para la optimización de sistema de liberación controlada de … · paro del ciclo celular...

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Utilización de modelos celulares in vitro para la optimización de sistema de liberación controlada de antitumorales María Jesús Garrido Dpto. Farmacia y Tecnología Farmacéutica Universidad de Navarra

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Utilización de modelos celulares in vitropara la optimización de sistema de

liberación controlada de antitumorales

María Jesús GarridoDpto. Farmacia y Tecnología Farmacéutica

Universidad de Navarra

¿Por qué sistemas in vitro?l Permiten explorar y cuantificar procesos propiamente

celulares además, de procesos o mecanismos debidos a la acción del agente que se ensaye.

l Es posible medir la evolución temporal de una respuesta concreta.

l Posibilidad de evaluar combinaciones farmacológicas.

Principal Limitaciónl Se ignoran procesos de regulación o feed-back

debidos a la propia fisiología o fisiopatología del individuo.

Antitumorales• Principales Mecanismos:

-Mecanismos Citostáticos-Mecanismos Citotóxicos

Mecanismo de Acción Fármaco

Citostático

Citotóxico

Tiempo de exposición al fármaco antitumoral

Viabilidad celular

Tiempo (h)

Cél

ulas

x 1

000

0 20 40 60

1020

4060

8010

0

> concentración fármaco >Inhibición crecimiento celular

basal> concentración fármaco > muerte celular

Ejemplo de ambos mecanismosCamptothecina

0

20

40

60

80

100

0 12 24 36 48 60 72

Tiempo (h)

Cél

ulas

*100

0

C

10nM

100nM

400nM

500nM

1000nM

Topotecan

0

20

40

60

80

100

0 12 24 36 48 60 72

Tiempo (h)

Cél

ulas

*100

0

C

100nM

500nM

1000nM

1500nM

2000nM

Cisplatino

0

20

40

60

80

100

0 12 24 36 48 60 72

Tiempo (h)

NºC

élul

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000

C

2.5mM

10mM

25mM

50mM

100mM

200mM

CISPLATINO (CDDP)

Pt

NH3

Cl

Cl

NH3

• Agente alquilante � uniones de tipo covalente ADN

• Capacidad antitumoral en gran variedad de tumores sólidos (testículo, ovario, vejiga, pulmón …)

• Eficacia limitada en cáncer de colon

• Alta toxicidad y fenómenos de resistencia

Cisplatino

Antecedentes:• Administraciones continuas de niveles subterapéuticos causaban

una activación mayor de apoptosis que una administración de

dosis elevada.

• Nanopartículas de paclitaxel eran capaces de superar los fenómenos

resistencia.

Objetivos

• Desarrollar formulaciones de liberacióncontrolada para disminuir la toxicidad y/oaumentar la eficacia del cisplatino.

• La caracterización in vitro del efectoantiproliferativo de las distintas formas de liberación controlada de cisplatino.

– Combinando sistemas de cultivos celulares y técnicas de modelización matemática

Caracterización de los perfiles de liberación de cisplatino desde las distintas formulaciones

0

0.4

0.8

1.2

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Time (days)

Cu

mu

lati

ve F

ract

ion

al R

elea

se (

Ft)

NP-ANP-BMP

Ecuación

( ) ( ))( 502

1

11 Ttk

tkt

eB

eAMM

−−×−

∞ ++−×=

where, A is the fraction of drug released during the phase I, k1 is the release rate constant during this phase; B is the fraction of total drug released during the phase III, k2 is the release rate constant during this phase and T50 is the time taken to release 50% of entrapped drug

- Fase de difusión: A y k1- Fase de entrada de agua a la matriz: T50- Fase de degradación de la matriz: B y k2

Descripción de los perfiles de liberación de cisplatino

0 5 10 15 20 25 30 35Time (days)

0.1

0.7

0.1

0.7

0.1

0.7

MP

NP-A

NP-B

Ft (

Mt/M

∞)

Aplicación de las diferentes formas farmacéuticas

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Descripción del efecto antiproliferativo

CISPLATINO (CDDP)

PtNH3

Cl

Cl

NH3

•••• Agente alquilante � uniones de tipo covalente ADN

ADUCTOS CDDP-ADNINHIBICIÓN PROCESOS TRANSDUCCIÓN Y REPLICACIÓN

PARO DEL CICLO CELULAR(Sistemas Control Celular: CHECKPOINT)

ACTIVACIÓN CASCADA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES APOPTÓTICASPROTEASAS FAMILIA CASPASAS � CASPASA-3

MUERTE CELULAR PROGRAMADA � APOPTOSIS / MUERTE MITÓTICA(FRAGMENTACIÓN DEL ADN)

ACUMULACIÓN CÉLULAS FASE G2/M

Cisplatino

Mecanismo de acción

N

Proliferación

Cisplatino

+

Señal

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+

Muerte celular

Mecanismo de acción “in vitro”Modelo de citotoxicidad

ModelizaciónCisplatino Mecanismo de Acción Citotóxico

Time (h)

Cel

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0 20 40 60

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Mecanismo de acción “in vitro”Modelo de citotoxicidad

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Descripción del efecto antiproliferativo

Mecanismo de acción

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45

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15

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0 10 24 48 72 144

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15

30

45

60

0 10 24 48 72 1440

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0 10 24 48 72 144

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15

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0 10 24 48 72 1440

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0 10 24 48 72 144

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0 10 24 48 72 1440

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0 10 24 48 72 144

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0 10 24 48 72 144

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0 10 24 48 72 1440

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0 10 24 48 72 1440

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Ciclo celularActivación Caspasa-3

0

0.5

1

1.5

0 3 10 24 48 72 144

0

0.5

1

1.5

0 3 10 24 48 72 144

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0 3 10 24 48 72 144

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1

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0 3 10 24 48 72 1440

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0 3 10 24 48 72 144

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Aplicación in silico para optimizar las formulaciones

Conclusiones• Mediante esta estrategia fue posible identificar y

cuantificar dos mecanismos de acción para el cisplatino:– El primero: “inhibición de la proliferación” apoyado por

el efecto observado en ciclo celular– El segundo muerte celular por activación de la vía

apoptótica debida a la caspasa-3.• El modelo concentración-efecto propuesto tuvo

características semi-mecanicista apoyadas por los resultados observados, y resultó una buenaherramienta para explorar in sílico la optimizaciónde las formulaciones para su posterior uso en sistemas in vivo

NANOPARTÍCULAS CISPLATINO

EFICACIA TOXICIDAD

FARMACOCINÉTICA

FARMACODINAMIA

Perfiles temporales de las concentraciones plasmáticas de

cisplatino

0.01

0.1

1

10

100

0 5 10 15 20

CDDP IV CDDP IP NP B IP

CD

DP

conc

entr

ació

n (m

g/L

Pt)

Tiempo (días)

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3

Evolución temporal del efecto antitumoral:cisplatino libre vs. encapsulado

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 5 10 15 20 25 30

Time (days)

Tum

or v

olum

e (m

m3 )

Control

NP-empty

Cisplatin iv

Cisplatin ip

NP-B ip

Evolución temporal del efecto tóxico:cisplatino libre vs. encapsulado

0.75

0.90

1.05

1.20

0 5 10 15 20 25 30

Time (days)

Rel

ativ

e cha

nge i

n bo

dyw

eigh

t

Control

Cis I.V.

Cis I.P.

NP-B I.P.

0.75

0.90

1.05

1.20

0 5 10 15 20 25 30

Time (days)

Rel

ativ

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eigh

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Control

Cis I.V.

Cis I.P.

NP-B I.P.

Biodistribución del cisplatino y actividad apoptótica inducida en tumor

Drug levels (µg cisplatin /g tissue)

Caspase-3 (pg/ g tissue)

Lung Liver Kidneys Spleen Tumor Tumor

Control n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 21.2± 12.3a

Cisplatin 0.4 ± 0.2 3.6 ± 1.3 5.1 ± 1.4 2.3 ± 1.4 1.1± 0.6 46.1± 26.0b

Cisplatin-NP

0.4 ± 0.1 2.1 ± 0.9 5.9 ± 1.9 6.5 ± 1.8* 0.12± 0.06* 98.8±23.8*a,b

NP: presentaron similar eficacia y menor toxicidad