchas de

proteínas, los geles fueron teñidos con azul de Coomasie R-250.


6.7. Adquisición y análisis de imágenes

Después de realizar la corrida de SDS-PAGE, los geles se tiñeron en solución de

tinción (azul de Coomassie R-250 0.1% (p/v), metanol:ácido acético glacial (45:45, (v/v)),

con agitación suave durante toda la noche, después se destiñó en solución de destinción

(ácido acético glacial:metanol (10:10, (v/v)) por al menos 3 horas en agitación.

Una vez estandarizado el método, se tomó el método más eficiente y más fiable para

llevar a cabo el análisis proteómico comparativo entre las variedades Az. Regional 87 y Az.

Higuera de plantas no colonizadas y colonizadas con G. intraradices. Una vez teñidas las

proteínas, se documentaron en el sistema Chemi Doc (BioRad). Las imágenes de los geles

bidimensionales se analizaron empleando el programa PDQuest (BioRad), analizándose al

menos tres muestras biológicas para cada condición.

6.8. Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas

Una vez realizada la comparación, se seleccionaron proteínas para ser identificadas

mediante espectrometría de masas. Las manchas de las proteínas de interés fueron cortadas

manualmente de los geles teñidos con azul de Coomassie. Dado que existen bases de datos

de secuencias de transcritos de frijol y de otras leguminosas, fue factible emplear

cromatografía líquida masas/masas (LC-MS/MS). Este análisis se realizó en la Unidad de

Proteómica del Instituto de Biotecnología de la UNAM en Cuernavaca, Morelos. Las

muestras fueron digeridas “en el gel” con tripsina y los péptidos

resultantes fueron aplicados en un sistema LC-MS constituido de un cromatógrafo líquido

de micro-flujo Accela (Thermo-Ficher Co. San Jose, CA) con “spliter” (1/20) y un

espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (Thermo-Ficher Co.) con sistema de ionización

tipo nano-electrospray (ESI). Para la fragmentación de los péptidos

se utilizó los métodos de CID (Collision-Induced Dissociation) y HCD (High-energy

Collision Dissociation). Solamente iones con carga 2+ y 3+ fueron seleccionados para los

eventos de fragmentación. No fueron considerados los iones con cargas 1+, 4+ y de cargas

indefinidas. Todos los espectros fueron adquiridos en modo de detección positivo. Durante

la captura automática de los datos fue utilizada la exclusión dinámica de iones, con un

tiempo de exclusión de 60 seg. Las secuencias de los péptidos resultantes se analizaron en

la base de datos del NCBI, mediante el empleo del programa BlastP


(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). El peso molecular y el punto isoeléctrico de los

polipéptidos fueron evaluados en EXPASy (http://www.expasy.org/tools/pi_tool) para la

confirmación final de acuerdo a sus posiciones en el mapa del gel bidimensional.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST�

http://www.expasy.org/tools/pi_tool�


VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1. Estandarización del método de extracción de proteínas

Este estudio fue imprescindible para evaluar, estandarizar y seleccionar el método

más eficiente para el análisis de las proteínas en hojas de plantas de frijol, ya que no

existían protocolos previamente reportados para este cultivo en la literatura.

Se evaluaron cuatro diferentes métodos de extracción de proteínas de hojas de

plantas de frijol. Esto con la finalidad de encontrar un protocolo que permitiera la

solubilización de la mayor cantidad y resolución de proteínas en el análisis por 2D-SDS-

PAGE (separación tanto por punto isoeléctrico, como por peso molecular) y la subsecuente

identificación por espectrometría de masas.

Primeramente, las muestras proteicas obtenidas de los distintos métodos se

cuantificaron empleando el reactivo de Bradford, ya que este método es compatible con

agentes reductores y bajas concentraciones de detergentes. Para esta cuantificación se

obtuvo una curva estándar (Figura 4), con el promedio de tres réplicas a concentraciónes

de 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.4 mg/ml de proteína albúmina de suero de bovino, con una

longitud de onda de 595 nm. El criterio de elección tomado en consideración fue un

coeficiente de determinación (R2) mayor a 0.95. Los resultados obtenidos muestran un (R2)

de 0.9991. Esto indica que el modelo ajustado es capaz de explicar la respuesta

(absorbancia) a partir de los valores de concentración. De manera que el intervalo de

concentración comprendido, satisface las condiciones de linealidad del método analítico.

Con la ecuación obtenida y = 0.4299x-0.0112, se calculó la concentración desconocida (x)

que corresponde a cada una de las muestras de concentrado de proteinas.


Figura 4. Curva estándar para determinar la concentración de proteína. Se

cuantificó con el reactivo de Bradford con albúmina de suero de bovino (BSA).

Los rendimientos de los métodos evaluados se muestran en el Cuadro 1. El

promedio de los rendimientos fue aproximadamente de 0.42 ± 0.1 mg de proteína/250 mg

de tejido vegetal fresco, siendo el mayor el del método TCA A (0.513 mg/250 mg de

tejido).

Cuadro 1. Rendimientos de extracción de proteínas de hojas de plantas mediante cuatro diferentes métodos

Método Concentración Rendimiento de extracción (mg/ml)1 mg/250mg de tejido2 1 Fenol A 3.02 ± 0.1 0.302 2 Fenol B 3.96 ± 0.1 0.396 3 TCA A 5.13 ± 0.1 0.513 4 TCA B 3.09 ± 0.1 0.464

1. Dos extracciones por método y cuantificación por duplicado. 2. Tejido congelado de hojas de plantas de frijol Az. Reg. 87.


En la Figura 5 se muestran las características cualitativas de las réplicas de los

diferentes métodos de extracción. En el método Fenol-B y TCA-A se observan proteínas

diferenciales de alto peso molecular (se indican con flechas) comparadas con los métodos

de Fenol-A y TCA-B.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

29

2001169766

45

KDa

Figura 5. Análisis por SDS-PAGE de proteínas extraídas por diferentes métodos de

extracción. Carriles 2 y 3: muestra extraída con Fenol-A; carriles 4 y 5: muestra extraída

con Fenol-B; carriles 7 y 8: muestra extraída con TCA-A; carriles 9 y 10: muestra extraída

con TCA-B; carriles 1, 6 y 11: marcador de peso molecular. En cada carril se cargaron 10

µg de proteína.

El análisis SDS-PAGE es de gran utilidad para asegurarrnos de que realmente

estemos extrayendo la concentración de proteína estimada mediante el método de Bradford.

Además, aún cuando los cuatro métodos permitieron la separación adecuada de las

proteínas mediante SDS-PAGE, solo estamos llevando a cabo su separación en base al peso

molecular. Lo que resulta en mezclas de proteínas altamente complejas. Esto no es

suficiente para la identificación de proteínas por espetrometría de masas. Incluso, esto no

permite inferir si estas serán separadas de manera adecuada en geles bidimensionales y así

determinar diferencias entre los distintos tratamientos. Por lo que realizar el análisis 2D-

SDS-PAGE es indispensable para decidir cuál será el mejor método de extracción a

emplear.


7.2. Electroforesis bidimensional (2D-SDS-PAGE)

Para una mejor separación de mezclas de proteínas, se llevó a cabo la 2D-SDS-

PAGE. Los cuatro métodos evaluados (Figura 6, 7, 8 y 9) han sido reportados previamente

para otros tejidos vegetales. Las imágenes son representativas del análisis por duplicado. La

comparación cuantitativa de extractos de proteínas usando los cuatro protocolos de

extracción reveló que el método de extracción con TCA-A fue el mejor en cuanto a

cantidad (20 spots) y calidad de proteínas resueltas en el análisis 2D-SDS-PAGE (Figura

8). Aún cuando en el análisis en primera dimensión (Figura 5) no evidenció muchas

diferencias en cuanto al patrón de proteínas obtenido por los diferentes métodos; en el

análisis 2D-SDS-PAGE hubo menor cantidad de spots resueltos para los métodos de Fenol-

A (10 spots, Figura 6), Fenol-B (8 spots, Figura 7) y TCA-B (4 spots, Figura 9). Es difícil

determinar los factores por los cuales se obtuvieron mejores resultados con el método de

TCA-A. Esto debido al análisis multifactorial de la muestra.

Estos resultados coinciden con los de Saravanan y Rose (2004) donde el método de

extracción con TCA proporciona mejoras en 2D-SDS-PAGE en base al análisis proteómico

de la mayoría de los tejidos vegetales. Pridmore et al. (1999) y Natarajan et al. (2005)

utilizaron un método de precipitación con TCA el cual aumentó la resolución de manchas

de proteínas individuales debido en parte a la inhibición de la actividad proteolítica.

Cascardo et al. (2001), Damerval et al. (1986) y Santoni et al. (1994) demostraron una alta

resolución de proteínas mediante 2D-SDS-PAGE usando el método de precipitación con

TCA en Arabidopsis thaliana y diferentes líneas de semillas de trigo.


3 10pI

M

1510

20

3025

506070100

KDa

Figura 6. Análisis 2D-SDS-PAGE de proteínas de hojas de frijol con el método de

extracción con Fenol-A. M. Indica marcador de peso molecular. 80 µg de proteínas fueron

enfocados en tiras IPG (pH 3-10, 7cm).

KDa3 10

pIM

29

45

6697

116


extracción con Fenol-B. M. Indica marcador de peso molecular. 80 µg de proteínas fueron



15

2530

4050

7060

20

100KDa

3 10pI

M


extracción con TCA-A. M. Indica marcador de peso molecular. 80 µg de proteínas fueron


3 10pI

M

25

30

40

50

7060

20

100KDa

80


extracción con TCA-B. M. Indica marcador de peso molecular. 80 µg de proteínas fueron



En el Cuadro 2 se presenta la cantidad de proteínas y el rango de pH en el que se

encuentran para cada método. Cabe mencionar que el número de proteínas encontradas en

el mejor método (TCA-A) son sólo 20 spots. Este número se verá incrementado en los geles

preparativos, donde se analizarán aproximadamente 500 µg por gel, es decir, cinco veces

más a lo empleado en estos ensayos analíticos.

Cuadro 2. Proteínas (spots) resueltas por cada uno de los diferentes métodos de

extracción.

Método de extracción No. de Spots Rango de pH

Fenol-A 10 5 a 7

Fenol-B 8 5 a 7

TCA-A 20 5 a 8

TCA-B 4 5 a 7

7.3. Análisis proteómico de plantas colonizadas con G. intraradices vs. no colonizadas

en dos variedades de frijol

7.3.1 Extracción en hojas de frijol

Para la identificación de patrones de proteínas inducidos en el proteoma de hoja de

frijol Az. Regional 87 e Higuera por la colonización con G. intraradices, el total de

proteínas de hojas de plantas de frijol inoculadas y no inoculadas fueron extraídas.

La extracción de las proteínas para evaluar el efecto de la micorrización en el tejido

foliar de frijol se llevó a cabo con el método modificado TCA-A (Saravanan y Rose, 2004)

descrito en la sección 6.2.3. Las extracciones de las diferentes condiciones (variedades Az.

Higuera y Az. Regional 87 ambas colonizadas y no colonizadas) se observaron

homogéneas al analizarse mediante SDS-PAGE (Figura 10), aún cuando se comparan las

proteínas de las dos distintas variedades de frijol, lo que muestra la limitante de la

comparación de proteínas separadas sólo en base a su peso molecular.


Figura 10. Análisis mediante electroforesis en gel desnaturalizante (SDS-PAGE) de

proteínas extraídas de hoja mediante el método de extracción TCA-A. Carril 1: marcador de

peso molecular; carril 2: frijol Az. Regional 87 colonizada con G. intraradices; carril 3:

frijol Az. Regional 87 no colonizado; carril 4: frijol Az. Higuera colonizado con G.

intraradices; carril 5: frijol Az. Higuera no colonizado. En cada carril se cargaron 10 µg de

proteína.

7.3.2. Perfil de proteínas inducido en hojas de frijol

En las Figuras 11, 12, 13 y 14 se muestran el patrón electroforético bidimensional

(2D-SDS-PAGE) de cada una de las plantas analizadas, en cada figura se exponen tres

geles bidimensionales que corresponden a las réplicas biológicas de los experimentos

realizados por Mora-Romero (2008). Las imágenes de los geles corresponden al formato

preparativo en tiras de gel de poliacrilamida en gradiente inmovilizado de 17 cm, pH 4-7,

de proteínas extraídas en hoja de plantas de frijol de dos variedades Az. Regional 87 y Az.

Higuera colonizadas con G. intraradices y no colonizadas.


Las imágenes de los geles preparativos bidimensionales se obtuvieron con la

finalidad de ser analizadas mediante el software PDQuest. Este software lleva a cabo el

análisis cualitativo o cuantitativo de proteínas mediante los estadísticos t-student y/o

mínimos cuadrados, promediando la intensidad por área (densidad del spot en pixeles) de

los spots (Cuadro 3) en base a tres réplicas (imágenes de geles bidimensionales) por

condición.

El análisis del perfil proteico de la variedad Az. Higuera colonizada con G.

intraradices comparado con la condición no colonizada de la misma variedad se observa

mediante un gel maestro (master gel) con el software PDQuest (Figura 15). Se observaron

un promedio de 200 proteínas (spots) distribuidas en un rango de pH de 4 a 7 y con un peso

molecular de 10 a 100 kDa. El análisis comparativo de proteínas reveló 5 proteínas

diferenciales las cuales disminuyeron su expresión de manera significativa en plantas

colonizadas comparadas con las no colonizadas (Cuadro 4) de acuerdo a los estadísticos t-

student y/o mínimos cuadrados (algunas proteínas resultaron diferenciales mediante los dos

estadísticos, spots en rojo y amarillo, Figura 15). Cabe mencionar que de acuerdo a Mora-

Romero (2008) la variedad Az. Higuera al encontrarse colonizada por G. intraradices no

mostró diferencias a la no colonizada respecto a la tolerancia contra el patógeno moho

blanco, como sí se observó en la variedad Az. Regional 87. Las pocas diferencias

observadas en los patrones de proteínas de Az. Higuera, podrían coincidir con los pocos

cambios a nivel fisiológico reportados previamente.


Figura 15. Gel maestro comparativo entre las proteínas de la variedad de frijol Az.

Higuera, colonizadas con G. intraradices vs. no colonizadas, obtenido en el

programa PDQuest.

El perfil proteico de la variedad Az. Regional 87 colonizada con G. intraradices al

ser comparado con la condición no colonizada de la misma variedad muestra un promedio

de 200 proteínas; las cuales tienen un intervalo en un rango de pH 4-7 y una masa

molecular de 20 a 100 kDa (Figura 16). El intervalo de las proteínas fue similar a lo

encontrado para las dos condiciones de la variedad Az. Higuera. El análisis comparativo del

patrón de proteínas reveló 14 proteínas diferenciales: una proteína cualitativa (que se

encuentra en las plantas colonizadas y no en las plantas sin colonizar, indicada en azul en

Figura 16) y 13 proteínas cuantitativas donde 11 aumentan su expresión y dos la

disminuyen en cuanto a plantas micorrizadas comparadas con las plantas no micorrizadas

(Cuadro 5) de acuerdo a los estadísticos t-student y/o mínimos cuadrados (algunas

proteínas resultaron diferenciales mediante los dos estadísticos, spots en rojo y amarillo,

Figura 16).

De acuerdo a Mora-Romero (2008), la variedad Az. Regional 87 mostró un

incremento a la tolerancia al moho blanco al encontrarse bajo la condición micorrízica, esto

en tejido foliar, por lo que es de gran interés la interpretación de las 14 proteínas

diferenciales, donde 13 de estas aumentaron su expresión en la condición micorrízica.


Figura 16. Gel maestro comparativo entre las proteínas de la variedad de

frijol Az. Regional 87, colonizadas con G. intraradices vs. no colonizadas, obtenido

en el programa PDQuest.

Para darnos una idea de qué tanto aumentaron o disminuyeron los spots inducidos,

se llevó a cabo una relación de densidad de spots. Se obtuvo el promedio de densidad del

spot (pixeles) de tres réplicas por condición (Cuadro 4 y 5). La relación de densidad se

obtuvo en base a plantas colonizadas con G. intraradices con respecto a no colonizadas de

cada variedad. La flecha indica un aumento (↑) o una disminución (↓) en la expresión de

proteínas de plantas colonizadas con G. intraradices con respecto a no colonizadas, la

ausencia de flecha indica una proteína cualitativa (Cuadro 4 y 5).


Cuadro 4. Relación de densidad de proteínas expresadas diferencialmente en hojas

de plantas de frijol Az. Higuera

Código del Spot Expresión Relación de Densidad5203 ↓ 0.315803 ↓ 0.335804 ↓ 0.366302 ↓ 0.537001 ↓ 0.41

Cuadro 5. Relación de densidad de proteínas expresadas diferencialmente en hojas

de plantas de frijol Az. Regional 87.

Código del Spot Expresión Relación de Densidad37011205 ↑ 1.982302 ↑ 3.472802 ↑ 2.663201 ↑ 1.983801 ↑ 2.525205 ↑ 4.495503 ↑ 2.266201 ↑ 3.346301 ↑ 1.496404 ↑ 1.837801 ↑ 2.76301 ↓ 0.80

2401 ↓ 0.50

Cualitativa


Un total de 19 spots fueron inducidos (aumento o disminución en intensidad*area

del spot, en base a los estadísticos mencionados). Un aumento de expresión de proteínas de

plantas colonizadas vs. no colonizadas de las dos variedades, se presentó en una relación de

densidad que va de 1.49 a 4.49 y una disminución de expresión en un rango menor de 0.8.

Los spots presentados en el Cuadro 4 y 5 se enviaron a identificar mediante LC-MS/MS a

la Unidad de Proteómica del Instituto de Biotecnología de la UNAM en Cuernavaca,

Morelos. En la variedad Az. Higuera de 5 péptidos enviados se obtuvo la secuencia de 3

(Cuadro 6) y en la variedad Az. Regional 87 de 14 enviados se obtuvo la secuencia de 11

péptidos (Cuadro 7). Las secuencias fueron analizadas en la base de datos del NCBI

(Cuadros 8 y 9), los valores teóricos de punto isoeléctrico y peso molecular de las

proteínas de las secuencias obtenidas se analizaron con el programa EXPASY para la

confirmación final de acuerdo a sus posiciones en el mapa del gel 2D-SDS-PAGE.


7.4. Interpretación del papel funcional de proteínas implicadas en la simbiosis

micorrízica arbuscular

La descripción de cambios en transcritos o proteínas en parte aérea de la planta

como respuesta a la simbiosis micorrízica se plantea de interés, debido a las observaciones

de que la simbiosis incrementa la tolerancia a distintos tipos de estrés. En el caso de frijol,

se tienen evidencias en nuestro grupo de trabajo de la inducción de tolerancia por

micorrización a S. sclerotiorum, un hongo de importancia agronómica. Existen reportes

adicionales de la inducción de tolerancia por micorrización en otros sistemas planta-HMA-

patógeno foliar (Lingua et al., 2002; Fritz et al., 2006; Liu et al., 2007; Galindo-Flores,

2008), sin embargo los reportes son escasos. En el caso de la descripción de cambios

transcripcionales como respuesta a la simbiosis micorrízica, sólo existen dos reportes

basados en análisis de microarreglos en parte aérea de plantas colonizadas con HMA: Liu

et al. (2007) en M. truncatula, una planta leguminosa, y Fiorelli et al. (2009) en tomate,

una solanácea. El objetivo de este estudio fue la identificación de proteínas inducidas

diferencialmente en hojas de dos variedades de frijol, una que respondió a la colonización

induciendo tolerancia a S. sclerotiorum (Az Regional 87) y otra que no mostró tal

inducción por la colonización micorrízica con G. intraradices. Estas proteínas podrían estar

potencialmente relacionadas a la tolerancia observada contra el patógeno foliar. Cambios

significativos en el perfil de proteínas fueron detectados en las hojas de P. vulgaris en

asociación simbiótica con G. intraradices. Considerando las dos variedades de frijol, se

obtuvo la identificación de 14 proteínas expresadas diferencialmente en hojas en respuesta

a la simbiosis MA, tres para Az Higuera, y 11 para Az Regional 87. Dentro de estas

proteínas, algunas de ellas fueron detectadas como diferenciales en ambas variedades. Una

de las proteínas encontradas en ambas variedades no ha sido reportada previamente en

tejidos vegetales (spots 7001 y 1205), una identificada como una proteína de función

desconocida (spot 2302) y once proteínas cuya función ya ha sido descrita con

anterioridad (spots, 5803, 5804, 3701, 2802, 3801, 5503, 6201, 6301, 6404, 7801 y 2401)

(Cuadro 6 y 7).

Liu et al. (2007) identificaron 468 genes cuya expresión aumentó y 131 genes cuya

expresión disminuyó en hojas de plantas de M. truncatula colonizadas con G. intraradices

con respecto a hojas de plantas no colonizadas. Aproximadamente el 25% de los genes


inducidos en hojas de plantas colonizadas por HMA pudieron asociarse in silico con

proteínas involucradas en mecanismos de defensa descritos en otros sistemas, sugiriendo

que la micorrización podría estar induciendo un mecanismo de defensa en la parte aérea de

las plantas.

Peinado-Guevara (2010, en revisión) encontró 27 proteínas expresadas

diferencialmente en hojas de plantas de tomate colonizadas con G. intraradices comparadas

con plantas no colonizadas. La mayoría de las proteínas identificadas disminuyeron su

expresión en la condición colonizada y fueron proteínas relacionadas a la fotosíntesis y al

estado celular de óxido-reducción. Una proteína reportada en raíces de plantas colonizadas

cuyo papel funcional se desconoce y una proteína importante en defensa de plantas fueron

encontradas inducidas.

Por otro lado, Mora-Romero (2008) reportó que plantas de frijol de la variedad Az.

Regional 87 en la condición colonizada con G. intraradices muestran tolerancia al moho

blanco (S. sclerotiorum), ésto, a diferencia de la variedad Az. Higuera también en la misma

condición, la cual fue susceptible al patógeno bajo las mismas condiciones de cultivo. En

base a esto, se sugiere que las proteínas diferenciales pueden estar relacionadas a tal

tolerancia observada. En plantas colonizadas por HMA de la variedad capaz de inducir

tolerancia (Az. Regional 87), la mayoría de las proteínas aumentaron su expresión con

respecto a la otra variedad (Az. Higuera). Ya que Az. Higuera fue incapaz de inducir

tolerancia a S. sclerotiorum, y en esta variedad se presentó un número menor de proteínas

diferenciales (tres proteínas diferenciales), mientras que en Az Regional 87 se identificaron

11, de las cuales 10 aumentaron su expresión en la condición colonizada, es posible sugerir

que al menos algunas de las proteínas diferenciales identificadas en Az Regional 87,

pudieran estar relacionadas con un mecanismo de inducción de tolerancia por

micorrización, o preacondicionamiento, tal como el observado en respuesta inducida por

rizobacterias promotoras de crecimiento (Van Loon et al., 1998).


7.4.1. Análisis proteómico en hojas de plantas de frijol de la variedad Az. Higuera

susceptible y Az. Regional 87 tolerante a S. sclerotiorum en asociación con G.

intraradices

El análisis proteómico de planta colonizada con G. intraradices vs. no colonizada de

de la variedad Az. Higuera, la cual no mostró inducción de tolerancia a S. sclerotiorum

reveló cinco proteínas diferenciales, las cuales disminuyeron su expresión en plantas

colonizadas. De estas cinco proteínas, se lograron identificar tres, una de ellas fue

identificada como una proenzima llamada tripsinógeno (Cuadro 6: spot 7001) y las otras

dos corresponden a transcetolasas (Cuadro 6: spot 5803 y 5804).

El spot 7001 identificado como una proenzima llamada tripsinógeno y reprimida en

Az. Higuera, fue encontrado sobreexpresado en Az. Regional 87 (spot 1205). Este péptido

ha sido reportado en jabalí (Sus acrofa) y en otros tejidos animales. Muchas de las tripsinas

son sintetizadas como zimógenos o proenzimas los cuales son precursores inactivos de las

enzimas. Las proenzimas se rompen durante la proteólisis para generar sus formas activas.

Las enzimas digestivas, algunos factores de la coagulación y otras proteinas son

sintetizadas como zimógenos. Sin embargo, esta proteína no ha sido reportada previamente

en tejidos vegetales. Por lo que se sugiere llevar a cabo estudios mas detallados en base a la

funcionalidad de esta enzima en plantas colonizadas.

Los spots 5803 y 5804 (cuadro 6) los cuales en la variedad Az. Higuera disminuyen

su expresión en hojas plantas colonizadas con respecto a no colonizadas, fueron

identificados como transcetolasas. Una transcetolasa también se encontró inducida en hojas

de la variedad Az. Regional 87 (Cuadro 7: spot 6301), la cual corresponde al mismo

péptido encontrado en Az. Higuera (spot 5804). Sin embargo en Az. Regional 87 se obtuvo

un efecto contrario, en esta variedad esta proteína se encontró inducida en la condición

colonizada. Transcritos correspondientes a estos péptidos (Spots 5804 y 6301) se

encontraron expresados diferencialmente en hojas de plantas de Platanus acerifolia tratadas

con la proteína fitotóxica cerato-platanina (Fontana et al., 2008) la cual inhibe el

crecimiento del patógeno Ceratocystis. Sus resultados también muestran diferentes

proteínas involucradas en la fotosíntesis tal como una proteína ferredoxina A, la ribulosa

1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa y enzimas cloroplásticas del fotosistema I y II. En

nuestros resultados, además de transcetolasas también encontramos otras proteínas


inducidas relacionadas a fotosíntesis (Cuadro 7: spots 2802, 3801, 5503, 6201, 6301, 6404

y 7801). En la variedad Az. Regional 87 (la cual muestra tolerancia a S. sclerotiorum en

condiciones de micorrización) se encontró un mayor perfil de proteínas inducidas en el

análisis proteómico (colonizadas vs. no colonizadas), la mayoría involucradas en el proceso

de fotosíntesis. Estas enzimas son: fructosa bifosfato aldolasa isoenzima citoplásmica (spot

5503), triosa fosfato isomerasa (spot 6201), ribulosa bifosfato carboxilasa subunidad grande

(spot 7801), ferredoxina-NADP reductasa isoenzima de hoja cloroplástica (spot 6404), ATP

sintasa CF1 subunidad alfa (spot 2802) y ATP sintasa subunidad B unida a membrana (spot

3801).

Nuestros resultados se podrían correlacionar con varios reportes que demuestran

que la fotosíntesis se incrementa en plantas en diferentes asociaciones simbióticas: Glycine

max colonizado con G. mosseae (Brown y Bethlenfalvay, 1988), tomate colonizado con G.

fasciculatum (Sanchez-Rocha et al., 2005), Citrus aurantium asociado con G. intraradices

(Johnson, 1984) y C. tangerine colonizado con G. versiforme (Wu and Xia, 2006).

A nivel proteómico en parte aérea, nuestros resultados coinciden con los obtenidos

por Shoresh y Harman (2008). Ellos encontraron una gran cantidad de proteínas inducidas

involucradas en el metabolismo de carbono en la asociación simbiótica de plántulas de

maíz colonizadas con el hongo T. harzianum. Algunas de las proteínas reguladas coinciden

con nuestros resultados, estas incluyen: fructosa bifosfato aldolasa (spot 5503) y la

subunidad grande de la ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (spot 7801).

Trichoderma harzianum al igual que G. intraradices es un agente de biocontrol y en ambos

sistemas su efecto en parte aérea de plantas, ocasiona cambios en el metabolismo de

carbono, lo cual probablemente prepara a la planta para la producción de subsecuentes

elicitores.

A nivel de genes en parte aérea, nuestros resultados también coinciden con los de

Liu et al. (2007). El patrón de expresión de transcriptos en hojas de M. truncatula

colonizadas con G. intraradices, mostró la sobreexpresión de genes que codifican para

proteínas relacionadas a fotosíntesis tales como ATP sintasa (ATPasa subunit IV), y la

subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilasa. Estos resultados son similares en

plantas de Az. Regional 87 (Spots: 2802, 3801 y 7801).


El ciclo de calvin es un ciclo llevado a cabo por organismos eucarioticos

fotosintéticos con la finalidad de reducir el dióxido de carbono a carbohidratos.

Transcetolasas participan en varias reacciones del ciclo de calvin. En base a esto se podría

sugerir que la fotosíntesis aumenta en condiciones de estrés/defensa de la planta a través de

la sobreexpresión de transcetolasas. Esto podría jugar un papel en la inducción de la

tolerancia a patógenos foliares por micorrización. Por lo que la sobreexpresión de enzimas

involucradas en fotosíntesis en la planta como transcetolasas, puede ser interpretada como

una respuesta de defensa de la misma al ataque por un patógeno.

Un efecto contrario se presenta en otros reportes como el de Fiorilli et al. (2009)

llevado a cabo en hojas de tomate colonizadas por el HMA G. mosseae y el trabajo de

Peinado-Guevara (2010, en revisión) llevado a cabo en hojas de tomate colonizadas con G.

intraradices, donde la mayoría de los genes y proteínas relacionadas a fotosíntesis

disminuyen su expresión. Galindo-Flores (2008), reporta una inducción de tolerancia en

hojas de plantas de tomate colonizadas con G. intraradices y retadas con el patógeno X.

campestris. Se ha demostrado en muchas interacciones planta-microorganismo que la

respuesta a una condición es dependiente del sistema involucrado. Aquí ambos sistemas

consisten en la asociación de un HMA con plantas de tomate y el estudio se llevó a cabo en

parte aérea. Probablemente esta asociación, requiera de la disminución de fotosíntesis como

un mecanismo para preparar a la planta contra diferentes tipos de estrés.

Un transcrito correspondiente a la enzima biosintética de tiamina fue reportada

disminuida en su expresión para M. truncatula por Liu et al. (2007). De manera interesante

se observó que en frijol Az. Regional 87 una proteína correspondiente a una enzima

biosintética de tiamina también disminuye su expresión (spot 2401). La tiamina funciona

como precursor de la tiamina difosfato la cual sirve como coenzima de enzimas

involucradas en varias rutas metabólicas como el ciclo del ácido tricarboxilico, ciclo de

Calvin, y en la biosíntesis de pigmentos en plantas (Friedrich, 1987). Además,

recientemente se ha reportado que tiene funciones como cofactor en respuesta a estrés

biótico y abiótico en plantas.

Rapala-Kozik et al. (2008), reportaron un aumento en el contenido de tiamina, en

hojas de plántulas de maíz bajo condiciones de estrés abiótico (sequía, salinidad y estrés

oxidativo). Además de que en este estudio también reportan un incremento en


transcetolasas (proteína ya discutida anteriormente) bajo condiciones de salinidad y estrés

oxidativo.

Tunc-Ozdemir et al. (2009), demostraron la acumulación de tiamina y pirofosfato

de tiamina en hojas de plantas de A. thaliana bajo condiciones de estrés oxidativo como

salinidad, frío, elevada intensidad de luz y tratamientos oxidativos. La acumulación de

tiamina y pirofosfato de tiamina fue acompañado con la expresión de transcriptos que

codifican para enzimas biosintéticas de tiamina. Las investigaciones muestran un aumento

en actividad de la enzima de la biosíntesis de tiamina en plantas bajo la condición de estrés

abiótico. Sin embargo, en nuestro trabajo y en el de Liu et al. (2007) se observa un efecto

contrario. La proteína enzima biosintética de tiamina disminuye su expresión en plantas

colonizadas con HMA. Análisis proteómicos en parte aérea de plantas de Az. Regional 87

colonizada con el hongo y retada con el patógeno podrían llevarse a cabo, para observar el

efecto del patógeno en la expresión de estas proteinas.

El trabajo de Liu et al. (2007) es el único trabajo de expresión diferencial de genes

llevado a cabo en parte aérea de plantas leguminosas colonizadas con un HMA. Los autores

reportaron un incremento a la tolerancia al patógeno foliar X. campestris en parte aérea de

plantas micorrizadas con G. intraradices, fenómeno similar a lo observado por Mora-

Romero (2008) en parte aérea de la variedad Az. Regional 87. En el trabajo de Liu et al.

(2007) se identificaron un número elevado genes diferenciales, aunque el número de

proteínas diferenciales encontradas en este trabajo corresponden a un número mucho

menor. Esto refleja las diferencias técnicas de las dos metodologías. Además, la proteómica

de plantas cuando está enfocada a evaluar tejido completo, presenta la dificultad que la

proteína Rubisco es la mayoritaria, haciendo difícil la detección de proteínas menos

abundantes. Estos resultados también abren la necesidad de llevar a cabo esfuerzos para

realizar subproteomas, buscando estrategias para la optimización del método de extracción

y el análisis bidimensional, con lo cual se podrían analizar distintos grupos de proteínas.

Se encontró sobreexpresada en la variedad Az. Regional 87 en condiciones de

micorrización una proteína de función desconocida (spot 2302). Esta proteína no se

encontró diferencialmente regulada en la variedad Az. Higuera. Experimentos posteriores,

resultan necesarios para establecer la función de esta proteína.


La inducción de una proteína identificada como tipo alfa faseolina (Cuadro 7: spot

3701), detectada solamente en la parte aérea de la variedad tolerante en la condición

micorrizada, podría estar directamente relacionada con la simbiosis de la planta con G.

intraradices y podría jugar un papel importante en la inducción de tolerancia por

micorrización. Es interesante la presencia de la alfa faseolina, ya que ésta pertenece a la

familia de las globulinas 7S, las cuales son proteínas de almacenamiento en grano, lo que

nos indica las repercusiones que pueden estarse presentando en las plantas colonizadas por

HMA a nivel de expresión génica. Por esto, trabajos posteriores deberán realizarse para

conocer la función que desempeña esta proteína en parte aérea en plantas micorrizadas.

En el presente estudio se encontró un perfil de proteínas diferenciales contrastantes

en hojas de plantas colonizadas con G. intraradices de la variedad Az. Regional 87, la cual

mostró inducción de tolerancia al patógeno S. sclerotiorum y Az. Higuera, la cual fue

incapaz de inducir tal tolerancia. Esto podría sugerir que al menos algunas de las proteínas

encontradas como reguladas de manera diferencial están participando en un mecanismo de

bioprotección que enciende la MA en la variedad Az. Regional 87 y que la preparan para

enfrentar a condiciones de estrés posteriores. Lo que implica que el mecanismo involucrado

es dependiente de la variedad, ya que en Az. Higuera se presenta un efecto contrario en el

patrón de expresión de proteínas.


VIII. CONCLUSIONES

El método de extracción de proteínas más adecuado, en hojas de frijol para

electroforesis bidimensional, involucra la precipitación con TCA/Acetona.

La proteómica comparativa es una herramienta que nos permitió la identificación de

proteínas que pudieran estar involucradas en la resistencia que se induce por

micorrización.

Las proteinas diferenciales transcetolasa y tripsinógeno, se encontraron reguladas de

manera distinta en hojas de plantas colonizadas con G. intraradices. En la variedad

Az. Regional 87 (la cual mostró inducción de tolerancia al patógeno S.

sclerotiorum) aumentaron su expresión y Az. Higuera (la cual fue incapaz de

inducir tal tolerancia) disminuyeron su expresión. Además, la proteína alfa faseolina

fue encontrada solo en la variedad Az. Regional 87 colonizada con G. intraradices.

Lo cual sugiere que estas proteínas podrían jugar un papel importante en la

inducción de la tolerancia a patógenos foliares por micorrización.

La mayoría de las proteínas inducidas en Az. Regional 87 corresponden a enzimas

implicadas en fotosíntesis: transcetolasa, fructosa bifosfato aldolasa isoenzima

citoplásmica, triosa fosfato isomerasa, ribulosa bifosfato carboxilasa subunidad

grande, ferredoxina-NADP reductasa isoenzima de hoja cloroplástica, ATP sintasa

CF1 subunidad alfa y ATP sintasa subunidad B unida a membrana. Por lo que se

sugiere que la fotosíntesis está siendo inducida por la MA en condiciones de

estrés/defensa de la variedad Az. Regional 87 colonizada con G. intraradices. Lo

cual puede ser interpretado como una respuesta de defensa de la variedad Az.

Regional 87 colonizada con G. intraradices al ataque por un patógeno.


Al menos algunas de las proteínas encontradas como reguladas de manera

diferencial están participando en un mecanismo de bioprotección que enciende la

MA en la variedad Az. Regional 87 y que la preparan para enfrentar a condiciones

de estrés posteriores. Lo que implica que el mecanismo involucrado es dependiente

de la variedad, ya que en Az. Higuera se presenta un efecto contrario en los patrones

de acumulación de algunas proteínas analizadas.

Este es el primer trabajo realizado con proteómica en la parte aérea de plantas de

frijol en donde se hace el estudio comparativo de proteínas que se inducen por

micorrización.


IX. RECOMENDACIONES

• Primeramente se sugiere fortalecer la infraestructura en cuanto al equipo y material

utilizado en en análisis proteómico.

• Perfeccionar aún más el método de extracción de proteínas mediante TCA-A, para

lograr un patrón más alto de proteínas. Ya que el análisis del proteoma es el

resultado de una combinación una serie de técnicas y posiblemente estemos

perdiendo una gran cantidad de proteínas.

• Generar oligonucleótidos para el gen que codifica para la proteína cualitativa alfa

faseolina y llevar a cabo experimentos en plantas colonizadas y no colonizadas y

además retadas con el patógeno y asi determinar si el gen es específico de

resistencia inducida por micorrización e interpretar su papel en la inducción de

tolerancia.

• Se recomienda realizar experimentos llevando a cabo el silenciamiento o

sobreexpresión de genes que codifican para las proteínas diferenciales encontradas.

Especialmente de las proteínas encontradas de manera constrastante en las dos

variedades, tripsinógeno y transcetolasa, así como la proteína cualitativa, alfa

faseolina. Esto mediante la tecnología de transgénicos y retando con el patógeno

para comprobar su función en la defensa sistémica de la planta.


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