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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS

MAESTRIA EN BIOLOGÍA MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA

PAPEL DE LA MICROGLIA Y LA SEROTONINA EN LA HIPERALGESIA INDUCIDA POR ESTRÉS REPETIDO

Trabajo presentado para optar al Grado de Magíster Scientiarum en Biología, Mención Inmunología Básica.

Autor: Shirley Medina de Leendertz, Licda.

C.I.: 6913159

Tutor: Dr. Heberto Suárez Roca

C.I.: 4.533.204

Maracaibo, Septiembre de 2007

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PAPEL DE LA MICROGLIA Y LA SEROTONINA EN LA HIPERALGESIA INDUCIDA POR ESTRÉS REPETIDO

Trabajo presentado para optar al Grado de Magíster Scientiarum en Biología, Mención Inmunología Básica.

Autor: Shirley Medina de Leendertz, Licda. C.I.: 6913159

E-mail: [email protected] Tutor: Dr. Heberto Suárez Roca

C.I.: 4.533.204 E-mail: [email protected]

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ACTA VEREDICTO

Este jurado aprueba el Trabajo de Grado titulado ¨PAPEL DE LA MICROGLIA Y LA SEROTONINA EN LA HIPERALGESIA INDUCIDA POR ESTRÉS REPETIDO¨, que la Licenciada en Biología Shirley Medina de Leendertz C.I.: 6.913.159, presenta ante el Consejo Técnico de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias, en cumplimiento de los requisitos señalados en los Artículos del Reglamento de Estudios para Graduados para optar al titulo de MAGISTER SCIENTIARUM EN BIOLOGÍA, MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA.

Jurado:

MSc. Sandra Azuero de G. Dra. María Zabala (Coordinadora) (Jurado Principal) C.I.7.885.249 ׃ C.I.7.492.506 ׃

Dr. Hector Pons P. (Jurado Principal) C.I.4.521.139 ׃

Maracaibo, Septiembre 2007

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AGRADECIMIENTOS:

• A mis padres, a mi esposo e hijas, a mis hermanos y sus familias todos

un hermoso regalo de Dios.

• Mis más sincero agradecimiento a mi tutor Dr. Heberto Suarez y al MSc .

Luis Quintero hombres pacientes, espectaculares personas, muy buenos

amigos y maestros, a todos los compañeros del Laboratorio de

Farmacología del Instituto de Investigaciones Clínicas Edixon,

Jacqueline, Ricardo y Heisher todos personas inigualables muy buenos

amigos.

• A los que laboran conmigo y el Dr. Ernesto Bonilla por permitirme seguir

creciendo profesionalmente, a todo el personal del Instituto de

Investigaciones Clínicas todas personas muy especiales y de las que en

momentos difíciles recibí todo su apoyo.

• A todos mis amigos, maravillosas personas que siempre están a mí

alrededor brindándome su amistad, su amor, su paciencia y sus

conocimientos a todos gracias.

15

DEDICATORIA: A Dios espíritu renovador de vida, creación vibrante y sabiduría infinita que esta

en mí y en todos seres del mundo. A mis padres los amo, a mi esposo e hijas

fuente de amor, comprensión y paciencia son mi vida, a mis hermanos y a

todos mis familiares doy gracias por ser tan afortunada de tenerlos a todos a mi

lado. A Norma y King por su apoyo. A mi madre y padre espiritual Gloria y

Rubén, y a todos mis queridos amigos ellos saben quienes son.

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INDICE DE CONTENIDO Pág.

Índice de figuras vii

Resumen ix

Abstract x

1. Introducción 11

2. Revisión Bibliográfica 20

3. Objetivos 36

3.1. Objetivo General 36

3.2. Objetivos Específicos 36

4. Metodología 38

4.1. Animales de experimentación 38

4.1.1. Modelo Experimental 1 38

4.1.1.2.- Nocicepción Química 39

4.1.1.3. Protocolo de Inmunohistoquímica para microglia 41

4.1.2. Modelo experimental 2 44

4.1.3. Modelo experimental 3 45

4.1.3.1. Protocolo de Inmunohistoquímica para c-Fos 46

4.2. Análisis estadístico 49

4.3. Análisis de las Imágenes 50

5. Resultados 51

6. Discusión 63

7. Conclusión 77

8. Referencias Bibliográficas 81

17

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA Pág

1 Curva de intensidad del estímulo vs. sensación dolorosa 29

2 Diseño Experimental 1 44



5 Cambios morfológicos de la Microglia. A microglia en reposo, B microglia activada y C microglia totalmente activa como macrófago. 52

6 Microfotografía (100X) mostrando los cambios en OX-42 en el asta dorsal espinal L4-5 de ratas, 1 día después de la inyección con formalina. Insertadas en cada una magnificación a 400X. Protocolo conductual (A) nado forzado (B) simulacro de nado (C) no manipulada y (D) Nado forzado + minociclina. 55

7 Curvas de respuesta nociceptiva. Todas las ratas fueron sometidas a la prueba de formalina. A) Ratas sometidas a los procedimientos condicionantes, mostrando respuestas hiperalgésicas en ratas estresadas, * representa una diferencia significativa con p< 0,001 de las ratas salinas estresadas al compararlas con ratas no manipuladas, B) Las ratas sometidas a nado forzado mostraron una respuesta hiperalgésica frente a la prueba de formalina, inhibida al pretratarlas con minociclina,

representa una diferencia significativa con p<0,001 de las ratas salinas estresadas al compararla con ratas estresadas y pretratadas con minociclina, C) simulacro de nado, D) no manipuladas. Las barras representan 2 períodos de no observación conductual (15 min. Cada unos). 56

8 Declive progresivo del tiempo de lucha después de la sección de nado forzado repetido una dosis baja de un inhibidor de la recaptación de serotonina clomipramina (2,5 mg/Kg, i.p. por día) y Minociclina una tetraciclina (40 mg/Kg)*

vii

18

representa una diferencia significativa con p<0,0001 al compararla con minociclina. 57 9 Curvas de respuesta nociceptiva. Todas las ratas sometidas a la prueba de formalina. A) Las ratas sometidas a nado

forzado mostraron una respuesta hiperalgésica frente a la prueba de formalina, conductual (15 min cada unos). Cada punto representa la media ± el error estándar obtenido de 6 ratas representa una diferencia significativa de p< 0.01 en todos los intervalos marcados, excepto el 8 y el 18 con un p<0,001 con respecto a control salino (A). 58 10 Expresión laminar de la proteína c-Fos en ratas seguida de la

inyección subcutánea de formalina en la pata trasera derecha. A) Las ratas pretratadas con solución salina

sometidas a nado forzado mostraron un incremento significativo en el marcaje de los núcleos inmunoreactivos en la lámina I-II y V-VI. B) simulacro de nado, C) no manipuladas. * representa una diferencia significativa con p<0,0001 de las ratas salinas estresadas al compararla con ratas estresadas y pretratadas con clomipramina. 59

11 Microfotografía (100X) mostrando la expresión de la

proteína c-Fos inducida por formalina en el asta dorsal espinal de ratas. Protocolo conductual (A) Salina con Nado

forzado (B) Clomipramina con nado forzado (C) Salina Simulacro, (D) Clomipramina Simulacro, (E) Salina No manipulada y (F) Clomipramina No manipulada. 62

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SHIRLEY MEDINA DE LEENDERTZ. PAPEL DE LA MICROGLIA Y LA SEROTONINA EN LA HIPERALGESIA INDUCIDA POR ESTRÉS REPETIDO. Trabajo de Grado para optar al titulo de Magister Scientiarum en Biología, Mención Inmunología Básica. División de Estudios para Graduados. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela, 2007. p 91.

RESUMEN

El propósito de este estudio fue determinar si la microglia y la serotonina están involucradas en la hiperalgesia provocada por exposición repetida a estrés. Ratas machos Sprague-Dawley fueron sometidos a estrés psicofísico (nado forzado) o psicológico (simulacro de nado) sin condiciones de escape, por 10-20 min, durante 3 días consecutivos. Los animales controles no fueron manipulados y permanecieron en sus jaulas. Cada uno de estos tres grupos de ratas fueron subdivididos en: (1) aquellos que no recibían ningún pretratamiento farmacológico; (2) pretratados con 40 mg/Kg i.p. de minociclina (un inhibidor selectivo de la microglia) ó con vehículo (NaCl 0.9%, i.p.), 1 hora antes de cada nado, simulacro o enjaulamiento; y (3) pretratados con 2.5 mg/Kg i.p. de clomipramina (un bien conocido antidepresivo e inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina) ó con vehículo (NaCl 0.9%, i.p.), 7 dias antes y durante cada nado, simulacro o enjaulamiento. Todas las ratas fueron luego inyectadas en la pata trasera con formalina 1% para producir un dolor inflamatorio agudo. Posteriormente las ratas fueron sacrificadas y perfundidas para removerles quirúrgicamente el segmento lumbar de la médula espinal. Los segmentos medulares de los grupos no tratados y tratados con minociclina fueron procesados inmunohistoquímicamente para observar la microglia (usando un anticuerpo anti-CR3, OX-42). A los tejidos provenientes de ratas tratadas con clomipramina se procesaron inmunohistoquímicamente para el marcador neuronal c-fos. El estrés de nado incrementó la activación microglial inducida por la inyección subcutánea de formalina. La minociclina inhibió la activación microglial central observada en la medula espinal de ratas estresadas con nado forzado. Al mismo tiempo, la administración de minociclina evitó el desarrollo de la hiperalgesia cutánea post-estrés de nado. La hiperalgesia cutánea post-estrés de nado, la disminución de los intentos de escape a lo largo de los nados consecutivos y la sobre-expresión de c-Fos inducida por un dolor inflamatorio agudo fueron bloqueadas por el pretratamiento con clomipramina. En conclusión, la hiperalgesia inducida por estrés de nado forzado estuvo vinculada a una sobre-activación de la microglia en el sistema nervioso central y a una deficiencia en la transmisión central serotoninérgica. Así, el estrés de nado pareciera sensibilizar los circuitos neuronales del dolor y la inmunidad intrínseca de la medula espinal para una respuesta incrementada a un estímulo inmunológicos y nocivos periféricos subsiguientes.

Palabras claves: activación microglial, estrés, dolor, serotonina, inflamación. Correo electrónico del autor: [email protected]

ix

20

SHIRLEY MEDINA DE LEENDERTZ. ROLE OF MICROGLIA AND SEROTONIN IN HIPERALGESIA INDUCED BY REPEATED STRESS. Trabajo de Grado para optar al titulo de Magister Scientiarum en Biología, Mención Inmunología Básica. División de Estudios para Graduados. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela, 2007. p 91.

ABSTRACT

The purpose of this study was to determine if microglia and serotonin are involved in hyperalgesia induced by repeated exposure to stress. Male Sprague-Dawley rats were submitted to psychophysical (forced swimming) or psychological stress (swimming simulacrum) without escape conditions, for 10-20 min, for 3 consecutive days. The control animals were not manipulated and remained in their cages. Each one of these three rat groups were subdivided in: (1) no pharmacologic pretreatment; (2) pretreatment with minocicline 40 mg/Kg i.p. or with vehicle (NaCl 0.9%, i.p.), 1 hour before each swim, simulacrum or encaged and (3) pretreatment with clomipramine 2.5 mg/Kg i.p. (a well known antidepressant and selective inhibitor of serotonin uptake) or with vehicle (NaCl 0.9%, i.p.), 7 days before and during each swim, simulacrum or while caged. All rats were injected afterwards on the hind paw with 1% formalin to produce acute inflammatory pain. The rats were sacrificed and perfused to surgically remove the lumbar segment of the spinal cord. The medullary segments of the minocicline treated and not treated groups were treated immunohystochemically for microglia observation (using an AntiCR3 antibody, OX-42). The tissues obtained from rats treated with clomipramine were processed immunohystochemically for the neuronal marker c-fos. Swimming stress increased microglial activation induced by the subcutaneous injection of formalin. Minocicline inhibited central microglial activation observed in the spinal cord of rats under swimming stress. At the same time, the administration of minocicline avoided the development of cutaneous hyperalgesia post swimming stress. Cutaneous hiperalgesia post swimming stress, reduced escape attempts in consecutive swims and the overexpression of c-Fos induced by an acute inflammatory pain were blocked by pretreatment with clomipramine. In conclusion, hyperalgesia induced by swimming stress could be linked to an overactivation of microglia in the central nervous system and a deficiency in central serotoninergic transmission. Thus, swimming stress seems to sensibilize the pain neuronal circuits and the intrinsic immunity of the spinal cord for an increased answer to a subsequent immunological and nocive peripheral stimulus.

Key Words: microglial activation, stress, pain, serotonin, inflammation. Authors Electronic Mail: [email protected]

x

21

1.- INTRODUCCIÓN

Las microglias son células de la inmunidad innata, que están residenciadas

en el SNC, representan en adultos aproximadamente el 10 % de la población

celular del sistema nervioso central (Town y col. 2005). El papel principal de la

microglia es mediar respuestas inmunitarias intrínsecas innatas frente a injurias

tisulares en una gran variedad de condiciones (Stence y col., 2001). Diversas

evidencias sugieren que la microglía juega un papel doble de neuroprotector ó

citotóxico dependiendo de la severidad de injuria sobre el tejido (Benati y col.,

1993).

La adhesión específica (no aleatoria) entre diferentes células o entre

células o matrices extracelulares es un componente esencial de la migración y

el reconocimiento celular y subyace a muchos procesos biológicos. El receptor

para el complemento tipo 3 (CD11b), es una integrina con cadenas αM de 165

kD y cadenas β2 de 95 kD. Las integrinas como su nombre lo indica integran la

unión del ligando extracelular con la motilidad dependiente del citoesqueleto, el

cambio de forma y la respuesta fagocítica. La integrina CD11b en humanos y

CR3 en ratas cuyo ligando es la proteína del complemento iC3b en humanos,

es expresado por monocitos/macrófagos y la microglía, permitiendo la

visualización de dichas células mediante inmunohistoquímica con el anticuerpo

monoclonal OX-42 (Abbas y col., 2003; Draskovic-Pavlovic y col., 1999; Choi

22

y col., 2003). También la microglia expresa el receptor CD200R principalmente

expresado por células mieloides (Wright y col., 2003).

Además de los receptores antes mencionados la microglia posee diferentes

tipos de receptores implicados en la modulación de la transmisión nociceptiva,

tales como, receptores adrenérgicos, serotoninérgico tipo 5-HT2a, purinérgicos,

GABAérgicos, glutamatérgicos y glicinérgicos. De esta manera, la actividad de

la neuroglia pudiera ser modulada o regulada por diferentes neurotransmisores,

entre ellos la 5-HT (Lee y col., 2001; Synowitz y col., 2004). Las células gliales

(microglia y astrocitos) de la médula espinal, son críticamente importantes en la

mediación de estos procesos nociceptivos (Watkins y col., 2003). Aunque las

células gliales no son eléctricamente excitables ni establecen sinapsis con las

neuronas, mantienen un diálogo continuo entre ellas y con las neuronas de un

modo bastante complejo, asegurándose el soporte estructural, metabólico y

trófico durante toda la vida (Aschner y col., 2002).

Las respuestas inmunitarias están inhibidas en el cerebro en condiciones

normales. Existen evidencias de que las neuronas controlan el estado de

activación de la microglia, contribuyendo a su estado quiescente. Uno de los

mecanismos sugeridos de cómo las neuronas controlan la activación microglial

es la interacción con el ligando CD200, una glicoproteína de membrana

presente en la neurona, con sus receptores presentes en la microglia (Neuman,

23

2001). También existen antibióticos con una acción potente y preferencial

inhibitoria sobre microglia y no sobre los astrocitos o neuronas, como es la

minociclina una tetraciclina semisintética de segunda generación que penetra

bien en SNC a través de la barrera hematoencefalica (Alonso, 1980). Además

de su acción como antibiótico, la minociclina tiene efecto neuroprotector y

antiinflamatorio en el SNC (Tikka y col., 2001; Yrjanheikki y col 1998).

Recientes estudios han demostrado que las células gliales del cordon

espinal, tales como los astrocitos y la microglia, juegan un papel importante en

la creación y mantenimiento del dolor patológico inducido por virus y bacterias,

elevando las citoquinas proinflamatorias. (Coyle 1998; Watkins y col. 1997;

Watkins y col. 2001a, b; Watkins y Maier 1999, 2000; Tsuda y col, 2003). La

microglia también puede sensibilizarse respondiendo a un estimulo nocivo,

expresando el receptor del complemento tipo CD11b en humanos y CR3 en

ratas cuyo ligando es la proteína del complemento iC3b. Se ha demostrado que

las células gliales pudieran ser activadas por sustancias relevantes para el

mecanismo del dolor como la sustancia P, bradykinina, péptidos, genes

relacionados con calcitonina (Fu y col, 1999; Watkins y col, 1997, 2001a, b).

Desde la sensación hasta la percepción del dolor y su modulación son vistos

clásicamente mediados solamente por neuronas. Recientes hallazgos implican

a la glía del cordón espinal con un papel importante en la creación y

24

mantenimiento del dolor patológico. Existen evidencias cada vez mayores de

que la glía puede ser la clave para crear estados de dolor exagerado en

diversas patologías, esto sugiere que pueden estar ampliamente involucrados

en la creación del dolor patológico y tal vez en otros fenómenos sensoriales

(Watkins y col., 2001). La inyección subcutanea de formalina en la superficie

plantar (prueba de formalina) nos provee de un valioso modelo de dolor

inflamatorio (Cho y col., 2006), la hiperalgesia inducida por formalina se ha

sugerido que involucra la glia espinal (Teng y col., 1998; Cho y col., 2006).

Los astrocitos y las microglías de las astas dorsales son activados en

respuesta a una amplia gama de condiciones que producen hiperalgesia. Estos

incluyen, inflamación subcutánea (Sweitzer y col., 1999; Fu y col., 1999),

bacterias intraperitoneales (Sweitzer y col., 1999), trauma de nervio

periférico (DeLeón y col., 1999), cáncer de hueso (Schwel y col., 1999),

constricción de raíces raquídeas lumbares (Watkins y col., 2000) y activación

inmunitaria dentro del cordón (Milligan y col. 2001).

La microglia y los astrocitos son atractivos candidatos como mediadores de

hiperalgesia, ya que: primero, la glia activada libera sustancias que excitan las

neuronas espinales que responden al dolor, tales como: especies de oxígeno

reactivo y Oxido Nítrico, prostaglandinas y otros productos del ácido

araquidónico, aminoácidos excitadores y factores de crecimiento (Watkins y

25

col., 2000). Segundo, sustancias liberadas de la glia activada originan

liberación exagerada de transmisores del dolor a partir de neuronas sensoriales

que forman sinapsis en el asta dorsal (Inoue y col., 1999; Southall y col., 1998).

Tercero, la microglia y los astrocitos forman asas de control positivo, creando

una liberación perseverante de mediadores del dolor (Watkins y col., 2000).

Cuarto, las sustancias derivadas de la glia ejercen funciones autocrinas y

paracrinas por lo cual están bien posicionadas para afectar globalmente la

actividad en el cordón espinal (Aldskogius y col., 1998). Finalmente, la glia es

activada por neurotransmisores del dolor en el cordón dorsal (Watkins y col.,

2001).

Entonces, es importante destacar que la función inmunológica de la

microglia y los astrocitos guardan cierto paralelismo con los mecanismos de

percepción del dolor, ya que ambas son células indispensables para la

protección del organismo al alertar de daño tisular frente a la exposición de

estímulos potencialmente nocivos. La percepción del dolor es regulada por el

organismo a través de diferentes mecanismos a diferentes niveles. Un nivel de

control está ubicado en las astas posteriores o dorsales de la médula espinal.

Varias teorías han surgido de datos experimentales que explican la regulación

espinal de la nocicepción. Una de ellas es la teoría de la puerta de control del

dolor (Melzack y Loeser, 1978; Loeser y Melzack, 1999; Ribera y col., 2003).

En esta teoría se considera que la transmisión de impulsos de dolor,

26

conducidos hasta la médula espinal por fibras aferentes nociceptoras que

provienen de tejidos periféricos, pueden ser inhibidas pre- o post-

sinápticamente, a nivel del asta dorsal espinal por: (1) impulsos conducidos por

fibras aferentes no nociceptoras (ej., táctiles, de temperatura no nociva, etc.)

que inervan tejidos periféricos, o (2) por fibras descendentes que se originan en

los niveles centrales del sistema nervioso, como la sustancia periacueductal

gris y que liberan serotonina o 5-hidroxitriptamina (5HT), como uno de sus

neurotransmisores mayores (Cabana y col., 2004).

La 5-HT regula la nocicepción a nivel de la medula espinal a través de

diferentes subtipos de receptores 5-HT y cambios funcionales de larga duración

en los mismos (Eide y col., 1993). Algunos estudios han evidenciado que la

estimulación de los receptores 5-HT1, 5-HT2 y 5-HT3 parece reducir la

nocicepción mientras que otros han reportado que la activación de 5-HT2 y 5-

HT3 parece incrementar la percepción del dolor. Además, el incremento o la

reducción adaptativa del número de los receptores pueden originar cambios de

larga duración o plasticidad en el sistema 5-HT. La lesión de neuronas

serotoninérgicas induce supersensibilidad por denervación a la 5-HT, por el

contrario, la estimulación prolongada de los receptores 5-HT puede producir

subsensibilidad a la 5-HT. El tratamiento a largo plazo con antidepresivos

utilizados en el manejo clínico del dolor parecen incrementar los receptores 5-

HT1 y disminuir los receptores 5-HT2 (Eide y col., 1993)

27

La liberación de 5HT dentro del SNC puede ser modificada por situaciones

estresantes que conducen a estados fisiológicos o emocionales que

interrumpen el balance homeostático del individuo o alostasis, equilibrio

dinámico del organismo (Ribera y col., 2003). Estudios con microdiálisis

intracerebral en ratas con libertad de movimientos han mostrado un incremento

en la liberación de 5HT en varias regiones del cerebro, especialmente en el

rafe magnus después de una exposición de 5 – 15 min a estrés de nado

forzado (Adell y col., 1997; Hellhammer y col., 1983; Ikeda y col., 1985). Por lo

contrario, un nado forzado prolongado por 30 min. disminuye la liberación de

5HT en algunas estructuras cerebrales tales como la amígdala y septum lateral

(Kirby y col, 1995, 1997). Una correlación entre la inhibición de la liberación de

5-HT y hacer frente activo en la prueba de estrés por nado (tratar de escapar)

involucra a este efecto neuroquímico en la respuesta conductual al estrés de

nado (Kirby y col., 1997).

Cambios en la actividad del sistema serotoninérgico central, pueden

explicar, en parte, los cambios bidireccionales en la nocicepción (analgesia e

hiperalgesia) observados después de diferentes condiciones de estrés. De

forma interesante, la actividad de las fibras serotoninérgicas descendentes del

rafe magno inhibe tónicamente la transmisión del dolor en la médula espinal y

la inhibición de la síntesis de serotonina a nivel espinal produce hiperalgesia en

ratas (Adell y col., 1997)

28

Estímulos y señales externas como estrés prolongado y el dolor pueden

activar a nivel celular numerosos genes con el fin de generar una gama de

factores transcripcionales o proteínas accesorias que interaccionan con

factores transcripcionales necesarios para responder adecuadamente al

ambiente y garantizar la supervivencia del organismo (Griffiths y col., 1995). El

prototipo de estos genes inmediatos es el c-fos, cuya proteína forma

heterodímeros específicos con otras proteínas nucleares como c-jun, a través

de una interacción ¨leucine-zipper¨ y de esta forma se fija al DNA de los genes

cuya expresión regula (Hughes y col., 1985). Por ello, la expresión de c-Fos ha

sido empleada como un índice marcador de la actividad neuronal (Hughes y

col., 1985; Hsu y col., 1981).

De la evidencia experimental señalada anteriormente pueden extraerse

varias conclusiones: 1) que la microglia posee receptores para 5-HT, y por lo

tanto es susceptible a un control regulatorio por fibras inhibitorias descendentes

que liberan 5-HT como neurotransmisor, 2) que la exposición aguda al estrés

induce la secreción de serotonina mientras que la exposición repetida al estrés

produciría una disminución de la liberación de 5-HT por mecanismos no

conocidos, probablemente por agotamiento del neurotransmisor almacenado

en los terminales sinápticos; 3) la serotonina es un modulador inhibitorio de la

nocicepción, por lo cual, aumentos de sus niveles llevarían a una analgesia

(disminución de la percepción del dolor) y una disminución de sus

29

concentraciones extracelulares provocarían un estado hiperalgésico (aumento

de la percepción del dolor).

De esta manera, es posible que el estrés repetido en la rata, como el

producido por el sometimiento a nado forzado, produzca una disminución de

los niveles de 5-HT en la medula espinal, lo cual disminuiría el control

inhibitorio de la nocicepción, y ocasionaría la hiperalgesia observada 24 horas

después del último episodio de estrés. Esta disminución del control inhibitorio

de la serotonina se reflejaría como una mayor activación de poblaciones de

neuronas y microglias en la medula espinal de la rata. El propósito de este

estudio fue determinar si bajo condiciones de estrés repetido la serotonina y la

microglia están involucradas en la hiperalgesia existiendo 1) cambios en

incremento de la percepción del dolor inflamatorio provocado por el estrés de

nado repetido al administrar la clomipramina un inhibidor de la recaptación de

serotonina, 2) cambios en la expresión de la proteína c-Fos indicador de

activación neuronal espinal sensorial al administrar clomipramina en ratas

estresadas con dolor inflamatorio, 3) cambios en activación microglial en ratas

estresadas con dolor inflamatorio inducido por la inyección subcutánea de

formalina indicado por la expresión del receptor CR3 y por último la 4) cambios

sobre el incremento de la percepción del dolor inflamatorio producido por estrés

repetido al administrar minociclina un inhibidor de la activación microglial.

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2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Activación de microglia

Después de lesión o de la infección, la microglia se activa, esto se

manifiesta mediante un proceso de contracción, proliferación e incremento de

la expresión de varios factores en la superficie de la célula. El nivel de

activación de la microglia y la expresión de sus receptores depende del tipo y la

severidad de lesión del cerebro (Raivich y col., 1999; Streit y col., 1988).

Después de una axonotomía reversible, la microglia prolifera y rodea los

nervios secretando factores solubles tales como factor de crecimiento del

fibroblasto (FGF) y factor de crecimiento del nervio (FCN) (Heumann y col.,

1987; Gomez-Pinilla y col., 1990; Araujo y Cotman, 1992). También ocurre un

incremento en la expresión de varios receptores como los de complemento, Fc,

Trombina, ¨scavenger¨, citoquinas como la IL-6 (que estimula el crecimiento de

los linfocitos B productores de anticuerpos) y la IL-18 (inflamatoria glia),

quimiocinas (que inician y promueven las reacciones inflamatorias, ya que

regulan el tráfico y afluencia al sitio de la inflamación de varios tipos celulares y

determinan un incremento de su adhesión a las células endoteliales y/o su

activación) y de co-receptores de CD4 (CMH clase II) y CD8 (CMH clase I). Así,

la microglia parece mostrar un efecto neuroprotector en su estado activado o

esferoide, y colabora en la recuperación de neuronas con daños reversibles.

31

Inversamente, la degeneración neuronal inducida por una proteína toxica

llamada ricina (acontecimiento irreversible y letal) da lugar a que la microglia se

active completamente como fagocito. Esta etapa de la activación está

caracterizada por un aumento significativo en la expresión de los marcadores

observados en la etapa fagocitaria incluyendo varias integrinas (α5β1, α6β1 y

αMβ2), y antígenos del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y II.

Así, la microglia muestra una plasticidad "funcional" notable dependiendo de la

severidad de lesión (Kitamura y col., 1977; Dickson y col., 1991; Lee y col.,

2001).

Por otra parte, es importante mencionar la acción de los nucleótidos y

nucleósidos extracelulares en situaciones de daño porque pueden estimular la

síntesis de ADN y la proliferación de la microglia, astrocitos y células

endoteliales. Cabe destacar que los nucleótidos y nucleósidos junto con el ATP

y otros componentes inducen a que haya un aumento de calcio en esas

células, siendo los responsables de su activación, e incluso podrían actuar

como sus reguladores endógenos además de serlo también para los

oligodendrocitos (Nearty y col., 1996).

Además, la microglia activada libera factores de crecimiento polipeptídicos y

citoquinas que estimulan la proliferación de células endoteliales capilares del

cerebro y cambios reactivos en los astrocitos. Por un lado, la glia juega un

32

papel positivo en los eventos regenerativos post-lesión, pero por el otro, la

reacción glial tiene un efecto negativo que se opone a la recuperación de

funciones porque desafortunadamente las reacciones gliales a la lesión

constituyen también un impedimento a la recuperación posterior, ya que la

cicatriz glial hecha por los astrocitos suele considerarse como un obstáculo

físico que limita la regeneración axonal (Streit, 2002).

Ahora bien, existe una gran cantidad de reportes que implican la activación

y la proliferación excesiva de la microglia en el desarrollo de la muerte neuronal

en varios estados patológicos de ciertas enfermedades del SNC. Los ejemplos

incluyen: el síndrome de Wernicke-Korsakoff, Enfermedad de Parkinson,

Enfermedad de Alzheimer, isquemia, y varios HIV-1 (Todd y Butterworth, 1999;

McGeer y McGeer, 1998; Walton y col., 1999; Akiyama y col., 2000; Xiong y

col., 2000). Una concordancia en los mecanismos observados en estas

enfermedades es la producción de una variedad de neurotoxinas en exceso por

la microglia, incluyendo el óxido nítrico (ON), factor de la necrosis tumoral alpha

(TNFα) y especies de oxigeno reactivo como el peróxido. La producción

excesiva de estos factores conduce a una cascada de efectos incluyendo la

activación de astrocitos, activación adicional de la microglia, y finalmente la

muerte neuronal (Lee y col., 2001).

33

Serotonina

Por otra parte, el oxido nítrico (ON) y la serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-

HT) son importantes neuromoduladores que están involucrados en

innumerables reacciones bioquímicas. Linden y col. (2002) describieron un

nuevo sistema de co-cultivo para estudiar las interacciones entre el ON y la 5-

HT. El óxido nítrico derivado de las células microgliales Bv2 (una línea celular

de microglia de murido modificada con el oncogen v-raf/v-myc transportado por

el retrovirus J2, estas células expresan una actividad no específica de la

esterasa, tienen habilidad fagocítica y la peroxidasa carece de actividad)

estimuladas por citoquinas depletan la 5-HT en ratas con células de leucemia

basofílica (RBL-2H3) (Linden y col., 2002).

Se conoce que el sistema serotoninérgico modula el humor, la emoción, el

sueño y el apetito, así como también está implicado en el control de numerosas

funciones fisiológicas y del comportamiento. Se ha propuesto que la

neurotransmisión serotoninérgica disminuida pudiera desempeñar un papel

clave en la etiología de la depresión. La concentración sináptica de serotonina

es controlada directamente por su recaptación en la terminal pre-sináptica, así,

las drogas que bloquean la recaptación de serotonina se han utilizado con éxito

para el tratamiento de la depresión. Por ello, se han desarrollado los

antidepresivos tricíclicos tales como clomipramina, un inhibidor no selectivo de

34

la recaptación de serotonina, fluoxetina y paroxetine inhibidores selectivos de

serotonina, los cuales son usualmente prescritos en pacientes con depresión

(Basbaum y col., 1978; Ardid y col., 1995).

Estrés

El estrés ha estado implicado en muchos desórdenes médicos y

psiquiátricos (Elenkov y Chrousos, 1999; Chrousos, 2000; Habib y col., 2001).

Un modelo de estrés experimental que resulta en cambios de comportamiento

a largo plazo es el estrés por nado, y este fenómeno es el elemento clave de la

prueba de nado forzado, un protocolo válido para la actividad de antidepresivos

(Porsolt y col., 1977). En la exposición inicial al estrés del nado forzado, las

ratas exhiben ambos comportamientos activo (nadar o luchar) y pasivo (el

flotar). Durante una segunda exposición (24 horas a 2 semanas más tarde), los

patrones cambian tal que el comportamiento activo disminuye y predomina el

comportamiento pasivo. Como otras estrategias experimentales que modelan

aspectos de depresión, este modelo inductor de estrés se inclina hacia el

comportamiento pasivo que es sensible a los tratamientos del antidepresivo

(Maier y Jackson, 1979; Weiss y col., 1981, Roche y col., 2003).

Estudios efectuados por Kirby y col. (1995), compararon el efecto de

diferentes estresores (nado, inmovilización, locomoción forzada y frío) sobre los

35

niveles extracelulares de 5-HT en estriado y hipocampo ventral usando

microdiálisis y midiendo corticosterona en plasma como indicador de estrés

(Kirby y col., 1994). De los cuatro estresantes estudiados: nado, inmovilización,

locomoción forzada y frío, el nado forzado produjo un gran efecto neuroquímico

y neuroendocrino (Kirby y col., 1995). Cambios bidireccionales en la actividad

serotoninérgica de núcleos cerebrales conocidos, que se relacionan en

respuesta al estrés han sido observados, por ejemplo, después de la

exposición aguda a diferentes tipos de estímulos adversos tanto físicos como

psicológicos aparece un incremento en la concentración extracelular de

serotonina en varias regiones del cerebro, especialmente en el rafe magnus.

Controversialmente, el estrés prolongado disminuye la concentración de

serotonina en algunas estructuras cerebrales conocidas que son activadas por

el estrés como son la amígdala y el septum lateral. La magnitud de la inhibición

tónica de la transmisión del dolor en las astas dorsales de la médula espinal

depende del estado conductual del organismo (deprimido, ansiedad, miedo).

El concepto de que el estrés puede contribuir a la generación y

mantenimiento del dolor no esta aún sistemáticamente explorado. Quizás, esto

se deba al hecho de que el interés científico durante varias décadas se ha

dirigido, a estudiar la disminución en la percepción del dolor (analgesia)

transitoria que se observa cuando la nocicepción es medida inmediatamente al

final de una exposición aguda o crónica de agentes estresores (Lewis y col.,

36

1980; Amit y Galina, 1986; Pignatiello y col., 1989). Varios estudios han

reportado que bajo algunas condiciones experimentales como exposiciones

simples o repetidas a situaciones de estrés incontrolable e inescapable pueden

provocar una hiperalgésia transitoria o persistente, en lugar de analgesia.

Usualmente, el aumento de la percepción del dolor que sigue a la exposición

de estresores ha sido interpretado erróneamente como un indicador del

desarrollo de tolerancia al efecto de estresores repetido o ha sido pasado por

alto a pesar de su significado clínico (Madden y col., 1977).

Se sabe que las neuronas responden al estímulo que les llega a la

membrana con cambios a corto plazo, que vienen mediados por canales

iónicos, o por segundos mensajeros, y con cambios a largo plazo, involucrando

nuevos patrones de expresión genética como son los proto-oncogenes, los

cuales no necesitan síntesis proteica para su inducción. La mayoría de estos

proto-oncogenes nucleares o genes tempranos o inmediatos codifican

proteínas reguladoras que controlan la expresión de otros genes.

El c-fos esta implicado en la codificación de una proteína nuclear que

interviene en la regulación de los genes de transcripción (Draisci y Ladarola,

1989). Las exposiciones a estímulos nocivos externos provocan la expresión

del proto-oncogen c-fos. En la médula espinal se ha demostrado que la

estimulación dolorosa de la pata trasera de la rata produce un aumento de la

37

expresión de c-fos, observándose un intenso marcaje en los segmentos

medulares L3 y L4 (ensanchamiento lumbar de la médula espinal) a nivel de las

láminas I, II, V y VI del asta posterior, siendo en estas láminas donde llegan las

ramas centrales de los nervios periféricos (Abbadie y Benson., 1993). En forma

similar, la inflamación de los tejidos puede inducir una rápida expresión de c-fos

y otros genes inmediatos tempranos, paralelamente con el desarrollo de una

conducta hiperalgésica. La estimulación nociceptiva periférica por inflamación

puede provocar la aparición de la inmunoreactividad de c-fos en las láminas I y

II así como en las láminas V y VI de la médula espinal. Muchos estudios han

demostrado que la síntesis de la proteína c-Fos inducida por inflamación tisular

muestra un curso variable, dependiendo del origen del estímulo inflamatorio

(Noguchi y col., 1991).

Nocicepción

El dolor es una sensación heterogénea que puede subdividirse en tres

categorías desde el punto de vista fisiopatológico: el dolor fisiológico,

inflamatorio y neuropático. El dolor normal o fisiológico es una sensación

protectora que nos alerta acerca de la presencia en el ambiente de estímulos

lasivos. A su vez, después de un proceso inflamatorio o injuria se suceden una

serie de alteraciones en el sistema somato sensorial, que amplifica las

respuestas e incrementa la sensibilidad a estímulos periféricos, de tal manera

38

que el dolor puede ser activado por estímulos normalmente inocuos o de baja

intensidad. Este tipo de dolor denominado clínico o patológico, es una

expresión de la plasticidad del sistema somatosensorial, definida como la

capacidad de estas neuronas de cambiar sus funciones, perfil bioquímico y su

estructura. Estos cambios operan en múltiples sitios y se producen por diversos

mecanismos. La hipersensibilidad que acompaña al dolor inflamatorio

usualmente retorna a lo normal si el proceso o enfermedad causante es

controlado, mientras que el dolor neuropático persiste por tiempo prolongado,

aún cuando haya ocurrido un proceso de cicatrización (Woolf y Costean, 1999;

Woolf y Salter, 2000).

Desde la sensación hasta la percepción del dolor y su modulación son

vistas clásicamente mediados solamente por neuronas. Recientes hallazgos

implican a la glia del cordón espinal con un papel importante en la creación y

mantenimiento del dolor patológico. Existen evidencias cada vez mayores de

que la glia puede ser la clave para crear estados de dolor exagerado en

diversas patologías, esto sugiere que pueden estar ampliamente involucrados

en la creación del dolor patológico y tal vez en otros fenómenos sensoriales

(Watkins y col., 2001). Subcutánea inyección de formalina en la superficie

plantar (prueba de formalina) nos provee de un valioso modelo de dolor

inflamatorio (Cho y col., 2006), la hiperalgesia inducida por formalina se ha

sugerido que involucra la glia espinal (Teng y col., 1998 y Cho y col., 2006).

39

Desde el punto de vista psicofisiológico, el término hiperalgesia se refiere a

un desplazamiento hacia la izquierda en la curva que relaciona la intensidad del

estímulo con la sensación dolorosa percibida e incluye la adolinia cuando el

estímulo es de baja intensidad (Garcia y col, 2001) Figura 1.

Figura 1. Curva de intensidad del estímulo vs. sensación dolorosa percibida.

La nocicepción es la actividad neurológica desencadenada por estímulos

potencialmente dañinos para los tejidos. Está modulada por factores

psicobiológicos y puede percibirse o no como dolor. Sin embargo, dolor y

nocicepción no son conceptos sinónimos. Nocicepción implica la excitación de

40

los nociceptores (receptores periféricos del dolor), y, si bien esta excitación

puede conducir a la percepción del dolor, éste también se puede originar en

ausencia de nocicepción. Actualmente, gracias a las técnicas de biología

molecular y a las técnicas de imagen se ha comprobado que son muchas las

estructuras nerviosas a nivel periférico, medular, subcortical y cortical que

intervienen en la percepción del dolor, con lo que esta percepción afecta a

nuestros pensamientos, memoria, actitudes, emociones, movimientos y

conducta, y a la vez se ve afectada por cada uno de estos procesos (Ribera y

col., 2003).

Un receptor sensitivo es una estructura anatómica capaz de responder ante

determinados estímulos convirtiendo la energía de estos estímulos en un

potencial eléctrico que se transmite por una vía periférica hasta los niveles

centrales del sistema nervioso. Habitualmente se trata de estructuras

especializadas de las propias neuronas o de terminaciones libres. Aunque la

mayor parte de receptores responden preferentemente a un estímulo

determinado (mecánico, químico, térmico), también existen receptores

polimodales (Ribera y col., 2003).

Una característica diferencial de los nociceptores en comparación con

los demás receptores radica en la posibilidad de que otras estructuras puedan

modular sus propiedades receptoras. Según el tipo de estímulo los

41

nociceptores se pueden dividir en tres grupos mecánicos, térmicos y

polimodales (activados por estímulos tanto mecánicos como térmicos)

(Basbaum y Jessell, 2000).

Uno de los avances más importantes en la investigación sobre el dolor

ha sido el descubrimiento de la existencia de varios circuitos neuronales de tipo

modulador cuya función consiste en regular la percepción del dolor. Estos

circuitos se encuentran a varios niveles del sistema nervioso, de tal forma que

las vías nociceptivas aferentes son permanentemente moduladas por sistemas

reguladores situados a distintos niveles del SNC (Ribera y col., 2003).

El primer nivel de modulación se encuentra en la médula espinal, donde las

conexiones que se establecen entre las fibras aferentes nociceptivas (de

pequeño diámetro) y las fibras aferentes no nociceptivas (de gran diámetro)

controlan la información nociceptiva que se transmite hacia los centros

nerviosos superiores, de tal forma que ésta es regulada por la actividad de las

fibras aferentes mielinizadas (Aβ) no relacionadas directamente con la

transmisión del dolor. Este primer circuito modulador se conoce como la Teoría

del Umbral del Dolor o Teoría de la Puerta de Control del Dolor (Wall y

Meltzack, 1994), según la cual el dolor es la resultante del equilibrio de la

actividad de las fibras aferentes nociceptivas y no nociceptivas.

42

La teoría de la puerta de control del dolor ha sufrido varias modificaciones

(Melzack y Loeser, 1978; Loeser y Melzack, 1999), y actualmente se considera

que la inhibición de la transmisión del dolor se produce tanto por fibras

aferentes presinápticas como postsinápticas periféricas, y también por fibras

descendentes que se originan en los niveles centrales del sistema nervioso. La

teoría de la puerta de control del dolor ha constituido la base para la utilización

de la Estimulación Nerviosa Eléctrica Transcutánea (ENET) y de la

estimulación la columna dorsal medular, para el alivio del dolor (Melzack y

Loeser, 1978; Loeser y Melzack, 1999; Ribera y col., 2003).

Dolor, inflamación, estrés y microglia.

Varios estudios recientes han demostrado el efecto de la estimulación

nociceptiva periférica en la respuesta de las neuronas de las astas dorsales.

Diversos estudios han evaluado los efectos de la lesión tisular en la respuesta

neuronal. Pocos estudios han evaluado los efectos de la estimulación

nociceptiva en la respuesta glial. Sin embargo parece que la glia juega un papel

muy significativo en la función del sistema nervioso central de lo que se

pensaba anteriormente, por ejemplo la microglia y los astrocitos pueden

sintetizar y secretar citoquinas, como la IL-1β (Kronfol y Remick, 2000), TNF-α

(Bethea y col., 1992), IL-6 (Fu y col 1998, Le y col 1989) y factor de crecimiento

neuronal (NGF) (Gilad y Gilad , 1995) las cuales juegan un papel crítico en el

43

mantenimiento de la homeostasis del SNC (Pousset 1994; Nakajima y

Kohsaka, 2004).

Además de la liberación de citoquinas la glia puede liberar otras sustancias

neuromoduladoras como los productos de la ciclooxigenasa y el óxido nítrico.

Los productos de la ciclooxigenasa y el óxido nítrico se cree que son

mediadores de la hiperalgesia. El comportamiento de dolor puede bloquearse

1) por antagonista de un receptor recombinante de la IL-1 humana, 2) un

anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento neural ó 3) inhibidores

metabólicos de la función de la glia. Dadas estas observaciones es razonable

postular que las células gliales (astrocitos y microglias) son fuentes importantes

de citoquinas, productos de ciclooxigenasa y óxido nítrico que contribuyen al

desarrollo del dolor persistente luego de un estimulo nociceptivo periférico (Fu y

col 1999).

Fu y col 1999 efectuaron el primer estudio que reportaba que la inyección

subcutánea de formalina en la superficie plantar de la pata trasera de rata

induce una activación de microglia en el cordón espinal lumbar. Aunque no

pudieron determinar si esta respuesta era resultado de la actividad nociceptiva,

de la inflamación periférica ó de la degeneración de las neuronas aferentes

primarias o centrales. Sin importar, que mecanismo determinen como el estrés

conlleva a la activación microglial existen diversas evidencias de que la

44

microglia puede prepararse por un número de estímulos diferentes incluyendo

neurodegeneración, envejecimiento y estrés para que un segundo estímulo

inflamatorio sistémico que pueda conllevar a un cambio en el fenotipo o un

fenotipo pro-inflamatorio exagerado. Esta respuesta exagerada a las citoquinas

puede llevar a cambios agudos en el comportamiento o exacerbar patologías.

Por lo tanto las microglias son tanto sensores de patología como también

juegan un papel crítico en la comunicación entre estresores de medio

ambiente, patógenos sistémicos, lesión, injuria ó toxinas en el cerebro. No es

difícil ver que esto tendrá consecuencias importantes para nuestro

entendimiento de las influencias ambientales en la salud mental y

enfermedades del cerebro (Perry 2007).

Para finalizar, por otra parte, la función inmunitaria intracerebral está

sometida a un estricto control y el privilegio inmunitario del cerebro viene

determinado no sólo por la barrera hematoencefálica sino también por la

existencia de señales de freno que hacen que la microglia, el macrófago del

SNC, se mantenga en un estado quiescente cuando el tejido nervioso no se

encuentra en una situación de estrés, a través de la interacción local del

receptor CD200 (CD200R) presente en la microglia y de su ligando CD200

(OX2) una glicoproteína de membrana que se expresa en neuronas, endotelio,

células del estroma y linfocitos; y proporciona una señal inhibitoria a células de

la línea mieloide como la microglia. Cuando se produce una lesión inflamatoria

45

en el cerebro, la microglia se activa y se produce un descenso en la expresión

del CD200R, para hacer frente a la situación de daño, sin embargo esta señal

debe ser controlada para que no sobrepase un umbral de tolerabilidad y

contribuya al daño (Wright y col, 2003; M. Hernangómez y col 2006).

46

3.- OBJETIVOS

3.1.- Objetivo General:

Determinar si la serotonina y la microglia están involucradas en la

hiperalgesia inducida por estrés repetido en ratas.

3.2.- Objetivos Específicos:

3.2.1.- Determinar la activación microglial midiendo el incremento de la

expresión del receptor CR3 del complemento en ratas estresadas con dolor

inflamatorio inducido por la inyección subcutánea de formalina.

3.2.2.- Determinar el efecto de la minociclina, inhibidor de la activación

microglial, sobre el incremento de la percepción del dolor inflamatorio producido

por estrés repetido, evaluando el efecto de este agente sobre la prueba de

formalina en ratas.

3.2.3.- Determinar el efecto del inhibidor de la recaptación de serotonina

clomipramina sobre el incremento en la percepción del dolor inflamatorio

provocado por estrés de nado repetido.

47

3.2.4.- Determinar el efecto del inhibidor de la recaptación de serotonina

clomipramina sobre la activación de las neuronas espinales sensoriales en

ratas estresadas con dolor inflamatorio, evaluando la expresión del factor de

trascripción temprana c-Fos.

48

4.- METODOLOGÍA:

4.1.- Animales de experimentación:

4.1.1- Modelo Experimental 1

Ratas machos Sprague-Dawley (250 – 300 gramos de peso) fueron

usadas para este estudio. En un experimento típico 12 ratas fueron enjauladas

individualmente y llevadas al lugar de las pruebas 3 días antes del

procedimiento conductual con agua y comida disponibles ad libitum. Cada

animal fue usado una sola vez. Los observadores desconocieron a qué

procedimiento conductual condicionante fueron sometidos los grupos

experimentales.

4.1.1.1.- Estrés de Nado

Un grupo de ratas (estrés de nado) fueron sometidas a

nado forzado en un cilindro con agua a 25 ºC y una profundidad de 30

centímetros por 10 minutos. Durante la sección de nado fueron medidos los

tiempos de inmovilidad y lucha siguiendo el método descritos por Porsolt y col.,

1978. La inmovilidad ocurre cuando la rata se mantiene sobre la superficie del

49

agua con movimientos mínimos para mantener la cabeza sobresaliendo de

esta. La lucha ocurre cuando la rata nada activamente, brinca, se mueve

vigorosamente con sus cuatro patas rompiendo la superficie del agua o cuando

intenta escalar la pared del cilindro buscando una escapatoria. Otro grupo de

ratas fueron sometidas a un simulacro de nado, colocándolas en un cilindro con

agua (25 ºC) de solo una profundidad de 2-3 centímetros, solo lo suficiente

para mojar parcialmente el animal, pero no para obligaralo a nadar. Finalmente,

un grupo de ratas no fueron manipuladas y permanecieron en sus jaulas. En

los días 2 y 3 las ratas fueron sometidas nuevamente a 20 minutos de nado

forzado, a simulacro de nado o a permanencia en sus jaulas (controles).

4.1.1.2.- Nocicepción Química

Nocicepción química se evaluó mediante la prueba de

formalina, la cual se realizó 48 horas después de la última sesión de nado

forzado o simulacro de nado y consistió en inyectar 0,1 cc de formalina al 1%

(37,5% de formaldehído en 0,9% de solución salina) en la superficie plantar de

la pata trasera derecha. La inyección de formalina indujo un comportamiento

característico de la rata ante un dolor inflamatorio agudo, el cual fue observado

por 2 horas a intervalos de 180 segundos. La primera hora de observación se

dividió en dos períodos: un primer período de 30 minutos durante el cual se

registró la conducta nociceptiva y un segundo período de 30 minutos durante el

50

cual no se registró la conducta. La segunda hora se dividió en cuatro períodos

de 15 minutos cada uno, alternando con 15 minutos de registro de la

nocicepción y 15 minutos donde no se registró. En total, fueron medidos 20

intervalos de 3 min. de duración por 2 horas. La intensidad del dolor fue

registrada de acuerdo a la siguiente escala basada en 4 categorías de

comportamientos básicos de la rata: 0 = el peso del cuerpo del animal estaba

igualmente distribuido en todas las patas, ya sea que esta estuviera quieta o en

movimiento; T1 = poco peso corporal apoyado sobre la planta de la pata

inyectada; T2 = pata inyectada elevada; T3 = la pata inyectada es lamida,

mordida o sacudida. El valor numérico fue calculado mediante la siguiente

formula (T1 + 2T2 + 3T3) /180, donde T1, T2 y T3 fueron el tiempo (en

segundos) gastado por categoría 1, 2 ó 3 durante cada intervalo de

observación de 180 segundos. Estas observaciones se realizaron con la

asistencia de un programa de computadora diseñado para esta prueba.

Un día después del estimulo, las ratas fueron sacrificadas, induciéndoles un

coma profundo al introducirlas por varios minutos en una cámara sellada

conteniendo CO2 a una presión controlada entre 4 y 6 libras. Los animales

fueron perfundidos vía intracardíaca, con una solución de Buffer Fosfato Salino

(PBS) 0,1 M pH 7,4 para limpiar los tejidos. Después se perfundió la misma

cantidad de paraformaldehido al 4% en PBS para fijar los tejidos. Una vez que

se aplicaron ambas soluciones, se procedió a la extracción de la médula

51

espinal del animal mediante disección quirúrgica. El segmento lumbar de la

médula espinal extraída se sumergió en 30 ml de formaldehído al 4 % en PBS

por 2 horas, para una post-fijación del tejido, posteriormente fue sumergido en

una solución crioprotectora de sacarosa al 30% por toda la noche. Los tejidos

fueron guardados a 4°C para posteriores estudios por inmunohistoquímica con

marcadores selectivos para la identificación de la microglia.

4.1.1.3.- Protocolo de Inmunohistoquímica para microglia:

Selección del tejido y cortes:

Se realizó la localización final del ensanchamiento lumbar, a

través de la lupa estereoscópica y se uso una hojilla de bisturí para seccionar la

región de interés. El trozo de tejido se puso sobre una placa metálica, con

previa adición de Histo-PrepTM, cuidando de que no quedaran burbujas, y se

colocó en la zona de congelamiento del micrótomo (Modelo HM505N)

temperatura de trabajo (-25°C). Una vez congelados los bloques, se procedió

a realizar cortes o rebanadas de 40 μm de grosor, cuidando la integridad del

tejido medular. Luego fueron tomadas las rebanadas con un pincel fino y

colectadas en PBS 0,1 M. Se seleccionaron morfológicamente los cortes

correspondientes a los segmentos lumbares L4 y L5.

52

Inmunotinción de microglias: El procedimiento duró tres días y

consistió en:

Día # 1: Los cortes fueron transferidos a un recipiente con malla que

contiene PBS. Se realizaron dos lavados de 10 minutos y dos lavados de 5

minutos. Se incubaron los tejidos en una solución bloqueadora (suero normal

de caballo al 4 % en PBS) por 1 hora. Luego, se incubaron los cortes en placas

serológica con anticuerpo primario de ratón, monoclonal anti-CR3 de rata (OX-

42; Serotec, USA) en una dilución de (1:1200 en 4% de suero normal de

caballo), por 36 horas a 4°C. Un grupo de cortes no se incubaron en anticuerpo

primario con el fin de determinar la especificidad de reacción cromática.

Día # 2: Se lavaron los cortes con PBS dos veces por 10 minutos y dos

veces por 5 minutos, seguidamente se realizo un incubación de bloqueo con

suero normal de caballo al 4% en PBS por 30 minutos, y se incubaron con

anticuerpo secundario biotinilado de caballo anti-IgG de ratón (absorbido en

ratas) en una dilución de 1:200 en NHS al 4% por 90 min. Se procedió a lavar

nuevamente con PBS 2 lavados por 5 min y 2 lavados por 10 min.

Aproximadamente 1 hora antes de comenzar el lavado se procedió a la

preparación del complejo reactivo ABC (Estreptavidina – Biotina – HRP) según

instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, C.A, U.S.A).

53

Terminados los lavados se incubaron los cortes con ABC por 90 minutos, para

luego lavarlos con PBS, por el mismo tiempo anterior. Finalmente se incubaron

con diaminobencidina (DAB) [20 mg en una mezcla de 33 μl H2O2 al 30% y 100

ml de Buffer Tris (0,05 M pH 7,6)] para revelar las proteínas marcadas, con una

reacción que produce un color negro-marrón. Los cortes se lavaron con buffer

Tris por 5 min y luego con PBS por 30 min. y se transfirieron a portaobjetos

precubiertos con gelatina. Los cortes se dejaron secar toda la noche.

Día # 3: Los cortes se lavaron sumergiéndolos en agua de grifo por 20

segundos y se procedió a la deshidratación de los mismos sumergiéndolos en

forma progresiva en etanol al 50 %, 70%, 95 %, 100 % por 1 minuto cada uno,

y en xileno por 4 minutos. Los cortes se montaron de forma permanente

cubiertos con Permount® y cubreobjetos, para la observación bajo microscopio

de luz.

Figura 2. Diseño Experimental 1.

• Procedimiento condicionante: Nado, simulacro y sin manipulación • • •

∗ Prueba de evaluación nociceptiva: Prueba de Formalina ∗

° Cirugía y extracción de la medula espinal °

Días 1 2 3 4 5 6

54

4.1.2- Modelo Experimental 2





animal fue usado una sola vez. Las ratas fueron sometidas a nado forzado

(n=4) o simulacro de nado (n=4) 10 min el primer día, el segundo y el tercer día

se sometieron a 20 min. Un grupo de ratas permaneció en sus jaulas no

manipuladas (n=4). La mitad de las ratas de cada grupo fueron tratadas: con 40

mg/Kg de minociclina intraperitonealmente (i.p.) o con vehículo (NaCl 0.9%,

i.p.), 1 hora antes de cada nado, simulacro o enjaulamiento.

La evaluación de la nocicepción química mediante la prueba de

formalina), realizada 48 horas después de la última sesión de nado forzado

como se describe en el Modelo Experimental 1. Un día después del estimulo,

las ratas fueron sacrificadas y prefundidas para luego removerle

quirúrgicamente el segmento lumbar de la médula espinal como se describe

en el Modelo Experimental 1.

55

♦ Tratamiento farmacológico: Minociclina ó vehículo ♦ ♦ ♦

• Procedimiento condicionante: Nado, Simulacro y no manipuladas • • •


° Cirugía y Extracción medular °

Figura 3. Diseño experimental 2

4.1.3.- Modelo experimental 3:





animal fue usado una sola vez. Los observadores desconocían a qué

tratamiento farmacológico y a cuál procedimiento conductual serán sometidos

los grupos experimentales

Las ratas fueron sometidas a nado forzado (n=4) o simulacro de nado

(n=4) 10 min el primer día, y 20 min el segundo y el tercer día. Un grupo de

ratas permaneció en sus jaulas no manipuladas (n=4). La mitad de las ratas de

Días 1 2 3 4 5 6

56

cada grupo experimental fueron tratadas: 2.5 mg/Kg i.p. de clomipramina o con

vehículo (NaCl 0.9%, i.p.), desde el día 1 hasta el final del protocolo conductual

el día 10.

La evaluación de la nocicepción química mediante la prueba de

formalina), realizada 48 horas después de la última sesión de nado forzado

como se describe en el Modelo Experimental 1. Un día después del estimulo,

las ratas fueron sacrificadas y perfundidas para luego removerle

quirúrgicamente el segmento lumbar de la médula espinal como se describe

en el Modelo Experimental 1.

4.1.3.1. Protocolo de Inmunohistoquímica para c-Fos:

Selección del tejido y cortes:

Se localizo el ensanchamiento lumbar de la medula

espinal a través de la lupa estereoscópica y se uso una hojilla de bisturí para

seccionar dicha región de interés. El trozo de tejido se puso sobre una placa

metálica, con previa adición de Histo-prepTM, cuidando de que no quedaran

burbujas, y colocándose luego en la zona de congelamiento del micrótomo

(Modelo HM505N). Una vez congelados los bloques, se procedió a realizar

cortes o rebanadas de 40 μm de grosor, cuidando la integridad del tejido

57

medular. Luego fueron tomadas las rebanadas con un pincel fino y colectadas

en buffer PBS/TX; (buffer fosfato alino 0,1 M con 4% Triton X-100). Se

seleccionaron morfológicamente los cortes correspondientes a los segmentos

lumbares L4 y L5.

Inmunotinción para c-Fos:

Se realizo en tres días y consistió en:

Día # 1: Los cortes fueron transferidos a un recipiente con malla que

contenían PBS/TX. Se realizaron dos lavados de 10 minutos y dos lavados de

5 minutos. Una vez culminado este lapso, se procedió a reducir la actividad de

la peroxidasa endógena exponiendo los cortes a H2O2 al 0.3 % por 30 minutos.

Luego se repitieron los lavados en PBS/TX, igual que la vez anterior, y se

procedió a bloquear con suero normal de cabra al 4 % en PBS/TX por 1 hora.

Por último se incubaron los cortes en placas serológicas con anticuerpo

primario policlonal anti-c-Fos antisuero levantado en conejo en una dilución de

1:2000 en suero normal de cabra (NGS), por 36 horas a 4°C. (Vector

Laboratories, Burlingame, C.A, U.S.A). Un grupo de cortes no se incubaron en

anticuerpo primario con el fin de determinar la especificidad de reacción

cromática.

58

Día # 2: Se lavaron los cortes con PBS/TX dos veces por 10 minutos y dos

veces por 5 minutos, seguidamente se bloquearon con NGS al 4% en PBS/TX

por 30 minutos, y se incubaron con biotinilado de cabra anti-IgG de conejo

(absorbido en ratas) a una dilución de 1:2000 en NGS. Se procedió a lavar

nuevamente con PBS/TX con los mismos tiempos estipulados.

Aproximadamente 1 hora antes de comenzar el lavado se preparo el complejo

reactivo ABC (Estreptavidina - Biotina- HRP) según instrucciones del fabricante

(Vector Laboratories, Burlingame, C.A, U.S.A). Terminados los lavados se

incubaron los cortes con ABC por 90 minutos, luego fueron lavados con

PBS/TX, por el mismo tiempo anterior. Finalmente se incubaron con

diaminobencidina (DAB) para revelar las proteínas marcadas, con una reacción

que produce un color negro-marrón. Los cortes se lavaron con TBS/TX, por el

mismo período de tiempo y se transfirieron a portaobjetos precubiertos con

gelatina. Los cortes se dejaron secar toda la noche.

Día # 3: Los cortes se lavaron sumergiéndolos en agua de grifo por 20

segundos y se procedió a la deshidratación de los mismos sumergiéndolos en

forma progresiva en etanol al 50 %, 70%, 95 %, 100 % por 1 minuto cada uno,

y en xileno por 4 minutos. Los cortes se montaron de forma permanente

cubiertos con Permount® y cubreobjetos, para luego observarlos bajo

microscopio de luz.

59

Figura 4. Diseño experimental 3

4.2. Análisis estadístico:

Para procesar los datos obtenidos, se utilizó un análisis de varianza

(ANOVA), para determinar si hubo diferencias globales entre los promedios de

más de dos grupos. ANOVA de una vía fue aplicada para una variable

independiente, y ANOVA de dos vías, para dos variables independientes. Para

las diferencias globales significativas, se aplicó la prueba de rangos múltiples

de Duncan´s para determinar las diferencias de los promedios entre sí. La

significancia estadística fue asumida a una p< 0,05.

♦ Tratamiento farmacológico: Clomipramina ó vehículo ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

• Procedimiento condicionante: Nado, Simulacro y no manipuladas • • •


° Cirugía y Extracción de la médula °

Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

60

4.2.1 Análisis de las Imágenes

El análisis cuantitativo de la inmunoreactividad al anticuerpo OX-

42 fue realizado en la lámina I – II de las astas dorsales de la médula espinal.

Fueron seleccionados al azar 4 cortes por rata. Las imágenes fueron

capturadas por un microscopio Axioskop 2 plus Zeiss® acoplado a una cámara

de video cuyas señales fueron enviadas a un computador. Estas fueron

adquiridas primero a una amplificación de 100 X, luego fueron ubicadas las

láminas I - II para tomar una amplificación de 400 X, con la finalidad de hacer

conteo de las microglias, las láminas I - II del asta dorsal recibe inervaciones de

la superficie plantar de la pata trasera que es estimulada durante la prueba

nociceptiva de formalina. La imagen fue capturada mediante el Imagen-pro®

Plus versión 4.5.1 de Media Cybernetics®. Posteriormente la imagen original

fue transferida a una plataforma Mac OS 10.4 y para el conteo individual de las

microglias se utilizó el programa Photo Shop CS3 extended.

61

5.- RESULTADOS El estrés incrementó la activación microglial inducida por la inyección

subcutánea de formalina. Las micrografías observadas en la Figura 6 muestran

que la inyección subcutánea de formalina (prueba de dolor inflamatorio) causa

activación microglial en todos los grupos estudiados aunque pudo observarse

que la activación de la microglia fue substancialmente mayor en las ratas que

fueron sometidas a estrés de nado repetido en comparación con aquellas

sometidas a simulacro de nado o no manipuladas.

Todos los grupos sometidos a la prueba de formalina, mostraron microglias

en reposo y activadas OX-42 positivas, tanto en sustancia gris como en blanca.

En el simulacro de nado y no manipuladas (microfotografía Figura 6B y 6C) se

pueden observar microglias OX-42 positivas con ramificaciones extendidas en

todas las direcciones y con un citoplasma perinuclear (microglias en reposo ver

Figura 5A), además de observarse escasas microglia OX-42 positivas

mostrando acortamiento de las ramificaciones y engrosamiento en su centro

(Figura 5B). La distribución se concentra en mayor número hacia la parte

posterior del asta dorsal.

En los animales que fueron sometidos a estrés de nado forzado repetido

durante 3 días consecutivos e inyectados subcutáneamente con formalina

62

mostraron abundantes microglias OX-42 positivas fuertemente teñidas con un

significativo acortamiento de las ramificaciones y engrosamiento en su centro,

aunque sin llegar al estado final de activación cuando las células toman una

morfología ameboide, estas se observan distribuidas homogéneamente en el

asta dorsal lumbar lamina I y II (Figura 6A).

Figura 5. Cambios morfológicos de la Microglia. A microglia en reposo, B microglia activada y C microglia totalmente

activa como macrófago.

La minociclina inhibió la activación microglial en ratas estresadas y

sometidas a la prueba de formalina además produjo una disminución en el

incremento de la percepción del dolor inflamatorio provocado por estrés de

nado forzado repetido. En los animales que fueron pretratados con minociclina

una hora antes de cada prueba de estrés por nado forzado, durante 3 días

consecutivos, y luego inyectados subcutáneamente con formalina en la pata

trasera derecha, mostraron patrones similares a los exhibidos por las ratas no

manipuladas o por aquellas sometidas a simulacro de nado, esto es, microglias

en reposo OX-42 positivas, tanto en sustancia gris como en blanca. De esta

A C B

63

manera, se puede observar el efecto inhibitorio de la sobre-activación microglial

provocada por exposición concomitante a estrés de nado y a la prueba de

formalina al comparar las ratas tratadas con minociclina con aquellas tratadas

con solución salina (Figura 6 D y A, respectivamente).

La cuantificación de las microglias OX-42 positivas observadas por campo

a 400X reveló que las ratas sometidas a nado forzado tenían un numero

significativamente mayor de dichas células/campo (104,3 ± 5,3) que las ratas

pretratadas con minociclina y sometidas a estrés (49 ± 2,51) (p<0,0001). Las

ratas simulacro de nado (68,3 ± 2,5) y no manipuladas (58,66 ± 3,752)

mostraron una diferencia significativa compararlas con las ratas pretratadas

con minociclina y sometidas a estrés (p<0,001).

Se pudo observar que las ratas pre-tratadas con solución salina (vehículo) y

sometidas a nado forzado exhibieron una mayor respuesta nociceptiva

(hiperalgesia) durante los intervalos de observación del 16 al 20 que los

animales no manipuladas (p<0,001) (Figura 7A). En la Figura 7B se muestra

que las ratas estresadas y pretratadas con minociclina mostraron una menor

respuesta nociceptiva que las ratas estresadas tratadas o no con solución

salina (vehículo) (p<0,001). No se observó diferencia significativa en las ratas

simulacro y no manipuladas al comparar dentro el mismo grupo las pretratadas

con minociclina o con solución salina (vehículo) (Figura 7C y D).

64

Las ratas pretratadas con clomipramina, varios días antes y durante las

exposiciones a las situaciones de estrés de nado forzado, tuvieron el típico

patrón bifásico de comportamiento nociceptivo frente a la prueba de formalina;

la magnitud de dicho comportamiento fue significativamente menor, durante la

fase II de la curva de respuesta (intervalos 18 – 19) en comparación con el

observado en las ratas pretratadas con solución salina (p<0,01) (Figura 9A). En

las Figuras 9B y 9C, se muestra que no hubo diferencias significativas en la

conducta nociceptiva de los animales sometidos a simulacro de nado o los no

manipuladas pretratados con clomipramina ó con solución salina. De esta

manera, un tratamiento crónico y a bajas dosis con un inhibidor de la

recaptación de serotonina como la clomipramina produjo un bloqueo de la

hiperalgesia inducida por exposición repetida a estrés de nado forzado.

65

Figura 6. Microfotografía (100X) mostrando los cambios en OX-42 en el asta dorsal espinal L4-5 de ratas, 1 día después de la inyección con formalina. Insertadas en cada una magnificación a 400X. Protocolo conductual (A) nado forzado (B) simulacro de nado (C) no manipulada y (D) Nado forzado + minociclina.

A B

C D

66

0 5 10 15 200

1

2

3SalinaMinociclina

** ****

**** *

Periodo de 15 min. sin observación

Nado Forzado Repetido

Intervalos min.

Punt

aje

de D

olor

Simulacro de Nado Forzado

0 5 10 15 200

1

2

3SalinaMinociclina


Intervalos min.

Punt

aje

de D

olor

No Manipuladas

0 5 10 15 200

1

2

3SalinaMinociclina


Intervalos min.

Punt

aje

de D

olor

A B

C D

Periodo de 15 min.sin observación

*

**

*** *

0 5 10 15 200

1

2

3 Salina nadoSalina simulacroSalina no manipulada

Intervalos min

Punt

aje

de d

olor *

*

*

Figura 7. Curvas de respuesta nociceptiva. Todas las ratas fueron sometidas a la prueba de formalina. A) Ratas salinas sometidas a los 3 procedimientos condicionantes, mostrando respuesta hiperalgésica en ratas estresadas. A) Ratas salinas sometidas a los 3 procedimientos condicionantes, mostrando respuesta hiperalgésica en ratas estresadas, * representa una diferencia significativa con p<0,001 de las ratas salinas estresadas al compararla con ratas no manipuladas, B) ratas sometidas a nado forzado mostraron una respuesta hiperalgésica frente a la prueba de formalina, inhibida al pretratarlas con minociclina, * representa una diferencia significativa con p<0,001 de las ratas salinas estresadas al compararla con ratas estresadas y pretratadas con minociclina, C) simulacro de nado, D) no manipuladas. Las barras representan 2 períodos de no observación conductual (15 min. cada unos).

67

Nado Forzado Clomipramina-Minociclina

1. 2. 3.0

50

100

150

200SalinaClomipraminaMinociclina

*

*

Sesiones de Nado Forzado

Tiem

po d

e Lu

cha

(seg

)

Nado forzado Porcentual Clomipramina-Minociclina

1. 2. 3.0

10

20

30

40SalinaClomipraminaMinociclina

**

Sesiones de Nado Forzado

Tiem

po d

e Lu

cha

(%)

Figura 8. Declive progresivo del tiempo de lucha después de la sección de nado forzado repetido una dosis baja de un inhibidor de la recaptación de serotonina clomipramina (2,5 mg/Kg, i.p. por día) y Minociclina una tetraciclina (40 mg/Kg). * representa una diferencia significativa con p<0,0001 observada en las ratas pretratadas con clomipramina al compararla con minociclina.

68


0 5 10 15 200

1

2

3SalinaClomipramina

* *

*

*

***

**

* *


Intervalos min.

Punt

aje

de D

olor


0 5 10 15 200

1

2

3SalinaClomipramina


Intervalos min.

Punt

aje

de D

olor

No Manipuladas

0 5 10 15 200

1

2

3SalinaClomipramina


Intervalos min.

Punt

aje

de D

olor

A

B

C

Figura 9. Curvas de respuesta nociceptiva. Todas las ratas fueron sometidas a la prueba de formalina. A) Las ratas sometidas a nado forzado mostraron una respuesta hiperalgésica frente a la prueba de formalina, B) simulacro de nado, C) no manipuladas. Las barras negras representan 2 períodos de no observación conductual (15 min cada unos). Cada punto representa la media ± el error estándar obtenido de 6 ratas. * representa una diferencia significativa de p< 0.01 en todos los intervalos marcados, excepto el 8 y el 18 con un p<0,001 con respecto a control salino (A).

69


I-II III-IV V-VI VII VIII IX X0

10

20

30

40

50SalinaClomipramina

**

*

Laminas

Núm

ero

de c

élul

as c

-Fos

+



10

20

30

40


Laminas

Núm

ero

de c

élul

as c

-Fos

+

No Manipuladas


10

20

30

40


Laminas

Núm

ero

de c

élul

as c

-Fos

+

A

B

C

Figura 10. Expresión laminar de la proteína c-Fos en ratas seguida de la inyección subcutánea de formalina en la pata trasera derecha. A) Las ratas pretratadas con solución salina sometidas a nado forzado mostraron un incremento significativo en el marcaje de los núcleos inmunoreactivos en la lámina I-II y V-VI. B) simulacro de nado, C) no manipuladas. * representa una diferencia significativa con p<0,0001 de las ratas salinas estresadas al compararla con ratas estresadas y pretratadas con clomipramina.

70

En la Figura 8 A y B muestran que las ratas sometidas a nado forzado

repetido, pretratadas con solución salinas ó con minociclina, tienen una

disminución progresiva en el tiempo de lucha o intentos de escape durante las

tres secciones consecutivas de nado, sin una diferencia significativa entre ellas.

Esta falta de deseo de escape (lo que es denominado “inmovilidad” en la

prueba de nado forzado), no se observó en las ratas que fueron tratadas con

clomipramina, un inhibidor de la recaptura de serotonina. Una diferencia

significativa entre las ratas pretratadas con clomipramina y minociclina fue

observada durante el segundo y tercer día de las secciones de nado forzado

(p<0,0001).

En las ratas sometidas a estrés, pretratadas con clomipramina, tuvieron una

disminución altamente significativa en el número de núcleos inmunoreactivos al

anticuerpo contra la proteina c-Fos (un marcador de activación de neuronas

sensoriales) en comparación con aquellas pretratadas con solución salina. En

las ratas salinas sometidas a nado forzado, la prueba de formalina indujo una

significativa activación neuronal demostrada por la presencia de núcleos c-Fos

inmunoreactivos en las láminas I-VI (sensoriales) del asta dorsal de la medula

espinal lumbar (Figuras 10 y 11). Las ratas sometidas a nado forzado y

pretratadas con clomipramina tuvieron un número significativamente menor de

núcleos c-Fos inmunoreactivos en las láminas I-VI (sensoriales) del asta dorsal

que las ratas tratadas con solución salina (p<0,0001) (Figuras 10A, 11A-B). La

71

mayoría de los núcleos estuvieron localizados en las laminas superficiales

(láminas I-II) y en la coyuntura (laminas V-VI) del asta dorsal de la medula

espinal lumbar, lo cual coincide con la proyección topográfica de las aferentes

en médula espinas de las patas traseras (Molander y Grant 1985, 1986). En las

ratas sometidas a simulacro de nado, y en aquellas no manipuladas, no se

observó diferencia significativa en el número de núcleos c-Fos inmunoreactivos

entre aquellas pretratadas con salina o con clomipramina (Figura 10 B-C y

Figura 11 C-F).

72

B

C D

E F

Figura 11. Microfotografía (100X) mostrando la expresión de la proteína c-Fos inducida por formalina en el asta dorsal espinal de ratas. Protocolo conductual (A) Salina con Nado forzado (B) Clomipramina con nado forzado (C) Salina Simulacro, (D) Clomipramina Simulacro, (E) Salina No manipulada y (F) Clomipramina No manipulada.

I-II

I-II

I-II

I-II

I-II

III-IV

III-IV III-IV

III-IV III-IV

V-VI

V-VI V-VI

V-VI V-VI

V-VI

III-IV

I-II A B I-II

III-IV

V-VI

73

6.- DISCUSION

En este estudio se observo que existe una relación entre el dolor

inflamatorio inducido por formalina y la activación de microglia. Los animales

sometidos a estrés de nado, simulacro de nado y no manipulados, a los cuales

se les produjo un dolor inflamatorio agudo con la inyección subcutánea de

formalina, mostraron microglia tanto en reposo como activadas marcadas con

OX-42. En los animales que fueron sometidos a estrés de nado forzado

repetido durante 3 días consecutivos y luego a dolor cutáneo inflamatorio

agudo mostraron un aumento significativo de las células microgliales OX-42

positivas, tanto aquellas que parecían en reposo como aquellas que lucían

activas desde el punto de vista morfológico. La microglia activada estuvo

fuertemente teñida con un significativo acortamiento de las ramificaciones y

engrosamiento en su centro, aunque sin llegar al estado final de activación

cuando las células toman una morfología ameboide. La microglia activada

estaba distribuida homogéneamente en el asta dorsal lumbar, observándose un

gran número de ellas en láminas I y II, la cual coincide con la proyección

topográfica de las aferentes en médula espinal de las patas traseras (Molander

y Grant 1985, 1986).

El anticuerpo monoclonal OX-42 en roedores (en humanos clon 25f9 y en

monos clon M1/70.15.1) se une al receptor para el complemento tipo 3 CR3,

74

también llamado Integrina αM [CD11b], Mac-1, Mo-1 ó integrina αM, cuyo

ligando natural endógeno es la proteína del complemento iC3b. El CR3 es

expresado constitutivamente en la microglia y por ello la microglia tanto en

reposo como activa se tiñen con el procedimiento inmunohistoquímico que usa

OX-42. Por este motivo, el criterio de activación para la evaluación de la

microglia se basa en cambios morfológicos que pueda sufrir la célula. Se uso el

OX-42 que marca el receptor constitutivo CR3, en vez de un anticuerpo que

inmunoreaccionara con receptores microgliales inducibles, porque se ha

establecido una estrecha relación entre la activación microglial, el aumento de

la expresión de este receptor CR3 y dos represores que mantienen la microglia

en reposo: la proteína CD200 expresada en neurona y el receptor CD200R

expresado en microglia.

Existen evidencias de que las neuronas controlan el estado de activación

de la microglia, contribuyendo a su estado quiescente. Uno de los mecanismos

sugeridos de cómo las neuronas controlan la activación microglial es la

interacción con el ligando CD200, una glicoproteína de membrana presente en

las neuronas, con su receptor CD200R que esta expresado abundantemente

en las células mieloides, entre ellas la microglia (Neuman, 2001; Wright y col.,

2003). Hoek y col. (2000) crearon un ratón homocigoto (- / -) para la expresión

de la glicoproteína CD200. En ratones con una expresión normal de la

glicoproteína CD200, las microglias que estaban quiescentes, expresaban en

75

su superficie celular muy bajos niveles de MHC II, CR3 y CD45, mostrando una

morfología muy ramificada. En contraste, las microglias de los animales

homocigoto (- / -), sin expresión detectable de la glicoproteína CD200, exhibían

muchas características de activación, incluyendo pocas ramificaciones,

engrosamiento en su centro, incremento en la expresión de MHC II, CR3 y

CD45. El CR3 es el receptor del iC3b, fragmento generado por la proteolisis de

C3b; y desempeña un papel importante en la fagocitosis de partículas

recubiertas por iC3b. El CD45 en su dominio citoplasmático contiene una

región con actividad proteica tirosina fosfatasa intrínseca que cataliza la

eliminación de fosfatos de los residuos de tirosina en varios sustratos. Uno de

esos sustratos es la Lck (tirosina quinasa específica de linfocitos, no receptora,

de la familia Src), la cual está asociada de forma no covalente (aunque

firmemente) a las colas citoplasmáticas de las moléculas CD4 y CD8, y es

necesaria para la maduración y activación de las células T. Además, el CD45

desempeña un papel esencial en la señalización mediada por receptores de las

células T y B para antígenos. Frank y col., 2007 demostraron que el estrés

origina una regulación corriente abajo de la expresión hipocámpica de la

proteína CD200 24 horas después del estrés. El efecto del estrés provocado

por el skock inescapable en CD200 estuvo limitado sólo a el análisis del ARN

mensajero, por lo tanto hasta que no se establezca que el skock inescapable

modula el CD200 a nivel de proteínas, estos resultado debe tratarse con

cuidado (Frank y col., 2007). Sin embargo, el efecto del estrés en el CD200

76

sugiere que la sensibilización inducida por estrés de la microglia puede

mediarse en parte por atenuación del control neuronal de microglia, el cual

resulta en un microambiente permisivo proinflamatorio en el sistema nervioso

central. Es de hacer notar que la expresión de CD200 también está reducido en

animales ancianos sugiriendo que el control neuronal reducido de la microglia

puede ser una característica general que contribuya a la activación microglial.

La señal neuroquímica o neurohormonal que es inducida por el estrés y que

actúa sobre el CD200 todavía no es bien conocida (Hernangómez y col.,

2006).

La exposición previa a una fuente de estrés puede potenciar la respuesta

inmunológica proinflamatoria del sistema nervioso central a un estímulo

inmunológico periférico, sin embargo los sustratos neuroinmunológicos que

median este efecto no se han determinado (Frank y col., 2007). Tanto la

exposición al estrés como la activación inmunológica inducen la producción de

citoquinas en el sistema nerviosos central. Jonson y col. (2004) demostraron

que la IL1β exógena simula los efectos del estrés, estos resultados sugieren

que la IL1β central media la potenciación inducida por estrés de la respuesta

inmunológica en el SNC (O´Connor y col., 2003), el estrés pareciera

sensibilizar o preparar el sistema nervioso para una respuesta incrementada a

un estímulo inmunológico periférico subsiguiente. Debido a que las microglias

son las células efectoras inmunológicas primarias en el sistema nervioso

77

central y son una fuente principal de citoquinas proinflamatorias en este

sistema, la microglia pudiera servir como sustrato neuroinmunológico. Los

astrocitos pueden jugar un papel importante, pero las microglias son más

reactivas que los astrocitos y la inducción de IL1β por activación inmunológica

periférica es más prominente en las microglias que en los astrocitos (Aloisi,

2001).

La prueba de formalina produce inflamación, la cual se acompaña de

acidosis tisular (Sawynok y col., 2003; Mogil y col., 2005), lo que es uno de los

factores que pueden contribuir a los mecanismos periféricos centrales de la

hiperalgesia. Mamet y col. (2005) demostraron que los niveles

transcripcionales de los canales iónicos ácido sensibles (ASICs) se

incrementaron in vitro en condiciones inflamatorias, observando que este

incremento era causado por NGF, serotonina, IL-1 y bradikinina. Una mezcla

de estos mediadores incrementaría el número de neuronas que expresan

ASICs llevando a una excitabilidad mayor de las neuronas sensoriales,

pudiendo especular que esta mayor excitabilidad pudiera de alguna manera

estar asociada a los cambios transcripcionales que pudieran modificar por

mecanismos no establecidos la expresión de la glicoproteína CD200 y a su vez

influir en la regulación del estado de quiescencia de las microglias, así como

también el efecto de la clomipramina sobre los niveles de serotonina pudiera a

78

través de esta vía aunque en menor grado que el NGF disminuir la

hiperalgesia.

Por otra parte, existen antibióticos con una acción potente y preferencial

inhibitoria sobre microglia y no sobre los astrocitos o neuronas como la

minociclina, que es una tetraciclina semisintética de segunda generación que

penetra bien en SNC a través de la barrera hematoencefálica (Cho y col.,

2006). Además de su acción como antibiótico, la minociclina tiene efecto

neuroprotector y antiinflamatorio en el SNC (Tikka y col., 2001; Yrjanheikki y col

1998). En el presente estudio se pudo observar que el tratamiento con

minociclina disminuyo considerablemente el número de microglias activas que

aparecían teñidas intensamente en el segmento lumbar de la medula espinal

de animales estresados sin minociclina (ratas controles tratadas con solución

salina), observándose un mayor número de microglia con morfología

característica de microglias en reposo, poco teñidas, con muchas

ramificaciones y con un centro citoplasmático perinuclear, adquiriendo una

apariencia muy similar a la observada en las ratas que fueron sometidas a

simulacro de nado y no manipulada, las cuales mostrando más microglias en

reposo que activadas.

El típico patrón bifásico de comportamiento nociceptivo frente al dolor

inflamatorio agudo, inducido por la inyección subcutánea de formalina en la

79

pata trasera de la rata fue observado en los animales pretratados con

minociclina sometidos a estrés, simulacro de nado y no manipuladas, un

patrón similar fue observado en las ratas pretratadas con solución salina

sometidas a simulacro de nado y no manipuladas. Observándose la máxima

actividad de comportamiento nociceptivo (dolor) en el inicio de la fase II con un

decrecimiento progresivo a través del tiempo.

Las ratas a las que se les inyectó solución salina y fueron sometidas a

estrés de nado mostraron una mayor respuesta nociceptiva (hiperalgesia) en

los 15 últimos minutos de observación de la fase II al compararlas con las ratas

estresadas y pretratadas con minociclina.

Las ratas pretratadas con minociclina y sometidas a estrés, mostraron un

bloqueo de la hiperalgesia observada durante la fase II de la prueba de

formalina en comparación con las ratas estresadas pretratadas con solución

salina. La fase I de la prueba de formalina se cree refleja dolor nociceptivo

agudo originado por la acción irritante que la formalina ejerce directamente

sobre las terminales nerviosas activadas por estímulos dolorosos, mientras que

la fase II se atribuye a la combinación de impulsos aferentes de nervios

sensoriales estimulados por el proceso inflamatorio del tejido subcutáneo

periférico (en la pata trasera) y cambios funcionales en la neurotransmisión

80

moduladora de la información dolorosa en el asta dorsal de la médula espinal

que conducen a una facilitación o sensibilización central a la transmisión y

procesamiento de los impulsos dolorosos. Debido a que la minociclina penetra

bien a través de la barrera hematoencefálica puede producir efecto

antinociceptivo mediante la regulación periférica y/o mecanismos centrales

relacionados con el dolor inflamatorio inducido por formalina e incrementados

por el estrés previo. Cho y col. (2006) reportaron resultados similares sobre el

efecto inhibitorio de la minociclina sobre el dolor inflamatorio en el modelo de

formalina; aunque sin someter los animales a estrés, ellos además observaron

que la minociclina tenía un efecto antiedematoso en el tejido periférico. A pesar

de que Cho y col (2006) no observaron cambio en las propiedades eléctricas

de la membrana o en la excitabilidad de las neuronas en el ganglion dorsal,

plantean que no se puede excluir la posibilidad de que la minociclina pueda

inhibir la respuesta inmune periférica inducida por la inyección de formalina,

inhibiendo por lo tanto de manera indirecta la actividad neuronal sensorial.

Los antidepresivos son el grupo coadyuvante más ampliamente utilizado en

el tratamiento del dolor, especialmente en el dolor crónico, unas veces como

complemento de los analgésicos antipiréticos (AAP)/antiinflamatorio no

esteroideos (AINE), opioides y otros como fármacos de primera elección

(McQuay y col., 1997; Yerro y col., 2000; Lynch 2001; Flórez, 2004). La acción

analgésica de los antidepresivos es independiente de su acción antidepresiva

81

(Cruciani y col. 2006), aunque existan situaciones de dolor crónico con

componente depresivo en las que el alivio de este factor contribuye a mejorar la

actividad general del paciente, dolor incluido (Flórez, 2004). El mecanismo de

su acción analgésica sigue siendo objeto de controversia. Suele afirmarse que

es el resultado del incremento de la actividad conjunta de los sistemas

endógenos descendentes noradrenérgicos y serotonérgicos que proyectan al

asta posterior de la médula espinal y controlan las vías aferentes del dolor,

como consecuencia de su acción bioquímica que consiste en la inhibición de la

recaptación de noradrenalina y serotonina en las respectivas terminaciones

nerviosas (Atkinson y col. 1999). Pero esta explicación dista de ser aceptada

por todos, y se proponen otras teorías como son la acción neurotrófica, la

acción reguladora de la plasticidad sináptica, los cambios a largo plazo en la

actividad y equilibrio entre diversos tipos de receptores, e incluso acciones

cerebrales supraespinales que contribuyan a reducir la percepción del dolor

(Eschalier y col., 1988; Flórez, 2004; Marchand y col., 2006).

Los fármacos con los que se tiene una experiencia más amplia son la

amitriptilina, la clomipramina, la desipramina y la doxepina (Flórez, 2004;

Veldhuijzen y col. 2006). En ocasiones, y en función del tipo de dolor que se

instaura en un determinado paciente, el antidepresivo será el primer fármaco

que se utilice: es el caso, por ejemplo, de una neuralgia postherpética o de una

neuralgia diabética (Vidal y col., 2004; Neira y col., 1998). En otras, en cambio,

82

el antidepresivo se suma al analgésico opioide o AAP/AINE que se estaba ya

utilizando: es el caso de un dolor oncológico en el que aparece un componente

neuropático nuevo, o un componente depresivo (Almanza-Muñoz y col., 2000).

La clomipramina es menos sedante y más euforizante que la amitriptilina, lo

que puede ser ventajoso para algunos pacientes, pero en conjunto, suele ser

peor tolerada, produciéndose un mayor número de abandonos del tratamiento

(Flórez, 2004).

El típico patrón bifásico de comportamiento nociceptivo frente a la prueba

de formalina fue observado en los animales pretratados con clomipramina ó

solución salina sometidos a simulacro de nado y no manipuladas.

Las ratas pretratadas con clomipramina, varios días antes y durante las

exposiciones a las situaciones de estrés, mostraron un bloqueo de la

hiperalgesia observada durante la fase II de la curva de respuesta nociceptiva

en comparación con las ratas pretratadas con solución salinas y sometidas a

estrés. Un tratamiento crónico y a bajas dosis con un inhibidor de la

recaptación de serotonina como la clomipramina produjo un bloqueo de la

hiperalgesia observada en las ratas salinas sometidas a nado forzado, para

verificar los efectos nociceptivos de la clomipramina en el dolor inflamatorio

inducido por formalina se observo inmunohistoquímicamente cambios en la

expresión de la proteína c-Fos inducida por dolor en el asta dorsal espinal. En

83

el presente estudio se demostró que la regulación corriente arriba de la

expresión de c-Fos originada por la inyección de formalina fue inhibida por la

clomipramina. Debido a que el c-Fos es un marcador que puede regularse

corriente arriba por muchos tipos de estímulos nocivos periféricos (Curran y

Morgan, 1995; Vergnolle y col, 2001; Watkins y col 1997), la reducción de su

expresión en el asta dorsal de la medula indica claramente la acción

antinociceptiva de la clomipramina.

Estudios en microdiálisis con ratas con movimiento libre mostraron un

incremento en los niveles de serotonina en varias regiones del cerebro,

específicamente el rafe magno, después de 15 minutos de nado forzado (Ikeda

y col., 1985; Adell y col., 1997). Por el contrario, el nado forzado prolongado por

30 minutos, disminuye el flujo de serotonina en ciertas estructuras cerebrales

como la amigdala y el septum lateral, por lo tanto especulamos que el estrés

de nado crónico produce un incremento inicial en la actividad de los sistemas

de serotonina central, el cual es seguido por una reducción en la liberación

como respuesta al estrés prolongado.

El presente estudio sugiere que el incremento en la percepción del dolor

inflamatorio cutáneo agudo que ocurre luego de la exposición repetida estrés

de nado forzado pudieran estar mediados por cambios en la actividad del

sistema central serotoninérgico, la serotonina es un modulador inhibitorio de la

84

nocicepción, por lo tanto, aumentos en sus niveles llevarían a una analgesia

(disminución de la percepción del dolor) y una disminución de sus

concentraciones extracelulares provocarían un estado hiperalgésico (aumento

de la percepción del dolor). En el presente estudio se encontró que la

hiperalgesia por exposición repetida a nado forzado disminuye

considerablemente por administración, antes de la exposición a estrés, de

bajas dosis de clomipramina, un inhibidor selectivo de la recaptación de

serotonina. Los sitios de acción de la clomipramina todavía no han sido bien

aclarados, debido a que su efecto antihiperalgesico puede ser llevado a cabo

en diferentes áreas inervadas por el sistema serotoninérgico central. Un

componente principal del efecto antihiperalgesico de este agente

serotoninérgico puede deberse a su acción en neuronas serotononérgicas en el

rafe magno que envía fibras descendentes a las capas superficiales de las asta

dorsales medulares. De hecho, se ha encontrado que las neuronas del rafe

magno inhiben la respuesta al dolor provocada por formalina (Abbott y col.,

1982). El estrés por nado agudo reduce significativamente y por largo plazo los

niveles extracelulares de 5-HT en el septum lateral y amigdala (Kirby y col.,

1995, 1997). Hallazgos experimentales convergentes implican en este efecto

inhibitorio al factor liberador de corticotropina (CRF), un neuropeptido liberado

rápida y masivamente durante una situación de estrés. La administración de

CRF en el núcleo dorsal del rafe imita el efecto inhibitorio del nado forzado

sobre el incremento de 5-HT (Price y col. 1998, 2002). Además el incremento

85

de la inhibición de 5-HT por el estrés de nado puede prevenirse por la previa

administración de antagonistas del CRF (Xiang y col., 2003).

El dolor evocado por formalina puede inhibirse por estimulación eléctrica de

la sustancia gris periacueductal, por lo tanto, el estrés de nado forzado repetido

puede producir hiperalgesia mediante el bloqueo del control inhibitorio de la

sustancia gris periacueductal y esto puede prevenirse con la administración de

agentes serotoninérgicos antes de la exposición a estrés (Dubuisson y col.,

1977). El bloqueo de varias estructuras en el circuito límbico activadas durante

la respuesta fisiológica de estrés, como el núcleo paraventricular del

hipotálamo y el hipocampo, también reduce el comportamiento de dolor

inducido por formalina (Vaccarino y col., 1992). De esta manera, el estrés

crónico puede incrementar la nocicepción al aumentar la actividad de las

estructuras límbicas del hipotálamo e hipocampo para producir hiperalgesia y

agentes serotoninérgicos pueden actuar en estas regiones para inhibir la

hiperalgesia inducida por estrés mediada por el sistema límbico (Akil y col.,

1995).

En el presente estudio también se observo, en las ratas controles tratadas

solo con solución salina, que a medida que se exponía repetidamente al estrés

de nado inescapable, había una reducción progresiva en el tiempo dedicado a

tratar de escaparse del recipiente con agua. Las ratas expuestas al estrés de

86

nado y tratadas con clomipramina antes del estrés mostraron un incremento

significativo en el tiempo dedicado a tratar de escapar del estresor. La

disminución del comportamiento de escape inducido por el estrés de nado

forzado inescapable se ha denominado comportamiento de desesperación o

invalidez aprendida y se cree que representa en los roedores un equivalente de

la depresión clínica en humanos. Es interesante el hecho de que el estrés

crónico produce cambios funcionales y bioquímicos en el eje límbico

hipotalámico pituitario que son muy similares a los observados durante la

depresión severa, siendo dichos cambios considerados una característica

necesaria de este síndrome (Akil y col., 1995). La sensibilidad al dolor se

incrementa en individuos con depresión menor o mayor (Merskey, 1965) y los

individuos deprimidos reportan una prevalencía mayor de problemas de dolor

clínico (Merskey, 1965; Piñerua-Shuhaibar, 1999). En el presente estudio, las

ratas mostraron una falta exagerada de deseo de escape (lo que es

denominado “inmovilidad” en la prueba de nado forzado) y una respuesta

hiperalgesica a la inflamación aguda, siendo dichos cambios revertidos por la

clomipramina, un inhibidor de la recaptura de serotonina (Izumi R, 1983;

Quintero y col., 2000). Esto nos podría llevar a especular que la falta exagerada

al deseo de escape y la hiperalgesia podría resultar de una deficiencia en la

transmisión central serotoninérgica, lo que produce tanto depresión como

sensibilización a las vías centrales del dolor.

87

7.- CONCLUSIÓN

1) El estrés incrementó la activación microglial inducida por la inyección

subcutánea de formalina. El estrés pareciera sensibilizar el sistema nervioso

para una respuesta incrementada a un estímulo inmunológico periférico

subsiguiente. La activación microglial esta condicionada por varios factores,

uno de los más importantes es la permanencia en un estado de quiescencia o

reposo provocada por la unión del receptor CD200R en la microglia con la

glicoproteína CD200 presente en las neuronas. La exposición repetida a estrés

pudiera de alguna manera estar asociada a cambios transcripcionales y de

señalización que causarían modificaciones en la expresión de la glicoproteína

CD200 en las neuronas.

2) La minociclina inhibió la activación microglial central observada en la

medula espinal de ratas estresadas y con un proceso inflamatorio agudo

doloroso. Al mismo tiempo, la administración de minociclina antes de cada

estrés de nado forzado evitó el desarrollo de la hiperalgesia cutánea, la cual si

se desarrolló en ratas estresadas pero tratadas solo con solución salina. Por lo

tanto, la hiperalgesia inducida por estrés de nado forzado podría estar

vinculada a una sobre-activación de la microglia en el sistema nervioso central.

88

3) El presente estudio sugiere que el incremento en la percepción del

dolor inflamatorio cutáneo agudo que ocurre luego de la exposición repetida a

estrés de nado forzado pudieran estar mediados por cambios en la actividad

del sistema central serotoninérgico. En el presente estudio, la hiperalgesia

cutánea, la falta exagerada del deseo de escape de un ambiente estresante

(“inmovilidad”) y la sobre-activación de las neuronas espinales sensoriales

inducida por un dolor inflamatorio agudo (estimada como un expresión

incrementada de la proteína c-Fos) fueron considerablemente bloqueadas por

administración de clomipramina antes de la exposición a estrés. Esto nos

podría llevar a especular que una deficiencia en la transmisión central

serotoninérgica produce tanto una conducta depresiva como una

sensibilización a las vías centrales del dolor.

89

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