padronização de técnicas e análises de biomarcadores em ... · v.3 – quantificaÇÃo de...
TRANSCRIPT
Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos da Costa Brasileira provenientes do
PMP-BS e PMC-BS
Relatório Técnico Anual
Versão 01
Junho / 2018 Período de Referência: Dezembro / 2016 a Dezembro / 2017
E&P
Pág. 3 / 203 Controle de Revisões
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
CONTROLE DE REVISÕES
REV. DESCRIÇÃO DATA
00 Versão inicial 17/04/2018
01 Primeira revisão 20/06/2018
Original Rev. 01 Rev. 02 Rev. 03 Rev. 04 Rev. 05 Rev. 06 Rev. 07 Rev. 08
Data 17/04/18 20/06/18
Elaboração LABCAI LABCAI
Verificação A. Bainy A. Bainy
Aprovação A. Bainy A. Bainy
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Índice Geral
Pág. 4203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ÍNDICE GERAL
ÍNDICE GERAL ..................................................................................................... 4
TABELAS E QUADROS ........................................................................................ 7
FIGURAS ............................................................................................................. 10
GLOSSÁRIO ........................................................................................................ 14
RESUMO ............................................................................................................. 16
I – INTRODUÇÃO ................................................................................................ 18
II – RECEBIMENTO E GUARDA DE AMOSTRAS .............................................. 20
III – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE BIOMARCADORES
BIOQUÍMICOS EM ESPÉCIES DE CETÁCEOS ................................................. 75
III.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS .............................................................. 75
III.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................. 76
III.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS ......... 77
III.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE
GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST) ......................................................... 77
III.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ...................................................... 78
III.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 81
III.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE
ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD) ................................................. 90
III.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ...................................................... 90
III.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 93
III.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA CETÁCEOS .................................. 99
III.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM CETÁCEOS: COMPARAÇÃO
COM OS DADOS DA LITERATURA .............................................................. 100
IV – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE BIOMARCADORES
BIOQUÍMICOS EM AVES MARINHAS .............................................................. 109
IV.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS ........................................................... 109
IV.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ........................................... 110
IV.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS ....... 110
IV.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE
GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST) ....................................................... 111
IV.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ................................................... 111
Pág. 5 / 203 Índice Geral
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
IV.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................... 113
IV.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE
ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD) ............................................... 117
IV.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ................................................... 117
IV.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................... 119
IV.6 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS AMOSTRAS
PARA O ENSAIO DE GST ............................................................................. 124
IV.6.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ................................................... 124
IV.6.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................... 126
IV.7 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS AMOSTRAS
PARA O ENSAIO DE EROD .......................................................................... 128
IV.7.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ................................................... 128
IV.7.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................... 129
IV.8 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA AVES .......................................... 132
IV.9 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM AVES: COMPARAÇÃO COM
OS DADOS DA LITERATURA ........................................................................ 133
V – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS ................................... 139
V.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS ............................................................ 139
V.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................ 139
V.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS ........ 140
V.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE
GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST) ...................................................... 141
V.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS .................................................... 141
V.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 142
V.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE
ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD) ............................................... 145
V.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS .................................................... 145
V.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 147
V.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA QUELÔNIOS .............................. 150
V.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS: COMPARAÇÃO
COM OS DADOS DA LITERATURA .............................................................. 151
VI – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE BIOMARCADORES
MOLECULARES ................................................................................................ 156
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Índice Geral
Pág. 6203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
VI.1 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: AVES MARINHAS .................... 156
VI.2 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: TARTARUGAS MARINHAS ...... 160
VI.3 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: CETÁCEOS MARINHOS .......... 162
VI.4 – PADRONIZAÇÃO DE BIOMARCADORES MOLECULARES ............ 168
VI.4.1 – EXTRAÇÃO DE RNA E AVALIAÇÕES DE CONCENTRAÇÃO E
INTEGRIDADE 169
VI.4.2 – DESENHO DE INICIADORES e qPCR .......................................... 173
VII – CONCLUSÕES ......................................................................................... 183
VIII – PRÓXIMAS ETAPAS ................................................................................ 187
IX - BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 188
X – EQUIPE TÉCNICA ...................................................................................... 202
Pág. 7 / 203
Lista de Tabelas e Quadros
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
TABELAS E QUADROS
TABELA OU QUADRO PÁG.
Tabela II-1 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de
Santos (PMP-BS) destinadas à análise de biomarcadores. 20/203
Tabela II-2 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Cetáceos da Bacia
de Santos (PMC-BS) destinadas à análise de biomarcadores. 21/203
Tabela II-3 - Caracterização das amostras do PMP-BS recebidas pelo LABCAI para
análise de biomarcadores: Código da amostra (SIMBA), espécies, matriz tecidual da
amostra, código de decomposição, método de preservação no local de coleta, método de
preservação no LABCAI, condição da amostra e observações.
23/203
Tabela II-4 - Caracterização das amostras do PMC-BS recebidas pelo LABCAI para
análise de biomarcadores: número da biópsia, espécies, matriz tecidual da amostra,
método de preservação no LABCAI, condição da amostra e observações.
63/203
Tabela III-1 - Identificação dos espécimes de cetáceos provenientes do PMP-BS e PMC-
BS cujas amostras hepáticas e tegumentares foram utilizadas para padronização da
atividade glutationa S-transferase (GST) e da atividade etoxiresorufina-O-deetilase
(EROD).
75/203
Tabela III-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-
transferase (GST) com amostras de cetáceos. 100/203
Tabela III-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-
O-deetilase (EROD) com amostras de cetáceos. 100/200
Tabela III-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos
da padronização do presente projeto com aqueles reportados em outros estudos
realizados em mamíferos marinhos.
102/203
Tabela III-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD)
oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados em outros estudos
realizados com mamíferos marinhos.
104/203
Tabela IV-1 - Identificação dos espécimes de aves marinhas provenientes do PMP-BS
cujas amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade glutationa S-
transferase (GST) e da atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).
109/203
Tabela IV-2 - Identificação e sumário de informações médicas e de admissão referentes
às aves amostradas para verificação de estabilidade de biomarcadores bioquímicos e
moleculares post mortem.
125/203
Tabela IV-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-
transferase (GST) com amostras de aves. 132/203
Tabela IV-4 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-
O-deetilase (EROD) com amostras de aves. 132/203
Tabela IV-5 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos
da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para aves. 134/203
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Lista de Tabelas e Quadros
Pág. 8/203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela IV-6 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD)
oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para
aves.
136/203
Tabela V-1 - Identificação dos espécimes de quelônios provenientes do PMP-BS cujas
amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade glutationa S-
transferase (GST) e da atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).
139/203
Tabela V-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-
transferase (GST) com amostras de quelônios. 150/203
Tabela V-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-
O-deetilase (EROD) com amostras de quelônios. 150/203
Tabela V-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos
da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para quelônios. 152/203
Tabela V-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD)
oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para
quelônios.
153/203
Tabela VI-1 - Espécies de aves marinhas, respectivos números de espécimes coletados
junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As
espécies com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma
estão destacadas em azul.
157/203
Tabela VI-2 - Espécies de tartarugas marinhas, respectivos números de espécimes
coletados junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma
público. A espécie com número amostral satisfatório para a análise de biomarcadores
moleculares está destacada em azul.
160/203
Tabela VI-3 - Relação dos genes potencialmente biomarcadores de exposição em
Chelonia mydas e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI. 161/203
Tabela VI-4 - Espécies de cetáceos, respectivos números de espécimes coletados junto
ao PMC-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies
com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma estão
destacadas em azul.
162/203
Tabela VI-5 - Espécies de cetáceos, respectivos números de espécimes coletados junto
ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies
com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma estão
destacadas em azul.
163/203
Tabela VI-6 - Relação dos genes potencialmente biomarcadores de exposição em
Tursiops truncatus e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI. 165/203
Tabela VI-7 - Espécies e correspondente número de sequências gênicas (DNA e RNA) e
de proteínas, obtidas no banco de dados do NCBI. 166/203
Tabela VI-8 - Lista de espécies coletadas pelo PMP-BS e PMC-BS, e sua relação com
existência de dados gênicos públicos para a espécie. 168/203
Tabela VI-9 - Subamostras de Chelonia mydas com suas respectivas concentrações
(ng/µL) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230. 171/203
Pág. 9 / 203
Lista de Tabelas e Quadros
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela VI-10 - Concentração (ng/µL) e pureza e razões de 260/280 e 260/230 do RNA
extraído de tecidos de Tursiops truncatus. 171/203
Tabela VI-11 - Lista de iniciadores de Chelonia mydas para os genes de interesse do
PMP-BS e PMC-BS. 174/203
Tabela VI-12 - Lista de iniciadores de Tursiops truncatus para os genes de interesse do
PMP-BS e PMC-BS. 174/203
Tabela VI-13 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em fígado de Chelonia
mydas. Não foi possível amplificar HSP1A e AHR. E: eficiência. A eficiência de 1,00
significa que os amplicons duplicam a cada ciclo e, portanto, a reação é 100% eficiente.
178/203
Tabela VI-14 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em tecidos de Tursiops
truncatus. E: eficiência. A eficiência de 1,00 significa que os amplicons duplicam a cada
ciclo e, portanto, a reação é 100% eficiente.
180/203
Tabela VI-15 - Subamostras de tecidos de cetáceos com suas respectivas concentrações
de RNA (ng/µL) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230. 181/203
Tabela VII-1 - Resumo das condições dos ensaios GST e EROD em tetrápodes marinhos. 184/203
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Figuras
Pág. 10/203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
FIGURAS
FIGURAS PÁG.
Figura III.4-1 - Reação de formação do conjugado GS-DNB a partir da reação entre 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e glutationa reduzida (GSH), catalisada por glutationa
S-transferase (GST) (Adaptado de Habig, 1981).
78/203
Figura III.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Sotalia
guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do
ensaio: Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por
meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As
linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
83/203
Figura III.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Sotalia
guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do
ensaio: Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por
meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As
linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
84/203
Figura III.4-4 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Stenella
frontalis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-
2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de
regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas
tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
85/203
Figura III.4-5 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Stenella
frontalis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-
2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:
tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de
regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas
tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
86/203
Figura III.4-6 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Tursiops
truncatus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos
glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do
ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por
meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As
linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
87/203
Pág. 11 / 203 Figuras
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.4-7 - Curvas cinéticas de atividade GST em epiderme de Balaenoptera
borealis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos
glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do
ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por
meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As
linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
88/203
Figura III.5-1 - A. Atividade EROD em tecido hepático de tainha (Mugil lisa) exposta a
dispersantes de petróleo, conforme observada no software SpectraMax® M5 (Molecular
Devices®), para fins de comparação com B. Atividade EROD em tecido tegumentar de
golfinho pintado do atlântico (Stenella frontalis), em duplicata, conforme observada no
software SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). Linhas em duplicata mais abaixo em
‘B’ representam o Branco, sem adição de amostra.
94/203
Figura III.5-2 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD. B.
Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Sotalia guianensis construída
com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo
Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao
modelo de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de
95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da
curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax prevista na ausência de
inibição por substrato.
96/203
Figura III.5-3 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD. B.
Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Stenella frontalis construída
com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo
Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao
modelo de Inibição por substrato, linhas pontilhadas indicam o intervalo de confiança de
95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da
curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax estimado na ausência de
inibição por substrato.
98/203
Figura IV.4-1 - Atividade GST, representada pelo aumento de absorbância por minuto
(Abs Min), em concentrações crescentes de etanol. Barras representam média ± DP,
calculados a partir de quadruplicatas técnicas* para cada condição de ensaio.*Réplicas
técnicas são repetições de análises de um mesmo organismo (amostra biológica)
realizadas durante um ensaio. As réplicas técnicas podem ser usadas para avaliar a
repetibilidade do método.
113/203
Figura IV.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Larus
dominicanus, construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos
glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B).
115/203
Figura IV.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Spheniscus
magellanicus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do
ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por
meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.
116/203
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Figuras
Pág. 12/203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura IV.5-1 - Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Larus
dominicanus construídas com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-
etoxiresorufina (7-ER) (A), sendo Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não
linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. Inibição da deetilação de 7-
ER em concentrações crescentes de NADPH (B).
121/203
Figura IV.5-2 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD,
dados relativizados pela atividade média da concentração de 2 mM. B. Curva cinética de
atividade EROD em tecido hepático de Spheniscus magellanicus construída com
concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo
Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao
modelo de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de
95%. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo
programa é o Vmax estimado na ausência de inibição por substrato.
123/203
Figura IV.6-1 - Atividade GST (mU*mgprt-1) post mortem em tecido hepático de Larus
dominicanus em diferentes tempos de decomposição. Pontosrepresentammédias de
duplicatas técnicas*. * Réplicas técnicas são repetições de análises de um mesmo
organismo (amostra biológica) realizadas durante um ensaio. As réplicas técnicas
podem ser usadas para avaliar a repetibilidade do método.
127/203
Figura IV.7-1 - Estabilidade da atividade EROD em tecido hepático de aves Larus
dominicanus: indivíduos 1 e 2. A atividade foi apresentada como porcentagem em
relação ao T0 (momento da morte do animal). *Atividade não detectada em L.
dominicanus 2 após 24 horas. O ajuste dos dados de ambos os espécimes à equação
exponencial de decaimento apresentou r2 = 0,98. O tempo de meia vida de L.
dominicanus 1 e L. dominicanus 2 foi de 2,8 e 5,2 horas, respectivamente.
130/203
Figura V.4-1 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Chelonia mydas
construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos glutationa
reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do ensaio:
tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 30°C. Km aparente e Vmax obtidos por meio
de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.
144/203
Figura V.5-1 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD,
normalizada pela atividade média da concentração 1 mM. B. Curva cinética de atividade
EROD em tecido hepático de Chelonia mydas construída com concentrações crescentes
do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidos por
meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato,
linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de 95%. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-
Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo programa é o Vmax estimado na
ausência de inibição por substrato.
149/203
Pág. 13 / 203 Figuras
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura VI.4-1 - Resultado da avaliação da qualidade do RNA das quatro subamostras do
mesmo fígado de Chelonia mydas. Eletroforese em gel de agarose 1,2% desnaturante
(Formaldeído) e corado com GelRed (Biotium). Foi aplicado 1 µg de RNA total. Presença
das bandas de RNA ribossomal 28S e 18S e ausência de DNA genômico e
contaminação por proteínas.
172/203
Figura VI.4-2 - Resultado da avaliação da qualidade do RNA das amostras de diferentes
tecidos de Turiops truncatus. Tecidos correspondentes aos números apresentados na
figura: 1) cérebro; 2) fígado; 3) gordura; 4) músculo; 5) pele; e 6) pulmão. *As amostras
de rim e baço não aparecem na figura porque o fotodocumentador foi incapaz de
registrar a fraca intensidade do rastro. O pulmão não apresentou bandas de RNA
ribossomal.
173/203
Figura VI.4-3 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), E2F1 (roxo), EEF2
(laranja), ESR1 (ciano) em fígado de Chelonia mydas. AHR apresentou múltiplos
produtos e não foi mostrado por prejudicar a visualização dos demais picos; HSP não
amplificou. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função
da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de
dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a presença de mais de
um produto.
176/203
Figura VI.4-4 - Curva de dissociação dos genes UGT1 (vermelho) em fígado de
Chelonia mydas. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em
função da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a
temperatura de dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a
presença de mais de um produto.
176/203
Figura VI.4-5 - Gel de agarose 1,2%, nativo, mostrando produtos de qPCR formados
para os genes UGT1A, CYP1A1, E2F, EEF2 e ESR1 de Chelonia mydas em duplicata.
M representa o marcador de peso molecular. Presença de outros produtos em E2F.
177/203
Figura VI.4-6 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), AHR primer A
(azul escuro), E2F1 (roxo), ESR1 (rosa), HSP (laranja) e UGT1 (ciano) em mix de
tecidos de Tursiops truncatus. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da
fluorescência em função da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha
representa a temperatura de dissociação do produto. A presença de mais de um pico
sugere a presença de mais de um produto.
179/203
Figura VI.4-7 - Gel de agarose 1,2%, nativo, evidenciando produtos de qPCR formados
para os genes CYP1A, E2F, ESR1, HSPA, UGT1A e AHR primer B em mix de tecidos
de Tursiops truncatus.
179/203
Figura VI.4-8 - Gel de RNA 1,2%, desnaturante, mostrando resultado da avaliação da
qualidade do RNA para as subamostras de pele de cetáceos (amostra BM66) com
massas de 25, 50, 75 e 100 mg. Foi aplicado 1 µg de RNA total em cada poço e as
amostras foram coradas com GelRed® (Biotium).
182/203
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Glossário
Pág. 14/203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
GLOSSÁRIO
7-ER: 7-etoxiresorufina
ε: Coeficiente de extinção molar
µg: Micrograma
µL: Microlitro
µM: Micromolar
1/V: Inverso da velocidade máxima
BSA: Albumina sérica bovina
cDNA: DNA complementar
CDNB: 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
CYP1A: Citocromo P450 família 1 subfamília A
DEPC: Dietilpirocarbonato
DNA: Ácido desoxirribonucléico
DTT: Ditiotreitol
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
EROD: Etoxiresorufina-O-deetilase
fmol.min-1.mgprt-1: Fentomol de produto por minuto por miligrama de proteína
GSH: Glutationa reduzida
GST: Glutationa S-transferase
IUCN: União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais
KCl: Cloreto de potássio
Ki: Constante de inibição
Km: Constante de Michaelis-Menten
Kmapp: Km aparente
M: Molar
mg: Miligrama
mg.mL-1: Miligrama por mililitro
milliabs.min: Taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1)
min: Minuto
mM: Milimolar
MOPS: 3-[N-morfolino]propano-ácido sulfônico
mU.min.mg proteína-1: Nanomol de substrato por minuto por miligrama de proteína
Pág. 15 / 203 Glossário
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
NADPH: Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina
NCBI: National Center for Biotechnology Information
ng/µL: Nanograma por microlitro
nm: Nanômetro
PCR: Reação em cadeia da polimerase
pH: Potencial hidrogeniônico
pmol.min-1.mgprt-1: Picomol de produto por minuto por miligrama de proteína
PMSF: Fluoreto de fenilmetilsulfonil
Pool: Soma de volumes iguais de amostras de diferentes espécimes
qPCR: Reação em cadeia da polimerase quatitativa
RFU.min-1: Unidade relativa de fluorescência por minuto
RNA: Ácido ribonucléico
S9: Fração citosólica, pós mitocondrial, após centrifugação de 9000 xg
DP: Desvio padrão
Spp: Espécies
Tris-HCl: Cloridrato de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
V: Velocidade
Vmax: Velocidade máxima
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Resumo
Pág. 16/203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
RESUMO
O presente documento descreve as metodologias empregadas e os
resultados obtidos no primeiro ano de padronização de técnicas e análises de
biomarcadores em espécies de tetrápodes marinhos provenientes do PMP-BS e
PMC-BS, compreendendo o período entre dezembro de 2016 e dezembro de
2017.
Foram realizadas as atividades de padronização das atividades das enzimas
glutationa S-transferase (GST) e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) nos
cetáceos Sotalia guianensis, Stenella frontalis, Tursiops truncatus e Balaenoptera
borealis, na tartaruga marinha Chelonia mydas e nas aves marinhas Spheniscus
magellanicus e Larus dominicanus; o ínicio das padronizações moleculares para
Chelonia mydas e Tursiops truncatus; e os testes de estabilidade temporal para
as atividade GST e EROD padronizadas em tecido hepático de Larus
dominicanus.
Os ensaios de padronização permitiram otimizar a concentração de
substratos utilizada nas metodologias de mensuração de atividade GST e EROD
para cada espécie. Ensaios enzimáticos deverão ser realizados a 37ºC para aves
e cetáceos e 30ºC para C. mydas. O ensaio enzimático para medir atividade GST
em S. magellanicus, L. dominicanus, e C. mydas, deverá utilizar CDNB e GSH em
concentrações de 2,5 mM e, em cetáceos, GSH deverá ser utilizada em
concentrações de 5 mM e CDNB em concentrações de 2,5 mM.
Para a análise da atividade EROD, ensaios com C. mydas e S. magellanicus
deverão utilizar o substrato 7-etoxiresorufina (7-ER) em concentrações de 4 M e
NADPH a 1 mM. Ensaios de atividade EROD com L. dominicanus deverão utilizar
7-ER em concentrações de 2 M e NADPH a 1 mM. Em tecido hepático de S.
frontalis, 7-ER deverá ser utilizada em concentrações de 0,5 M e NADPH a 1
mM, para tecido hepático de S. guianensis deverá ser utilizada concentração de
7-ER a 1 M e NADPH a 0,5 mM. Nossos resultados mostram também que não
foi possível detectar a atividade EROD em tecido tegumentar de cetáceos.
Para os tecidos das espécies avaliadas foi observado um modelo cinético
para a atividade EROD de inibição por substrato.
Testes de estabilidade temporal realizados com espécimes de Larus
dominicanus evidenciaram um decaimento da atividade EROD a partir da
Pág. 17 / 203 Resumo
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
segunda hora após a morte. Este padrão, no entanto, não foi observado para
atividade GST, que manteve-se constante ao longo do tempo post mortem. Estes
resultados suportam a possibilidade de análise de atividade GST em L.
dominicanus coletados em código 2 pelo PMP-BS e reforçam a realização de
análises de atividade EROD apenas em L. dominicanus amostrados
imediatamente após a morte.
Além da padronização de ensaios enzimáticos, no período abrangido pelo
presente documento também foram elaborados critérios para a determinação das
espécies nas quais serão sequenciados os seus transcriptomas. Para as espécies
C. mydas e T. truncatus informações genéticas já estão mapeadas e
disponibilizadas publicamente, portanto as análises serão realizadas, inicialmente,
em seis espécies, sendo, além das duas recém citadas, duas espécies de
cetáceos: Stenella longirostris, Balaenoptera brydei, e duas de aves: Puffinus
puffinus e L. dominicanus, para as quais será necessário realizar o
sequenciamento e a identificação dos genes. Destaca-se que na revisão 00 do
presente Relatório Técnico Anual protocolado em abril de 2018 pela Petrobras, o
principal critério de determinação de espécies-alvo foi a quantidade de amostras
coletadas e entregues pelo PMP-BS e PMC-BS ao LABCAI/UFSC até dezembro
de 2017. Assim, as espécies S. frontalis, B. borealis e T. truncatus foram
recomendadas como espécies-alvo de cetáceos para o monitoramento dos
biomarcadores moleculares. Entretanto, após a atualização da quantidade de
amostras disponível para cada espécie em maio de 2018 e consulta à equipe
técnica do PMC-BS, decidiu-se pela revisão da proposta das espécies
prioriatárias, fazendo a substituição de S. frontalis por S. longirostris e de B.
borealis por B. brydei, conforme acordado com o IBAMA em 07/05/2018 em
reunião registrada na Ata de Reunião COPROD nº 2421956 (SEI
02001.114275/2017-00).
O início das padronizações moleculares para as duas espécies que possuem
dados genômicos de acesso público (C. mydas e T. truncatus) confirma a
especificidade e eficiência da maioria dos iniciadores desenhados. Aqueles que
foram considerados inadequados serão redesenhados nos próximos meses.
Os resultados da padronização molecular também reforçam a possibilidade
de extração de RNA de amostras diminutas, de até 25 mg, de tecido tegumentar
de cetáceos, quadro similar aquele observado para o material de biópsia oriundo
do PMC-BS.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS I. Introdução Pág.
18 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
I – INTRODUÇÃO
O ambiente natural está constantemente sujeito a alterações de origem
natural e/ou antrópica. Potenciais impactos oriundos de alterações antrópicas
reforçam a necessidade de monitoramento das condições ambientais a fim de
desenvolver e adequar estratégias de gerenciamento para mitigação dos danos.
Diversas ferramentas podem ser utilizadas para o monitoramento de
condições ambientais. O uso de biomarcadores é uma das ferramentas mais
utilizadas para avaliação de exposição e efeito a xenobióticos de origem antrópica
(HUGGETT et al., 2002). Biomarcadores são compreendidos como alterações
celulares, bioquímicas ou moleculares decorrentes de exposição à determinada
condição ambiental. São, por definição, responsivos e facilmente mensuráveis,
fornecendo indícios precoces de exposição e resposta biológica a condições
ambientais adversas (HUGGETT et al., 2002; WALKER, 1995).
Embora sejam ferramentas promissoras, Den Besten (1998) reforça que o
uso de biomarcadores como indicativo de alterações na homeostase do
organismo depende diretamente da determinação de parâmetros considerados
‘normais’. Tal determinação só é possível a partir da continuidade de análises de
biomarcadores em organismos saudáveis, bem como em indivíduos
potencialmente impactados. Ademais, particularidades bioquímicas de cada
espécie tornam necessária a adequação de ensaios utilizados para a análise de
biomarcadores, a fim de garantir que as técnicas utilizadas retratem de forma
fidedigna os processos bioquímicos e/ou moleculares nos organismos (BEGER et
al., 2017).
O presente documento apresenta o 1º Relatório Técnico Anual das atividades
desenvolvidas durante os primeiros 12 meses (dez/2016 – dez/2017) do projeto
intitulado “Padronização de técnicas e análise de biomarcadores em espécies de
tetrápodes marinhos da costa brasileira”. O projeto está previsto no contexto do
licenciamento ambiental do Polo Pré-Sal da Bacia de Santos - ETAPA 2.
O projeto visa, primeiramente, desenvolver, adaptar e padronizar técnicas
para a análise de biomarcadores bioquímicos e moleculares de contaminação
ambiental em tetrápodes marinhos. Os biomarcadores padronizados serão
subsequentemente analisados em amostras de tecidos tegumentar e hepático de
Pág. 19 / 203 I. Introdução
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
cetáceos e de tecido hepático de aves e tartarugas marinhas provenientes do
Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de Santos (PMP-BS) e do Projeto
de Monitoramento de Cetáceos da Bacia de Santos (PMC-BS).
No presente relatório são descritas as atividades finalizadas até dezembro de
2017, conforme segue: a padronização das atividades das enzimas glutationa S-
transferase (GST) e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) nos cetáceos Sotalia
guianensis, Stenella frontalis, Tursiops truncatus e Balaenoptera borealis, na
tartaruga marinha Chelonia mydas e nas aves marinhas Spheniscus magellanicus
e Larus dominicanus; o ínicio das padronizações das técnicas de quantificação
dos biomarcadores moleculares para Chelonia mydas e Tursiops truncatus; e os
testes de estabilidade temporal para as atividades das enzimas GST e EROD
padronizadas em tecido hepático de Larus dominicanus.
Também são apontados no presente documento os critérios que estão sendo
utilizados para determinação das espécies para as quais serão realizados o
sequenciamento de seu transcriptoma para identificação dos genes de interesse.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
20 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
II – RECEBIMENTO E GUARDA DE AMOSTRAS
Até a conclusão deste Relatório Técnico Anual, encontravam-se destinadas à
análise de biomarcadores bioquímicos e moleculares amostras de 517 espécimes
provenientes do PMP-BS e PMC-BS. Amostras coletadas no âmbito do PMP-BS
totalizam 380 espécimes pertencentes a 26 espécies (Tabela II-1). Amostras
coletadas no âmbito do PMC-BS totalizam 145 espécimes pertencentes a 17
espécies (Tabela II-2). O sumário das amostras destinadas à análise de
biomarcadores é proveniente dos dados disponíveis no SIMBA em 03/05/2018
(PMP-BS) ou de tabelas disponibilizadas pela equipe da Socioambiental
Consultores Associados (PMC-BS). Os dados do PMC-BS são referentes aos
ciclos I, II, III, IV, V e VI das campanhas de telemetria.
Tabela II-1 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de
Santos (PMP-BS) destinadas à análise de biomarcadores. Espécies alvo para emissão
de laudos de biomarcadores bioquímicos sinalizadas em azul.
PMP-BS – SIMBA (03/05/2018)
Classe Reptilia
Grupo Taxonômico Espécie Número de espécimes
Ordem Testudinata Chelonia mydas 265
Caretta caretta 02
Eretmochelys imbricata 01
Classe Aves
Grupo Taxonômico Espécie Número de espécimes
Ordem Sphenisciformes Spheniscus magellanicus 64
Ordem Charadriiformes Larus dominicanus 39
Sterna hirundo 02
Charadrius semipalmatus 01
Thalasseus acuflavidus 01
Ordem Procellariiformes Puffinus puffinus 28
Ordem Procellariiformes Calonectris diomedea 03
Procellaria aequinoctialis 03
Puffinus gravis 02
Thalassarche melanophris 02
Macronectes giganteus 01
Oceanites oceanicus 01
Pág. 21 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Ordem Suliformes Sula leucogaster 10
Phalacrocorax brasilianus 06
Fregata magnificens 06
Classe Mammalia
Grupo Taxonômico Espécie Número de espécimes
Ordem Cetacea Subordem Odontoceti
Pontoporia blainvillei 28
Sotalia guianensis 35
Tursiops truncatus 04
Stenella frontalis 03
Phocoena dioptrica 01
Stenella longirostris 01
Ordem Cetacea Subordem Mysticeti
Balaenoptera acutorostrata 01
Ordem Carnivora Arctocephalus australis 07
TOTAL: 26 espécies TOTAL: 517 espécimes disponibilizados no SIMBA em 03/05/2018
Tabela II-2 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Cetáceos da Bacia
de Santos (PMC-BS) destinadas à análise de biomarcadores. Espécies alvo para
emissão de laudos de biomarcadores bioquímicos sinalizadas em azul.
PMC-BS – Lista Geral (Ciclos I a IV) (03/05/2018)
Classe Mammalia
Grupo Taxonômico Espécie Número de espécimes
Ordem Cetacea Subordem Odontoceti
Stenella frontalis 64
Tursiops truncatus 38
Stenella longirostris 47
Stenella clymene 7
Stenella attenuata 12
Delphinus capensis 04
Delphinus sp. 04
Steno bredanensis 07
Physeter macrocephalus 05
Peponocephala electra 05
Orcinus orca 01
Sotalia guianensis 01
Delphinus delphis 01
Ordem Cetacea Subordem Mysticeti
Balaenoptera borealis 14
Megaptera novaeangliae 14
Balaenoptera brydei 08
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
22 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Balaenoptera physalus 06
Balaenoptera bonaerensis 03
Balaenoptera musculus 01
Eubalaena australis 01
Globicephala sp. 01
TOTAL: 21 espécies TOTAL: 244 espécimes disponibilizados em email - Lista Geral (Ciclos I a IV) (03/05/2018)
Dentre as amostras disponibilizadas nos bancos de dados, 617 foram
coletadas pelo PMP-BS e 265 pelo PMC-BS e encontram-se armazenadas em
freezer -80 ºC (Tabela II-3) pelo LABCAI/UFSC.
Pág. 23 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela II-3 - Caracterização das amostras do PMP-BS recebidas pelo LABCAI para análise de biomarcadores: Código da amostra (SIMBA), espécie, matriz
tecidual da amostra, código de decomposição, método de preservação no local de coleta, método de preservação no LABCAI, condição da amostra e
observações.
# Código da amostra
Espécie Matriz Código de
decomposição Método de
preservação Preservação no LABCAI
Condição da
amostra Observações
1 87614 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
2 49341 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
3 60659 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
4 63930 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
5 81910 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
6 60465 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
7 48261 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
8 79775 Sula leucogaster Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
9 87915 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
10 30088 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
11 87408 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
12 39397 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
13 39395 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
24 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
14 42498 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
15 85521 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
16 84370 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
17 80093 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
18 79160 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
19 64858 Thalassarche
chlororhynchos Fígado 2
Temperatura ambiente -80 °C
A
20 64236 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
21 60209 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
22 56014 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
23 33094 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
24 64998 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
25 49464 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
26 79473 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
27 42480 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
28 37474 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
29 30084 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Pág. 25 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
30 38116 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
31 41684 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
32 78085 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
33 37469 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
34 76280 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
35 75211 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
36 39378 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
37 39031 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
38 37266 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
39 38748 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
40 50231 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
41 48127 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
42 38740 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
43 37265 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
44 39895 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
45 47744 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
26 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
46 37261 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
47 39890 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
48 38735 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
49 42473 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
50 83099 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
51 75073 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
52 80553 Sula leucogaster Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
53 80282 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
54 62090 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
55 82345 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
56 60832 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
57 82538 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
58 64352 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
59 60785 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
60 60293 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
61 60292 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
62 36439 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
63 36433 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
64 59945 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Pág. 27 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
65 34618 Sula leucogaster Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
66 34617 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
67 29287 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
68 57259 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
69 76272 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
70 64088 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
71 34509 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
72 57435 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
73 49791 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
74 75369 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
75 62524 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
76 59447 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
77 64051 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
78 69249 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
79 31989 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
80 71398 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
81 49782 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
82 76096 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
83 75795 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
84 72556 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
28 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
85 55625 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
86 69031 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
87 54657 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
88 37056 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
89 37047 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
90 52665 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
91 61639 Tursiops truncatus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
92 50753 Sula leucogaster Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
93 40803 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
94 48105 Calonectris diomedea Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
95 40844 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
96 49890 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
97 38682 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
98 40767 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
99 41942 Puffinus gravis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
100 29428 Arctocephalus australis Fígado 2 Refrigerado -80 °C
I Espécie não contemplada
pelo Projeto
101 49141 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
102 46824 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
103 45307 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
104 64113 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
105 71906 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
106 76741 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
107 63554 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
108 54549 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Pág. 29 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
109 52906 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
110 52873 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
111 47515 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
112 75014 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
113 34241 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
114 34203 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
115 60646 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
116 60399 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
117 60241 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
118 75297 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
119 36422 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
120 74613 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
121 60174 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
122 73266 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
123 36406 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
124 72493 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
125 53816 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
126 50719 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
127 36388 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
30 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
128 43941 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
129 33854 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
130 71893 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
131 53304 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
132 61863 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
133 74821 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
134 33264 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
135 38294 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
136 39004 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
137 73319 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
138 39025 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
139 39024 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
140 37604 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
141 37882 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
142 42469 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
143 37232 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
144 37223 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Pág. 31 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
145 66064 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
146 33078 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
147 34078 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
148 41160 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
149 50439 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
150 50720 Thalassarche
chlororhynchos Fígado 2
Temperatura ambiente -80 °C
A
151 49368 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A Tubo identificado 49369
152 47551 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
153 41072 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
154 41030 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
155 44571 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
156 44573 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
157 39479 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
158 56948 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
159 64270 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
160 38288 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
161 39359 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
162 39358 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
163 63925 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
32 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
164 38287 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
165 63212 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
166 63124 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
167 38242 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
168 41643 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
169 56516 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
170 34033 Caretta caretta Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
171 59369 Fregata magnificens Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
172 63705 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
173 61464 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
174 53595 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
175 65643 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
176 37305 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
177 38164 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
178 65329 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
179 42462 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
180 53599 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
181 45872 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Pág. 33 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
182 44935 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
183 45990 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
184 44952 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
185 47068 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
186 47987 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
187 49372 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
188 34470 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
189 63808 Caretta caretta Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
190 49751 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
191 64154 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
192 49780 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
193 52456 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
194 43925 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
195 64503 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
196 50211 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
197 50207 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
34 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
198 50204 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
199 39847 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
200 39846 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
201 38723 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
202 37197 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
203 60463 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
204 42450 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
205 50191 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
206 50190 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
207 50187 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
208 58625 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
209 58599 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
210 49053 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
211 49052 Balaenoptera acutorostrata Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
212 33850 Sterna hirundo Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
213 32479 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A tubos com identificação a
Pág. 35 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente lápis.
214 34148 Sotalia guianensis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
215 63851 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
216 34163 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
217 50052 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
218 39353 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
219 36969 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
220 37442 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
221 41636 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
222 53590 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
223 60178 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
224 56265 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C
A tubos com identificação a
lápis.
225 59837 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
226 56180 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
227 50039 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C
A tubos com identificação a
lápis.
228 48295 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
229 48293 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
36 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
230 32423 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
231 57543 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
232 62051 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
233 34062 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
234 61493 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
235 60790 Sotalia guianensis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
236 31977 Fregata magnificens Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
237 56796 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
238 60113 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
239 60113 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
240 57342 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
241 57342 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
242 57300 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
243 57300 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
244 59663 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
245 59663 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
246 57200 Stenella frontalis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Pág. 37 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
247 57200 Stenella frontalis Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
248 43806 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
249 43806 Pontoporia blainvillei Pele 2 Refrigerado -80 °C
I Amostra não foi enviada para
análise
250 59616 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
251 59616 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
252 58733 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
253 58733 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
254 42164 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
255 42164 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
256 60032 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
257 60032 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
258 56177 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
259 56121 Fregata magnificens Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
tubos com identificação a lápis.
260 36799 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
261 36799 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C
I Amostra não foi enviada para
análise
262 33537 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
263 33537 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
264 42683 Thalassarche melanophris Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
38 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
265 34365 Fregata magnificens Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
266 20220 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente
-80 °C
A
Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em eppendorf
NÃO livre de RNases.
267 20220 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente
-80 °C
A
Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em eppendorf
NÃO livre de RNases.
268 31879 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
269 37000 Phalacrocorax brasilianus Fígado 2 Temperatura
ambiente
-80 °C
A
Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em eppendorf
NÃO livre de RNases.
270 37000 Phalacrocorax brasilianus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não enviada.
271 44136 Phalacrocorax brasilianus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
272 44136 Phalacrocorax brasilianus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não enviada.
273 32282 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação no tubo (FAI)
em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA).
274 32282 Larus dominicanus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não enviada.
275 39335 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A Acondicionada em tubo de 5
Pág. 39 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente mL, em desacordo ao protocolo.
276 39335 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
277 36798 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
278 36798 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
279 39334 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
280 39334 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
281 32390 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
282 55088 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
283 55088 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Armazenada em RNA later, adequada apenas para
análise de biomarcadores moleculares.
284 53555 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
285 53555 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Armazenada em RNA later, adequada apenas para
análise de biomarcadores moleculares.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
40 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
286 47706 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
287 47706 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
288 57215 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
289 57215 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
290 34355 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
291 34355 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
292 34354 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
293 34354 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
294 57055 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
295 57055 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
296 48749 Phalacrocorax brasilianus Fígado 2 Congelado -80 °C A
297 57015 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
298 57015 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
Pág. 41 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
299 31231 Arctocephalus australis Fígado 2 Congelado -80 °C
A Espécie não contemplada
pelo projeto.
300 31231 Arctocephalus australis Pele 2 Congelado -80 °C
I Espécie não contemplada
pelo projeto.
301 29254 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
302 29940 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
303 29940 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
304 34353 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
305 34353 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
306 47704 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
307 47704 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
308 55597 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
309 35717 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
310 35717 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra não foi enviada para análise
311 35680 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
312 39797 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
42 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
313 39797 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
314 56561 Procellaria aequinoctialis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
315 31788 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
316 55633 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
317 31772 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
318 55556 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
319 55540 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
320 48546 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
321 31769 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
322 55328 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
323 47473 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
324 56140 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
325 56140 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura -80 °C A Acondicionada em tubo de 5
Pág. 43 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente mL, em desacordo ao protocolo.
326 55609 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
327 55609 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
328 40491 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
329 40491 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
330 39330 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo
331 39330 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo
332 39324 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
333 39324 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
334 29939 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
335 29939 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubos de 5
mL, em desacordo ao Protocolo.
336 56231 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
44 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
337 56231 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
338 41614 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
339 41614 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
340 41612 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
341 41612 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
342 41613 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
343 41613 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
344 48455 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Congelado -80 °C A
345 47027 Procellaria aequinoctialis Fígado 2 Congelado -80 °C A
346 47907 Phocoena dioptrica Fígado 2 Congelado -80 °C A
347 47907 Phocoena dioptrica Pele 2 Congelado -80 °C A
348 34345 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
349 34345 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
350 50882 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Pág. 45 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
351 50882 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Amostra armazenada apenas em RNA later, adequada apenas para análise de
biomarcadores moleculares.
352 32380 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C
I Data de necrópsia não condiz
com data de ocorrência do animal.
353 32380 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C
I Data de necrópsia não condiz
com data de ocorrência do animal.
354 56301 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação no tubo (FAI)
em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA).
355 56301 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação no tubo (FAI)
em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA).
356 32379 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
357 32379 Sotalia guianensis Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
358 31955 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C
A Data de necrópsia não condiz
com data de ocorrência do animal.
359 31955 Spheniscus magellanicus Pele 2 Refrigerado -80 °C I Amostra não enviada.
360 48821 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
361 48821 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
362 40177 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
363 48014 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
46 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
364 48014 Sula leucogaster Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não enviada
365 47478 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
366 47478 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
367 29926 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
368 29926 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
369 42419 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
370 42419 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
371 55166 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
372 55166 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
373 39782 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
374 39782 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
375 34337 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
376 34337 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
377 52851 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
378 52851 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
379 54246 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A Acondicionada em tubo de 5
Pág. 47 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente mL, em desacordo ao protocolo.
380 54246 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Acondicionada em tubo de 5
mL, em desacordo ao protocolo.
381 35674 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
382 35671 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
383 35663 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
384 45839 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
385 50174 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
386 50174 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
387 37160 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
388 37160 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
389 39779 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
390 39779 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
391 50173 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
392 50173 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
393 53825 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
48 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
394 53825 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
395 38706 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
396 38706 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
397 52296 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
398 52296 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
399 50171 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
400 50171 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
401 40185 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
402 31010 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
403 29246 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
404 47045 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
405 47045 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Armazenada apenas em RNA later, adequada apenas para
análise de biomarcadores moleculares.
406 54685 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
407 44603 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Pág. 49 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
408 53674 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
409 53312 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
410 31625 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
411 31133 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
412 29841 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
413 30040 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
414 53705 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
415 50727 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
416 52615 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
417 52903 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
418 48296 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
419 29812 Oceanites oceanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
420 31115 Macronectes giganteus Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
50 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
421 46625 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
422 30038 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
423 30037 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
424 31113 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
425 30022 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
426 29740 Puffinus gravis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
427 29739 Thalassarche melanophris Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
428 47668 Calonectris diomedea Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
429 29810 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
430 45388 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de
custódia (SIMBA)
431 46114 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Congelado -80 °C A
432 53299 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
433 35656 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Pág. 51 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
434 36027 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
435 43355 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
436 43355 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
437 32871 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
438 32871 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
439 32352 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
440 32352 Larus dominicanus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não enviada.
441 49746 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
442 49765 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
443 37587 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
444 37587 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
445 39318 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
446 39318 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
447 48056 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
448 48056 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
449 49327 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
450 49327 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
451 47893 Sotalia guianensis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
452 47893 Sotalia guianensis Pele 2 Refrigerado -80 °C A
453 47886 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
454 47886 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
52 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
455 36781 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
456 36781 Pontoporia blainvillei Pele 2 Refrigerado -80 °C A
457 48424 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
458 48424 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
459 48300 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
460 48300 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
461 48290 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
462 48290 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
463 39316 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
464 39316 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
465 36011 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
466 32442 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
467 48033 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
468 45362 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
469 38945 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
470 37148 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
471 37149 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
472 40981 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
473 31915 Tursiops truncatus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Amostra armazenada apenas em RNA later, adequada
apenas para biomarcadores moleculares.
474 31915 Tursiops truncatus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Amostra armazenada apenas em RNA later, adequada
apenas para biomarcadores moleculares.
Pág. 53 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
475 31914 Tursiops truncatus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Amostra armazenada apenas em RNA later, adequada
apenas para biomarcadores moleculares.
476 31914 Tursiops truncatus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A
Amostra armazenada apenas em RNA later, adequada
apenas para biomarcadores moleculares.
477 32315 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
478 46685 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
479 36361 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
480 36361 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A
481 36360 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
482 36360 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
483 47357 Procellaria aequinoctialis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
484 31550 Arctocephalus australis Fígado 2 Congelado -80 °C
I Espécie não contemplada
pelo projeto.
485 31550 Arctocephalus australis Pele 2 Congelado -80 °C
I Espécie não contemplada
pelo projeto.
486 30797 Larus dominicanus Fígado 2 Congelado -80 °C A
487 32839 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
488 46902 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
489 40945 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
490 32795 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
54 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
491 31890 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
492 32792 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
493 31891 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Coletada com material não estéril.
494 36001 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
495 36001 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
496 36351 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
497 36351 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
498 35996 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
499 35996 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
500 48280 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
501 48280 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
502 32796 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
503 35995 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
504 36346 Calonectris diomedea Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
505 35965 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
Pág. 55 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
custódia (SIMBA).
506 35965 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
507 43281 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente
-80 °C
A
Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação na ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em microtubo
NÃO livre de RNases.
508 43281 Larus dominicanus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não enviada.
509 38982 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
510 38978 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
511 32701 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra acondicionada em líquido não identificado
512 32701 Larus dominicanus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não enviada.
513 32294 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Amostra acondicionada em líquido não identificado
514 32294 Larus dominicanus Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I Amostra não foi enviada.
515 29236 Charadrius semipalmatus Fígado 2 Temperatura
ambiente
-80 °C
A
Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação na ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em microtubo
NÃO livre de RNases.
516 27970 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação no tubo (FAI)
em desacordo à identificação na ficha de custódia (SIMBA).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
56 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Armazenada em microtubo NÃO livre de RNases.
517 27970 Sotalia guianensis Pele 2 Temperatura
ambiente
-80 °C
A
Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação na ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em microtubo
NÃO livre de RNases.
518 46457 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
519 47084 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
520 46389 Thalasseus acuflavidus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
521 44881 Phalacrocorax brasilianus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
522 45908 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
523 40510 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
524 19432 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
525 37417 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
526 37415 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
527 30983 0 Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
528 40299 Larus dominicanus Fígado 2 Congelado -80 °C
I Amostra em código 3 de
decomposição
529 27909 Larus dominicanus Fígado 2 Congelado -80 °C A
530 27857 Larus dominicanus Fígado 2 Congelado -80 °C A
531 43813 Stenella longirostris Fígado 2 Congelado -80 °C A
Pág. 57 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
532 43813 Stenella longirostris Pele 2 Congelado -80 °C A
533 30382 Chelonia mydas Fígado 2 Congelado -80 °C A
534 30382 Chelonia mydas Pele 2 Congelado -80 °C A
535 34320 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
536 34320 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
537 35980 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
538 35980 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
539 34314 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
540 42656 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
541 42656 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
542 34303 Stenella frontalis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
543 34303 Stenella frontalis Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
544 45409 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
545 45409 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
58 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
546 45260 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
547 45260 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
548 35955 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
549 34297 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
550 34297 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
551 40418 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C
A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de
custódia (SIMBA).
552 35949 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
553 35949 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
554 34294 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
555 34294 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
556 34290 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
557 34290 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
558 34449 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Pág. 59 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
559 34449 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
560 34448 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
561 34448 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
562 35926 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
563 40521 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
564 40223 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C
A Data de necrópsia difere da data de coleta do animal na
praia.
565 30497 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
566 19594 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
567 19270 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
568 19271 Phalacrocorax brasilianus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
569 18013 Larus dominicanus Fígado 2 Congelado -80 °C A
570 26015 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
571 25485 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
572 25470 Sterna hirundinacea Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
573 19925 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
60 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
574 17599 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
575 18575 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
576 18575 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
577 17222 Sotalia guianensis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
578 17222 Sotalia guianensis Pele 2 Refrigerado -80 °C A
579 18462 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
580 18462 Sotalia guianensis Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
581 18410 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
582 18410 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
583 30497 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
584 21328 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
585 22276 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
586 17580 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
587 17534 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
588 17533 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
589 17544 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
590 17601 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura -80 °C A
Pág. 61 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ambiente
591 17597 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
592 21581 Arctocephalus australis Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Espécie não contemplada pelo projeto
593 21581 Arctocephalus australis Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C I
Espécie não contemplada pelo projeto
594 17541 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
595 17596 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
596 17536 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
597 17531 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
598 17600 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
599 17535 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
600 17543 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
601 17593 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
602 17532 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
603 17537 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
604 20439 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
605 17529 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
606 20713 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
62 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
607 20713 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
608 18465 Eretmochelys imbricata Fígado 2 Refrigerado -80 °C A
609 18465 Eretmochelys imbricata Pele 2 Refrigerado -80 °C A
610 18466 Arctocephalus australis Fígado 2 Refrigerado -80 °C
I Espécie não contemplada
pelo projeto
611 18466 Arctocephalus australis Pele 2 Refrigerado -80 °C
I Espécie não contemplada
pelo projeto
612 18750 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
613 18751 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
614 26450 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
615 17598 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
616 20844 Stenella frontalis Pele 2 Temperatura
ambiente -80 °C A Espécie não identificada.
617 23844 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura
ambiente -80 °C A
*A: Adequada para análise de biomarcadores; I: Inadequada para análise de biomarcadores.
Pág. 63 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Das 617 amostras coletadas pelas equipes do PMP-BS, 582 estavam
adequadas para análise de biomarcadores, enquanto 35 foram consideradas
inadequadas.
Em relação às amostras coletadas pelo PMC-BS (Tabela II-4), nove foram
consideradas inadequadas para a emissão de laudos. Destas, oito amostras
estavam mal armazenadas nos criotubos e foram encontradas soltas no container
de nitrogênio líquido. Decidiu-se colocá-las agrupadas em um único tubo e utilizá-
las em algumas etapas de padronização.
Tabela II-4 - Caracterização das amostras do PMC-BS recebidas pelo LABCAI para
análise de biomarcadores: número da biópsia, espécie, matriz tecidual da amostra,
método de preservação no LABCAI, condição da amostra e observações.
# Nº da
Biópsia Espécie Matriz
Preservação LABCAI
Cond. amostra
Observações
1 BB 129 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
2 BM 129 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
3 BB 130 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
4 BM 130 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
5 BB 131 Stenella clymene Pele -80 ºC A
6 BM 131 Stenella clymene Pele -80 ºC A
7 BB 132 Stenella clymene Pele -80 ºC A
8 BM 132 Stenella clymene Pele -80 ºC A
9 BB 133 Stenella clymene Pele -80 ºC A
10 BM 133 Stenella clymene Pele -80 ºC A
11 BB 134 Stenella clymene Pele -80 ºC A
12 BM 134 Stenella clymene Pele -80 ºC A
13 BB 135 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
14 BM 135 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
15 BB 137 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
16 BM 137 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
17 BB 138 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
18 BM 138 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
19 BB 139 Balaenoptera musculus Pele -80 ºC A
20 BM 139 Balaenoptera musculus Pele -80 ºC A
21 BB 140 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
22 BM 140 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
23 BB 141 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
24 BM 141 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
25 BB 142 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
26 BM 142 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
27 BB 143 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
28 BM 143 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
64 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
29 BB 144 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
30 BM 144 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
31 BB 147 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
32 BM 147 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
33 BB 148 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
34 BM 148 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
35 BB 149 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
36 BM 149 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
37 BB 151 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
38 BB 152 Balaenoptera bonaerensis
Pele -80 ºC A
39 BM 152 Balaenoptera bonaerensis
Pele -80 ºC A
40 BB 153 Balaenoptera bonaerensis
Pele -80 ºC A
41 BM 153 Balaenoptera bonaerensis
Pele -80 ºC A
42 BB 154 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
43 BM 154 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
44 BB 155 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
45 BM 155 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
46 BB 157 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
47 BM 157 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
48 BB 165 Pele -80 ºC A Amostra não identificada
49 BM 165 Pele -80 ºC A Amostra não identificada
50 BB 166 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
51 BM 166 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
52 BB 167 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
53 BM 167 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
54 BB 168 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
55 BM 168 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
56 BB 169 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
57 BM 169 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
58 BB 170 Eubalaena australis Pele -80 ºC A
59 BM 170 Eubalaena australis Pele -80 ºC A
60 BB 171 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
61 BM 171 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
62 BB 172 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
63 BM 172 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
64 BB 173 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
65 BM 173 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
66 BB 174 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
67 BM 174 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
68 BB 175 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
69 BM 175 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
Pág. 65 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
70 BB 176 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
71 BM 176 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
72 BB 177 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
73 BM 177 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
74 BB 84 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
75 BM 84 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
76 BB 85 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
77 BM 85 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
78 BB 87 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
79 BM 87 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
80 BB 88 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
81 BM 88 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
82 BB 89 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
83 BM 89 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
84 BB 91 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
85 BM 91 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
86 BB 92 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
87 BM 92 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
88 BB 94 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
89 BM 94 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
90 BB 95 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
91 BM 95 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
92 BB 96 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
93 BM 96 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
94 BB 97 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
95 BM 97 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
96 BB 98 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
97 BM 98 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
98 BB 99 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
99 BM 99 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
100 BB 100 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
101 BM 100 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
102 BB 101 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
103 BM 101 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
104 BB 102 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
105 BM 102 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
106 BB 103 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
107 BM 103 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
108 BB 104 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
109 BM 104 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
110 BB 107 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
111 BM 107 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
112 BB 109 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
113 BM 109 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
114 BB 110 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
115 BM 110 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
66 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
116 BB 111 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
117 BM 111 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
118 BB 112 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
119 BM 112 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
120 BB 113 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
121 BM 113 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
122 BB 114 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
123 BM 114 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
124 BB 115 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
125 BM 115 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
126 BB 117 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
127 BM 117 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
128 BB 118 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
129 BM 118 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
130 BB 119 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
131 BM 119 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
132 BB 120 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
133 BM 120 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
134 BB 121 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
135 BM 121 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
136 BB 122 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
137 BM 122 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
138 BB 123 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
139 BM 123 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
140 BB 124 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
141 BM 124 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
142 BB 125 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
143 BM 125 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
144 BB 126 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
145 BM 126 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
146 BB 127 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
147 BM 127 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
148 BB 128 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
149 BM 128 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
150 B 1 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
151 B 2 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
152 B 4 Sotalia guianensis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
153 B 5 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
154 B 6 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
155 B 7 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
156 B 8 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
157 B 8D Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e
Pág. 67 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
fervida em água
158 B 9 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
159 B 10 Delphinus capensis Pele -80 ºC A
160 B 11 Delphinus capensis Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
161 B 12 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
162 B 13 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
163 B 14 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
164 B 15 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
165 B 17 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
166 B 18 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
167 B 19 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
168 B 20 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
169 B 21 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
170 B 22 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
171 B 23 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
172 B 24 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
173 B 25 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
68 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
174 B 26 Stenella frontalis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
175 B 27 Stenella frontalis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
176 B 28 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
177 B 29 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
178 B 35 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
179 B 36 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
180 B 37 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
181 B 38 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
182 B 39 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
183 B 39D Stenella frontalis Pele -80 ºC A
184 B 40 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
185 B 41 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
186 B 42 Balaenoptera bonaerensis
Pele -80 ºC A
187 B 43 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
188 B 44 Stenella clymene Pele -80 ºC A
189 B 45 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
190 B 46 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
191 B 47 Tursiops truncatus Pele -80 ºC I
Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água
192 B 48 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
193 B 49 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
194 B 50 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
195 BM 51 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
196 BB 51 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
197 BM 52 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
198 BM 53 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
199 BB 53 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
200 BM 54 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
201 BB 54 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
202 BM 55 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
203 BB 55 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
204 BM 56 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
205 BB 56 Stenella frontalis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
206 BM 57 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
207 BB 57 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
208 BM 58 Tursiops truncatus Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
209 BB 58 Tursiops truncatus Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
210 BM 59 Delphinus capensis Pele -80 ºC A
Pág. 69 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
211 BB 59 Delphinus capensis Pele -80 ºC A
212 BM 60 Delphinus capensis Pele -80 ºC A
213 BB 60 Delphinus capensis Pele -80 ºC A
214 BM 61 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
215 BB 61 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
216 BM 62 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
217 BB 62 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
218 BM 63 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
219 BB 63 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
220 BM 64 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
221 BB 64 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
222 BM 65 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
223 BB 65 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
224 BM 66 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo
225 BB 66 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
226 BM 68 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
227 BB 68 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
228 BM 69 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
229 BB 69 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A
230 BM 70 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
231 BB 70 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
232 BM 71 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
233 BB 71 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
234 BM 72 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
235 BB 72 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
236 BM 73 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
237 BB 73 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
238 BM 74 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
239 BB 74 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
240 BM 75 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
241 BB 75 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
242 BM 76 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
243 BB 76 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
244 BB 77 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A
245 BM 78 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
246 BB 78 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
247 BM 79 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
248 BB 79 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
249 BM 80 Globicephala sp. Pele -80 ºC A
250 BB 80 Globicephala sp. Pele -80 ºC A
251 BM 81 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
252 BB 81 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
253 BM 82 Stenella frontalis Pele -80 ºC A Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
70 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
limpa em álcool e fervida em água
254 BB 82 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
255 BM 83 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
256 BB 83 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
257 BB 178 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
258 BM 178 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
259 BB 179 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
260 BM 179 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
261 BB 180 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
262 BM 180 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
263 BB 181 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
264 BM 181 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
265 BB 182 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
266 BM 182 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
267 BB 183 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
268 BM 183 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
269 BB 184 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
270 BM 184 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
271 BB 185 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
272 BM 185 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
273 BB 186 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
274 BM 186 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A
275 BB 187 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
276 BM 187 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A
277 BB 188 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
278 BM 188 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
279 BB 189 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
280 BM 189 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
281 BB 190 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
282 BM 190 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
283 BB 191 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
284 BM 191 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
285 BB 192 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
286 BM 192 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
287 BB 193 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
288 BM 193 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
289 BB 194 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
290 BM 194 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
291 BB 195 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
292 BM 195 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
293 BB 196 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
294 BM 196 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
295 BB 197 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
Pág. 71 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
296 BM 197 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
297 BB 198 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
298 BM 198 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
299 BB 199 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
300 BM 199 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
301 BB 200 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
302 BM 200 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
303 BB 201 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
304 BM 201 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
305 BB 202 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
306 BM 202 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
307 BB 203 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
308 BM 203 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
309 BB 204 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
310 BM 204 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
311 BB 205 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
312 BM 205 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A
313 BB 206 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
314 BM 206 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
315 BB 207 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
316 BM 207 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
317 BB 208 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
318 BM 208 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
319 BB 209 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
320 BM 209 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
321 BB 210 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
322 BM 210 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
323 BB 211 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
324 BM 211 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
325 BB 212 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
326 BM 212 Delphinus sp. Pele -80 ºC A
327 BB 213 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
328 BM 213 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
329 BB 214 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
330 BM 214 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
331 BM 215 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
332 BM 215 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
333 BB 216 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
334 BM 216 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
335 BB 217 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
336 BM 217 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
337 BB 218 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
338 BM 218 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
339 BB 219 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
340 BM 219 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
341 BB 220 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
72 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
342 BM 220 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
343 BB 221 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
344 BM 221 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
345 BB 222 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
346 BM 222 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
347 BB 223 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
348 BM 223 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
349 BB 224 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
350 BM 224 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
351 BB 225 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
352 BM 225 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
353 BB 226 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
354 BM 226 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
355 BB 227 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
356 BM 227 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
357 BB 228 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
358 BM 228 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
359 BB 158 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
360 BM 158 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
361 BB 159 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
362 BM 159 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
363 BB 228 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
364 BM 228 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
365 BB 230 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
366 BM 230 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
367 BB 231 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
368 BM 231 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
369 BB 232 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
370 BM 232 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
371 BB 233 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
372 BM 233 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
373 BB 234 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
374 BM 234 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
375 BB 235 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
376 BM 235 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
377 BB 237 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A Dois tubos
378 BM 237 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
379 BB 238 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
380 BM 238 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A Dois tubos
381 BB 239 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
382 BM 239 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
383 BB 240 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
384 BM 240 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A
385 BB 241 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
386 BM 241 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
387 BB 242 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
Pág. 73 / 203
II. Recebimento e Guarda de
amostras Padronização de Técnicas e Análises de
Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
388 BM 242 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
389 BB 243 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
390 BM 243 Stenella frontalis Pele -80 ºC A
391 BB 244 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
392 BM 244 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
393 BB 245 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
394 BM 245 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
395 BB 246 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
396 BM 246 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
397 BB 247 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
398 BM 247 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
399 BB 248 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
400 BM 248 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
401 BB 249 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
402 BM 249 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
403 BB 250 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
404 BM 250 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
405 BB 251 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
406 BM 251 Steno bredanensis Pele -80 ºC A
407 BB 252 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
408 BM 252 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
409 BB 253 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
410 BM 253 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
411 BB 254 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
412 BM 254 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
413 BB 255 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
414 BM 255 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
415 BB 256 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
416 BM 256 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
417 BB 257 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
418 BM 257 Peponocephala electra Pele -80 ºC A
419 BB 258 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
420 BM 258 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
421 BB 259 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
422 BM 259 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
423 BB 260 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
424 BM 260 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
425 BB 261 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
426 BM 261 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
427 BB 262 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
428 BM 262 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
429 BB 263 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
430 BM 263 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
431 BB 264 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
432 BM 264 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
433 BB 265 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
II. Recebimento e guarda de
amostras Pág.
74 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
434 BM 265 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
435 BB 266 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
436 BM 266 Stenella longirostris Pele -80 ºC A
437 BB 267 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
438 BM 267 Stenella attenuata Pele -80 ºC A
439 BB 268 Stenella clymene Pele -80 ºC A
440 BM 268 Stenella clymene Pele -80 ºC A
441 BB 269 Stenella clymene Pele -80 ºC A
442 BM 269 Stenella clymene Pele -80 ºC A
*A: Adequada para análise de biomarcadores; I: Inadequada para análise de biomarcadores.
Pág. 75 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
III – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM ESPÉCIES DE CETÁCEOS
III.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS
Para a padronização de técnicas para análise de biomarcadores bioquímicos
em cetáceos foram utilizadas amostras de fígado e de pele de dois espécimes de
Sotalia guianensis, três espécimes de Stenella frontalis, dez espécimes de
Tursiops truncatus e de dez espécimes de Balaenoptera borealis. As amostras de
S. guianensis e S. frontalis foram coletadas por equipes constituintes de bases
integrantes do PMP-BS, sendo que todas as amostras foram coletadas de
carcaças em estágio de decomposição código 2. Amostras de pele de T.
truncatus e B. borealis foram coletadas pela equipe do PMC-BS. Informações
sobre as amostras utilizadas estão apresentadas na Tabela III-1.
Tabela III-1 - Identificação dos espécimes de cetáceos provenientes do PMP-BS
(necrópsia) e PMC-BS (biópsia) cujas amostras hepáticas e tegumentares foram
utilizadas para padronização das atividades das enzimas glutationa S-transferase (GST)
e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).
Espécie
Identificação no
SIMBA ou código
do PMC-BS
Tecido biológico Origem do material
biológico
Sotalia guianensis 47084 Hepático Necrópsia
Sotalia guianensis 47893 Hepático e Tegumentar Necrópsia
Stenella frontalis 34303 Hepático e Tegumentar Necrópsia
Stenella frontalis 43813 Hepático e Tegumentar Necrópsia
Stenella frontalis 30983 Hepático Necrópsia
Tursiops truncatus B1 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus B2 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus B7 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus B18 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus BB122 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus BB123 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus BB125 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus BB126 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus BB127 Tegumentar Biópsia
Tursiops truncatus BB128 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB66 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB68 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB70 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB71 Tegumentar Biópsia
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 76 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Balaenoptera borealis BB72 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB73 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB74 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB75 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB76 Tegumentar Biópsia
Balaenoptera borealis BB77 Tegumentar Biópsia
III.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
Para a homogeneização das amostras de tecidos hepático e tegumentar de
cetáceos, aproximadamente 150 mg de cada amostra foram homogeneizados em
cinco vezes o volume de tampão de homogeneização Tris-HCl (50 mM Tris-HCl
pH 7,4), contendo 150 mM KCl, 1 mM DTT e 0,5 mM do inibidor de proteases
PMSF. Para amostras provenientes de biópsia, foram utilizados 50 mg de tecido,
em função do pequeno tamanho amostral proveniente de biópsias remotas. Os
tecidos foram homogeneizados com o homogeneizador TissueTearorTM
(BiospecTM). Durante todo o procedimento, as amostras foram mantidas sobre o
gelo.
O homogeneizado foi centrifugado a 9.000 xg por 30 minutos a 4°C, obtendo-
se, assim, a fração citosólica, denominada fração S9. Para a obtenção da fração
microssomal, que corresponde à membrana do retículo endoplasmático, foi
realizada uma segunda centrifugação da fração S9 a 100.000 xg por 60 minutos a
4°C com a ultracentrífuga Hitachi CP100WX. A fração sobrenadante resultante foi
acondicionada em novo microtubo e armazenada em freezer -80°C e a fração
microssomal foi ressuspendida em tampão Tris-HCl (0,1 M, pH 7,4), contendo
1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 M KCl e glicerol 20%. A fração microssomal foi
armazenada em freezer -80°C.
A fração sobrenadante foi utilizada para as etapas subsequentes de
quantificação de proteínas totais citosólicas e padronização da atividade GST,
enquanto a fração microssomal foi utilizada para as etapas subsequentes de
determinação de proteínas totais microssomais e padronização da atividade
EROD.
Pág. 77 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
III.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS
A determinação de proteínas citosólicas e microssomais das amostras foi
realizada por meio do método de Bradford (BRADFORD, 1976). O método utiliza
o corante Coomassie Brilliant Blue (G-250), que reage com os aminoácidos das
proteínas, mostrando uma coloração que varia do tom marrom para o azulado. A
coloração da amostra varia de acordo com a massa de proteínas.
A determinação de proteínas totais foi realizada com o kit Bio-Rad Protein
Assay® (Bio-Rad®) de acordo com instruções do fabricante. Em uma microplaca
com 96 poços foram adicionados, em duplicata, 2,5 ou 5 µL de cada amostra,
diluída em tampão de homogeneização quando necessário,e 200 µL do reagente
de Bradford filtrado. Após incubação de cinco minutos, foi realizada uma leitura
simples das amostras a 595 nm utilizando o espectrofotômetro de placas
SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). As absorbâncias das amostras foram
comparadas a uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA) produzida no
mesmo ensaio das amostras. A concentração de proteínas totais nas amostras foi
expressa em mg.mL-1.
III.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA
ATIVIDADE GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST)
O princípio do método da atividade GST, descrito por Habig e Jakoby (1976),
está baseado na reação de conjugação do tripeptídeo γ-glutamil-cisteinil-glicina
(GSH) com o substrato hidrofóbico 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). Essa
reação é catalisada pelas enzimas glutationas S-transferases (GSTs) (Figura
III.4-1). Após a reação, o conjugado GS-DNB é detectado no comprimento de
onda de 340 nm em espectrofotômetro.
A condição de saturação é necessária para a otimização de ensaios
enzimáticos para que não haja uma subestimação da atividade da enzima de
interesse (WILKINSON, 1971).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 78 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.4-1 - Reação de formação do conjugado GS-DNB a partir da reação entre 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e glutationa reduzida (GSH), catalisada por glutationa S-
transferase (GST) (Adaptado de Habig; Jakoby, 1981).
Vale ressaltar que o CDNB é um reagente hidrofóbico e precisa ser
previamente solubilizado em etanol para ser adicionado ao meio de reação.
Concentrações crescentes de CDNB requerem, portanto, concentrações também
crescentes de etanol no meio de reação. Ensaios prévios mostraram que, para
atingir a concentração de 5 mM de CDNB, foi necessária a utilização de meio com
aproximadamente 12% etanol.
A utilização de elevadas concentrações de etanol seria muito discrepante dos
5% de etanol utilizado nos ensaios dos idealizadores do método de quantificação
de GST, Keen, Habig e Jakoby (1976) e Habig e Jakoby (1981), e dos ensaios
realizados em diversos outros estudos que fazem referência a esses métodos.
Ainda, Habig e Jakoby (1981) recomendam o uso da menor quantidade possível
de etanol para solubilizar o substrato, pois o etanol pode inibir as reações
enzimáticas.
Além disso, estudos realizados em nosso laboratório mostraram que o uso de
10% de etanol e 2,5 mM de CDNB causam turbidez no meio de reação do ensaio.
Esta turbidez interfere na leitura da absorbância do produto da reação enzimática
(GS-DNB), diminuindo a precisão e repetibilidade das análises. Tais ressalvas
foram consideradas para a realização dos ensaios subsequentes, sendo a
concentração máxima de etanol fixada em 7,5% após ensaios realizados com
tecido hepático de aves marinhas (descrito na seção IV.4).
III.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
A fim de determinar as condições do ensaio GST para tecidos hepático e
tegumentar de cetáceos, foram construídas duas curvas de cinética enzimática
Pág. 79 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
para GST para cada espécie. As curvas cinéticas foram utilizadas para determinar
os parâmetros cinéticos de velocidade máxima (Vmax) e a constante de
Michaelis-Menten aparente (Kmapp) para os substratos CDNB e GSH.
Vmax é compreendida como a velocidade máxima da enzima nas condições
de total saturação da enzima pelo substrato (> 100 vezes o Km). Já Kmapp, a
constante de Michaelis-Menten, expressa a concentração de substrato na qual a
velocidade da reação corresponde à metade da velocidade máxima. Esses
parâmetros são importantes para a padronização do ensaio GST em cada
espécie de tetrápode.
As curvas de cinética enzimática foram ajustadas ao modelo hiperbólico de
Michaelis-Menten (equação abaixo), utlizando o software Graphpad Prism 5.0®:
Equação: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
(𝐾𝑚+[𝑆])
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Km = Km
[S] = concentração do substrato
vo = velocidade inicial
Os ensaios diferiram entre si quanto à diluição da amostra e concentrações
escolhidas para a composição da curva, conforme apresentado abaixo para as
espécies separadamente. A atividade GST foi calculada por meio da fórmula:
𝑚𝑈.𝑚𝑔𝑝𝑟𝑡−1 = (milli𝐴𝑏𝑠.𝑚𝑖𝑛) × (𝑉𝑜𝑙. 𝑡𝑜𝑡𝑎l)/(𝑉𝑜𝑙. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) × (𝑚𝑔. 𝑝𝑟𝑡) × 𝜀
Onde,
mU.mgprt-1 = atividade GST
milliAbs.min = taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1) em 340nm
Vol.total = volume total da reação
Vol.amostra = volume da amostra
mg.prt = concentração de proteína em mg.mL-1
ε = coeficiente de extinção molar
Condições de ensaios da atividade GST em tecido hepático de Sotalia
guianensis e Stenella frontalis
Para os ensaios de determinação das condições de ensaio da atividade GST
para tecido hepático de boto cinza, Sotalia guianensis, e de Stenella frontalis,
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 80 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
foram utilizados ‘pools’ formados a partir de volumes similares de frações
sobrenadantes das amostras homogeneizadas para cada espécie e diluídos 1:5
(v/v) em tampão de homogeneização. A determinação das condições de ensaio
da atividade GST para tecido tegumentar de S. frontalis também foi realizada com
um ‘pool’ das duas amostras homogeneizadas, não diluídas. A determinação das
condições de ensaio da atividade GST para tecido tegumentar de S. guianensis
foi realizada com apenas uma amostra não diluída, representando a totalidade de
amostras desse tecido de S. guianensis provenientes do PMP-BS no momento da
padronização.
Para os tecidos de ambas as espécies, foram realizados dois ensaios para a
determinação das curvas de cinética enzimática de GST: (i) com concentração
fixa de GSH no meio de reação, e (ii) com concentração fixa de CDNB. Para a
primeira situação, foi utilizado 2,5 mM de GSH e concentrações crescentes de
CDNB: 0,0049; 0,0098; 0,0195; 0,0390; 0,0781; 0,156; 0,312; 0,625; 1,25 e 2,5
mM. Na segunda curva de cinética enzimática foi utilizada a concentração 2,5 mM
de CDNB e concentrações crescentes de GSH: 0,009; 0,019; 0,039; 0,078; 0,156;
0,3125; 0,625; 1,25; 2,5; 5 e 10 mM.
Os ensaios de atividade GST foram realizados com concentração final de
etanol de 7,5% para solubilizar o CDNB. Para obtenção do Kmapp e Vmax em
todos os ensaios, as curvas de cinética enzimática com base nas concentrações
de GSH e CDNB foram submetidas à regressão não linear com a equação
hiperbólica de Michaelis-Menten por meio do programa Graphpad Prism 5®.
Condições de ensaios da atividade GST em tecido hepático de Tursiops
truncatus e Balaenoptera borealis
Para os ensaios de determinação das condições de ensaio da atividade GST
para tecido tegumentar de boto-da-tainha, Tursiops truncatus, e de baleia-sei,
Balaenoptera borealis, foram utilizados ‘pools’ de cada espécie, formados a partir
de volumes similares de frações sobrenadantes das dez amostras
homogeneizadas (Tabela III-1). Foram realizados ensaios de atividade GST com
concentração fixa de GSH (2,5 mM) no meio de reação e concentrações
crescentes de CDNB: 0,0024; 0,0049; 0,0098; 0,0195; 0,0390; 0,0781; 0,156;
0,312; 0,625; 1,25 e 2,5 mM. Adicionalmente, uma segunda curva de cinética
enzimática foi construída, utilizando uma concentração fixa de CDNB (2,5 mM) e
Pág. 81 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
concentrações crescentes de GSH: 0,002; 0,004; 0,009; 0,019; 0,039; 0,078;
0,156; 0,3125; 0,625; 1,25; 2,5 e 5 mM.
Os ensaios de atividade GST foram realizados com concentração final de
etanol de 7,5% para solubilizar o CDNB. Para obtenção do Kmapp e Vmax em
todos os ensaios, as curvas de cinética enzimática com base nas concentrações
de GSH e CDNB foram submetidas à regressão não linear com a equação
hiperbólica de Michaelis-Menten por meio do programa Graphpad Prism 5®.
III.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Concentrações ótimas para o ensaio enzimático podem ser estimadas a partir
dos Km aparentes obtidos para ambas as curvas cinéticas. Wilkinson (1971)
recomenda que para o estabelecimento de condições de ensaio enzimático, o
substrato seja utilizado em concentrações de cinco a 10 vezes o Km.
Vale lembrar que o CDNB é um reagente hidrofóbico e precisa ser
previamente solubilizado em etanol para ser adicionado ao meio de reação.
Concentrações crescentes de CDNB requerem, portanto, concentrações também
crescentes de etanol no meio de reação. Ensaios prévios mostraram que, para
atingir a concentração de 5 mM de CDNB, foi necessária a utilização de meio com
aproximadamente 12% etanol. O resultado dos ensaios de padronização aqui
apresentados indicam como ideal a utilização de CDNB em concentrações de até
33,8 mM, o que exigiria a utilização de quantidades muito elevadas de etanol no
meio de reação.
A utilização dessas concentrações elevadas de etanol seria muito discrepante
dos 5% de etanol utilizado nos ensaios dos idealizadores do método de
quantificação de GST, Keen, Habig e Jakoby (1976) e Habig e Jakoby (1981), e
dos ensaios realizados em diversos outros estudos que fazem referência a esse
método. Ainda, Habig e Jakoby (1981) recomendam o uso da menor quantidade
possível de etanol para solubilizar o substrato, pois o etanol pode inibir as reações
enzimáticas.
Em estudos realizados em nosso laboratório, foi verificado que o uso de
etanol em concentração de 10% causa turbidez no meio de reação do ensaio.
Esta turbidez interfere na leitura da absorbância do produto da reação enzimática
(GS-DNB), diminuindo a precisão e repetibilidade das análises.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 82 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tendo em vista a turbidez no meio de reação com concentrações elevadas de
etanol, a necessidade de comparação dos dados obtidos neste projeto com
àqueles reportados na literatura e o potencial inibitório do etanol, a equipe do
LABCAI não julga pertinente o uso de etanol em ensaios de GST em
concentrações acima de 7,5%. Sendo assim, foram estabelecidas as maiores
concentrações de CDNB possíveis, utilizando 7,5% de etanol.
Com base nas diretrizes supracitadas e nos maiores valores de Km obtidos,
sugere-se, para amostras hepáticas de S. guianensis, a utilização do substrato
CDNB em concentrações de 4,45 a 8,9 mM, enquanto GSH deverá ser utilizada
em concentrações de 2,78 a 5,56 mM.
Para tecido tegumentar de S. guianensis, CDNB deverá ser utilizado em
concentrações de 3,45 a 6,9 mM, e GSH deverá ser utilizado em concentrações
de 5,32 a 10,64 mM (Figuras III.4-2 e III.4-3).
Pág. 83 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Sotalia guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
50
100
150
200
250
Curva cinética de atividade GST hepática de Sotalia guianensis
Sotalia guianensis 1
Sotalia guianensis 2
Vmáx1 = 142,0
Kmapp1= 0,7202
Vmáx2 = 297,8
Kmapp2= 0,8945
A
[CDNB] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
0.0 2.5 5.0 7.5 10.00
100
200
300
400
Curva cinética de atividade GST hepática de Sotalia guianensis
Sotalia guianensis 1
Sotalia guianensis 2
Vmáx1 = 196,4
Kmapp1= 0,4681
Vmáx2 = 333,7
Kmapp2= 0,5562
B
[GSH] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 84 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Sotalia guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
50
100
150
200
250
Curva cinética de atividade GST em pele de Sotalia guianensis
Vmáx1 = 254,7
Kmapp1= 0,6777Sotalia guianensis 2
A
[CDNB] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
0 2 4 6 8 100
100
200
300
Curva cinética de atividade GST em pele de Sotalia guianensis
Vmáx1 = 278,2
Kmapp1= 1,064Sotalia guianensis 2
B
[GSH] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
Pág. 85 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Para amostras hepáticas de S. frontalis, o substrato CDNB deverá ser
utilizado em concentrações entre 5,65 e 11,3 mM, e GSH deverá ser utilizado em
concentrações de 3,4 a 6,8 mM (Figuras III.4-4 e III.4-5). Para amostras
tegumentares da mesma espécie, sugere-se a utilização de CDNB em
concentrações de 3,3 a 6,6 mM, e de GSH em concentrações entre 4,8 e 9,6 mM.
Figura III.4-4 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Stenella frontalis
construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-
dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:
tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de
regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas
tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
200
400
600
Vmáx1 = 115,4
Kmapp1= 1,108
Curva cinética de atividade GST hepática de Stenella frontalis
Stenella frontalis 2
Stenella frontalis 3
Stenella frontalis 1Vmáx2 = 758,9
Kmapp2= 0,9661
Vmáx3 = 826,7
Kmapp3= 1,131
A
[CDNB] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
0 2 4 6 8 100
200
400
600
800
1000
Vmáx1 = 115,4
Kmapp1= 0,428
Curva cinética de atividade GST hepática de Stenella frontalis
Stenella frontalis 2
Stenella frontalis 3
Stenella frontalis 1Vmáx2 = 939,0
Kmapp2= 0,6338
Vmáx3 = 954,9
Kmapp3= 0,6804
B
[GSH] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 86 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.4-5 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Stenella
frontalis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-
2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:
tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de
regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas
tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
Para T. truncatus foram realizados ensaios de padronização apenas em
tecido tegumentar. Os resultados obtidos indicam que o substrato CDNB deverá
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
20
40
60
80
100
Curva cinética de atividade GST na pele de Stenella frontalis
Stenella frontalis 2
Stenella frontalis 1Vmáx1 = 103,2
Kmapp1= 0,6639
Vmáx2 = 109,9
Kmapp2= 0,5805
A
[CDNB] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
0 2 4 6 8 100
50
100
150
200
Curva cinética de atividade GST na pele de Stenella frontalis
Stenella frontalis 2
Stenella frontalis 1Vmáx1 = 86,88
Kmapp1= 0,3952
Vmáx2 = 188,4
Kmapp2= 0,9692
B
[GSH] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
Pág. 87 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ser utilizado em concentrações entre 12,45 e 24,9 mM, enquanto o substrato
GSH deverá ser utilizado em concentrações de 3,48 a 6,97 mM (Figura III.4-6).
Figura III.4-6 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Tursiops
truncatus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos (A) 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:
tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de
regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas
tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
0 1 2 3 4 50
100
200
300
400
Curva cinética de atividade GST na pelede Tursiops truncatus
Vmáx1 = 222,4
Kmapp1= 0,6978
[GSH] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
50
100
150
200
250
Curva cinética de atividade GST na pelede Tursiops truncatus
Vmáx1 = 407,0
Kmapp1= 2,49
[CDNB] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1A
B
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 88 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Para B. borealis foram realizados ensaios de padronização apenas em tecido
tegumentar. Os resultados indicam a utilização de CDNB em concentrações de
16,9 a 33,8 mM e GSH em concentrações de 2,8 a 5,6 mM (Figura III.4-7).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
50
100
150
200
Curva cinética de atividade GST em pelede Balaenoptera borealis
Vmáx1 = 407
Kmapp1= 3,38
[CDNB] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
0 1 2 3 4 50
50
100
150
200
Curva cinética de atividade GST em pelede Balaenoptera borealis
Vmáx1 = 191,1
Kmapp1= 0,56
[GSH] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
A
B
Figura III.4-7 - Curvas cinéticas de atividade GST em epiderme de Balaenoptera borealis
construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-
dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:
tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de
regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas
tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
Pág. 89 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
De acordo com os resultados obtidos para atividade GST em cetáceos e
considerando a limitação da solubilidade de CDNB no meio de reação, foi
estabelecida a concentração de 5 mM para GSH e 2,5 mM para CDNB.
Portanto, para os ensaios futuros visando a determinação da atividade GST
em cetáceos das espécies S. guianensis, S. frontalis, T. truncatus e B. borealis,
serão utilizadas as seguintes condições metodológicas:
Tampão fosfato de potássio: 0,1 M, pH 7,0
GSH: 5 mM
CDNB: 2,5 mM
Etanol: 7,5%
Temperatura: 37°C
Além da determinação de condições ideais para futuros ensaios com
amostras de cetáceos, a padronização aqui apresentada também permitiu
observar que a Vmax de GST no tecido hepático de ambos os espécimes de S.
guianensis e dos três espécimes de S. frontalis são maiores do que aqueles
observados em tecido hepático de outros cetáceos odontocetos, como Kogia spp.
e T. truncatus (CANTÚ-MEDELLIN et al., 2011) (Tabela III-4). Similarmente, a
Vmax de GST em tecido tegumentar de ambos os indivíduos de T. truncatus e B.
borealis foi maior que o encontrado para outros mamíferos. Esta diferença pode
estar relacionada à otimização dos ensaios realizados neste estudo,
principalmente em relação às concentrações dos substratos, permitindo, portanto,
uma análise mais robusta da atividade GST nas espécies de cetáceos testadas
(Tabela III-4). Ainda, tais diferenças também podem ser atribuídas a variações
entre espécies, ou em decorrência de características individuais, tais como idade,
sexo, exposição aos xenobióticos, patologias, grau de decomposição, dentre
outros fatores.
Vale ressaltar que as diferenças na Vmax serão, ao longo do projeto,
correlacionadas com os níveis de contaminantes orgânicos quantificados no
tecido de cada indivíduo analisado, mas a presença de correlação não significa
que os xenobióticos sejam o único fator influenciando a atividade GST. Além
disso, a presença de correlação estatística não indica necessariamente a
presença de relação causal direta (causation) entre os fatores (i.e. contaminantes
e atividade GST) em nível biológico.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 90 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Dados da literatura apontam que concentrações elevadas de hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos e contaminantes organoclorados afetam a atividade GST
em invertebrados marinhos (LÜCHMANN et al., 2011). Outros fatores, como sexo,
idade e condições ambientais, como temperatura, também podem influenciar a
atividade enzimática em fígado de peixes (BASTOS et al., 2013) e ratos
(GUSTAFSSON et al., 1983). Em cetáceos, Nash et al. (2014) verificaram
variações da atividade GST na pele de baleias jubarte em decorrência do estágio
reprodutivo, no qual animais em jejum nas áreas reprodutivas apresentaram
atividade mais baixa da enzima. Entretanto, a influência destas variáveis sobre a
atividade de GST ainda é pouco explorada em tetrápodes marinhos.
III.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA
ATIVIDADE ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD)
III.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
A determinação de atividade EROD foi realizada no espectrofluorímetro
SpectraMax® M5 (Molecular Devices®), utilizando microplacas pretas (Perkin
Elmer). Resumidamente, as amostras foram adicionadas nos poços, ajustando-se
o volume final com tampão de microssoma, se necessário. As amostras foram
incubadas com 70 µL de 7-etoxiresorufina (7-ER) por 10 minutos a 37ºC (WHITE
et al., 1994; CHANG, WAXMAN, 2006; WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK,
2006). Após a incubação, NADPH foi adicionado em cada poço para iniciar a
reação. O protocolo foi adaptado de Burke e Mayer (1974). O par de excitação e
emissão (ex/em) foi ajustado para 530nm/585nm com filtro (cutoff) em 550 nm e
fotomultiplicador ligado no máximo (high) para otimizar a detecção de resorufina.
Foram realizadas 20 leituras por poço em cada intervalo de tempo de 30 s. A
reação foi monitorada por 600 s e o coeficiente angular da reta RFU.min-1 foi
utilizado para o cálculo da atividade enzimática.
Uma curva padrão com resorufina foi utilizada para converter a fluorescência
(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em picomoles de
resorufina formada por minuto por massa de proteína (pmol.min-1.mgprt-1), usando
a seguinte fórmula:
Pág. 91 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Atividade EROD = (𝑹𝑭𝑼×𝒎𝒊𝒏−𝟏)×(𝒄𝒐𝒆𝒇.𝒓𝒆𝒔𝒐𝒓𝒖𝒇𝒊𝒏𝒂)
𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂
Apesar de seguirem o mesmo procedimento analítico, as padronizações para
amostras hepáticas e tegumentares de Sotalia guianensis e Stenella frontalis
foram distintas das realizadas para Balaenoptera borealis e Tursiops truncatus,
conforme segue.
Condições de ensaios da atividade EROD em tecidos hepático e
tegumentar de Sotalia guianensis e Stenella frontalis
Devido à restrição de quantidade de amostra, as determinações das
condições do ensaio EROD para tecidos hepático e tegumentar de Stenella
frontalis e Sotalia guianensis foram realizadas com ‘pool’ das amostras
homogeneizadas para cada espécie.
Primeiramente, a fim de avaliar o efeito da coenzima NADPH, foram
realizadas análises utilizando uma concentração fixa de 7-etoxiresorufina (7-ER)
(2 µM) e concentrações crescentes de NADPH: 0,25; 0,5; 1 e 2 mM. Esse teste
apenas foi realizado para o ‘pool’ de amostras hepáticas devido à restrição de
volume de microssoma tegumentar. Nas situações em que houve restrição da
quantidade de amostra, foi priorizada a curva cinética do substrato 7-
etoxiresorufina (7-ER).
Para a determinação dos parâmetros Vmax e Kmapp para o substrato 7-ER
foram realizados ensaios de atividade EROD para todos os ‘pools’ de ambas as
espécies com concentração fixa de NADPH (1 mM) e concentrações crescentes
de 7-ER: 0,0078; 0,0156; 0,0312; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4 e 8 µM. A curva
de cinética enzimática foi avaliada por meio de regressão não linear com as
equações de Michaelis-Menten e do modelo de inibição por substrato (equações
abaixo), usando o programa Graphpad Prism 5®.
Equação de Michaelis-Menten: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
(𝐾𝑚+[𝑆])
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 92 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Km = Km
[S] = concentração do substrato
vo = velocidade inicial
Equação de inibição por substrato: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
𝐾𝑚+([𝑆]×(1+[𝑆]
𝐾𝑖))
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Km = Km
[S] = concentração do substrato
Ki = constante de inibição
vo = velocidade inicial
No caso de inibição de uma enzima pelo substrato, a padronização do
método com concentrações do substrato iguais a 100, 50, 10 ou 5 vezes o Km da
enzima deve ser aplicada com cautela, pois, dependendo da concentração do
substrato, o método será padronizado em uma concentração inibitória para a
enzima (BISSWANGER, 2011; 2014).
Não foi detectada atividade EROD nas amostras de pele de S. frontalis e S.
guianensis. Portanto, não foram realizadas curvas cinéticas para 7-ER nem
ensaios com diferentes concentrações de NADPH em pele destas espécies de
cetáceos.
Condições de ensaios da atividade EROD em tecido tegumentar de
Tursiops truncatus e Balaenoptera borealis
Devido à restrição de quantidade de amostra, a determinação das condições
do ensaio EROD em microssoma de tecido tegumentar de Tursiops truncatus e
Balaenoptera borealis foi realizada em um ‘pool’ das 10 amostras
homogeneizadas para cada espécie. O ‘pool’ era formado por volumes
equivalentes de cada amostra homogeneizada.
Primeiramente foi realizado um teste a fim de identificar a ocorrência de
atividade EROD em tecido tegumentar destas espécies. Nesse teste foram
utilizadas as seguintes condições para a análise EROD: 2 µM do substrato 7-
etoxiresorufina (7-ER) e 1 mM de NADPH, pH 7,4, a 37ºC.
Pág. 93 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
A determinação de atividade EROD foi realizada no espectrofluorímetro
SpectraMax® M5 (Molecular Devices®), utilizando microplacas pretas (Perkin
Elmer) similarmente ao processo descrito para amostras de Sotalia guianensis e
Stenella frontalis. Entretanto, foram utilizados 60 µg de proteína microssomal do
‘pool’ de amostras.
Não foi detectada atividade EROD nas amostras de pele de B. borealis e
de T. truncatus. Portanto, não foram realizadas curvas cinéticas para 7-ER
nem ensaios com diferentes concentrações de NADPH em tecido
tegumentar destas espécies.
III.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não foi detectada atividade EROD em tecido tegumentar de Sotalia
guianensis, Stenella frontalis, Balaenoptera borealis e Tursiops truncatus (Figura
III.5-1). Logo, os resultados e recomendações de ensaio abaixo descritas
referem-se apenas ao tecido hepático de S. guianenis e S. frontalis.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 94 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.5-1 - A. Atividade EROD em tecido hepático de tainha (Mugil liza) exposta a
dispersantes de petróleo, conforme observada no software SpectraMax® M5 (Molecular
Devices®), para fins de comparação com B. Atividade EROD em tecido tegumentar de
golfinho pintado do Atlântico (Stenella frontalis), em duplicata, conforme observada no
software SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). Linhas em duplicata mais abaixo em ‘B’
representam o “Branco”, sem adição de amostra.
Para a curva cinética de 7-ER de S. guinaneis e S. frontalis foi possível
identificar uma diminuição da atividade da enzima a partir de determinadas
concentrações de substrato (Figuras III.5-2A e III.5-3A). Embora usualmente
ajustados para modelos clássicos de Michaelis-Menten, a atividade EROD em
tecido hepático de cetáceos adequou-se melhor a um modelo de inibição por
substrato. Modelos de inibição por substrato já foram aplicados a diversos
membros da família de citocromos P450, tais como reportado por Lin et al. (2001),
Pág. 95 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
que identificaram inibição da atividade EROD de CYP1A2 humano quando em
concentrações do substrato 7-ER acima de 8 µM.
Para determinar o Kmapp em casos de inibição por substrato, Stromme e
Theodorsen (1976) propuseram a utilização de gráficos duplo-recíprocos de
Lineweaver-Burk. Tais gráficos linearizam dados enzimáticos, facilitando a
identificação do ponto no eixo X, referente à concentração do 1/[substrato], em
que a relação 1/[substrato] versus 1/V inverte-se, ou seja, referente ao momento
no qual o incremento de substrato reflete em um decréscimo da atividade
enzimática. Este ponto refere-se à determinada concentração do substrato em
questão, sendo que as condições ideais do ensaio devem utilizar concentrações
abaixo desta. O modelo matemático foi escolhido para evitar o uso de
concentrações inibitórias do substrato.
Concernente ao ensaio com concentrações crescentes de NADPH, os
resultados mostraram que não há diferença aparente de atividade EROD hepática
entre os ensaios realizados com concentrações de 0,25, 0,5, 1 e 2 mM de NADPH
(Figura III.5-2B) em amostras hepáticas de S. guianensis. Dessa forma, a
concentração final de 0,5 mM de NADPH será adotada em futuros ensaios
visando minimizar a utilização de NADPH, mas mantendo a linearidade da
reação.
Para a curva cinética de EROD hepática de S. guianensis em função de 7-ER,
a inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorre quando a concentração V/[7-ER] é
próxima a 619, referente ao ponto de 2 µM de 7-ER (Figura III.5-2A - ‘inset’).
Tendo em vista o exposto, sugere-se o uso de concentrações de 7-ER abaixo de
2 µM para o ensaio EROD em tecido hepático de boto cinza S. guianensis.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 96 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.5-2 - A. Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Sotalia
guianensis construída com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-
etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidas por meio de regressão não linear
dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato. Linhas hachuradas indicam o
intervalo de confiança de 95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ –
Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax
prevista na ausência de inibição por substrato. B. Efeito de diferentes concentrações de
NADPH na atividade EROD.
0 2 4 6 8 100
500
1000
1500
Vmáx = 3718,0 1018,0
Kmapp= 2,133 0,79
Ki = 2,39 0,96
Atividade EROD em diferentes concentrações de 7-ER
[7-ER] (M)
fmo
l.m
in-1
. m
g p
rote
ina
-1
0 500 1000 1500 2000 25000
500
1000
1500
[V/Substrate]
V
Atividade EROD - S. guianensis
0,25
mM
0,5
mM
1 m
M
2 m
M
0.0
0.5
1.0
1.5
[NADPH] (mM)
pm
ol.
min
-1.
mg
pro
tein
a-1
B
A
Pág. 97 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Para amostras hepáticas de S. frontalis, os resultados do ensaio com NADPH
mostraram menor atividade EROD quando utilizado NADPH na concentração de
0,25 mM. Por outro lado, a atividade se manteve estável entre os ensaios que
utilizaram de 0,5 a 1 mM de NADPH (Figura III.5-3B). Dessa forma, a
concentração final de 1 mM de NADPH será adotada em futuros ensaios para
manter a linearidade da reação por um período mais longo, garantindo a
qualidade analítica quando for necessário avaliar um grande número de amostras
simultaneamente.
Paralelamente, o gráfico linearizado de Eadie-Hofstee construído para curva
cinética de EROD no golfinho pintado do Atlântico, S. frontalis (Figura III.5-3A -
‘inset’) permitiu identificar que a inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorre
quando concentração V/[7-ER] é próxima a 2138, referente ao ponto de 2 µM de
7-ER. Considerando o exposto, sugere-se o uso de concentrações de 7-ER
abaixo de 2 µM para o ensaio EROD em tecido hepático de S. frontalis.
Por fim, com base nos resultados obtidos, as condições de ensaio da enzima
EROD em fígado de S. guianensis e S. frontalis em estudos futuros serão:
S. guianensis:
* 20 µg de proteína microssomal em tampão Tris/NaCl (50 mM/0,1M, pH 7,4)
* 1 µM de 7-ER
* 0,5 mM de NADPH
* Temperatura de 37ºC
S. frontalis:
* 20 µg de proteína microssomal em tampão Tris/NaCl (50 mM/0,1M, pH 7,4)
* 1 µM de 7-ER
* 1 mM de NADPH
* Temperatura de 37ºC
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 98 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura III.5-3 - A. Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Stenella
frontalis construída com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-
etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidas por meio de regressão não linear
dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato, linhas pontilhadas indicam o
intervalo de confiança de 95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ –
Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax
estimado na ausência de inibição por substrato. B. Efeito de diferentes concentrações de
NADPH na atividade EROD.
0 2 4 6 8 100
1000
2000
3000
4000
5000
Vmáx = 8020,0 1221,0
Kmapp= 0,548 0,14
Ki = 2,6 0,72
Atividade EROD em diferentes concentrações de 7-ER
[7-ER] (M)
fmo
l.m
in-1
. m
g p
rote
ina
-1
0 10000 20000 30000 400000
1000
2000
3000
4000
5000
[V/Substrate]
V m
ax
Atividade EROD - S. frontalis
0,25
mM
0,5
mM
1 m
M
2 m
M
0
1
2
3
4
5
[NADPH] (mM)
pm
ol.
min
-1.
mg
pro
tein
a-1
B
A
Pág. 99 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Nestes testes foi possível identificar os valores de Vmax para atividade EROD
em tecido hepático de S. guinanesis (3,72 pmol.min-1.mgprt-1) e S. frontalis (8,02
pmol.min-1.mgprt-1). Os valores de Vmax para ambas as espécies são, em geral,
menores que aqueles descritos para outras espécies de odontocetos e misticetos
(vide Tabela III-5). No entanto, apesar de alguns trabalhos indicarem atividade
EROD mais alta que as amostras do PMP-BS em amostras de cetáceos (WHITE
et al., 2000; BOON, LEWIS, GOKSOYR, 2001; MCKINNEY et al., 2004), a
ausência de detecção da atividade EROD em amostra tegumentar já foi descrita
para misticetos (NASH et al., 2014), enquanto outros trabalhos mostraram uma
baixa atividade EROD mesmo em tecido hepático (BOON, LEWIS, GOKSOYR,
2001; GARRICK et al., 2006).
É possível que a reduzida atividade hepática observada tanto para S.
guianensis quanto para S. frontalis seja consequência do tempo decorrido após a
morte do animal de até 24 horas. Alguns estudos citados no presente relatório
utilizaram amostras coletadas imediatamente após a morte, como é o caso de
amostras provenientes de animais abatidos para subsistência pela população
Inuit, localizada na região ártica do Canadá (WHITE et al., 1994), ou, mais
frequentemente, de amostras teciduais de animais encalhados vivos (Tabela III-
5).
No entanto, é possível que a atividade EROD seja constitutivamente baixa em
cetáceos, especialmente na pele, visto que as amostras desse tecido de T.
truncatus e B. borealis foram coletadas por meio de biópsia remota de animais
vivos.
III.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA CETÁCEOS
As condições ótimas para realização de futuros ensaios com tecido de
cetáceos encontram-se sumarizadas nas tabelas abaixo. Todas as condições
apresentadas foram determinadas com base nos ensaios realizados durante a
etapa de padronização do presente projeto. A atividade EROD em cetáceos foi
determinada apenas no fígado de animais provenientes do PMP-BS (animais
mortos). Como não foi possível padronizar a técnica de quantificação da atividade
EROD na pele dos cetáceos, serão realizadas análises desta atividade neste
tecido adotando-se a técnica padronizada para o fígado.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 100 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela III-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-
transferase (GST) em amostras de cetáceos.
Espécie Atividade GST
Tampão [GSH]
mM [CDNB]
mM Temperatura Tecido
Condições de preservação
Stenella frontalis
Fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0)
5 2,5 37 °C Pele e Fígado Freezer -80 °C
Sotalia guianensis
Fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0)
5 2,5 37 °C Pele e Fígado Freezer -80 °C
Tursiops truncatus
Fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0)
5 2,5 37 °C Pele Freezer -80 °C
Balaenoptera borealis
Fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0)
5 2,5 37 °C Pele Freezer -80 °C
Tabela III-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-
O-deetilase (EROD) em amostras de cetáceos.
Espécie Atividade EROD
Tampão [7-ER]
µM [NADPH]
mM Temperatura Tecido
Condições de preservação
Stenella frontalis
TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH
7,4) 1 1 37 °C Fígado Freezer -80 °C
Sotalia guianensis
TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH
7,4) 1 0,5 37 °C Fígado Freezer -80 °C
Tursiops truncatus
ND Pele Freezer -80 °C
Balaenoptera borealis
ND Pele Freezer -80 °C
ND: Não detectada.
III.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM CETÁCEOS:
COMPARAÇÃO COM OS DADOS DA LITERATURA
A tabela comparativa (Tabela III-4) mostra que as atividades GST de
cetáceos odontocetos analisados neste estudo são maiores que aquelas
observadas em outros odontocetos. Os resultados de atividade GST de
Pág. 101 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Balaenoptera borealis obtidos neste estudo são similares aos valores observados
em fígado para outros balaenopterídeos (Tabela III-4).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 102 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela III-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) obtidos durante a padronização deste projeto com aqueles reportados em
outros estudos realizados em mamíferos marinhos.
ESPÉCIE TECIDO ORIGEM DA AMOSTRA
CONDIÇÃO DA AMOSTRA
[GSH] [CDNB] TEMPERATURA DO ENSAIO
Km (mM) VMAX
(mU*.mgprt-1) REFERÊNCIA
Tursiops truncatus
Pele Biópsia Fresca 0,002 – 5 mM
0,002 – 2,5 mM
37 °C
GSH: 0,69 GSH: 222,4
Este trabalho
CDNB: 2,49 CDNB: 407
Fígado Necrópsia
< 2 h post mortem
1 mM 0,2 mM 25 °C - 21,57*10³± 8,7*10³ Cantú-medellín et al., 2011
Stenella frontalis
Pele Necrópsia Código 2 0,009 – 10 mM
0,004 – 2,5 mM
37 °C
GSH: 0,96 GSH: 137±71
Este trabalho
CDNB: 0,66 CDNB: 106±4
Fígado Necrópsia Código 2
0,009 – 10 mM
0,004 – 2,5 mM
37 °C
GSH: 0,68 GSH: 669±480
Este trabalho
CDNB: 1,13 CDNB: 567±392
Sotalia guianensis
Pele Necrópsia Código 2 0,009 – 10 mM
0,004 – 2,5 mM
37 °C
GSH: 1,06 GSH: 278
Este trabalho
CDNB: 0,67 CDNB: 254
Fígado Necrópsia Código 2
0,009 – 10 mM
0,004 – 2,5 mM
37 °C
GSH: 0,55 GSH: 265±97
Este trabalho
CDNB: 0,89 CDNB: 219±110
Pág. 103 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Kogia sp. Fígado Necrópsia < 2 h post mortem
1 mM 0,2 mM 25 °C - 19,98*10³±
7,86*10³ Cantú-medellín et al., 2011
Balaenoptera borealis
Pele Biópsia Fresca 0,002 – 5 mM
0,002 – 2,5 mM
37 °C
GSH: 0,56 GSH: 191,1
Este trabalho
CDNB: 3,38 CDNB: 508
Balaenoptera acutorostrata
Fígado Necrópsia Coletada
imediatamente após a morte
- - - - Feto: 102±24
Adulto: 985±287 Goksoyr et al., 1988
Megaptera noveangliae
Pele Biópsia Fresca 1 mM 1 mM 25 °C - 31,35*10³ Nash et al., 2014
Phoca hispida
Fígado Necrópsia < 5 min post
mortem 1 mM 1 mM 25 °C -
Machos: 395±40
Wolkers et al., 1998
Fêmeas: 332±77
Fígado Necrópsia
Coletada imediatamente após a morte
25 μM 2,5 mM 25 °C - 45*10³ Routti et al., 2008
Phoca vitulina
Fígado Necrópsia Coletada
imediatamente após a morte
1 mM 1 mM 25 °C - 323,4±51,7 Ruus et al., 2002
* Nenhuma amostra foi submetida a tratamento químico ou farmacológico.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 104 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela III-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados em
outros estudos realizados com mamíferos marinhos.
ESPÉCIE TECIDO ORIGEM DA AMOSTRA
CONDIÇÃO DA
AMOSTRA TRATAMENTO [7-ER] [NADPH]
TEMPERATURA DO ENSAIO
Km (μM) VMAX
(pmol.mgprt-1. min-1)
REFERÊNCIA
Tursiops truncatus
Cultura celular
Biópsia Cultura celular
BNF A 0,01 - 10 μM E TCDD A 0,01 – 30 nM
2,67 μM - - - 3,6 – 15,1 Garrick et al.,
2006
Pele Biópsia Fresca NÃO 2 μM 1 mM 37 °C - ND Este trabalho
Sotalia guianensis
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0 - 8 μM 1 mM 37 °C 2,1 μM 3,72 Este trabalho
Stenella frontalis
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0 - 8 μM 1 mM 37 °C 0,548 μM 8,02 Este trabalho
Pele Necrópsia Código 2 NÃO 2 μM 1 mM 37 °C - ND Este trabalho
Delphinapterus leucas
Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C -
Fêmeas: 97±84:
White et al., 1994
Machos: 413±263
Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - Machos: 563 White et al., 2000
Pág. 105 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - ND-260 McKinney et al.,
2004
Globicephala melas
Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - 67 White et al., 2000
Physeter macrocephalus
Fígado Necrópsia Até 18 h post
mortem NÃO 0,88 μM 2 mM 20 °C - 20±7 Boon et al., 2001
Lagenorhyncus albirostris
Fígado Necrópsia Até 2 h post
mortem NÃO 0,88 μM 2 mM 20 °C - 9 Boon et al., 2001
Lagenorhyncus acutus
Fígado Necrópsia Até 24 h post
mortem NÃO 5 μM 1,67 mM 25 °C -
Machos: 65±34 Wilson et al.,
2010 Fêmeas: 102±116
Phocoena phocoena
Fígado Necrópsia Até 2 h post
mortem NÃO 0,88 μM 2 mM 37 °C - 417 Boon et al., 2001
Balaenoptera borealis
Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - 2180 Goksoyr et al.,
1986
Pele Biópsia Fresca NÃO 2 μM 1 mM 37 °C - ND Este trabalho
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Pág. 106 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Megaptera noveangliae
Pele Biópsia Fresca NÃO 200 μM
37 °C - ND - 73 Nash et al., 2014
Phoca vitulina Fígado Necrópsia Até 2 h post
mortem NÃO 1 μM 5 mM 37 °C - 2460 Boon et al., 1994
Fígado Necrópsia - NÃO 1 μM - -
Baltic Sea: 0,12
Baltic Sea: 1191 Nyman et al.,
2000 Canada: 0,16
Canada: 95
Fígado Necrópsia Até 48 h post
mortem NÃO 0,5 μM 0,2 mM - 9600
Troisi e Mason, 1997
Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 2,5 μM - 33 °C 0,72 37±24 Addison et al.,
1986
Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 1,6 μM 0,06 mM 25 °C - 323,4 Ruus et al., 2002
Pusa hispida Fígado Necrópsia
Coletada imediatament
e após a morte
NÃO 2,08 μM
Sistema de
regeneração de NADPH
37 °C -
Machos: 172
Wolkers et al., 1998
Fêmeas: 154
Juvenis: 65
Fígado Biópsia Fresca BNF A 50
mg.quilo-1.dia-1 2,08 μM 2 mM 37 °C -
Controle: 30,8±2,4
Miller et al., 2005
Pág. 107 / 203
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores para
Cetáceos
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Tratado: 37,2±6,6
Pele Biópsia Fresca
BNF A 50 mg.quilo-1.dia-1
2,08 μM 2 mM 37 °C -
Controle: 2,1±0,1
Miller et al., 2005
Tratado: 1,8
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
III. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em Cetáceos
Pág. 108 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
A otimização dos ensaios realizados neste estudo, referente às
concentrações de substrato e temperatura, permitiu uma análise mais robusta da
atividade GST em amostras de cetáceos, o que pode explicar a diferença em
relação aos dados da literatura. No entanto, é possível também que as diferenças
observadas sejam relacionadas à variação interindividual decorrente de
características intrínsecas ao organismo, como sexo, idade, ou, ainda, devidas à
exposição a determinadas condições ambientais ou alterações em função do
tempo post-mortem, como no caso de animais provenientes do PMP-BS.
A atividade EROD observada nos cetáceos analisados na presente
padronização foram menores que aquelas descritas para outras espécies de
odontocetos e misticetos. Em biópsias do tecido tegumentar de cetáceos
coletados no PMC, não foi detectada atividade. Os resultados obtidos podem
estar associados a características espécie-específicas e/ou tecido-específicas. A
padronização em tecido hepático de necrópsias do PMP-BS permitiu obter dados
essenciais relacionadas às concentrações potencialmente inibitórias do substrato
7-ER, que variam entre as espécies de tetrápodes. Este é um dado de alta
relevância, visto que concentrações mais elevadas de substrato podem inibir a
atividade EROD em cetáceos, gerando valores inferiores à real estimativa de
atividade do espécime. A técnica padronizada em tecido hepático poderá ser
utilizada para quantificar a atividade EROD em pele de espécimes coletados no
PMC.
É importante ressaltar, ainda, que o esforço de padronização neste estudo
representa, per se, um importante incremento aos dados disponíveis na literatura
mundial para parâmetros enzimáticos de GST e EROD em cetáceos. Os dados
inéditos gerados para os odontocetos T. truncatus, S. frontalis, S. guianensis e o
misticeto B. borealis são, portanto, ferramentas de grande valia para programas
de biomonitoramento ambiental em regiões com ocorrência das espécies
supracitadas. Deve-se ter cautela ao avaliar animais provenientes do PMP-BS,
pois o estágio de decomposição do animal pode afetar os resultados dos
biomarcadores. Os biomarcadores avaliados neste estudo são enzimas
(proteínas) e, portanto, suscetíveis à degradação microbiológica e por proteases
endógenas liberadas no processo de decomposição do animal. A causa mortis
também é um importante fator, pois doenças que afetam o metabolismo hepático
ou infecções sistêmicas também podem afetar a resposta dos biomarcadores.
Pág. 109 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
IV – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM AVES MARINHAS
IV.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS
Para a padronização de técnicas para análise de biomarcadores bioquímicos
em aves marinhas foram utilizadas duas amostras de fígado de Larus
dominicanus e dez amostras de fígado de Spheniscus magellanicus. As amostras
de ambas as espécies foram coletadas pelas equipes das bases integrantes do
PMP-BS.
A amostra de L. dominicanus 026450 foi utilizada para padronização da
atividade de GST nesta espécie, bem como para o teste de inbição por etanol. A
amostra R3A002635 foi utilizada para padronização de atividade EROD.
Dentre as amostras de S. magellanicus, 017599, 017600 e 017533 foram
utilizadas para padronização de GST. As demais foram utilizadas para a
padronização de atividade EROD.
Informações sobre as amostras estão apresentadas na Tabela IV-1.
Tabela IV-1 - Identificação dos espécimes de aves marinhas provenientes do PMP-BS
cujas amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade glutationa S-
transferase (GST) e da atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).
Espécie Identificação
no SIMBA
Tecido
biológico Situação da carcaça
Larus dominicanus 026450 Hepático Código 2 de decomposição
Larus dominicanus R3A002635 Hepático Fresca - eutanasiado
Spheniscus magellanicus 017599 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017600 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017533 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017544 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017596 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017531 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017535 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017543 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 017593 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 019270 Hepático Código 2 de decomposição
Spheniscus magellanicus 019432 Hepático Código 2 de decomposição
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 110 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
IV.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
Para obtenção das frações citosólica e microssomal, o tecido hepático dos
espécimes de Larus dominicanus e Spheniscus magellanicus foi descongelado
sobre o gelo e pesado individualmente. Aproximadamente 150 mg de tecido foram
homogeneizados com o equipamento TissueTearorTM (BiospecTM) em cinco vezes
o volume de tampão de homogeneização Tris-HCl (50 mM Tris-HCl, pH 7,4)
contendo 150 mM KCl, 1 mM DTT e 0,5 mM do inibidor de proteases fluoreto de
fenilmetilsulfonil (PMSF). Durante todo o procedimento, as amostras foram
mantidas em frascos sobre o gelo.
O homogeneizado foi centrifugado a 9.000 xg por 30 minutos a 4°C, obtendo-
se, assim, a fração citosólica, denominada fração S9. Para a obtenção da fração
microssomal, foi realizada uma segunda centrifugação da fração S9 a 100.000 xg
por 60 minutos a 4°C com a ultracentrífuga Hitachi CP100WX. A fração
sobrenadante resultante foi acondicionada em novo microtubo e armazenada em
freezer -80°C, e a fração microssomal foi ressuspendida em tampão Tris-HCl (0,1
M, pH 7,4), contendo 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 M KCl e glicerol 20%, e
armazenada em freezer -80°C até o momento de seu processamento.
A fração citosólica foi utilizada para padronização das técnicas de análise da
atividade GST, enquanto a fração microssomal foi utilizada para padronização da
técnica de atividade EROD.
IV.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS
AMOSTRAS
A determinação da concentração de proteínas totais das frações citosólica e
microssomal das amostras homogeneizadas foi realizada por meio do método de
Bradford (BRADFORD, 1976). O método de Bradford utiliza o corante Coomassie
Brilliant Blue (G-250), que reage com os aminoácidos das proteínas, formando
uma coloração que varia do tom marrom para o azulado.
A determinação de proteínas totais foi realizada com o kit Bio-Rad Protein
Assay® (Bio-Rad) de acordo com instruções do fabricante. Em uma microplaca
com 96 poços foram adicionados, em duplicata, 5 µL de cada amostra e 200 µL
Pág. 111 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
de Reagente de Bradford filtrado, totalizando um volume final de 205 µL. Após
incubação de 5 minutos, foi realizada uma leitura simples das amostras a 595 nm
utilizando o espectrofotômetro de placas SpectraMax® M5 (Molecular Devices®).
As absorbâncias das amostras foram comparadas a uma curva padrão de
albumina sérica bovina produzida no mesmo ensaio das amostras. A quantidade
de proteínas totais nas amostras foi expressa em mg.mL-1.
IV.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA
ATIVIDADE GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST)
IV.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
Com o intuito de garantir que a utilização de níveis mais elevados de etanol
não represente inibição da atividade enzimática ou problemas de turbidez em
futuros ensaios, primeiramente foi avaliada a atividade GST em uma mesma
amostra de fígado de L. dominicanus em meios de reação com concentrações
crescentes de etanol (5,5; 7,5 e 10% de etanol no ensaio final) e concentração
fixa dos substratos (GSH a 1 mM e CDNB a 1 mM).
A determinação da atividade GST seguiu o método descrito por Keen, Habig e
Jakoby (1976), com modificações para microplaca. A atividade GST foi calculada
com a fórmula:
𝑚𝑈.𝑚𝑔𝑝𝑟𝑡−1 = (milli𝐴𝑏𝑠.𝑚𝑖𝑛) × (𝑉𝑜𝑙. 𝑡𝑜𝑡𝑎l)/(𝑉𝑜𝑙. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) × (𝑚𝑔. 𝑝𝑟𝑡) × 𝜀
Onde,
mU.mgprt-1 = atividade GST
milliAbs.min = taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1)
Vol.total = volume total da reação
Vol.amostra = volume da amostra
mg.prt = concentração de proteína em mg.mL-1
ε = coeficiente de extinção molar
A determinação das condições do ensaio GST propriamente dita, para tecidos
hepáticos de Larus dominicanus e Spheniscus magellanicus, foi realizada com a
construção de duas curvas de cinética enzimática para GST para cada espécie.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 112 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
As curvas cinéticas são utilizadas para determinar os parâmetros cinéticos de
velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis-Menten aparente (Kmapp)
para os substratos CDNB e GSH.
Para ambas as espécies a curva de cinética enzimática para CDNB foi
construída com concentração fixa de GSH (2,5 mM) e concentrações crescentes
de CDNB: 0,125; 0,156; 0,25; 0,312; 0,500; 0,625; 1; 1,25; 2 e 2,5 mM. Uma
segunda curva de cinética enzimática de GST foi construída, com uma
concentração fixa de CDNB (2,5 mM) e concentrações crescentes de GSH: 0,011;
0,023; 0,046; 0,093; 0,187; 0,375; 0,75; 1,5; 3 e 6 mM. A concentração final de
etanol no ensaio foi de 7,5%.
Ambas as curvas de cinética enzimática foram submetidas à regressão não
linear, com a equação de Michaelis-Menten, para obtenção do Kmapp e Vmax,
usando o programa Graphpad Prism 5.
Vmáx é compreendida como a velocidade máxima da enzima nas condições
de total saturação da enzima pelo substrato (> 100 vezes o Km). Já Kmapp, a
constante de Michaelis-Menten, expressa a concentração de substrato na qual a
velocidade da reação corresponde à metade da velocidade máxima. Esses
parâmetros são importantes para padronização do ensaio GST em cada espécie
de tetrápode.
As curvas de cinética enzimática foram ajustadas ao modelo hiperbólico de
Michaelis-Menten (equação abaixo), utlizando o software Graphpad Prism 5.0®:
Equação: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
(𝐾𝑚+[𝑆])
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Km = Km
[S] = concentração do substrato
vo = velocidade inicial
Pág. 113 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
IV.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
IV.4.2.1 – AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO POR ETANOL
No teste de inibição por etanol não foi observada uma redução na atividade
da enzimas GST para as concentrações crescentes de etanol utilizadas (Figura
IV.4-1). A ausência de inibição na atividade enzimática em decorrência do
aumento da concentração final de etanol no ensaio possibilita que haja um
aumento na concentração deste solvente e, consequentemente, de CDNB no
ensaio de GST. Embora este procedimento permita a utilização de maiores
concentrações de CDNB, ressalta-se que não é recomendada a utilização de
concentrações elevadas de etanol no ensaio, tendo em vista seu potencial
inibitório na atividade enzimática em concentrações acima daquelas testadas no
presente trabalho. Além disso, modificações muito significativas podem impedir a
comparação dos resultados obtidos com aqueles existentes na literatura científica.
Para futuros ensaios, portanto, foi determinada a utilização de concentrações
finais máximas de etanol de 7,5%. Nessas condições não há turbidez do meio
nem inibição enzimática.
Figura IV.4-1 - Atividade GST em concentrações crescentes de etanol e concentração
fixa de CDNB (1mM). Barras representam média±DP, calculados a partir de
quadruplicatas técnicas* para cada condição de ensaio.*Réplicas técnicas são repetições
de análises de um mesmo organismo (amostra biológica) realizadas durante um ensaio.
As réplicas técnicas podem ser usadas para avaliar a repetibilidade do método.
ATIVIDADE GST
5,5
%
7,5
%10
%
0
100
200
300
[ETANOL]
mU
. m
g p
rote
ína
-1
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 114 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
IV.4.2.2 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS PARA O
ENSAIO
Concentrações ótimas para o ensaio enzimático podem ser estimadas a partir
dos Km aparentes (Kmapp) obtidos para ambas as curvas cinéticas. Wilkinson
(1971) recomenda que para o estabelecimento de condições de ensaio
enzimático, o substrato seja utilizado em concentrações de cinco a dez vezes o
Kmapp. Com base nestas diretrizes, para Larus dominicanus, o substrato GSH
deveria ser utilizado em concentrações de 2,9 a 5,8 mM, enquanto CDNB deveria
ser utilizado em concentrações de 5,5 a 11 mM (Figura IV.4-2). Para Spheniscus
magellanicus, o substrato GSH deveria ser utilizado em concentrações de 1,5 a 6
mM, enquanto CDNB deveria ser utilizado em concentrações entre 3 e 9 mM
(Figura IV.4-3).
Em estudos preliminares realizados no laboratório, a elevação da
concentração relativa de CDNB no meio de reação, mantendo-se a
porcentagem de etanol em 5%, resultou em um aumento significativo da
turbidez do meio de reação durante a leitura, acarretando em interferência na
leitura da absorbância do método.
Alternativamente, a concentração de CDNB poderia ser aumentada elevando-
se também a porcentagem de etanol no meio. No entanto, para atingir a
concentração de 5 mM de CDNB foi necessária a utilização de meio com
aproximadamente 12% etanol. Para atingir concentrações ainda mais elevadas de
CDNB seria necessário ampliar ainda mais a porcentagem de etanol na reação
inviabilizando a comparação direta com a literatura científica.
A equipe do LABCAI não julga pertinente o uso de concentrações mais altas
de etanol em decorrência das razões já explicitadas na seção anterior (Seção
IV.4.2.1 deste documento). Dessa forma, a escolha das concentrações de GSH e
CDNB, 2,5 mM e 2,5 mM, respectivamente, foi realizada com o intuito de otimizar
as condições do ensaio, maximizando a atividade GST, em concentrações de
etanol que permitissem a solubilização do CDNB (sem turbidez ou precipitação),
não inibissem as reações enzimáticas e ainda possibilitassem a comparação de
Pág. 115 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
resultados com os dados de literatura, cujos ensaios foram realizados em sua
maioria com até 7,5% de etanol e concentração dos substratos de 1 mM.
Figura IV.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Larus
dominicanus, construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos
glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B).
0 2 4 60
200
400
600
800
1000
Vmáx = 774,1
Kmapp= 0,58
Atividade GST em diferentes concentrações de GSH
A)
[GSH] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
200
400
600
800
Vmáx = 829,5
Kmapp= 1,109
Atividade GST em diferentes concentrações de CDNB
B)
[CDNB] (mM)
mU
. m
g p
rote
ína
-1
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 116 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura IV.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Spheniscus
magellanicus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do
ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por
meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.
Cinética enzimática de Spheniscus magellanicus
0 1 2 30
200
400
600
S. magellanicus 1
S. magellanicus 2
S. magellanicus 3
Km= 0,6063
Vmáx= 626,9
Km= 0,9206
Vmáx= 256,6
Km= 0,5933
Vmáx= 294,5
[CDNB]
mU
/mgprt
Cinética enzimática de Spheniscus magellanicus
0 2 4 6 80
200
400
600
800
1000
S. magellanicus 1
S. magellanicus 2
S. magellanicus 3
Km = 0,6542
Vmáx= 918,5
Km= 0,3636
Vmáx= 428,8
Km= 0,5213
Vmáx= 310,6
[GSH]
mU
/mgprt
A
B
Pág. 117 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Além da determinação das condições ideais de ensaios futuros, a presente
padronização permitiu observar que o Vmax das espécies L. dominicanus e S.
magellanicus são similares aos valores de atividade GST quantificados em outras
espécies de aves, marinhas ou não (Tabela IV-5). Tais resultados respaldam a
eficiência das condições padronizadas.
IV.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA
ATIVIDADE ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD)
IV.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
Os ensaios de atividade EROD para padronização em tecido hepático de
Larus dominicanus e Spheniscus magellanicus foram realizados no
espectrofluorímetro SpectraMax® M5 (Molecular Devices®), utilizando microplacas
pretas (Perkin Elmer). Resumidamente, 20 µg de proteína microssomal de cada
amostra foram adicionados por poço, ajustando o volume final para 20 µL com
tampão de microssoma quando necessário, e incubadas com 140 µL de 7-
etoxiresorufina (7-ER) por 10 minutos a 37ºC (WHITE et al., 1994; CHANG,
WAXMAN, 2006; WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK, 2006). Após a incubação,
40 µL de NADPH foram adicionados em cada poço para iniciar a reação. A
determinação da atividade EROD seguiu o método de Burke e Mayer (1994)
adaptado para microplaca.
O par de excitação e emissão (ex/em) foi ajustado para 530nm/585nm com
filtro (cutoff) em 550 nm e fotomultiplicador ligado no máximo (high) para otimizar
a detecção de resorufina. Foram realizadas 20 leituras por poço em cada intervalo
de tempo de 30 s. A reação foi monitorada por 600 s e o coeficiente angular da
reta RFU.min-1 foi utilizado para o cálculo da atividade enzimática.
Uma curva padrão com resorufina foi utilizada para converter a fluorescência
(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em picomoles de
resorufina formada por minuto por massa de proteína (pmol.min-1.mgprt-1), usando
a seguinte fórmula:
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 118 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Atividade EROD = (𝑹𝑭𝑼×𝒎𝒊𝒏−𝟏)×(𝒄𝒐𝒆𝒇.𝒓𝒆𝒔𝒐𝒓𝒖𝒇𝒊𝒏𝒂)
𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂
Na padronização, os parâmetros Vmax (velocidade máxima) e Kmapp
(constante de Michaelis-Menten aparente) para o substrato 7-etoxiresorufina (7-
ER) foram determinados usando uma curva de cinética com concentrações
crescentes de 7-ER. A curva de cinética enzimática foi avaliada por meio de
regressão não linear com as equações de Michaelis-Menten e do modelo de
inibição por substrato (equações abaixo), usando o programa Graphpad Prism 5.
Equação de Michaelis-Menten: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
(𝐾𝑚+[𝑆])
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Km = Km
[S] = concentração do substrato
vo = velocidade inicial
Equação de inibição por substrato: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
𝐾𝑚+([𝑆]×(1+[𝑆]
𝐾𝑖))
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Km = Km
[S] = concentração do substrato
Ki = constante de inibição
vo = velocidade inicial
No caso de inibição de uma enzima pelo substrato, a padronização do
método com concentrações do substrato iguais a 100, 50, 10 ou 5 vezes o Km da
enzima deve ser aplicada com cautela, pois dependendo da concentração do
substrato, o método será padronizado em uma concentração inibitória para a
enzima (BISSWANGER, 2011; 2014).
Um segundo ensaio foi realizado para avaliar os efeitos da concentração da
coenzima NADPH no ensaio. Apesar da similaridade entre os procedimentos, a
padronização para L. dominicanus e S. magellanicus diferiram entre si em alguns
aspectos, conforme explicitado a seguir.
Pág. 119 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Condições de Ensaios da Atividade EROD para Tecido Hepático de
Larus dominicanus
Foram realizados ensaios de atividade EROD com concentração fixa de
NADPH (2 mM) e concentrações crescentes de 7-ER: 0,0039; 0,0078; 0,0156;
0,0312; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2 e 4 µM.
A fim de avaliar o efeito da coenzima NADPH, foram realizadas análises
utilizando uma concentração fixa de 7-ER (2 µM) e concentrações crescentes de
NADPH (1, 2, 4 e 8 mM).
Todos os ensaios foram realizados com a fração microssomal obtida de
apenas uma amostra (R3A002635), coletada pela equipe do LABCAI
imediatamente após a eutanásia do animal.
Condições de ensaios da atividade EROD para tecido hepático de
Spheniscus magellanicus
Os ensaios foram realizados com um ‘pool’ formado por volumes iguais dos
microssomas obtidos das oito amostras homogeneizadas.
A fim de avaliar o efeito da coenzima NADPH, foram realizadas análises
utilizando uma concentração fixa de 7-ER (2 µM) e concentrações crescentes de
NADPH (0,25; 0,5; 1; 2 e 4 mM).
Para a determinação dos parâmetros Vmax e Kmapp para 7-ER foram
realizados ensaios de atividade EROD com concentração fixa de NADPH (1 mM)
e concentrações crescentes de 7-ER: 0,0097; 0,0195; 0,039; 0,078; 0,15; 0,312;
0,625; 1,25; 2,5; 5 e 10 µM.
IV.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para Larus dominicanus, a curva cinética de EROD em função de 7-ER
(Figura IV.5-1) apresentou um Km aparente (Kmapp) de 108,4 nM e Vmax de
30,31 pmol.min-1.mgprt-1. O Kmapp de L. dominicanus está dentro da variação
encontrada para o pinguim Pygoscelis adeliae, de 51 a 109 nM
(WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK, 2006), e para o cormorão Phalacrocorax
carbo, que variou de 82 até 240 nM (KUBOTA, KIM, IWATA, 2009) (Tabela IV-3).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 120 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Wilkinson (1971) recomenda a utilização do substrato em concentrações de
cinco a 10 vezes o Km. Portanto, recomenda-se a utilização de concentrações
mínimas entre 0,5 a 1 µM de 7-ER em futuros ensaios com L. dominicanus. No
entanto, considerando que alguns ensaios EROD utilizam 2 µM de 7-ER (KLOTZ,
STEGEMAN, WALSH, 1984; YAWETZ, WOODIN, STEGEMAN, 1998), optou-se
por usar esta concentração em estudos futuros com L. dominicanus para permitir
comparações com dados da literatura. Esta escolha não causa prejuízo à
determinação do Vmax do ensaio, pois não há diferença na atividade quando
utilizadas concentrações entre 1 µM e 2 µM de 7-ER (Figura IV.5-1A).
Para o ensaio com NADPH, os resultados dos testes evidenciaram uma
inibição da deetilação da 7-ER proporcional à concentração utilizada da coenzima
(Figura IV.5-1B). Logo, o ensaio deverá ser realizado em baixas concentrações
de NADPH, apenas para garantir que haverá equivalentes redutores suficientes
para a redução do citocromo P450 (HANNEMANN et al., 2007).
Portanto, para futuros ensaios com L. dominicanus, serão adotadas as
seguintes condições:
* 10 µg de proteína microssomal em tampão Tris/NaCl (50 mM/0,1M, pH 7,4)
* 2 µM de 7-ER
* 1 mM de NADPH
* Temperatura de 37ºC
Para Spheniscus magellanicus, os resultados mostraram uma menor
atividade EROD nas concentrações de 0,25 mM, 0,5 mM e 4 mM de NADPH
(Figura IV.5-2A). Dessa forma, concentrações entre 1 e 2 mM de NADPH
mostraram-se mais adequadas para este ensaio, garantindo que haja
equivalentes redutores suficientes para redução do citocromo P450
(HANNEMANN et al., 2007).
Pág. 121 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Figura IV.5-1 - Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Larus
dominicanus construídas com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-
etoxiresorufina (7-ER) (A), sendo Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não
linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. Inibição da deetilação de 7-
ER em concentrações crescentes de NADPH (B).
A curva cinética de EROD em função de 7-ER (Figura IV.5-2 B) foi ajustada
ao modelo de inibição por substrato e apresentou um Km aparente (Kmapp) de
1,3 µM e Vmax de 7,4 pmol.min-1.mgprt-1. O Kmapp de S. magellanicus também
está acima da faixa encontrada para os pinguins P. adeliae e P. carbo
(WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK, 2006; KUBOTA, KIM, IWATA, 2009).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00
10
20
30
Vmáx = 30,31
Kmapp= 0,1084
Curva cinética ERODA
[ER] (M)
pm
ol.
min
-1.
mg
pro
tein
a-1
Atividade EROD - L. dominicanus
1mM
2mM
4mM
8mM
0
5
10
15
201mM
2mM
4mM
8mM
B
[NADPH] (mM)
pm
ol.
min
-1.
mg
pro
tein
a-1
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 122 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
É importante ressaltar que os Kms dos artigos supracitados foram ajustados
com base no modelo clássico de Michaelis-Menten, diferentemente do Km de S.
magellanicus,que se ajustou melhor a um perfil cinético de inibição por substrato
(p<0,0001) (Figura IV.5-2).
Embora o modelo de Michaelis-Menten seja amplamente utilizado, modelos
de inibição por substrato já foram aplicados a diversos membros da família dos
citocromos P450 e foram, inclusive, encontrados na padronização de atividade
EROD em tecido hepático de cetáceos (vide seção III.5 deste relatório).
Para enzimas ajustadas ao modelo de Michaelis-Menten, a concentração de
substrato sugerida é de cinco a 10 vezes o Km (WILKINSON, 1971). No entanto,
esta extrapolação não é aplicável a modelos de inibição pelo substrato.
Pág. 123 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Figura IV.5-2 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD,
dados relativizados pela atividade média da concentração de 2 mM. B. Curva cinética de
atividade EROD em tecido hepático de Spheniscus magellanicus construída com
concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo
Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo
de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de 95%.
‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo programa é o
Vmax estimado na ausência de inibição por substrato.
0 2 4 6 8 100
2
4
6
Vmáx = 7,4 0,47
Kmapp= 1,3 0,14
Ki = 13,54 2,40
Atividade EROD em diferentes concentrações de 7-ER
[7-ER] (M)
pm
ol.
min
-1.
mg
pro
tein
a-1
0 5 10 15 20 25 30 350
1
2
3
4
5
[V/Substrato]
V
Atividade EROD - S. magellanicus
0,25
mM
0,5
mM
1 m
M
2 m
M
4 m
M
0
50
100
150
[NADPH] (mM)
% d
e a
tiv
ida
de
em
re
laç
ão
à m
éd
ia d
e 2
mM
A
B
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 124 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Stromme e Theodorsen (1976) propuseram a utilização de gráficos duplo-
recíprocos de Lineweaver-Burk para linearização dos dados enzimáticos de γ-
glutamil transferase, facilitando a identificação do ponto no eixo X, referente à
concentração do 1/[substrato], em que a relação 1/[substrato] versus1/V inverte-
se, ou seja, o momento no qual o incremento de substrato reflete em um
decréscimo da atividade enzimática.
Assim como gráficos duplo-recíprocos, o gráfico linearizado de Eadie-Hofstee
construído para curva cinética de EROD na ave S. magellanicus (Figura IV.5-2 -
‘inset’) permitiu identificar que a inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorre
quando concentração V/[7-ER] é próxima de 0,92, referente ao ponto de 5 µM de
7-ER. Tendo em vista o exposto, sugere-se o uso de concentrações de 7-ER
abaixo de 5 µM para o ensaio EROD em tecido hepático de ave S. magellanicus.
Com base nos resultados obtidos, as condições para o ensaio EROD em
fígado de S. magellanicus são:
* 20 µg de proteína microssomal em tampão Tris/NaCl (50 mM/0,1M, pH 7,4)
* 4 µM de 7-ER
* 1 mM de NADPH
* Temperatura de 37ºC
A Vmax de L. dominicanus e S. magellanicus encontrou-se abaixo dos valores
observados para outras espécies de aves marinhas, embora similares ao Vmax
observado para espécies próximas evolutivamente, como Larus argentatus e P.
adeliae (Tabela IV-6, apresentada na seção IV-9).
IV.6 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS
AMOSTRAS PARA O ENSAIO DE GST
IV.6.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
Para avaliar a estabilidade temporal da atividade GST foram utilizadas aves
que seriam mortas por eutanásia. Assim, foram realizados ensaios com amostras
de tecido hepático obtidas no momento da eutanásia (tempo 0) e 1, 2, 3, 6, 12, 18
e 24 horas após a morte de dois indivíduos de Larus dominicanus.
Pág. 125 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
As amostras utilizadas foram coletadas pela equipe do LABCAI juntamente
com a equipe da R3 Animal, integrante do PMP-BS. Os espécimes amostrados
foram submetidos à reabilitação no Centro de Reabilitação e Despetrolização de
Florianópolis e, posteriormente, foram eutanasiados. Tendo em vista que estes
ensaios visam apenas avaliar a degradação enzimática ao longo do tempo, e não
necessariamente o valor per se da atividade quando comparada a outros animais,
foi possível utilizar animais submetidos à reabilitação. Estes organismos, no
entanto, não devem ser utilizados para fins de emissão de laudos, uma vez que
os medicamentos utilizados durante a reabilitação podem alterar o valor de
atividades enzimáticas, transcrição de genes e expressão proteica. As
informações sobre os dois espécimes seguem abaixo:
Tabela IV - 2 - Identificação e sumário de informações médicas e de admissão referentes
às aves amostradas para verificação de estabilidade de biomarcadores bioquímicos e
moleculares post mortem.
ID1 ID2
Espécie Larus dominicanus Larus dominicanus
Número SIMBA 2752 3018
Número FAI R3A002635 R3A002712
Data de admissão 22-12-2016 10-02-2017
Data de eutanásia 24-02-2017 24-02-2017
Sexo Indeterminado Indeterminado
Medicamentos administrados
Mercepton; Glicopan; Metronidazol; Drontal; Baytril; Eutanásia: Quetamina + Xilazina + Acepram + MPA + KCl
Glicopan; Clindamicina; Tronadol; Meloxicam; Euntanásia: Quetamina + Xilazina + Acepram + MPA + KCl
A homogeneização e quantificação de proteínas seguiu os métodos relatados
nas seções IV.2 e IV.3.
Os ensaios foram realizados em duplicata e em condições ótimas conforme
descrito na seção IV.4. Brevemente, o substrato GSH a 2,5 mM foi incubado com
a fração citosólica das amostras por 5 minutos a 37ºC. Após a incubação, foi
adicionado CDNB na concentração de 2,5 mM, e a formação do produto GS-DNB
foi acompanhada durante 5 minutos em 340 nm no espectrofotômetro
(SpectraMax® M5, Molecular Devices®). Os dados de atividade GST em relação
ao tempo post mortem foram analisados por meio de regressão linear, usando o
programa Graphpad Prism 5.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 126 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
IV.6.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao realizar o teste da estabilidade temporal de GST, a hipótese inicial é que
existiria uma diminuição na atividade GST dependente do tempo post mortem das
aves. Essa hipótese está fundamentada no processo de decomposição natural do
animal, que promove a degradação das proteínas dos tecidos biológicos,
destruindo sua atividade enzimática e função biológica (BENJAKUL et al., 1997;
KEMP, KÜLTZ, 2012; POLOZ, O’DAY, 2009). No entanto, não foi observado um
padrão consistente de diminuição de atividade GST ao longo do tempo post
mortem para os dois espécimes de L. dominicanus (Indivíduo 1: r²=0,012;
Indivíduo 2: r²=0,051).
A atividade GST se manteve estável ao longo do tempo para o espécime 1
(código R3A002635), ou seja, não houve padrão de diminuição ao longo do
tempo. A atividade GST no espécime 2 (código R3A002712) após 1 e 2 horas
post mortem foi menor que a atividade GST nos demais tempos de coleta, mas
não houve padrão de diminuição da atividade GST ao longo do tempo de
teste (Figura IV.6-1). É importante mencionar que estes dados se referem a
apenas dois indivíduos. Até o momento, não foram possíveis análises em mais
indivíduos desta espécie. No entanto, este padrão foi observado em espécimens
de tartaruga C. mydas, reforçando a estabilidade de GST post mortem. Análises
com mais indivíduos podem ser feitas ao longo do trabalho.
Pág. 127 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Figura IV.6-1 - Atividade GST (mU*mgprt-1) post mortem em tecido hepático de Larus
dominicanus em diferentes tempos de decomposição. Pontos representam médias de
duplicatas técnicas*.
* Réplicas técnicas são repetições de análises de um mesmo organismo (amostra
biológica) realizadas durante um ensaio. As réplicas técnicas podem ser usadas para
avaliar a repetibilidade do método.
O presente resultado suporta a realização do ensaio de atividade GST em
tecido hepático de L. dominicanus em código 2 de decomposição. No entanto,
vale ressaltar que o presente ensaio foi realizado com amostras em
decomposição em condições de laboratório. Possivelmente em condições de
campo, variáveis como temperatura, incidência solar, umidade, salinidade, dentre
outras, podem influenciar na qualidade da amostra e acelerar o processo de
decomposição tecidual, e consequentemente, de degradação proteica. Tendo em
vista estas limitações, serão priorizados dentre os organismos coletados, os mais
frescos possíveis, para a emissão de laudos, conforme informações
disponibilizadas no SIMBA.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 128 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
IV.7 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS
AMOSTRAS PARA O ENSAIO DE EROD
IV.7.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
Além da determinação da estabilidade temporal para ensaio GST, as
amostras de L. dominicanus coletadas também foram utilizadas para determinar a
estabilidade temporal da atividade EROD.
Para tal foi realizado o ensaio de atividade EROD com amostras de tecido
hepático obtidas no momento da eutanásia (tempo 0) e 1, 2, 3, 6, 12, 18 e 24
horas após a morte.
O ensaio EROD foi realizado no espectrofluorímetro SpectraMax® M5
(Molecular Devices®) utilizando microplacas pretas (Perkin Elmer®), conforme
condições ótimas já estabelecidas para a espécie. Resumidamente, o ensaio foi
realizado em tampão TRIS/NaCl 50 mM/0,1 M (pH 7,4), a 37ºC, com
concentrações finais de 2 μM de 7-ER e 1 mM de NADPH. O par de excitação e
emissão (ex/em) foi ajustado para 530nm/585nm com filtro (cutoff) em 550 nm e
fotomultiplicador ligado no máximo (high) para otimizar a detecção de resorufina,
produto da reação. Foram realizadas 20 leituras por poço em cada intervalo
temporal de 30 segundos. A reação foi monitorada por 600 segundos e o
coeficiente angular da reta RFU/min foi utilizado para o cálculo da atividade
enzimática.
Uma curva padrão com resorufina foi utilizada para converter a fluorescência
(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em fentomoles de
resorufina formada por minuto por mg de proteína (fmol.min-1.mgprt-1), utilizando-
se a seguinte fórmula:
Atividade EROD = (𝑹𝑭𝑼×𝒎𝒊𝒏−𝟏)×(𝒄𝒐𝒆𝒇.𝒓𝒆𝒔𝒐𝒓𝒖𝒇𝒊𝒏𝒂)
𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 *1000
Pág. 129 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
IV.7.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a morte, as células dos organismos aeróbios consomem todo o oxigênio
molecular e iniciam o metabolismo fermentativo, que é insuficiente para manter a
concentração de ATP (trifosfato de adenosina) em níveis normais. A baixa
quantidade de energia química, na forma de ATP, é insuficiente para manter o
funcionamento das bombas de membranas. Concomitantemente, a fermentação
láctica provoca a queda do pH intracelular. Esses fenômenos provocam a
desestabilização das membranas dos lisossomos, seguido de extravasamento
das enzimas lisossomais, resultando na ativação de enzimas proteolíticas que
degradam os componentes intracelulares, como as enzimas microssomais
(BUTZBACH, 2010). Portanto, a determinação da estabilidade temporal de uma
enzima microssomal é de suma importância para garantir a interpretação dos
resultados obtidos.
Liukkonen-Anttila e colaboradores (2003) observaram uma diminuição de
34% na atividade EROD em fígado de perdiz-cinzenta (Perdix perdix) após 30
minutos post-mortem, e recomendam a padronização do tempo de coleta do
tecido para avaliação da atividade EROD. Similarmente, em fígado de ratos, a
quantidade de citocromo P450 diminuiu 90% e a atividade de algumas isoformas
do citocromo P450 diminuiu entre 75 e 98% após 48 horas post-mortem
(YAMAZAKI; WAKASUGI, 1994). Estes resultados mostram que a diminuição da
atividade enzimática do citocromo P450 post-mortem é comum nos organismos
aeróbios.
Neste estudo, a atividade EROD (Figura IV.7-1) diminuiu ao longo do tempo
no fígado da ave L. dominicanus. O padrão de diminuição da atividade se ajustou
a uma curva de decaimento exponencial com tempo de meia vida de 2,8 e 5,2
horas para os espécimes L. dominicanus 1 e 2, respectivamente. Portanto, o
tempo post-mortem é uma variável importante a ser considerada nas análises de
atividade EROD de animais coletados no PMP-BS. De acordo com estes
resultados, é importante considerar a possibilidade de que futuras análises de
algumas amostras do PMP apresentem pouca ou nenhuma atividade EROD
devido ao estágio de decomposição (tempo post mortem).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 130 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura IV.7-1 - Estabilidade da atividade EROD em tecido hepático de aves Larus
dominicanus: indivíduos 1 e 2. A atividade foi apresentada como porcentagem em relação
ao T0 (momento da morte do animal). *Atividade não detectada em L. dominicanus 2
após 24 horas. O ajuste dos dados de ambos os espécimes à equação exponencial de
decaimento apresentou r2 = 0,98. O tempo de meia vida de L. dominicanus 1 e L.
dominicanus 2 foi de 2,8 e 5,2 horas, respectivamente.
Os dados apresentados na Figura IV.7-1 demonstram, ainda, uma
variabilidade interindividual para a estabilidade da enzima post mortem. Estes
resultados podem ser decorrentes de variações biológicas existentes entre L.
dominicanus 1 e 2. Adicionalmente, os animais analisados não foram submetidos
ao mesmo tratamento veterinário. De acordo com os dados apresentados na
Tabela IV-2, tanto os medicamentos administrados como a duração dos
tratamentos diferiram entre os espécimes. A consequência desta variação de
protocolos de tratamento veterinários nas atividades enzimáticas obtidas neste
trabalho permanece desconhecida. Por fim, deve-se considerar que, em trabalhos
de campo similares ao PMP-BS, fatores como causa mortis (predação, patógenos
e/ou contaminação) e condições ambientais (temperatura, umidade, presença de
perfurações na pele ou carcaça, dentre outros) durante a decomposição da
carcaça do animal também podem exercer alguma influência sobre a atividade
enzimática nos tecidos dos animais analisados.
Corroborando os resultados apresentados neste relatório, Espín et al. (2016)
concluíram em sua revisão que amostras de tecido hepático devem ser coletadas
imediatamente após a morte do animal:
EROD de L. dominicanus post mortem
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240
20
40
60
80
100
120Larus dominicanus 1
Larus dominicanus 2
*
Larus dominicanus 1
r2 = 0,98
Meia vida = 2,8 horas
Larus dominicanus 2
r2 = 0,98
Meia vida = 5,2 horas
Tempo (h)
Po
rce
nta
ge
m e
m r
ela
çã
o a
o T
0
Pág. 131 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
“Em nossa revisão de 249 estudos europeus, 111 analisaram tecidos
internos e o fígado foi de longe o órgão mais comumente analisado (98 estudos,
Tabela 2). Em alguns casos, tecidos internos são coletados especificamente
para a determinação de biomarcadores de efeito (Mateo et al., 2003; Rainio et
al., 2012) mas estes são instáveis, devem ser medidos ou conservados
imediatamente após a biópsia ou morte (Mateo et al., 2003; Rainio et al., 2012) e
não podem ser medidos em tecidos de carcaças encontradas no campo algum
tempo após a morte” (transcrito do original com tradução livre e negrito pela equipe
do LABCAI).
Portanto, é necessária uma padronização eficaz, tanto do ensaio EROD,
quanto do procedimento de coleta e armazenamento da amostra. Se esta etapa
não for adequadamente realizada, haverá comprometimento das análises
estatísticas subsequentes e das possíveis conclusões do estudo. A partir dos
dados gerados nessa etapa de padronização da determinação da atividade EROD
em amostras hepáticas de aves, recomenda-se que as mesmas sejam coletadas
em até 30 minutos post mortem para viabilizar as análises bioquímicas e
estatísticas de atividade EROD. É importante ressaltar que a escolha desse
tempo de coleta post mortem é relativa, variando conforme a espécie,
biomarcador/enzima alvo, causa mortis e condições de decomposição. O ideal é
coletar amostras frescas, obtidas imediatamente após a morte do animal.
Qualquer tempo de coleta superior à coleta imediata implicará em: um grande
risco de perda de qualidade da amostra e possível enviesamento dos resultados
nas análises estatísticas. O enviesamento de dados dificultará ou impossibilitará a
interpretação e obtenção de conclusões robustas sobre a relação entre os dados
de determinados biomarcadores e os resultados de concentração contaminantes.
Em suma, a padronização do ensaio EROD na ave L. dominicanus neste
relatório mostrou claramente o efeito do tempo post mortem (grau de
decomposição do animal) na atividade EROD, ao contrário do resultado
observado para atividade da enzima GST.
Essa diferença entre as enzimas poderia também estar associada a
composição de aminoácidos na extremidade amino-terminal destas enzimas, que
influencia na estabilidade biológica destas biomoléculas. Bachmair et al. (1986)
mostraram que variações na composição de aminoácidos, com resíduos de
metionina, serina, alanina, treonina, valina e glicina, na extremidade amino-
terminal da enzima β-galactosidase da levedura Saccharomyces cerevisiae
apresentaram valores de meia-vida que variaram de 3 minutos a 20 horas,
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 132 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
quando comparados com outros resíduos de aminoácidos, como prolina, arginina
e tirosina. Entretanto, estudos adicionais seriam necessários para avaliar esta
hipótese.
IV.8 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA AVES
As condições otimizadas para realização de futuros ensaios com tecido de
aves marinhas encontram-se sumarizadas nas tabelas abaixo. Todas as
condições ora apresentadas foram determinadas com base nos ensaios
realizados durante a etapa de padronização de biomarcadores bioquímicos do
presente projeto.
Tabela IV-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-
transferase (GST) com amostras de aves.
Espécie Atividade GST
Tampão [GSH]
mM [CDNB]
mM Temperatura Tecido
Condições de
preservação
Spheniscus magellanicus
Fosfato de potássio (0,1 M,
pH 7,0) 2,5 2,5 37 °C Fígado
Freezer -80 °C
Larus dominicanus
Fosfato de potássio (0,1 M,
pH 7,0) 2,5 2,5 37 °C Fígado
Freezer -80 °C
Tabela IV-4 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-
O-deetilase (EROD) com amostras de aves.
Espécie Atividade EROD
Tampão [7-ER]
µM [NADPH]
mM Temperatura Tecido
Condições de preservação
Spheniscus magellanicus
TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4)
4 1 37 °C Fígado Freezer -80 °C
Larus dominicanus
TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4)
2 1 37 °C Fígado Freezer -80 °C
Pág. 133 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
IV.9 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM AVES:
COMPARAÇÃO COM OS DADOS DA LITERATURA
As tabelas comparativas apresentadas abaixo permitem observar que as
atividades GST e EROD padronizadas em fígado de aves marinhas no âmbito do
projeto PMP-BS são similares àquelas observadas em matrizes teciduais de
outras espécies de aves. Os resultados obtidos respaldam a otimização dos
ensaios realizados neste estudo, no que se refere às condições de concentração
de substratos e temperatura dos mesmos.
Especialmente para atividade EROD, os ensaios realizados permitiram obter
dados relacionados às concentrações potencialmente inibitórias do substrato 7-
ER, que variam significativamente entre grupos animais. Esse é um resultado de
extrema relevância, tendo em vista que concentrações elevadas de 7-ER
podem inibir a atividade EROD de aves marinhas, interferindo diretamente
na quantificação precisa da atividade enzimática.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 134 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela IV-5 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na
literatura para aves.
ESPÉCIE MATRIZ TECIDUAL
ORIGEM DA
AMOSTRA
CONDIÇÃO DA
AMOSTRA
TRATAMENTO [GSH] (mM)
[CDNB] (mM)
TEMPERATURA DE ENSAIO
Km (μM) VMÁX (mU*mgprt-1)
REFERÊNCIA
Larus dominicanus
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,011 - 6 0,125 - 2,5
37 °C GSH: 580 CDNB: 1109
GSH: 774,1 CDNB: 829,5
Presente trabalho
Larus Argentatus
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 30 3 - - 755,9±122,7 Ruus et al., 2002
Larus atricilla Fígado Necrópsia Fresca MERCÚRIO (μg/g): 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6
- - - - 370-460 Jenko et al., 2012
Spheniscus magellanicus
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,011 - 6 0,125 - 2,5
37 °C GSH: 363,6 – 654,2 CDNB: 593,3 – 920,6
GSH: 310,6 – 918,5 CDNB: 256,6 – 626,9
Presente trabalho
Gallus gallus domesticus
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 100 100 37 °C - Não infectadas: 184,2 ± 29,7, Infectadas: 206,8 ± 33,4
Biazus et al., 2017
Bursa de Fabricius
Necrópsia Fresca NA2SEO3; (CH3COO)2PB
kit kit - - Controle: 29000 a 33000; Se: 31000 a 35000; Pb: 14000 a 18000; Se/Pb: 21000 a 22000
Jiao et al., 2017
Pág. 135 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Cobb500 (Gallus gallus)
Plasma Biópsia Fresca ÓLEO DE UVA kit kit - - Controle: 8,11 Tratados: 9,67 a 10,54
Abu Hafsa et al., 2017
Milvus migrans
Pele Biópsia Fresca NÃO 12 - - - ~2±1 Abbasi et al., 2017
Athene brama Fígado Biópsia Fresca NÃO 12 - - - ~4±2,5 Abbasi et al., 2017
Ficedula hypoleuca
Plasma Biópsia Fresca NÃO kit kit - - Poluído: Ca-sup: 3,5±1,1 Controle:4,1±1,8 Não poluído: Ca-sup: 3,7±1,6 Controle: 2,8±1,4
Espín et al., 2017
Meleagris sp. Fígado Necrópsia Fresca Não 0,002 a 1
0,0025 a 1,25
0 – 70 °C GSH:0,154 CDNB: 0,380
CDNB: 2125 GSH: 1803 (mU/mL)
Akkemiket al., 2012
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 136 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela IV-6 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na
literatura para aves.
ESPÉCIE MATRIZ TECIDUAL
ORIGEM DA AMOSTRA
CONDIÇÃO DA AMOSTRA
TRATAMENTO [7-ER] (μM)
[NADPH] (mM)
TEMPERATURA DE ENSAIO
Km (μM)
VMÁX (pmol.mgprt-1. min-1)
REFERÊNCIA
Larus dominicanus
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - Controle: 70,1 Tratado: 1550
Numata et al., 2008
Fígado Necrópsia Imediatamente após a morte (tempo zero)
SIM 0,0039 - 4
1 - 8 37 °C 0,11 30,31 Presente trabalho
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,0039 - 4
1 - 8 37 °C - 40 Presente trabalho
Larus argentatus
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 10 50 30°C - Resultado em log de pmol
Routti et al., 2013
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 10 1 25 ou 37 °C - 10 – 180 Kennedy et al., 2003
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 500 10 25 °C - 181,6±75 Ruus et al., 2002
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - Diferentes regiões: 1) 11,4–118,3 2) 52,9–217,5 3) 173–616 4) 21–208 5) 38,5–391 6) 92,1–194 7) 4,5–205 8) 122–376 9) 209–483 10) 180–501 11) 165–1077 12) 198–470 13) 58–295 14) 87–184
Fox et al., 2005
Pág. 137 / 203
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
para Aves
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
15) 199–849 16) 69–427 17) 14–237
Phalacrocorax brasilianus
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - - Presente trabalho
Phalactrocorax carbo
Fígado Necrópsia Fresca NÃO
1,5 0,6 nM 42 °C - Machos: 171±139 Fêmeas: 127±133
Guruge et al., 1997
Puffinus puffinus
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - 13 Presente trabalho
Spheniscus magellanicus
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - 0,9 Presente trabalho
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 4 1 37 °C 1,3±0,14
7,4±0,47 Presente trabalho
Pygoscelis adeliae
Fígado Necrópsia 30 min post mortem
NÃO - - - - ~10 Focardi et al., 1992
Fígado Necrópsia Fresca NÃO - 1 37 °C Km1 (nM) 51±109: 0.2–358 Km2 (nM) 872±703: 303–2450
Vmax1: 1,8±1,4 Vmax2: 9,6±3,7
Wanwimolruk, Wanwimolruk, 2006
Sterna hirundo Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - - Presente trabalho
Sula leucogaster
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - 9 Presente trabalho
Tadorna variegata
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - Controle: 16,2 Tratado: 1430
Numata et al., 2008
Catharacta maccormicki
Fígado Necrópsia 30 min post mortem
NÃO - - - - ~120 Focardi et al., 1992
Diomedea Fígado Necrópsia 2-6 horas post NÃO 0,9 150 37 °C - 21 Boon et al.,
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IV. Padronização de
Técnicas de Biomarcadores
bioquímicos para Aves
Pág. 138 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
immutabilis mortem 1998 Histrionicus histrionicus
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 2 50 - - Com óleo: 204,6 Sem óleo: 70,7
Trust et al., 2000
Bucephala islandica
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 2 50 - - Com óleo: 94,3 Sem óleo: 49,5
Trust et al., 2000
Tachycineta bicolor
Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - NW: 52,6±7,4 HL: 44,8±7,0 DP: 26,7±4,6 PC: 28,5±2,5
Smits et al., 2000
Alle alle Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.
37 °C - 36,9±3,2 Borga et al., 2005
Uria lomvia Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.
37 °C - 8,2±1,5 Borga et al., 2005
Cepphus grylle Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.
37 °C - 10,1±0,7 Borga et al., 2005
Rissa tridactyla Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.
37 °C - 12±1,4 Borga et al., 2005
Perdix perdix Fígado Necrópsia Fresca
NÃO 0,25 0,25 37 °C - Selvagem: 13,06±2,87 Domésticos: 14,34±2,19
Liukkonen-Anttila et al., 2003
Tetrao urogallus Fígado Necrópsia Fresca
NÃO 0,25 0,25 37 °C - Selvagem: 4,38±1,79 Domésticos: 19,13±2,28
Liukkonen-Anttila et al., 2003
Phasianus colchicus
Fígado Necrópsia Fresca
NÃO 0,25 0,25 37 °C - Selvagem: 82,30±32,86 Domésticos: 50,59±8,75
Liukkonen-Anttila et al., 2003
Coturnix coturnix japonica
Fígado Necrópsia Fresca
NÃO 0,25 0,25 37 °C - Domésticos: 7,33±1,24
Liukkonen-Anttila et al., 2003
Columba livia Fígado Necrópsia Fresca
NÃO 0,25 0,25 37 °C - Domésticos: 15,11±1,43
Liukkonen-Anttila et al., 2003
Pág. 139 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
V – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS
V.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS
Para a padronização de técnicas para análise de biomarcadores bioquímicos
em quelônios foram utilizadas amostras de fígado de dezessete espécimes de
Chelonia mydas. As amostras foram coletadas por equipes constituintes de bases
integrantes do PMP-BS.
Informações sobre as amostras utilizadas são apresentadas na Tabela V-1.
Tabela V-1 - Identificação dos espécimes de quelônios provenientes do PMP-BS cujas amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST) e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).
Número do espécime
testado
Identificação
no SIMBA
Tecido biológico
utilizado
Código de decomposição
da carcaça
Chelonia mydas (SN8) 018575 Hepático 2
Chelonia mydas (3) 44151 Hepático 2
Chelonia mydas (4) 30382 Hepático 2
Chelonia mydas (5) 37415 Hepático 2
Chelonia mydas (6) 40510 Hepático 2
Chelonia mydas (7) 35965 Hepático 2
Chelonia mydas (8) 34320 Hepático 2
Chelonia mydas (9) 45260 Hepático 2
Chelonia mydas (10) 42656 Hepático 2
Chelonia mydas (11) 34449 Hepático 2
Chelonia mydas (12) 34297 Hepático 2
Chelonia mydas (13) 35955 Hepático 2
Chelonia mydas (14) 34311 Hepático 2
Chelonia mydas (15) 35949 Hepático 2
Chelonia mydas (16) 45409 Hepático 2
Chelonia mydas (17) 30497 Hepático 2
V.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
Para a homogeneização das amostras de tecido hepático de quelônios,
aproximadamente 150 mg de cada amostra foram homogeneizados em cinco
vezes o volume de tampão de homogeneização Tris-HCl (50 mM Tris-HCl pH
7,4), contendo 150 mM KCl, 1 mM DTT e 0,5 mM do inibidor de proteases PMSF.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 140 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Os tecidos foram homogeneizados com o homogeneizador TissueTearorTM
(BiospecTM). Durante todo o procedimento, as amostras foram mantidas sobre o
gelo.
O homogeneizado foi centrifugado a 9.000 xg por 30 minutos a 4°C, obtendo-
se, assim, a fração citosólica, denominada fração S9. Para a obtenção da fração
microssomal, que corresponde à membrana do retículo endoplasmático, foi
realizada uma segunda centrifugação da fração S9 a 100.000 xg por 60 minutos a
4°C com a ultracentrífuga Hitachi CP100WX. A fração sobrenadante resultante foi
acondicionada em novo microtubo e armazenada em freezer -80°C e a fração
microssomal foi ressuspendida em tampão Tris-HCl (0,1 M, pH 7,4), contendo
1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 M KCl e glicerol 20%. A fração microssomal foi
armazenada em freezer -80°C.
A fração sobrenadante foi utilizada para as etapas subsequentes de
quantificação de proteínas totais citosólicas e padronização da atividade GST,
enquanto a fração microssomal foi utilizada para a determinação de proteínas
totais microssomais e padronização da atividade EROD.
V.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS
A determinação de proteínas citosólicas e microssomais das amostras foi
realizada por meio do método de Bradford (BRADFORD, 1976). O método utiliza
o corante Coomassie Brilliant Blue (G-250), que reage com os aminoácidos das
proteínas, mostrando uma coloração que varia do tom marrom para o azulado. A
coloração da amostra varia de acordo com a massa de proteínas.
A determinação de proteínas totais foi realizada com o kit Bio-Rad Protein
Assay® (Bio-Rad®) de acordo com instruções do fabricante. Em uma microplaca
com 96 poços foram adicionados, em duplicata, 2,5 ou 5 µL de cada amostra,
diluída em tampão de homogeneização quando necessário, e 200 µL do reagente
de Bradford filtrado. Após incubação de cinco minutos, foi realizada uma leitura
simples das amostras a 595 nm utilizando o espectrofotômetro de placas
SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). As absorbâncias das amostras foram
comparadas a uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA) produzida no
Pág. 141 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
mesmo ensaio das amostras. A concentração de proteínas totais nas amostras foi
expressa em mg.mL-1.
V.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA
ATIVIDADE GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST)
V.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
A determinação da atividade GST foi realizada de acordo com o método
descrito por Keen, Habig e Jakoby (1976) e modificado para espectrofotômetro de
microplaca. O princípio do método está baseado na reação de conjugação do
tripeptídeo γ-glutamil-cisteinil-glicina (GSH) com o substrato hidrofóbico 1-cloro-
dinitrobenzeno (CDNB). Essa reação é catalisada pelas enzimas glutationas S-
transferases (GSTs). Após a reação, o conjugado GS-DNB é detectado no
comprimento de onda de 340nm em espectrofotômetro.
No intuito de determinar as condições do ensaio GST para tecido hepático de
quelônios foram construídas duas curvas de cinética enzimática para GST para a
espécie Chelonia mydas. O espécime utilizado foi C. mydas SN8 (Tabela V-1). As
curvas cinéticas foram utilizadas para determinar os parâmetros cinéticos de
velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis-Menten aparente (Kmapp)
para os substratos CDNB e GSH.
Para os ensaios de determinação das condições de ensaio da atividade da
enzima GST para tecido hepático de C. mydas foram realizados ensaios com
concentração fixa de GSH (2,5 mM), concentrações crescentes de CDNB de
0,125; 0,156; 0,25; 0,312; 0,500; 0,625; 1; 1,25; 2 e 2,5 mM, e concentração final
de etanol de 7,5%, a fim de possibilitar a utilização de concentrações mais
elevadas de CDNB. Uma segunda curva de cinética enzimática de GST foi
construída, utilizando-se uma concentração fixa de CDNB de 2,5 mM e
concentrações crescentes de GSH de 0,011; 0,023; 0,046; 0,093; 0,187; 0,375;
0,75; 1,5; 3 e 6 mM. A concentração final de etanol no ensaio foi de 7,5%.
A atividade GST foi calculada com a fórmula:
𝑚𝑈.𝑚𝑔𝑝𝑟𝑡−1 = (milli𝐴𝑏𝑠.𝑚𝑖𝑛) × (𝑉𝑜𝑙. 𝑡𝑜𝑡𝑎l)/(𝑉𝑜𝑙. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) × (𝑚𝑔. 𝑝𝑟𝑡) × 𝜀
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 142 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Onde,
mU.mgprt-1 = atividade GST
milliAbs.min = taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1)
Vol.total = volume total da reação
Vol.amostra = volume da amostra
mg.prt = concentração de proteína em mg.mL-1
ε = coeficiente de extinção molar
Para obtenção do Kmapp e Vmax, ambas as curvas de cinética enzimática
foram submetidas à regressão não linear, com a equação hiperbólica de
Michaelis-Menten, por meio do programa Graphpad Prism 5.
Vmax é compreendida como a velocidade máxima da enzima nas condições
de total saturação da enzima pelo substrato (> 100 vezes o Km). Já Kmapp, a
constante de Michaelis-Menten, expressa a concentração de substrato na qual a
velocidade da reação corresponde à metade da velocidade máxima. Esses
parâmetros são importantes para padronização do ensaio GST em cada espécie
de tetrápode.
As curvas de cinética enzimática foram ajustadas ao modelo hiperbólico de
Michaelis-Menten (equação abaixo), utlizando o software Graphpad Prism 5.0®:
Equação: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
(𝐾𝑚+[𝑆])
Onde, Vmax = velocidade máxima Km = Km [S] = concentração do substrato vo = velocidade inicial
V.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Concentrações ótimas para o ensaio enzimático podem ser estimadas a partir
dos Km aparentes obtidos para ambas as curvas cinéticas. Wilkinson (1971)
Pág. 143 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
recomenda que para o estabelecimento de condições de ensaio enzimático o
substrato seja utilizado em concentrações de cinco a 10 vezes o Km. Com base
nessas diretrizes, o substrato GSH deveria ser utilizado em concentrações de
3,15 a 6,3 mM, enquanto CDNB deveria ser utilizado em concentrações entre 8,8
e 17,6 mM (Figura V.4-1).
No entanto, a concentração final de etanol necessária para solubilizar a
concentração requerida de CDNB (de 8,5 a 19 mM) seria maior que 10% de
etanol. Estas concentrações de álcool são muito discrepantes dos 5% de etanol
utilizado nos ensaios de Keen, Habig e Jakoby (1976) e Habig e Jakoby (1981).
Habig e Jakoby (1981) recomendam o uso da menor quantidade possível de
etanol, pois esse álcool pode inibir as reações enzimáticas. A escolha das
concentrações de GSH e CDNB, de 2,5 mM e 2,5 mM, respectivamente, foi
realizada de forma a otimizar as condições do ensaio, maximizando a atividade
GST, em concentrações de etanol que permitissem a solubilização do CDNB, e
não inibissem as reações enzimáticas. A escolha dessas concentrações permitirá
a comparação dos resultados obtidos com os dados encontrados na literatura,
cujos ensaios foram realizados em sua maioria com até 7,5% de etanol e
concentração dos substratos de 1 mM (vide Tabela V-4, apresentada na seção
V.7). Em relação aos ensaios descritos na literatura, a padronização realizada
neste trabalho tem a vantagem de utilizar concentrações de GSH apropriadas
especificamente à atividade GST em tecido hepático de C. mydas, conforme
determinado pelo Kmapp. A observação desta particularidade garante que os
ensaios sejam realizados em condições saturantes, ou seja, que as
concentrações de GSH não atuem como fator limitante à atividade enzimática.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 144 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura V.4-1 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Chelonia mydas construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 30°C. Km aparente e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.
Desta forma, os futuros ensaios de atividade GST em tecido hepático de C.
mydas deverão ser realizados nas seguintes condições:
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0)
2,5 mM de GSH
Cinética enzimática de Chelonia mydas
0 2 4 6 80
1000
2000
3000
C. mydas SN8
Km= 0,6295
Vmáx= 2736
[GSH]
mU
/mg
prt
Cinética enzimática de Chelonia mydas
0 1 2 30
500
1000
1500
2000
C. mydas SN8
Km= 1,756
Vmáx= 3006
[CDNB]
mU
/mg
prt
A
B
Pág. 145 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
2,5 mM de CDNB
7,5% etanol
Temperatura de 30°C
O Vmax obtido para esta espécie é maior que os valores quantificados nesta
e outras espécies de quelônios marinhos e de água doce (Tabela V-4,
apresentada na seção V.7). Este resultado reforça a importância da adequação
das condições de ensaio enzimáticas que foram padronizadas.
V.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA
ATIVIDADE ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD)
V.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS
A determinação das condições de ensaio da EROD foi realizada por meio de
ensaios que utilizaram um ‘pool’ de tecido hepático de tartaruga Chelonia mydas.
Este ‘pool’ continha volumes similares de frações microssomais das quinze
amostras homogeneizadas dos espécimes de C. mydas que não foram utilizados
no ensaio da atividade de GST.
Para determinação dos parâmetros Vmax e Kmapp para o substrato 7-ER
foram realizados curvas cinéticas de atividade EROD com concentração fixa de
NADPH (1 mM) e concentrações crescentes de 7-ER (0,0156; 0,0312 0,0625;
0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 e 16 µM).
Uma curva padrão com resorufina foi utilizada para converter a fluorescência
(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em fentomoles de
resorufina formada por minuto por mg de proteína (fmol.min-1.mgprt-1), usando a
seguinte fórmula:
Atividade EROD =((𝑹𝑭𝑼×𝒎𝒊𝒏−𝟏)×(𝒄𝒐𝒆𝒇.𝒓𝒆𝒔𝒐𝒓𝒖𝒇𝒊𝒏𝒂)
𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 ) ∗ 𝟏𝟎𝟎𝟎
A curva de cinética enzimática foi avaliada por meio de regressão não linear,
com as equações de Michaelis-Menten e do modelo de inibição por substrato,
para obtenção do Kmapp e Vmax, usando o programa Graphpad Prism 5.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 146 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Equação de Michaelis-Menten: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
(𝐾𝑚+[𝑆])
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Km = Km
[S] = concentração do substrato
vo = velocidade inicial
Equação de inibição por substrato: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])
𝐾𝑚+([𝑆]×(1+[𝑆]
𝐾𝑖))
Onde,
Vmax = velocidade máxima
Km = Km
[S] = concentração do substrato
Ki = constante de inibição
vo = velocidade inicial
No caso de inibição de uma enzima pelo substrato, a padronização do método
com concentrações do substrato iguais a 100, 50, 10 ou 5 vezes o Km da enzima
deve ser aplicada com cautela, pois dependendo da concentração do substrato
pode haver inibição da enzima (BISSWANGER, 2011; 2014).
A fim de avaliar o efeito da coenzima NADPH, foram realizadas análises
utilizando uma concentração fixa de 7-ER (8 µM) e concentrações crescentes de
NADPH (0,25; 0,5; 1; 2 e 4 mM). A concentração fixa de 7-ER foi determinada
com base no Kmapp obtido para este substrato.
A determinação de atividade EROD foi realizada no espectrofluorímetro
SpectraMax® M5 (Molecular Devices®), utilizando microplacas pretas (Perkin
Elmer). Resumidamente, 60 µg de proteína microssomal de cada amostra foram
adicionados por poço, ajustando o volume final para 20 µL com tampão de
microssoma, se necessário, e incubadas com 140 µL de 7-etoxiresorufina (7-ER)
por 10 minutos a 30ºC (VENANCIO et al., 2013). Após a incubação, 40 µL de
NADPH foram adicionados em cada poço para iniciar a reação. O protocolo foi
adaptado de Burke e Mayer (1974). O par de excitação e emissão (ex/em) foi
ajustado para 530nm/585nm com filtro (cutoff) em 550 nm e fotomultiplicador
Pág. 147 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
ligado no máximo (high) para otimizar a detecção de resorufina. Foram realizadas
20 leituras por poço em cada intervalo temporal de 30 s. A reação foi monitorada
por 600 s e o coeficiente angular da reta RFU.min-1 foi utilizado para o cálculo da
atividade enzimática.
V.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para o ensaio com NADPH, os resultados dos testes evidenciaram uma
menor atividade EROD nas concentrações de 0,25 e 4 mM de NADPH (Figura
V.5-1A). Dessa forma, concentrações entre 0,5 e 2 mM de NADPH mostraram-se
mais adequadas para este ensaio, garantindo que haja equivalentes redutores
suficientes para redução do citocromo P450 (HANNEMANN et al., 2007). O
ensaio cinético manter-se-á linear enquanto os substratos estiverem em
concentrações saturantes. Neste ensaio, apesar da concentração de 0,5 mM de
NADPH não ter atuado como fator limitante, optar-se-á para futuros ensaios
EROD em tecido hepático de C. mydas pela concentração final de 1 mM de
NADPH. Essa concentração possibilitará a ampliação do tempo de reação, tendo
em vista que serão realizadas diversas amostras simultaneamente durante a fase
de monitoramento.
A curva cinética de EROD em função de 7-ER (Figura V.5-1B) apresentou
um Kmapp de 1,146 µM e Vmax de 1084 fmol.min-1.mgprt-1. De acordo com
Wilkinson (1971), para o estabelecimento de condições ideais de qualquer ensaio
enzimático, a concentração de substrato sugerida é de cinco a dez vezes os
valores de Km. Com base nestas diretrizes, o substrato 7-ER deveria ser utilizado
em concentrações de 5,7 a 11 µM. No entanto, foi observada uma diminuição da
atividade EROD na concentração mais elevada de 7-ER.
Esse padrão sugere um perfil de inibição pelo substrato (Figura V.5-1B). De
fato, a curva cinética obtida foi significativamente melhor ajustada para um
modelo de inibição por substrato, do que por um modelo clássico de Michaelis-
Menten (p<0,0001).
A inibição por substrato já foi observada em reações enzimáticas catalisadas
por citocromo P450 (Lin et al., 2001). Stromme e Theodorsen (1976) propuseram
a utilização de gráficos duplo-recíprocos de Lineweaver-Burk para linearização
dos dados enzimáticos de γ-glutamil transferase, facilitando a identificação do
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 148 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ponto no eixo X, referente à concentração do 1/[substrato], em que a relação
1/[substrato] versus1/V inverte-se, ou seja, o momento no qual o incremento de
substrato reflete em um decréscimo da atividade enzimática.
O gráfico linearizado de Eadie-Hofstee foi construído para a curva cinética de
EROD em tartaruga C. mydas (Figura V.5-1B – ‘inset’) permitiu identificar que a
inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorreu na relação V/[7-ER] de 98,57,
referente ao ponto de 8 µM de 7-ER. Dessa forma, sugere-se a utilização de
concentrações de 7-ER abaixo de 8 µM para o ensaio EROD em tecido hepático
de tartaruga C. mydas.
Com base nos resultados obtidos, as condições para ensaio EROD em fígado
de C. mydas em estudos futuros serão:
60 µg de proteína microssomal em tampão Tris/NaCl (50 mM/0,1M, pH
7,4)
4 µM de 7-ER
1 mM de NADPH
Temperatura de 30ºC
A Vmax observada para C. mydas está abaixo da identificada na literatura
para tartarugas terrestres Chrysemys picta picta induzidas com PCBs, embora
seja similar à mensurada para atividade EROD de Phrynops geoffroanus (Tabela
V-5, apresentada na seção V.7). Dados sobre atividade EROD em tartarugas
marinhas não estão disponíveis na literatura para comparação.
Pág. 149 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Figura V.5-1 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD, normalizada pela atividade média da concentração 1 mM. B. Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Chelonia mydas construída com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de 95%. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo programa é o Vmax estimado na ausência de inibição por substrato.
0 1 2 3 4 50
300
600
900
6 8 10 12 14 16
Vmáx = 1084 60,68
Kmapp= 1,146 0,13
Ki = 25 4,9
Atividade EROD em diferentes concentrações de 7-ER
[7-ER] (M)
fmo
l.m
in-1
. m
g p
rote
ina
-1
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 20000
200
400
600
800
1000
[V/Substrate]
V
Atividade EROD - C. mydas
0,25
mM
0,5
mM
1 m
M
2 m
M
4 m
M
0
50
100
150
[NADPH] (mM)
% d
e a
tivid
ad
e e
m r
ela
çã
o
à m
éd
ia d
e 1
mM
A
B
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 150 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
V.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA QUELÔNIOS
As condições ótimas para realização de futuros ensaios com tecido hepático
de C. mydas encontram-se sumarizadas nas tabelas abaixo. Todas as condições
ora apresentadas foram determinadas com base nos ensaios realizados durante a
etapa de padronização do presente projeto.
Tabela V-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-transferase (GST) com amostras de quelônios.
Espécie Atividade GST
Tampão [GSH]
mM [CDNB]
mM Temperatura Tecido
Condições de preservação
Chelonia mydas
Fosfato de potássio (0,1 M,
pH 7,0) 2,5 2,5 30 °C Fígado Freezer -80 °C
Tabela V-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) com amostras de quelônios.
Espécie Atividade EROD
Tampão [7-ER]
µM [NADPH]
mM Temperatura Tecido
Condições de preservação
Chelonia mydas
TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH
7,4) 4 1 30 °C Fígado Freezer -80 °C
Pág. 151 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
V.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS:
COMPARAÇÃO COM OS DADOS DA LITERATURA
A tabela comparativa apresentada abaixo (Tabela V-4) traz o resumo das
informações obtidas na literatura para a atividade GST de quelônios. Os dados
mostram que a atividade GST em fígado de Chelonia mydas, avaliada durante as
etapas de padronização do presente projeto, é maior que aquela observada para
a mesma e para outras espécies de tartarugas marinhas. A tartaruga de água
doce, Chrysemys picta, foi a única que apresentou atividade GST maior que C.
mydas.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 152 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela V-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na
literatura para quelônios.
ESPÉCIE TECIDO ORIGEM DA
AMOSTRA
CONDIÇÃO DA
AMOSTRA
TRATAMENTO [GSH] [CDNB] TEMPERATURA DO
ENSAIO
Km (μM)
VMÁX (mU.mgprt-1)
REFERÊNCIA
Chelonia mydas Fígado Necrópsia Código 2 Não 0,011 – 6 mM
0,125 – 2,5 mM
30 °C GSH: 629 CDNB: 1.756
GSH: 2736 CDNB: 3006
Este trabalho
Fígado Necrópsia <24 h post mortem
Não 1 mM 1 mM 25 °C - 1103 ± 267 Richardson et al., 2010
Fígado Necrópsia <6 h post mortem
Não 1 mM 10 mM 25 °C - ~1000 Valdivia et al., 2007
Fígado Necrópsia <6 h post mortem
Não 0,0625 - 1 mM
0,0625 - 1 mM
25 °C GSH: 163 CDNB: 547
GSH: 1254 CDNB: 1777
Richardson et al., 2009
Sangue Coleta direta
Fresca Não 1 mM 1 mM 25 °C - P.A.*: 990±170 B.M.*²: 620±110
Labrada-Martagón et al., 2011
Caretta caretta Fígado Necrópsia <24 h post mortem
Não 1 mM 1 mM 25 °C - 1047 ± 436 Richardson et al., 2010
Fígado Necrópsia <6 h post mortem
Não 0,0625 - 1 mM
0,0625 - 1 mM
25 °C GSH: 172 CDNB: 269
GSH: 1201 CDNB: 134
Richardson et al., 2009
Lepidochelys olivacea
Fígado Necrópsia <24 h post mortem
Não 1 mM 1 mM 25 °C - 877 ± 300 Richardson et al., 2010
Fígado Necrópsia <6 h post mortem
Não 0,0625 - 1 mM
0,0625 - 1 mM
25 °C GSH: 225 CDNB: 373
GSH: 1059 CDNB: 1201
Richardson et al., 2009
Eretmochelys imbricata
Fígado Necrópsia <6 h post mortem
Não 0,0625 - 1 mM
0,0625 - 1 mM
25 °C GSH: 122 CDNB:
GSH: 712 CDNB: 929
Richardson et al., 2009
Pág. 153 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
455 Sangue Coleta
sanguínea Fresca Não 1 mM 1 mM 25 °C - 4 U mg Hb-1 Tremblay et
al., 2017 Chrysemys picta Fígado Necrópsia Coletado
imediatamente após a morte
Não 1 mM 1 mM 25 °C - I*³: 8000± 1300 NI*4: 8200± 1100
Rie et al., 2000
Phrynops geoffroanus
Fígado Necrópsia Coletado imediatamente após a morte
Não 2 mM 2 mM 30 °C - Controle: 2000±170 Área urbana: 2730±150
Venancio et al., 2013*
*Após comunicação via correio eletrônico com os autores foi percebido que o artigo apresentava um erro nas concentrações dos reagentes. As concentrações utilizadas nos
ensaios foram 2 mM para GSH e CDNB.
Tabela V-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na
literatura para quelônios.
ESPÉCIE TECIDO ORIGEM DA AMOSTRA
CONDIÇÃO DA AMOSTRA
TRATAMENTO [7-ER] [NADPH] TEMPERATURA DO
ENSAIO
Km (μM)
VMÁX (pmol.mgprt-1.
min-1)
REFERÊNCIA
Chelonia mydas
Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,015 - 16 µM
1 mM 30 °C 1,15±0,13
1,084±0,06 Presente trabalho
Chrysemys picta
Fígado TCB (5 – 50 mg kg-
1) BNF (25 – 50 mg kg-1) Aroclor (100 mg kg-
1) 2,3,3′,4,4′- PeCB (5 mg kg-1)
2 µM 1 mM 22 °C - Controle: ~5 BNF: ~45 Aroclor: ~35 PCB77: ~40 PCB105: ~40
Yawetz et al., 1998
Fígado Necrópsia Coletada imediatamente após a morte
Não 2 µM 1,67 mM 25 °C - I: Fêmeas - 3,3±0,5 a 4,2±0,5; Machos – ND a
Rie et al., 2000
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Pág. 154 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
5,8±1,5 NI: Fêmeas – 2,5; Machos – ND – 3,8±0,6
Phrynops geoffroanus
Fígado Necrópsia Coletada imediatamente após a morte
Não 3,32 µM 0,2 mM 25 °C - Controle: 0,4±0,049 Área urbana: 0,85±0,21
Venancio et al., 2013*
Chelydra serpentina serpentina
Fígado Necrópsia Coletada imediatamente após a morte
Não 2 µM 0,6 mM 37 °C - Lynde Park: 20 Algonquin: 5
Bishop et al., 1998
*Após comunicação via correio eletrônico com os autores foi percebido que o artigo apresentava um erro nas concentrações dos reagentes. As concentrações utilizadas nos
ensaios foram 3,32 mM de 7-ER e 0,2 mM de CDNB.
Pág. 155 / 203
V. Padronização de Técnicas
de Biomarcadores
bioquímicos em quelônios
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
A otimização dos ensaios realizados neste estudo para substrato e
temperatura da reação permitiu uma análise mais robusta da atividade GST em
amostras de C. mydas, o que pode explicar a diferença em relação aos dados da
literatura. No entanto, é possível também que as diferenças estejam associadas à
variação interindividual, decorrente de características intrínsecas ao organismo,
como sexo, hábito alimentar e idade, e/ou relacionadas à exposição a
determinadas condições ambientais ou ao tempo post mortem.
Devido à ausência de trabalhos prévios que tenham mensurado atividade
EROD em tartarugas marinhas, somente foi possível a comparação dos dados
obtidos com aqueles obtidos em quelônios de água doce ou terrestres (Tabela V-
5). Pode-se observar uma elevada variabilidade de atividade EROD entre as
espécies. Em geral, os valores de Vmax obtidos em C. mydas foram menores que
a atividade EROD encontrada em outras espécies. Os ensaios realizados
permitiram a obtenção de informações importantes sobre as concentrações
inibitórias do substrato 7-ER, que variam significativamente entre espécies de
tetrápodes. Esta é uma informação de alta relevância, tendo em vista que
concentrações elevadas do substrato podem inibir a atividade EROD em C.
mydas, conforme discutido na seção V.5.2 deste relatório.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 156 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
VI – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE
BIOMARCADORES MOLECULARES
O transcriptoma corresponde ao conjunto completo de RNAs, denominados
transcritos, produzidos por um organismo em um determinado tempo, local ou
condição ambiental. Por meio deste, é possível identificar quais genes estão
sendo expressos em resposta a diferentes estímulos, tais como a exposição a
contaminantes ambientais (SNAPE et al., 2004).
Considerando a complexidade desse tipo de análise, o número de amostras
coletadas, a diversidade de espécies e o ineditismo desse tipo de monitoramento,
o presente projeto prevê o sequenciamento do transcriptoma de quatro espécies:
uma ave, uma tartaruga e dois cetáceos marinhos. O desenvolvimento desta
ferramenta visa a identificação dos genes de interesse citocromo P4501A
(CYP1A), fator de transcrição E2F, chaperona HSP70, receptor de estrogênio
(ER), receptor de aril hidrocarboneto (AhR) e UDP-glicuronil-transferase (UDPGT)
(FOSSI et al., 2010, 2013, 2014; PANTI et al., 2011), conforme especificação
técnica do projeto.
A escolha das espécies deve seguir alguns critérios, tais como a
disponibilidade de amostras coletadas no âmbito do Projeto de Monitoramento de
Praias (PMP-BS) e do Projeto de Monitoramento de Cetáceos da Bacia de Santos
(PMC-BS), a distribuição geográfica da espécie (hábitos costeiros ou oceânicos),
e a disponibilidade pública de sequências gênicas. Desta forma, são discutidos, a
seguir, os critérios separados para cada grupo animal no âmbito dos projetos
PMC-BS e PMP-BS. São apresentados, ainda, os resultados da padronização de
biomarcadores moleculares, para as espécies selecionadas, realizados até o
momento pela equipe.
VI.1 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: AVES MARINHAS
Em relação às aves marinhas, até o dia 03/05/2017, haviam sido coletados
168 espécimes de 15 espécies, conforme disponibilizado no banco de dados
SIMBA. Destas, o pinguim-de-magalhães, Spheniscus magellanicus, apresenta-se
como a espécie mais abundante, com 64 espécimes coletados para análise de
Pág. 157 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
biomarcadores. A gaivota, Larus dominicanus, apresenta-se como a segunda
espécie mais coletada, com 39 indivíduos, seguida do bobo-pequeno, Puffinus
puffinus, com 28 espécimes. Para as demais espécies coletadas no PMP-BS,
existem disponíveis desde um até nove espécimes para a análise de
biomarcadores (Tabela VI-1).
Tabela VI-1 - Espécies de aves marinhas, respectivos números de espécimes coletados junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma estão destacadas em azul.
Classe Aves
Espécie Número de espécimes Transcriptoma público
Spheniscus magellanicus 64 Não
Larus dominicanus 39 Não
Puffinus puffinus 28 Não
Sula leucogaster 15 Não
Phalacrocorax brasilianus 06 Não
Fregata magnificens 06 Não
Calonectris diomedea 03 Não
Procellaria aequinoctialis 03 Não
Puffinus gravis 02 Não
Sterna hirundo 02 Não
Thalassarche melanophris 02 Não
Charadrius semipalmatus 01 Não
Macronectes giganteus 01 Não
Oceanites oceanicus 01 Não
Thalasseus acuflavidus 01 Não
Total 168 -
Dentre as aves mais abundantes, S. magellanicus caracteriza-se por ser uma
espécie migratória, encontrada no sul da América do Sul. Dos espécimes de S.
magellanicus coletados no âmbito do PMP-BS, 46 foram amostrados pela base
R3 Animal, seguido de seis indivíduos coletados pela equipe da UDESC, em
Laguna, SC. De um a quatro espécimes são provenientes das demais bases.
No Brasil, os pinguins-de-magalhães são encontrados ao longo da costa das
regiões sul e sudeste nas estações frias, para onde se deslocam em busca de
alimento, cuja dieta é formada basicamente por peixes, crustáceos e cefalópodes
(PINTO et al., 2007). De acordo com a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas
da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais
(IUCN), S. magellanicus é uma espécie classificada como quase ameaçada de
extinção (IUCN, 2017a). Dentre as principais ameaças, merece destaque a
poluição por óleo e derivados de atividades da indústria do petróleo, o que
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 158 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
justificaria sua escolha como espécie sentinela em estudos de monitoramento
ambiental. Entretanto, a espécie não utiliza a área onde ocorre a produção de
petróleo e gás natural pela PETROBRAS na Bacia de Santos, de forma que os
impactos dessa atividade não seriam monitorados. Por esse principal motivo a
espécie S. magellanicus, em acordo com o IBAMA, não foi selecionada como
prioritária para a análise de biomarcadores. Ainda, cabe mencionar que são
poucos os trabalhos no âmbito da ecotoxicologia realizados com S. magellanicus
(BALDASSIN et al., 2016; KEHRIG et al., 2015), cujas sequências nucleotídicas
de genes biomarcadores permanecem desconhecidas (Tabela VI-1).
A segunda espécie mais coletada pelo PMP-BS, L. dominicanus, caracteriza-
se pela sua ampla distribuição geográfica em regiões costeiras do hemisfério sul.
Dentre os espécimes de L. dominicanus disponíveis para a análise de
biomarcadores, doze foram coletados no Paraná pela equipe da UFPR, oito são
provenientes das bases da Univali e Univille, seguidos de sete, quatro e três
exemplares coletados pelas bases R3 Animal, da Udesc e CTA, respectivamente.
As demais bases coletaram um espécime cada.
Apresenta uma dieta alimentar generalista e oportunista, sendo capaz de
utilizar vários hábitats e diferentes presas (COULSON, COULSON, 1992;
LUDYNIA, GARTHE, LUNA-JORQUERA, 2005). De acordo com a Lista Vermelha
de Espécies Ameaçadas da IUCN, a gaivota não é considerada uma espécie
ameaçada de extinção, mas pode sofrer futuras ameaças, tais como aquelas
oriundas de derrames de petróleo (IUCN, 2016a). Assim como S. magellanicus, L.
dominicanus também não apresenta sequências gênicas disponíveis no banco de
dados público do NCBI. Desta forma, a espécie L. dominicanus foi selecionada
como prioritária para a análise de biomarcadores.
Em relação à bobo-pequeno, P. puffinus, embora apresente um pequeno
número amostral, sua coleta foi realizada de forma homogênea, com seis
indivíduos encontrados no litoral sul de São Paulo, pelo Biopesca, seguido de
cinco espécimes amostrados no Paraná, pela equipe da UFPR. Quatro
exemplares foram coletados em Florianópolis, pela equipe da R3 animal, e quatro
na região de Laguna, pela equipe da UDESC, além de três espécimes
provenientes do litoral norte de SC, pela equipe da Univille. Adicionalmente, dois
espécimes foram coletados pelas equipes da Univali (litoral central de Santa
Pág. 159 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Catarina) e CTA (Estado do Rio de Janeiro), e um indivíduo coletado em cada
uma das bases do IPeC e Argonauta (Estado de São Paulo).
Em termos biológicos, P. puffinus caracteriza-se por ser uma ave marinha
migratória, cosmopolita, com ampla distribuição geográfica e hábito alimentar
diverso, alimentando-se especialmente de pequenos peixes, crustáceos e lulas
(LEE, 1995). De acordo com a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas da IUCN,
bobo-pequeno não é considerada ameaçada de extinção, mas pode sofrer
ameaças de diversas atividades antropogênicas, como poluição luminosa,
diminuição de área de vida e poluição marinha (IUCN, 2016b). P. puffinus também
não apresenta sequências gênicas disponíveis no banco de dados público do
NCBI. Cardoso et al. (2014) observaram níveis significativos de metais,
organoclorados e presença de bactérias em exemplares de P. puffinus coletados
no litoral fluminense e capixaba e sugeriram a utilização desta espécie como
organismo sentinela. Além disso, desde o início do PMP-BS em agosto de 2015,
já foram registrados 45 indivíduos oleados, cujas amostras de óleo foram
encaminhadas para análise de fingerprint a fim de identificar a origem e o tipo do
óleo (bruto ou derivado). Apesar de constituir uma espécie de interesse global, em
termos de monitoramento, seu hábito migratório, vindo desde a região do Reino
Unido, no Atlântico Norte, até a costa brasileira, na primavera (GUILFORD et al.,
2009), impõe algumas incertezas dentro do escopo de monitoramento da
atividade de produção de petróleo e gás natural pela PETROBRAS na Bacia de
Santos.
A quarta espécie de ave marinha mais coletada (15 espécimes) no âmbito do
PMP-BS, Sula leucogaster, caracteriza-se por apresentar uma distribuição
geográfica extremamente abrangente. Dos 15 espécimes de atobá coletados,
quatro são provenientes do Paraná e quatro foram coletadas pela equipe do CTA,
três do litoral sul paulista, sendo os demais coletados pela R3 Animal, GREMAR e
pela base da UDESC. Não é considerada uma espécie migratória, sendo
residente em áreas marinhas, onde se alimenta de peixes e lulas. Em função de
sua larga ocorrência e amplo número populacional, o atobá não é considerado
ameaçado (IUCN, 2017b). Em relação às sequências gênicas dos biomarcadores
moleculares, há disponível no banco de dados do NCBI, somente uma sequência
parcial da proteína citocromo P450 19A1 (Número de Acesso GenBank
KY76069.1). Esta sequência foi recentemente depositada por Reddy et al. (2017).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 160 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Esta espécie não foi escolhida como alvo nesta etapa do trabalho em função
do menor número amostral, comparativamente às outras espécies. No entanto,
caso haja um aumento no número de amostras e posterior interesse de sua
análise ao longo do projeto, não é descartada sua utilização futura.
VI.2 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: TARTARUGAS
MARINHAS
Dentre as três espécies de tartarugas marinhas coletadas no PMP-BS, cujos
dados encontram-se disponíveis no SIMBA em 03/05/2018, 265 espécimes são
de Chelonia mydas, seguida de dois indivíduos de Caretta caretta, e um de
Eretmochelys imbricata (Tabela VI-2). Das 265 tartarugas-verdes amostradas, 95
são provenientes de coletas no litoral norte de São Paulo pelo Instituto Argonauta,
enquanto 41 e 37 foram coletadas no litoral sul paulista pela equipe do Biopesca,
e pela base da UFPR na costa paranaense, respectivamente. Os demais
indivíduos foram amostrados de forma homogênea pelas demais bases do PMP-
BS.
Tabela VI-2 - Espécies de tartarugas marinhas, respectivos números de espécimes
coletados junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma
público. A espécie com número amostral satisfatório para a análise de biomarcadores
moleculares está destacada em azul.
Classe Reptilia
Espécie Número de espécimes
Transcriptoma público
Chelonia mydas 265 Sim
Caretta caretta 02 Sim
Eretmochelys imbricata 01 Sim
Total 268 -
A espécie C. mydas possui distribuição cosmopolita, desde os trópicos até as
regiões temperadas, sendo a espécie de tartaruga marinha com hábitos mais
costeiros (HIRTH, 1997). É uma espécie altamente migratória, de vida longa e
com hábitos alimentares que variam de acordo com a fase de vida. Nos primeiros
anos de vida são onívoras, tornando-se exclusivamente herbívoras após a fase
pelágica. De acordo com Almeida et al. (2011), no Brasil as áreas reprodutivas
Pág. 161 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
concentram-se nas ilhas oceânicas, embora seja frequente a ocorrência de
indivíduos juvenis ao longo de toda a costa.
Segundo a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas da União Internacional
para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN), C. mydas é
uma espécie classificada como ameaçada de extinção (SEMINOFF, 2004).
Dentre as principais ameaças, merece destaque a captura incidental em artefatos
de pesca, além das mais variadas formas de poluição que modificam os hábitats
marinhos e terrestres. Segundo os dados disponibilizados no SIMBA, é nítido o
impacto antropogênico na costa sudeste brasileira, o que tem resultado na maior
ocorrência de amostras de tartarugas-verdes coletadas até o momento.
Em função de seu estado de vulnerabilidade ecológica e, portanto, com forte
apelo conservacionista, C. mydas já apresenta seu genoma sequenciado (WANG
et al., 2013). Assim, pode-se concluir que para C. mydas já se encontram
disponíveis as sequências de genes previamente selecionados como
biomarcadores moleculares (Tabela VI-3), sem a necessidade de
sequenciamento de seu transcriptoma.
Tabela VI-3 - Relação dos genes potencialmente biomarcadores de exposição em
Chelonia mydas e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI.
Gene de interesse
Descritor Número de acesso no GenBank - NCBI
CYP1A Cytochrome P450 1ª 102933577
E2F1 E2F transcription factor 1 102941250
EEF2 Eukaryotic translation elongation factor 2 102932033
HSPA1-Like Chelonia mydas heat shock 70 kDa protein 1A/1B-like 102935471
HSPA5 Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 102940886
HSPA12B Heat shock protein family A (Hsp70) member 12B 102948369
HSPA4 Heat shock protein family A (Hsp70) member 4 102936364
HSPA4L Heat shock protein family A (Hsp70) member 4 like 102941630
HSPA14 Heat shock protein family A (Hsp70) member 14 102936818
HSPA13 Heat shock protein family A (Hsp70) member 13 102935009
HSPA12A Heat shock protein family A (Hsp70) member 12A 102933776
HSPA8 Heat shock protein family A (Hsp70) member 8 102932086
ESR1 Estrogen receptor 1 102934699
ESR2 Estrogen receptor 2 102943584
AHR Aryl hydrocarbon receptor 102939242
UGT1A1 UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1 102944299
Obs.: Acesso realizado em 15/06/2017.
Vale ressaltar que, embora o número de amostras coletadas junto ao PMP-
BS seja irrelevante para fins de monitoramento, o transcriptoma da espécie de
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 162 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
tartarugas marinhas C. caretta e E. imbricata foi recentemente sequenciado em
amostras de sangue (HERNANDEZ-FERNANDEZ, 2017; HERNANDEZ-
FERNANDEZ et al., 2017).
VI.3 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: CETÁCEOS MARINHOS
Dentre os cetáceos marinhos, está previsto o sequenciamento do
transcriptoma de duas espécies, uma da subordem Odontoceti e outra da
subordem Mysticeti. Portanto, com o intuito de identificar potenciais espécies de
cetáceos para o desenvolvimento dos transcriptomas, foi realizado um
levantamento de todas as amostras obtidas para biomarcadores moleculares
durante os ciclos I, II, III, IV, V e VI das Campanhas de Avistagem Embarcada e
Telemetria realizados no âmbito do PMC-BS, bem como de amostras coletadas
pelo PMP-BS.
No total, 244 espécimes de 17 espécies foram amostrados ao longo dos seis
ciclos de campanhas do PMC-BS. Destes, 197 indivíduos pertencem a 14
espécies da subordem Odontoceti, e 47 espécimes pertencem a sete espécies da
subordem Mysticeti (Tabela VI-4). Estes números não incluem amostras de
cetáceos provenientes do PMP-BS.
Tabela VI-4 - Espécies de cetáceos, respectivos números de espécimes coletados junto
ao PMC-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies
com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma estão
destacadas em azul.
PMC-BS (Ciclos I a VI)
Classe Mammalia
Ordem Cetacea, Subordem Odontoceti
Espécie Número de espécimes
Transcriptoma público
Stenella frontalis 64 Não
Tursiops truncatus 38 Sim
Stenella longirostris 47 Não
Stenella clymene 07 Não
Stenella attenuata 12 Não
Delphinus capensis 04 Não
Delphinus sp. 04 Não
Steno bredanensis 07 Não
Physeter macrocephalus 05 Sim
Peponocephala electra 05 Não
Sotalia guianensis 01 Não
Orcinus orca 01 Sim
Pág. 163 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Dentre os cetáceos amostrados pelo PMP-BS, 72 indivíduos pertencem a
seis espécies da subordem Odontoceti, e somente um espécime era da subordem
Mysticeti (Tabela VI-5). De todas as espécies de cetáceos marinhos amostradas,
três foram coletadas nos dois projetos: Tursiops truncatus, Stenella frontalis e
Stenella longirostris. Entretanto, pode-se observar um padrão de ocorrência
distinto, com maior frequência de espécies exclusivamente costeiras (Pontoporia
blainvillei e Sotalia guianensis) dentre as amostras obtidas pelo PMP-BS. Estas
espécies de pequenos delfinídeos são particularmente vulneráveis a impactos
antropogênicos, especialmente de atividades nos ambientes costeiros (SECCHI,
2012; ZERBINI et al., 2017).
Tabela VI-5 - Espécies de cetáceos, respectivos números de espécimes coletados junto
ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies
com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma estão
destacadas em azul.
PMP-BS
Classe Mammalia
Ordem Cetacea, Subordem Odontoceti
Espécie Número de espécimes Transcriptoma público
Pontoporia blainvillei 28 Não
Sotalia guianensis 35 Não
Tursiops truncatus 04 Sim
Stenella frontalis 03 Não
Phocoena dioptrica 01 Não
Stenella longirostris 01 Não
Total 72 -
Ordem Cetacea, Subordem Mysticeti
Espécie Número de espécimes Transcriptoma público
Balaenoptera acutorostrata 01 Não
Total 01 -
Delphinus delphis 01 Não
Globicephala sp. 01 Não
Total 197 -
Ordem Cetacea, Subordem Mysticeti
Espécie Número de espécimes
Transcriptoma público
Balaenoptera borealis 14 Não
Megaptera novaeangliae 14 Não
Balaenoptera brydei 08 Não
Balaenoptera physalus 06 Não
Balaenoptera bonaerensis 03 Não
Eubalaena australis 01 Não
Balaenoptera musculus 01 Não
Total 47 -
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 164 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Cabe ressaltar que as amostras hepáticas de cetáceos marinhos
provenientes do PMP-BS foram coletadas post mortem em animais em código 2
de decomposição. Desta maneira, para a definição das espécies para o
sequenciamento do transcriptoma, optou-se por amostras tegumentares de
cetáceos amostrados pelo PMC-BC. Assim, a qualidade do material biológico é
assegurada, evitando eventuais resultados falso-negativos. Diante deste cenário,
a discussão segue em relação às amostras tegumentares de biópsias remotas
obtidas junto ao PMC-BC.
Frente aos resultados apresentados, as espécies S. frontalis, T. truncatus e
S. longirostris representam, respectivamente, 32,5%, 19,3% e 23,8% dos
odontecetos biopsados. Dentre os misticetos, a baleia-sei, Balaenoptera borealis,
representa 29,8% dos animais amostrados, seguida da baleia jubarte, Megaptera
novaeangliae, com 29,8% das amostragens realizadas no PMC-BS e da baleia de
bryde, Balaenoptera brydei, com 17% das amostragens realizadas no PMC.
Portanto, até o momento, estas seis espécies possuem indivíduos biopsados com
número amostral satisfatório para o desenvolvimento dos transcriptomas.
Entretanto, como somente uma espécie de cada subordem será escolhida,
fez-se uma busca no banco de dados do NCBI por sequências de genes e
proteínas das cinco espécies de cetáceos marinhos. Destes, o boto-da-tainha, T.
truncatus, apresentou a maior quantidade de sequências, com 131.061
sequências de nucleotídeos e 54.358 sequências de proteínas depositadas no
NCBI (Tabela VI-7). Vale ressaltar que o transcriptoma desta espécie já foi
sequenciado em amostras de sangue (MOREY et al., 2016) e pele (VAN DOLAH
et al., 2015), corroborando com o grande número de sequências identificadas.
Ainda, 19 sequências referentes aos genes que codificam as proteínas
citocromo P4501A (CYP1A), fator de transcrição E2F, chaperona HSP70, receptor
de estrogênio (ER), receptor de aril hidrocarboneto (AhR) e UDP-glicuronil-
transferase (UDPGT) foram identificadas para T. truncatus no mesmo banco de
dados (Tabela VI-6). Portanto, pode-se concluir que para T. truncatus já se
encontram disponíveis as sequências de genes previamente selecionados como
biomarcadores moleculares, sem a necessidade de sequenciamento do
transcriptoma.
Pág. 165 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Tabela VI-6 - Relação dos genes potencialmente biomarcadores de exposição em
Tursiops truncatus e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI.
Gene Descritor Número de Acesso no
GenBank/NCBI
CYP4501A1-like Cytochrome P450 1A1-like 101329596
EEF2 Eukaryotic translation elongation factor 2 101325570
HSPA5 Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 101332967
HSPA8 Heat shock protein family A (Hsp70) member 8 101336392
HSPA12B Heat shock protein family A (Hsp70) member 12B 101332284
HSPA6 Heat shock protein family A (Hsp70) member 6 101329419
HSPA13 Heat shock protein family A (Hsp70) member 13 101328273
HSPA4L Heat shock protein family A (Hsp70) member 4 like 101326624
HSPA12A Heat shock protein family A (Hsp70) member 12 101324430
HSPA14 Heat shock protein family A (Hsp70) member 14 101322174
HSPA2 Heat shock protein family A (Hsp70) member 2 101319934
HSPA4 Heat shock protein family A (Hsp70) member 4 101317058
HSPA9 Heat shock protein family A (Hsp70) member 9 101316057
LOC101335433 Heat shock 70 kda protein 1B 101335433
ESR1 Estrogen receptor 1 101324820
ESR2 Estrogen receptor 2 101328472
AHR Aryl hydrocarbon receptor 101329569
UGT 1-3 UDP-glucuronosyltransferase 1-3, known as UGT1A1 101329554
UGT1A10 UDP glucuronosyltransferase family 1 member A10 101322091
Obs.: Acesso realizado em 10/03/2017.
Por outro lado, para as demais espécies selecionadas, S. frontalis, S.
longirostris, B. borealis, M. novaeangliae e B. brydei, um pequeno número de
sequências encontram-se disponíveis, conforme mostra a Tabela VI-7. Cabe
ressaltar que grande parte das sequências identificadas referem-se a genes e/ou
proteínas mitocondriais, com nenhuma relação aos genes pré-definidos como
potenciais biomarcadores moleculares para os tetrápodes marinhos, com exceção
da sequência identificada para AhR em baleia jubarte (Cógido de Acesso no
GenBank/NCBI 118419961).
Portanto, as informações apresentadas, associadas ao número amostral
disponível até o momento, reforçam o uso dos odontocetos S. frontalis ou S.
longirostris, e dos misticetos B. borealis ou B. brydei como espécies prioritárias
para o sequenciamento de transcriptoma visando a identificação de genes
biomarcadores moleculares de exposição a contaminantes ambientais.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 166 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Destaca-se que na revisão 00 do presente Relatório protocolada em abril de
2018 pela Petrobras, foi utilizada a quantidade de amostras coletadas e entregues
pelo PMP-BS e PMC-BS até dezembro de 2017, sendo que as espécies S.
frontalis, B. borealis e T. truncatus foram recomendadas como espécies-alvo de
cetáceos para o monitoramento dos biomarcadores moleculares. Entretanto,
após a atualização da quantidade de amostras disponível para cada espécie
(maio de 2018) e consulta à equipe técnica do PMC-BS, que esclareceu questões
de uso de hábitat, hábitos migratórios e alimentares de cetáceos, decidiu-se pela
revisão da proposta, conforme apresentado na reunião realizada com o IBAMA
em 07/05/2018, tendo sido proposta a substituição de S. frontalis por S.
longirostris e de B. borealis por B. brydei.
Tabela VI-7 - Espécies e correspondente número de sequências gênicas (DNA e RNA) e
de proteínas, obtidas no banco de dados do NCBI.
Espécie Número de sequências gênicas
Número de sequências de proteínas
Tursiops truncatus 131.061 a 54.358 b
Megaptera novaeangliae
2.618 c 1.001 d
Stenella longirostris 823e 1.614 f
Stenella frontalis 319 g 33h
Balaenoptera borealis 102i 99j
Balaenoptera brydei 13l 78m
Fonte: a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Tursiops%20truncatus b https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Tursiops%20truncatus c https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Megaptera+novaeangliae d https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Megaptera+novaeangliae
e https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Stenella%20longirostris f https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Stenella%20longirostris g https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Stenella%20frontalis%20 h https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Stenella%20frontalis%20 ihttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Balaenoptera%20borealis j https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Balaenoptera%20borealis l https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Balaenoptera%20brydei m https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Balaenoptera%20brydei Obs.: Acessos realizados em 20/05/2017 e 11/12/2017.
Em termos ecológicos, o golfinho-pintado-do-Atlântico, S. frontalis, é
encontrado no Oceano Atlântico, desde o sul do Brasil e até a costa oeste da
África, tanto em regiões costeiras até águas oceânicas profundas, onde
geralmente se desloca em busca de cardumes de peixes migratórios. Não é
considerada uma espécie migratória, e apresenta hábito alimentar diverso,
Pág. 167 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
alimentando-se preferencialmente de peixes epi- e mesopelágicos, além de lulas
e invertebrados bentônicos (LOPES et al., 2012). De acordo com a Lista
Vermelha da IUCN, há dados insuficientes para estabelecer o seu estado de
conservação (HAMMOND et al., 2012).
Similarmente, para o golfinho rotador, S. longirostris, ainda não está
estabelecido o estado de conservação da espécie (BEARZI et al., 2012).
Entretanto, sabe-se que se trata de uma espécie com ampla distribuição
geográfica, sendo encontrada em todos os oceanos dos hemisférios norte e sul.
Embora geograficamente bem distribuído, este pequeno cetáceo parece ter
preferência por áreas de talude continental, sobrepondo-se às áreas de
exploração da Bacia de Santos (PETROBRAS, 2017).
Em relação aos misticetos, a baleia-sei, B. borealis, caracteriza-se por
apresentar uma ampla distribuição geográfica, sendo subdividida em duas
subespécies. Apresenta um comportamento migratório ao longo da costa
brasileira que é desconhecido, e se alimenta de copépodos, eufasídios e
anfípodos. Em função da captura ostensiva entre as décadas de 1950 e 1980, as
populações declinaram de forma vertiginosa, sendo atualmente considerada como
uma espécie ameaçada de extinção pela IUCN (REILLY et al., 2008a).
A segunda provável espécie de misticeto para desenvolvimento e análise de
biomarcadores moleculares, a baleia de bryde, B. brydei, é considerada
“deficiente em dados” pela IUCN (REILLY et al., 2008a) e, ao contrário do
comportamento observado para os demais misticetos, não apresenta hábito
migratório, permanecendo na costa brasileira ao longo do ano (PETROBRAS,
2017; WEDEKIN, 2018 COM. PESSOAL).
Por outro lado, a terceira provável espécie de misticeto para desenvolvimento
e análise de biomarcadores moleculares, a baleia jubarte, M. novaeangliae, é
considerada “pouco preocupante” em termos de conservação (REILLY et al.,
2008b), devido à significativas ações conservacionistas em todo o mundo. Esta
espécie cosmopolita caracteriza-se por ser migratória, com períodos de migração
bem definidos entre as áreas de alimentação e reprodução (ANDRIOLO;
ZERBINI, 2010).
Dentre as potenciais espécies-alvo de cetáceos delineadas acima, iniciou-se
a padronização de análise de biomarcadores moleculares apenas para T.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 168 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
truncatus, tendo em vista a existência de sequências gênicas para esta espécie
depositadas no GenBank.
Por fim, e considerando todos os aspectos e critérios abordados neste
documento, a Tabela VI-8 apresenta uma listagem das espécies de tetrápodes
coletadas nos projetos PMP-BS e PMC-BS, e sua relação com a presença de
dados gênicos públicos. A tabela compila os dados apresentados, destacando
somente as espécies com número amostral relevante para fins de monitoramento
por meio da análise de biomarcadores moleculares.
Tabela VI-8 - Lista de espécies coletadas pelo PMP-BS e PMC-BS, e sua relação com
existência de dados gênicos públicos para a espécie.
Espécies com transcriptoma público Espécies sem transcriptoma público
Chelonia mydas Tursiops truncatus
Spheniscus magellanicus Larus dominicanus Puffinus puffinus Stenella frontalis Stenella longirostris Balaenoptera borealis Balaenoptera brydei Megaptera novaeangliae Pontoporia blainvillei Sotalia guianensis
VI.4 – PADRONIZAÇÃO DE BIOMARCADORES MOLECULARES
Considerando o grande número amostral disponível no PMP-BS e PMC-BS
bem como a existência de transcriptoma público, foi iniciada a etapa de
padronização de biomarcadores moleculares em amostras de fígado de Chelonia
mydas e amostras teciduais deTursiops truncatus.
Esses procedimentos foram realizados com o objetivo de: 1) aferir a qualidade
e integridade do RNA extraído com o reagente comercial Qiazol (Qiagen®); 2)
desenhar e verificar se os iniciadores desenhados são capazes de amplificar o
gene alvo em cada espécie com eficiência necessária para a quantificação; e 3)
verificar se os genes escolhidos para o biomonitoramento molecular são
transcritos nos tecidos e espécies avaliados.
Pág. 169 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Para a padronização de técnicas moleculares em C. mydas foi utilizada uma
amostra de tecido hepático de tartaruga verde coletada cerca de 6 horas após a
morte do indivíduo. Este espécime é proveniente do PMP-BS e identificado pelo
código SIMBA 050421.
Para a padronização de técnicas moleculares em T. truncatus foram
utilizadas amostras de baço, cérebro, fígado, gordura, músculo, pele, pulmão e
rim de um espécime, identificado pelo código SIMBA 002892. A coleta destas
matrizes teciduais não está contemplada no presente projeto e foi realizada pela
equipe da UDESC do PMP-BS, em parceira com a equipe do LABCAI, para
utilização em projetos de pesquisa em andamento no LABCAI. As amostras foram
utilizadas para esta etapa adicional de padronização, a fim de garantir que a
avaliação da eficiência e especificidade dos iniciadores pudesse ser identificada
mesmo para genes pouco ou não expressos na pele.
VI.4.1 – EXTRAÇÃO DE RNA E AVALIAÇÕES DE
CONCENTRAÇÃO E INTEGRIDADE
Para esta etapa de padronização, realizou-se, primeiramente, a extração de
RNA das amostras selecionadas. O protocolo de extração de RNA iniciou com a
homogeneização de 100 mg de cada tecido em 1 mL do reagente Qiazol
(Quiagen®). A homogeneização foi realizada com o homogeneizador mecânico
Tissue Tearor (Biospec®). Os tecidos homogeneizados foram incubado a 20ºC por
30 minutos e, após esse período de incubação, foi acrescentado 0,2 mL de
clorofórmio. Os tubos contendo a mistura de Qiazol, amostra e clorofórmio foram
agitados vigorosamente em vórtex por 15 s, mantidos a 20ºC por 3 minutos e
centrifugados a 14.000 xg por 30 minutos a 4ºC.
Após a centrifugação, a fase transparente superior de cada um dos tecidos foi
cuidadosamente separada em outros tubos, ao qual foram acrescentados 0,5 mL
de isopropanol. O conteúdo dos tubos foi misturado por inversão, incubado por 10
minutos a 20ºC e centrifugado a 14.000 xg por 30 minutos a 4ºC.
Após a centrifugação, o RNA (sedimento/pellet) foi mantido e o sobrenadante
descartado. O RNA de cada tecido foi cuidadosamente lavado duas vezes
consecutivas com etanol 75% para remover os reagentes utilizados durante a
extração. Após a purificação com etanol, o RNA foi secado a 40ºC e
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 170 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
ressuspendido com água própria para aplicações de biologia molecular. Todos os
reagentes, tubos e ponteiras utilizados no protocolo eram próprios para biologia
molecular (livres de RNAses, DNAses e pirógenos).
A avaliação de concentração e pureza do RNA extraído foi realizada
espectrofotometricamente com o equipamento Nanodrop®. As leituras foram
realizadas em 260 nm, 280 nm e 230 nm. A absorbância em 260 nm foi utilizada
para estimar a concentração de RNA, a razão 260/280 (ótimo entre 1,8-2,0) para
estimar a pureza com relação à contaminação por proteínas e a razão 260/230
(ótimo entre 2,0-2,2) para avaliar a pureza relativa a outros contaminantes, como
sal (WIECZOREK, DELAURIERE, SCHAGAT, 2012).
Além da determinação espectrofotométrica, faz-se necessária a avaliação de
integridade do RNA extraído. Esta avaliação foi realizada através de eletroforese
em gel de agarose 1,2%, tampão MOPS/formaldeído como desnaturante e
GelRed (Biotium®) como corante fluorescente, de acordo com o apêndice C do
manual do kit Omniscript Reverse Transcription (Qiagen).
Todos os reagentes utilizados eram livres de DNAse e RNAses e as cubas e
demais equipamentos foram lavados e descontaminados com dodecilsulfato de
sódio 0,2%, peróxido de hidrogênio e enxaguados com água previamente tratada
com Dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNAses.
Foi utilizado 1 µg de RNA das amostras para avaliação da qualidade do RNA
e analisaram-se parâmetros como: a integridade das bandas dos RNAs
ribossomais 18S e 28S, que reflete integridade do RNA; a presença de rastro
intenso de fundo (background), que reflete a degradação do RNA; a presença de
banda de DNA genômico contaminante de alto peso molecular e permanência de
parte do RNA no poço (contaminação por proteínas) (WIECZOREK,
DELAURIERE, SCHAGAT, 2012).
Os resultados das análises espectrofotoméricas e por meio de eletroforese
estão apresentados abaixo. A concentração e pureza (260/280nm e 260/230nm)
das quatro subamostras do mesmo fígado de Chelonia mydas foram
consideradas adequadas para análises de qPCR (Tabela VI-9).
Pág. 171 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Tabela VI-9 - Subamostras de Chelonia mydas com suas respectivas concentrações
(ng/µl) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230.
Identificação das
subamostras Concentração
(ng/µL) Razão 260/280 Razão 260/230
Cm1 2093,54 1,94 2
Cm 2 2301,01 1,92 1,98
Cm 3 2128,02 1,94 1,97
Cm 4 1919,31 1,95 2,07
Para T. truncatus, apenas o músculo, gordura e pele apresentaram razão
260/230 dentro da faixa esperada (Tabela VI-10). No entanto, amostras que
apresentam essa contaminação ainda podem ser utilizadas nos ensaios
subsequentes em função da robustez do Kit de transcrição reversa da Qiagen
(Quantitect Reverse Transcription kit), dependendo da razão de pureza 260/280 e
da concentração do RNA extraído. Estas foram consideradas adequadas para as
aplicações de qPCR.
Tabela VI-10 - Concentração (ng/µL) e pureza e razões de 260/280 e 260/230 do RNA
extraído de tecidos de Tursiops truncatus.
Tecido Concentração
(ng/µL) Razão 260/280 Razão 260/230
Baço 1320,64 1,87 1,75
Cérebro 1154,13 2,02 1,88
Fígado 1696,20 1,98 1,89
Gordura 315,53 1,82 2,16
Músculo 1125,38 1,96 2,18
Pele 1289,62 1,93 2,00
Pulmão 1052,30 1,98 1,91
Rim 160,94 2,00 1,19
Quanto à integridade do RNA extraído, o gel de RNA desnaturante para
amostras de C. mydas mostrou a presença das bandas de RNA ribossomal 28S e
18S, ausência de DNA genômico e contaminação por proteínas. O rastro foi
menor na primeira subamostra e gradativamente maior até a quarta subamostra
(Figura VI.4-1), que foram utilizadas nas análises preliminares de qPCR.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 172 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura VI.4-1 - Resultado da avaliação da qualidade do RNA das quatro subamostras do
mesmo fígado de Chelonia mydas. Eletroforese em gel de agarose 1,2% desnaturante
(formaldeído) e corado com GelRed (Biotium). Foi aplicado 1 µg de RNA total. Presença
das bandas de RNA ribossomal 28S e 18S e ausência de DNA genômico e contaminação
por proteínas.
Para T. truncatus a qualidade do RNA extraído foi considerada razoável
apenas para os tecidos do fígado, cérebro, gordura, pele e músculo. Não foi
observado DNA genômico nem contaminação por proteínas como contaminantes
nas amostras (Figura VI.4-2). Entretanto, foi observado RNA de baixo peso
molecular em amostras de fígado gordura, músculo e pulmão, indicando
degradação de amostra. O pulmão não apresentou as bandas de RNA ribossomal
e foi excluído do ‘pool’ de amostras. Os tecidos do rim e baço mostraram um
rastro pouco intenso e ausência de bandas, indicando degradação total de
amostra e não foram considerados nas análises de qPCR (dados não
apresentados*).
Pág. 173 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Figura VI.4-2- Resultado da avaliação da qualidade do RNA das amostras de diferentes
tecidos de Tursiops truncatus. A seguir estão descritos os tecidos correspondentes aos
números apresentados na figura: 1) cérebro; 2) fígado; 3) gordura; 4) músculo; 5) pele; e
6) pulmão. *As amostras de rim e baço não aparecem na figura porque o
fotodocumentador foi incapaz de registrar a fraca intensidade do rastro. O pulmão não
apresentou bandas de RNA ribossomal.
VI.4.2 – DESENHO DE INICIADORES e qPCR
Para o desenho dos iniciadores de Chelonia mydas e Tursiops truncatus
foram utilizadas sequências já depositadas no GenBank para estas espécies
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). A fim de garantir que a amplificação seja
restrita a fragmentos do mRNA, não havendo a amplificação de DNA genômico,
os iniciadores foram desenhados em exons distintos ou em regiões de junção
exonexon.
As sequências foram submetidas ao programa de desenho de iniciadores
PrimerQuest, da Integrated DNA Technologies, disponível no endereço eletrônico
https://www.idtdna.com. Os parâmetros especificados para qPCR foram: tamanho
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 174 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
do produto (amplicon) em 120 pb, tamanho do iniciador entre 20 e 26 pb e
temperatura de anelamento entre 58 e 60ºC. Os iniciadores desenhados foram
avaliados quanto à formação de Hairpin, dímeros próprios e não-próprios e
similaridade entre temperatura de dissociação (Tm). Sua qualidade e
complexidade também foram avaliadas pelo programa FastPCR 6.5 (Primer
Digital). Os iniciadores redesenhados encontram-se sumarizados nas Tabelas VI-
11 e VI-12.
Tabela VI-11 - Lista de iniciadores de Chelonia mydas para os genes de interesse do
PMP-BS.
Tabela VI-12 - Lista de iniciadores de Tursiops truncatus para os genes de interesse do
PMP-BS e PMC-BS.
Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3'
CYP1A Citocromo P450 1A F - GGACACAACACTGAACGGCTTCTA R - GTGTCATGGGCAGTGAGGAATCT
E2F1 E2F fator de transcrição 1 F - CGCCAAGAAGTCCAAGAACCACATC R - CTGTCAGCATCCTCGGAAAGCAG
EEF2 Fator de alongamento F - TGATGATGTGGCAGACGCTGTAATG R - TCTGAGAGCTCGTAGAAGAGGGAAATG
HSPA1 Proteína de choque F - AGCACAAGAAGGACATCAGCCAGAAC
Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3'
CYP1A Citocromo P450 1AF - ACATTCCTCCTTCCTGCCCTTCA
R - CATCGTGATTGACTTGCCATTGGTTGAC
F - CCCTCTGAGCAAATGGTGATGGTGATAAA
R - TGAAAGGACTCTTGACTGGGCTACAGE2F1 E2F fator de transcrição 1
EEF2 Fator de alongamento F - CTGTACCAGACCTTCCAGCGTATT
R - AAGCCAGAACCAAAGCCAACAG
F - CAGGCGAAGAAGAAGGTGATGGAGAA
R - TGATGCCCGTGGTGCTGTTACTTAHSPA1-like
Proteína de choque térmico
70 kDa 1A/1B-like
ESR1 Receptor de estrogênio alfaF - CTGGCTCAGCTCCTCCTCATAC
R - CTGGCTCCGATTCTCTTCTTCCATC
F - GTCTGGTTGAACTGGAGGAACAGAAG
R - GTGTCTCTTGGATGGATTGGACTTGG
Receptor de hidrocarbonetos
arilaAHR
UGT1A UDP glucuronosiltransferaseF - ACACAAAGCTAATCAAATGGCTAC
R - GTCTCCAAATAATGGCATCAGAAC
Pág. 175 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
térmico 70 kDa 1B R - GCCCTGGTGATGGACGTGTAGAA
ESR1 Receptor de estrogênio α F - TTGAGGGCATGGTGGAGATCTTTG R - ACTTCAGGGTGCTGGACAGAAATG
AHR primer A Receptor de hidrocarbonetos arila
F - GGCTGTGTCAATGTACCAGTGC R - GATGGGTGGTAGGCTGAGTGTTATTTATG
AHR primer B Receptor de hidrocarbonetos arila
F - ACAGCAGCATCAGAAGCACAGA R - AAGGCACGGATTGGTTCGAGTT
UGT1A UDP glucuronosiltransferase
F - TCCGATGGTGATGATGCCCTTGTT R - GCGGTCCTTGTGAAGGCTAGAGA
Para amplificação dos genes de interesse, foi primeiramente realizada a
síntese de DNA complementar (cDNA), a partir do RNA extraído de C. mydas e T.
truncatus. Para tal, o RNA total foi tratado com DNAse e submetido à reação de
transcrição reversa para obtenção cDNA com o uso do kit Quantitect Reverse
Transcription® (Qiagen).
Todas as reações de PCR quantitativo (qPCR) foram realizadas com o kit
QuantiNova SYBR Green PCR (Qiagen), usando 0,7 µM de cada iniciador (em um
volume final de reação de 20 µL para cada gene.
Uma curva padrão com concentrações conhecidas de cDNA (200 ng, 100 ng,
50 ng, 25 ng e 12,5 ng) foi submetida às reações de qPCR no termociclador Rotor
Gene® (Qiagen) para obtenção da eficiência da reação. Para T. truncatus essa
curva foi obtida a partir de um ‘pool’ formado de volumes iguais dos cDNAs
sintetizados para cada tecido.
A verificação da especificidade dos produtos de PCR formados (amplicons)
para cada gene foi obtida por meio do monitoramento da fluorescência dos
produtos formados em função do aumento da temperatura (60ºC-95ºC) (i.e. curva
de dissociação, do inglês melting curve) no termociclador Rotor Gene® (Qiagen).
Por fim, um gel de agarose 1,2% em condições nativas em tampão TBE foi
produzido para visualmente aferir a especificidade dos iniciadores na reação de
qPCR.
Os iniciadores dos genes CYP1A1, E2F1, EEF2, ESR1, UGT1A amplificaram
seus respectivos transcritos em fígado de Chelonia mydas (Figuras VI.4-3 e VI.4-
4).
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 176 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Figura VI.4-3 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), E2F1 (roxo), EEF2
(laranja), ESR1 (ciano) em fígado de Chelonia mydas. AHR apresentou múltiplos
produtos e não foi mostrado por prejudicar a visualização dos demais picos; HSP não
amplificou. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função
da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de
dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a presença de mais de
um produto.
Os iniciadores de AHR amplificaram múltiplos produtos, sugerindo
inespecificidade do iniciador. Os iniciadores para HSP não amplificaram seu
respectivo gene e, portanto, não há curva de dissociação disponível.
Figura VI.4-4 - Curva de dissociação dos genes UGT1 (vermelho) em fígado de Chelonia
mydas. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função da
temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de
dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a presença de mais de
um produto.
A especificidade do qPCR, testada em gel de agarose 1,2%, indicou que
todos os genes de C. mydas apresentaram um único produto formado,
confirmando a os resultados da curva de dissociação (Figura VI.4-5).
Pág. 177 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Figura VI.4-5 - Gel de agarose 1,2%, nativo, produtos de qPCR formados para os genes
UGT1A, CYP1A1, E2F, EEF2 e ESR1 de Chelonia mydas em duplicata. M representa o
marcador de peso molecular. Presença de outros produtos em E2F.
A análise de eficiência mostrou que a amplificação de todos os genes em
C. mydas, exceto AHR, HSP1A e E2F1, foi considerada satisfatória para a
quantificação de transcritos (0,9 até 1,1). Serão desenhados novos iniciadores
para AHR, HSP1A e E2F1 para amplificar os genes de forma específica e
eficiente.
UGT1A
CYP1A1
E2F
EEF2
ESR1
M
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 178 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela VI-13 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em fígado de Chelonia
mydas. Não foi possível amplificar HSP1A e AHR. E: eficiência. A eficiência de 1,00
significa que os amplicons duplicam a cada ciclo e portanto a reação é 100% eficiente.
No mix de tecidos de T. truncatus, as curvas de dissociação dos produtos
amplificados (amplicons) dos genes CYP1A1 (vermelho), E2F (roxo), ESR1
(rosa), HSP (laranja), UDPGT1 (ciano) mostraram um único produto (amplicon)
(Figura VI.4-6). O par de iniciadores para EEF2 não amplificou seu gene no mix
de tecidos e por isso não há curva de dissociação correspondente. Outro gene
referência será escolhido (e.g. GAPDH) ou novos iniciadores serão desenhados
para esse gene (EEF2).
O par de iniciadores AHR primer A amplificou dois produtos e não será
utilizado neste estudo (Figura VI.4-6).
Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3' E
CYP1A Citocromo P450 1AF - ACATTCCTCCTTCCTGCCCTTCA
R - CATCGTGATTGACTTGCCATTGGTTGAC
F - CCCTCTGAGCAAATGGTGATGGTGATAAA
R - TGAAAGGACTCTTGACTGGGCTACAGE2F1 E2F fator de transcrição 1
EEF2 Fator de alongamento F - CTGTACCAGACCTTCCAGCGTATT
R - AAGCCAGAACCAAAGCCAACAG
F - CAGGCGAAGAAGAAGGTGATGGAGAA
R - TGATGCCCGTGGTGCTGTTACTTAHSPA1-like
Proteína de choque térmico
70 kDa 1A/1B-like
ESR1 Receptor de estrogênio alfaF - CTGGCTCAGCTCCTCCTCATAC
R - CTGGCTCCGATTCTCTTCTTCCATC
F - GTCTGGTTGAACTGGAGGAACAGAAG
R - GTGTCTCTTGGATGGATTGGACTTGG
Receptor de hidrocarbonetos
arilaAHR
UGT1A UDP glucuronosiltransferaseF - ACACAAAGCTAATCAAATGGCTAC
R - GTCTCCAAATAATGGCATCAGAAC
0,96
1,12
1,00
N.A
1,03
N.A
1,00
Pág. 179 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Figura VI.4-6 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), AHR primer A (azul escuro), E2F1 (roxo), ESR1 (rosa), HSP (laranja), UGT1 (ciano) em mix de tecidos de Tursiops truncatus. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a presença de mais de um produto.
A especificidade do qPCR para T. truncatus também foi testada em gel de
agarose 1,2%. Todos os genes apresentaram um único produto formado,
confirmando os resultados da curva de dissociação (Figura VI.4-7).
Figura VI.4-7 - Gel de agarose 1,2%, nativo, produtos de qPCR formados para os genes CYP1A, E2F, ESR1, HSPA, UGT1A e AHR primer B em mix de tecidos de Tursiops truncatus.
A análise de eficiência mostrou que a amplificação de todos os genes em
T. truncatus, exceto EEF2 e AHR, foi considerada satisfatória para a quantificação
de transcritos (0,9 até 1,1). Será utilizado um segundo iniciador para AHR já
desenhado e avaliado nas qPCRs, e um novo iniciador para EEF2 será
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 180 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
desenhado a fim de garantir a amplificação os genes de forma específica e
eficiente.
Tabela VI-14 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em tecidos de Tursiops
truncatus. E: eficiência. A eficiência de 1,00 significa que os amplicons duplicam a cada
ciclo e portanto a reação é 100% eficiente.
Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3' E
CYP1A Citocromo P450 1A F - GGACACAACACTGAACGGCTTCTA R - GTGTCATGGGCAGTGAGGAATCT
1,15
E2F1 E2F fator de transcrição 1
F - CGCCAAGAAGTCCAAGAACCACATC R - CTGTCAGCATCCTCGGAAAGCAG
1,02
EEF2 Fator de alongamento F - TGATGATGTGGCAGACGCTGTAATG R - TCTGAGAGCTCGTAGAAGAGGGAAATG
N.A
HSPA1 Proteína de choque térmico 70 kDa 1B
F - AGCACAAGAAGGACATCAGCCAGAAC R - GCCCTGGTGATGGACGTGTAGAA
1,00
ESR1 Receptor de estrogênio α
F - TTGAGGGCATGGTGGAGATCTTTG R - ACTTCAGGGTGCTGGACAGAAATG
1,00
AHR primer B²
Receptor de hidrocarbonetos arila
F - ACAGCAGCATCAGAAGCACAGA R - AAGGCACGGATTGGTTCGAGTT
não realizado
UGT1A UDP glucuronosiltransferase
F - TCCGATGGTGATGATGCCCTTGTT R - GCGGTCCTTGTGAAGGCTAGAGA
1,00
Além da padronização aqui descrita para C. mydas e T. truncatus, também foi
iniciada a padronização para outras espécies de cetáceos, a partir de material
oriundo de biópsia pelo PMC-BS. No entanto, devido à ausência de informações
gênicas para as demais espécies, foi realizada apenas a extração de RNA e
avaliação quanto à sua concentração, pureza e integridade, seguindo a descrição
metodológica detalhada acima, a fim de determinar se a extração de RNA é
possível e eficiente a partir de quantidades reduzidas de material tegumentar de
cetáceos, como aqueles oriundos de biópsias, método de coleta realizadas pelo
PMC-BS.
Para tal, foram utilizadas massas variadas (25 mg, 50 mg, 75 mg e 100 mg)
de amostras de pele provenientes de uma amostra composta do PMC. Essa
amostra composta, denominada BM66, contém porções de pele de diversos
Pág. 181 / 203
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
cetáceos que foram encontradas fora dos tubos de armazenamento no galão de
nitrogênio por problemas na armazenagem. As amostras constituintes da amostra
composta são: B4; B26; B27; BB56; BM58; BB58; BB63 e BM66.
O resultado da extração deste material encontra-se na Tabela VI-15 e Figura
VI.4-8. A concentração e pureza do RNA de todas as subamostras foram
consideradas adequadas para as aplicações subsequentes de transcrição reversa
e PCR quantitativo (qPCR) (Tabela VI-15). A razão 260/230 da subamostra de 25
mg ficou abaixo de esperado, mas essa razão pode ser otimizada aumentando o
número de lavagens com etanol ou utilizando protocolos para reprecipitação de
RNA em análises futuras.
O sucesso na extração do RNA de uma subamostra de 25mg com Qiazol®
(Qiagen) permitirá a análise de biomarcadores moleculares mesmo quando
houver pouco material biológico disponível.
Tabela VI-15 - Subamostras de tecidos de cetáceos com suas respectivas concentrações
(ng/µL) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230.
Identificação das subamostras
(massa) Concentração
(ng/µL) Razão 260/280 Razão 260/230
BM66 (25 mg) 527,19 1,84 1,18
BM66 (50 mg) 808,56 1,89 2,2
BM66 (75 mg) 1014,45 1,92 2,18
BM66 (100 mg) 1361,86 1,92 2,18
A integridade do RNA foi considerada satisfatória apenas para a subamostra
de 25 mg (Figura VI.4-8). Nas demais subamostras foram observados indicativos
de degradação de RNA, como ausência das bandas 28S e 18S ou presença de
um rastro muito intenso de RNA em relação às bandas dos rRNAs ribossomais.
O motivo da degradação de amostra nas subamostras de 50 mg, 75 mg e 100
mg é desconhecido, uma vez que o mesmo procedimento de extração de RNA foi
adotado para todas as subamostras (i.e. mesmos reagentes, temperaturas de
incubação, mesma centrífuga, mesmo pesquisador). A hipótese mais plausível é a
degradação da amostra em função do acondicionamento inadequado durante o
transporte, que provocou a abertura dos tubos e subsequente queda das biópsias
dentro do container de nitrogênio. Conforme mencionado anteriormente, este
teste foi realizado com o material biológico presente no tubo BM66, sem a prévia
identificação individual das amostras. A porção da amostra utilizada para compor
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VI. Padronização de técnicas
para análise de
biomarcadores moleculares
Pág. 182 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
a subamostra de 25 mg possivelmente não é a mesma porção utilizada para as
subamostras de 50 ou 75 ou 100 mg. Desta maneira, recomenda-se cautela nas
comparações diretas entre as subamostras.
Vale ressaltar que este procedimento foi realizado com o intuito de verificar
qual a massa mínima possível de ser utilizada para extração de RNA. A partir dos
resultados obtidos, podemos garantir que todos os ensaios previstos podem ser
realizados com as amostras provenientes de biópsia remota no âmbito do PMC-
BS, que apresentam restrição em termos de massa.
A
B
Figura VI.4-8 - Gel de RNA 1,2%, desnaturante, mostrando resultado da avaliação da qualidade do RNA para as subamostras de pele de cetáceos (amostra BM66) com massas de 25 mg, 50 mg, 75 mg e 100 mg. Foi aplicado 1 µg de RNA total em cada poço e as amostras foram coradas com GelRed® (Biotium). A. Imagem obtida com luz ultravioleta. B. Mesma imagem trabalhada no Programa Adobe Photoshop para melhor visualização das bandas. As setas indicam: seta superior banda do gene 28S e seta inferior, gene 18S.
Pág. 183 / 203
VII. Conclusões Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
VII – CONCLUSÕES
Analisando os dados referentes à padronização das técnicas de
biomarcadores bioquímicos e moleculares em tetrápodes marinhos apresentados
neste relatório, é possível constatar que foram atingidas as diversas metas
traçadas para o primeiro ano de padronização, com exceção da etapa de
padronização da imunoquantificação de CYP1A, que está aguardando a
instalação do fotodocumentador.
Os testes de padronização realizados entre dezembro de 2016 e dezembro
de 2017 permitiram otimizar a concentração de substratos e temperatura
utilizadas nos ensaios GST e EROD para cada espécie de tetrápode avaliada.
Ambos os ensaios enzimáticos para aves e cetáceos deverão ser realizados a
37ºC. Para Chelonia mydas, os ensaios deverão ser realizados a 30ºC.
Para o ensaio GST em tecido hepático de Spheniscus magellanicus, Larus
dominicanus, e C. mydas, os substratos CDNB e GSH deverão ser utilizados em
concentrações de 2,5 mM. Para análises em tecidos hepático e tegumentar de
Stenella frontalis e Sotalia guianensis, e em pele de Tursiops truncatus e
Balaenoptera borealis, GSH deverá ser utilizada em concentrações de 5 mM e
CDNB em concentrações de 2,5 mM.
Para EROD, ensaios com amostras de fígado de C. mydas e S. magellanicus
deverão utilizar 7-ER em concentrações de 4 µM e NADPH a 1 mM. Ensaios com
fígado de L. dominicanus deverão utilizar 7-ER em concentrações de 2 µM e
NADPH a 1 mM. Para tecido hepático de S. frontalis, 7-ER deverá ser utilizada
em concentrações de 0,5 µM e NADPH a 1 mM, enquanto para tecido hepático de
S. guianensis deverá ser utilizada concentração de 7-ER de 1 µM e NADPH a 0,5
mM. A padronização de atividade EROD em tecido tegumentar de cetáceos não
pôde ser realizada devido à inexistência de atividade EROD nesta matriz tecidual.
Sendo assim, somente será utilizado o protocolo estabelecido para a
quantificação de EROD no fígado.
Nossos resultados também permitiram identificar que, para algumas espécies
avaliadas, a atividade EROD apresenta um modelo cinético de inibição por
substrato, reforçando a necessidade de padronização espécie-específica das
concentrações de 7-ER para evitar a inibição enzimática.
A Tabela VII.1 apresenta o resumo das condições de ensaio de GST e EROD
em tetrápodes marinhos.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VII. Conclusões Pág. 184 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Tabela VII-1 - Resumo das condições dos ensaios GST e EROD em tetrápodes
marinhos.
Grupo
Taxonômico Espécie
Matriz Tecidual
Atividade EROD Atividade GST
Répteis Chelonia mydas
Fígado
Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER 4 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 30ºC.
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (2,5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 30°C.
Aves Spheniscus
magellanicus Fígado
Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER (4 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 37ºC.
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (2,5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 37°C.
Larus
dominicanus Fígado
Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), de 7-ER (2 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 37ºC.
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (2,5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 37°C.
Cetáceos Stenella frontalis
Fígado e Pele
Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER (0,5 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 37ºC.
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 37°C.
Sotalia guianensis
Fígado e Pele
Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER (1 µM) e NADPH (0,5 mM). Temperatura de 37ºC.
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 37°C.
Tursiops truncatus
Pele Sem atividade na pele
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 37°C.
Balaenoptera borealis
Pele Sem atividade na pele
Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 37°C.
Considerando-se a alteração nas espécies prioritárias definidas na reunião
realizada em maio de 2018 com representantes do IBAMA, deverá ser realizado
ensaio GST e EROD em fígado de Puffinus puffinus, e pele de Stenella
longirostris e Balaenoptera brydei. Os testes de padronização das condições
ideiais para cada espécie ocorrerão entre os meses de junho e setembro de 2018.
Além da padronização das condições de ensaio dos biomarcadores, testes
preliminares de estabilidade temporal realizados com espécimes de L.
dominicanus evidenciaram decaimento da atividade EROD a partir da segunda
Pág. 185 / 203
VII. Conclusões Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
hora após a morte. Este padrão, no entanto, não foi observado para atividade
GST, que se manteve constante ao longo do tempo post mortem. Estes
resultados suportam a análise de atividade GST em L. dominicanus coletados em
código 2 pelo PMP-BS e a realização de análises de atividade EROD apenas em
L. dominicanus amostrados imediatamente após a morte. Coletivamente,
esses resultados indicam que o tempo decorrido desde a morte do indivíduo até a
coleta de material biológico pode alterar a integridade da amostra afetando a
quantificação do biomarcador. Dependendo do biomarcador, o efeito do tempo
post mortem poderá afetar mais ou menos a análise de atividade enzimática. Com
base nos dados obtidos neste relatório, recomendamos que o tempo post mortem
de coleta para biomarcadores não ultrapasse preferencialmente 30 minutos, pois
torna-se, difícil ter certeza da qualidade da amostra. Para minimizar este
problema, uma estratégia seria processar todas as amostras das espécies alvo
com código 2 e realizar as análises bioquímicas e moleculares posteriores
somente naquelas amostras que apresentarem uma boa qualidade de RNA. Esta
avaliação será realizada utilizando-se equipamento específico, a ser adquirido em
breve. Mesmo assim, será importante ter cautela na interpretação dos resultados.
Além da padronização bioquímica, dados preliminares da padronização de
análises de biomarcadores moleculares reforçam a possibilidade de extração de
RNA de amostras diminutas, de até 25 mg, de tecido tegumentar de cetáceos,
quadro similar àquele observado para o material de biópsia oriundo do PMC-BS, e
indicam que a maioria dos iniciadores desenhados pela equipe do LABCAI/UFSC
apresentaram eficiência e especificidade satisfatórios para análises de qPCR em
fígado de C. mydas e T. truncatus. Novos iniciadores serão desenhados para
substituir aqueles que não apresentaram índices satisfatórios.
Nas próximas etapas deste trabalho está prevista a padronização da
metodologia da imunoquantificação da isoforma de citocromo P450 (CYP1A) por
meio da técnica de imunoblot. Esta etapa iniciou em meados de abril de 2018,
após a chegada e instalação do fotodocumentador adquirido com recursos deste
projeto, com testes com anticoporpos comerciais.
As seis espécies prioritárias para o desenvolvimento da metodologia de
biomarcadores moleculares foram: C. mydas, L. dominicanus, T. truncatus, S.
longirostris, B. brydei e P. puffinus. Essas espécies foram também aprovadas em
reunião com o IBAMA realizada em 07/05/2018. . Para tal, será necessário o
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
VII. Conclusões Pág. 186 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
sequenciamento dos transcriptomas de S. longirostris e B. brydei, P. puffinus e L.
dominicanus.
Pág. 187 / 203
VIII. Próximas etapas Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
VIII – PRÓXIMAS ETAPAS
Dando continuidade a este serviço será realizada a padronização das
condições de quantificação da expressão da isoforma de citocromo P450 1A
(CYP1A) em tecido hepático de quelônios, aves e cetáceos (PMP-BS) e
tegumentar de cetáceos (PMC-BS).
Serão sequenciados os transcriptomas das espécies alvo definidas em
reunião com representantes do IBAMA: Larus dominicanus, Puffinus puffinus,
Stenella longirostris e Baleonoptera brydei. Posteriormente será dada
continuidade à padronização das técnicas moleculares a partir da identificação
das sequências de nucleotídeos dos genes alvo nas espécies escolhidas.
Adicionalmente, será realizada a padronização das técnicas bioquímicas
para a espécie de ave Puffinus puffinus, e dos cetáceos Stenella longirostris e
Baleonoptera brydei.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IX. Bibliografia Pág. 188 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
IX - BIBLIOGRAFIA
ABBASI, N.A.; ARUKWE, A.; JASPERS, V.L.B.; EULAERS, I.; MENNILO, E.;
IBOR, O.R.; FRANTZ, A.; COVACI, A.; MALIK, R.N. Oxidative stress responses in
relationship to persistent organic pollutant levels in feathers and blood of two
predatory bird species from Pakistan. Science of the Total Environment, v. 580,
p. 26-33. 2017.
ABU HAFSA, S.H.; IBRAHIM, S.A. Effect of dietary polyphenol-rich grape seed on
growth performance, antioxidant capacity and ileal microflora in broiler chicks.
Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, v. 102, p. 268-275. 2017.
ALMEIDA, A.P.; SANTOS, A.J.B.; THOMÉ, J.C.A.; BELINI, C.; BAPTISTOTTE,
C.; MARCOVALDI, M.A.; SANTOS, A.S.; LOPEZ, M. Avaliação do Estado de
Conservação da Tartaruga Marinha Chelonia mydas (Linnaeus, 1758) no Brasil.
Biodiversidade Brasileira, v. 1, p. 12-19. 2011.
ANDRIOLO, A.; ZERBINI, A.N. Migração de baleias-jubarte: o que falta conhecer?
Revista de Etologia, v. 9, p. 31-33. 2010.
ADDISON, R.F.; BRODIE, P.F.; EDWARDS, A.; SADLER, M.C. Mixed function
oxidase activity in the harbor seal (Phoca vitulina) from Sable is, N.S.
Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative
Pharmacology, v. 85, p. 121-124. 1986.
AKKEMIK, E.; TASER, P.; BAYINDIR, A.; BUDAK, H.; CIFTCI, M. Purification and
characterization of glutathione S-transferase from turkey liver and inhibition effects
of some metal ions on enzyme activity. Environmental Toxicology and
Pharmacology, v. 34, n. 3, p. 888-894. 2012.
BACHMAIR, A.; FINLEY, D.; VARSHAVSKY, A. In vivo half-life of a protein is a
function of its amino-terminal residue. Science, v. 234, p. 179-186. 1986.
BALDASSIN, P.; TANIGUCHI, S.; GALLO, H.; MARANHO, A.; KOLESNIKOVAS,
C.; AMORIM, D.B.; MANSILLA, M.; NAVARRO, R.M.; TABEIRA, L.C.; BICEGO,
M.C.; MONTONE, R.C. Persistent organic pollutants in juvenile Magellanic
Penguins (Spheniscus magellanicus) in South America. Chemosphere, v. 149, p.
391-399. 2016.
Pág. 189 / 203
IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
BASTOS, F.F.; HAUSER-DAVIS, R.A.; TOBAR, S.A.L.; CAMPOS, R.C.; ZIOLLI,
R.L.; CUNHA BASTOS, V.L.F.; CUNHA BASTOS, J. Enzymatic GST levels ans
overall health of mullets from contaminated Brazilian lagoons. Aquatic
Toxicology, v. 126, p. 414-423. 2013.
BEARZI, G.; BJØRGE, A.; FORNEY, K.A.; HAMMOND, P.S.; KARKZMARSKI, L.;
KASUYA, T.; PERRIN, W.F.; SCOTT, M.D.; WANG, J.Y.; WELLS, R.S.; WILSON,
B. Stenella longirostris. The IUCN Red List of Threatened Species 2012:
e.T20733A17837287.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2012.RLTS.T20733A178
37287.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.
BEGER, R.; YU, L.R.; DANIELS, J.; MATTES, W.B. Exploratory biomarkers:
Analytical approaches and their implications. Current Opinion in Toxicology, v.
4. p. 59-65. 2017.
BENJAKUL, S.; SEYMOUR, T.A.; MORRISSEY, M.T.; AN, H. Physicochemical
changes in Pacific Whiting Muscle proteins during iced storage. Journal of food
Science, v. 62, p. 729-733. 1997.
BIAZUS, A.H.; SILVA, A.S.; BOTTARI, N.B.; BALDISSERA, M.D.; CARMO, G.M.;
MORSCH, V.M.; SCHETINGER, M.R.C.; CASAGRANDE, R.; GUARDA, N.S.;
MORESCO, R.N.; STEFANI, L.M.; CAMPIGOTTO, G.; BOIAGO, M.M. Fowl
typhoid in laying hens cause hepatic oxidative stress. Microbial Pathogenesis, v.
103, p. 162-166. 2017.
BISHOP, C.; NG, P.; PETTIT, K.; KENNEDY, S.; STEGEMAN, J.; NORSTROM,
R. Environmental contamination and developmental abnormalities in eggs and
hatchlings of the common snapping turtle (Chelydra serpentina serpentina) from
the Great lakes-St. Lawrence river basin (1989-91). (R827102). Environmental
Pollution, v. 101, p. 143-156. 1998.
BISSWANGER, H. Practical Enzymology. 2a ed. Weinheim: Wiley-Blackwell,
2011.
BISSWANGER, H. Enzyme assays. Perspectives in Science, v. 1, p. 41-55.
2014.
BOON, J.P.; OOSTINGH, I.; VAN DER MEER, J.; HILLEBRAND, T.J. A model for
the bioaccumulation of chlorobiphenyl congeners in marine mammals. European
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IX. Bibliografia Pág. 190 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
Journal of Pharmacology: Environmental Toxicology and Pharmacology, v.
270, p. 237-251. 1994.
BOON, J.P.; SLEIDERINK, H.M.; HELLE, M.S.; DEKKER, M.; SCHANKE, A.;
ROEX, E.; HILLEBRAND, M.T.J.; KLAMER, H.J.C.; GOVERS, B.; PASTOR, D.;
MORSE, D.; WESTER, P.G.; BOER, J. The use of a microsomal in vitro assay to
study phase I biotransformation of chlorobornanes (Toxaphene®) in marine
mammals and birds. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:
Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, v. 121, p. 385-403. 1998.
BOON, J.P.; LEWIS, W.E.; GOKSOYR, A. Immunochemical and catalytic
characterization of hepatic microsomal cytochrome P450 in the sperm whale
(Physeter macrocephalus). Aquatic Toxicology, v. 52, p. 297-309. 2001.
BORGÅ, K.; WOLKERS, H.; SKAARE, J.U.; HOP, H.; MUIR, D.C.G.;
GABRIELSEN, G.W. Bioaccumulation of PCBs in Arctic seabirds: influence of
dietary exposure and congener biotransformation. Environmental Pollution, v.
134, p. 397-409. 2005.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry, v. 72, p. 248-254. 1976.
BURKE, M.D.; MAYER, R.T. Ethoxyresorufin: direct fluometric assay of a
microsomal o-dealkylation which is preferentially inducible by 3-
methylchloranthrene. Drug Metabolism and Disposition, v. 2, p. 583-588. 1974.
BUTZBACH, D.M. The influence of putrefaction and sample storage on post-
mortem toxicology results. Forensic Science, Medicine, and Pathology, v. 6, p.
35-45. 2010.
CANTÚ-MEDELLIN, N.; BYRD, B.; HOHN, A.; VÁZQUEZ-MEDINA, J.P.;
ZENTENO-SAVÍN, T. Differential antioxidant protection in tissues from marine
mammals with distinct diving capacities. Shallow/short vs. deep/long divers.
Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, v. 158, p. 438-443. 2011.
CARDOSO, M.D.; DE MOURA, J.F.; TAVARES, D.C.; GONÇALVES, R.A.;
COLABUONO, F.I.; ROGES, E.M.; DE SOUZA, R.L.; RODRIGUES, D.P.;
MONTONE, R.C.; SICILIANO, S. The Manx shearwater (Puffinus puffinus) as a
Pág. 191 / 203
IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
candidate sentinel of Atlantic Ocean health. Aquatic Biosystems, v. 1, p. 10-6.
2014.
CHANG, T.K.H.; WAXMAN, D.J. Cytochrome P450 Nomenclature. In: PHILLIPS,
I.R.; SHEPHARD, E.A. (Ed.). Cytochrome P450 Protocols. 2. ed. New Jersey:
Humana Press Inc, 2006. p. 73-84.
COULSON, R.; COULSON, G. Diets of the Pacific Gull Larus pacificus and the
Kelp Gull Larus dominicanus in Tasmania. EMU, v. 93, p. 50-53. 1992.
DANILEWICZ, D.; OTT, P.; SECCHI, E.; ANDRIOLO, A.; ZERBINI, A. Occurrence
of the Atlantic spotted dolphin, Stenella frontalis, in the southern Abrolhos Bank,
Brazil. Marine Biodiversity Records, v. 6, p. 1-3. 2013.
DEN BESTEN, P.J. Concepts for the implementation of biomarkers in
environmental monitoring. Marine Environmental Research, v. 46, p. 253-256.
1998.
ESPÍN, S.; GARCÍA-FERNÁNDEZ, A.J.; HERZKE, D.; SHORE, R.F.; VAN
HATTUM, B.; MARTÍNEZ-LÓPEZ, E.; COEURDASSIER, M.; EULAERS, I.;
FRITSCH, C.; GÓMEZ-RAMÍREZ, P.; JASPERS, V.L.; KRONE, O.; DUKE, G.;
HELANDER, B.; MATEO, R.; MOVALLI, P.; SONNE, C.; VAN DEN BRINK, N.W.
Tracking pan-continental trends in environmental contamination using sentinel
raptors - what types of samples should we use? Ecotoxicology, v. 25, p. 777-801.
2016.
ESPÍN, S.; RUIZ, S.; SANCHEZ-VIROSTA, P.; LILLEY, T.; EEVA, T. Oxidative
status in relation to metal pollution and calcium availability in pied flycatcher
nestlings – A calcium manipulation experiment. Environmental Pollution, v. 229,
p. 448-458. 2017.
FOCARDI, S.; FOSSI, M.C.; LEONZIO, L.L.; MARZILI, L. Mixed function oxidase
activity and chlorinated hydrocarbon residues in antarctic sea birds: south polar
skua (Catharacta maccormickl) and adélie penguin (Pygoscelis adeliae). Marine
Environmental Research, v. 34, p. 201-205. 1992.
FOSSI, M.C.; CASINI, S.; MALTESE, S.; PANTI, C.; MARSILI, L. Skin biopsy
slices of cetaceans as a multi-response “in vitro” method to detect toxicological
effects of lipophilic contaminants. Technical Report of International Whaling
Commission Agadir, Morocco, SC/62/E10. 2010.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IX. Bibliografia Pág. 192 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
FOSSI, M.C.; PANTI, C.; MARSILI, L.; MALTESE, S.; SPINSANTI, G.; CASINI, S.;
CALIANI, I.; GASPARI, S.; MUÑOZ-ARNANZ, J.; JIMENEZ, B.; FINOIA, M.G. The
Pelagos Sanctuary for Mediterranean marine mammals: Marine Protected Area
(MPA) or marine polluted area? The case study of the striped dolphin (Stenella
coeruleoalba). Marine Pollution Bulletin, v. 70, n. 1-2, p. 64-72. 2013.
FOSSI, M.C.; PANTI, C.; MARSILI, L.; MALTESE, S.; COPPOLA, D.; JIMENEZ,
B.; MUÑOZ-ARNANZ, J.; FINOIA, M.G.; ROJAS-BRACHO, L.; URBAN, R.J.
Could feeding habit and migratory behaviour be the causes of different
toxicological hazard to cetaceans of Gulf of California (Mexico)? Environmental
Science and Pollution Research, v. 21, n. 23, p. 13353-13366. 2014.
FOX, G.A.; WHITE, P.A.; TRUDEAU, S.; THEODORAKIS, C.; SHUTT, L.J.;
KENNEDY, S.W.; FERNIE, K.J. DNA strand length and EROD activity in relation
to two screening measures of genotoxic exposure in Great Lakes herring
gulls. Ecotoxicology, v. 14, p. 527-544. 2005.
GARRICK, R.A.; WOODIN, B.R.; WILSON, J.Y.; MIDDLEBROOKS, B.L.;
STEGEMAN, J.J. Cytochrome P4501A is induced in endothelial cell lines from the
kidney and lung of the bottlenose dolphin, Tursiops truncatus. Aquatic
Toxicology, v. 76, p. 295-305. 2006.
GOKSOYR, A.; SOLBAKKEN, J.E.; TARLEBO, J.; KLUNGSOYR, J. Initial
characterization of the hepatic microsomal cytochrome P-450-System of the Piked
Whale (Minke) Balaenoptera acutorostrata. Marine Environmental Research, v.
19, p. 185-203. 1986.
GOKSOYR, A.; ANDERSSON, T.; FORLIN, L.; STENERSEN, J.;
SNOWBERGER, E.A.; WOODIN, B.R.; STEGEMAN, J.J. Xenobiotic and steroid
metabolism in adult and foetal Piked (Minke) whales, Balaenoptera acutorostrata.
Marine Environmental Research, v. 24, p. 9-13. 1988.
GUILFORD, T.; MEADE, J.; WILLIS, J.; PHILLIPS, R.A.; BOYLE, D.; ROBERTS,
S.; COLLET, M.; FREEMAN, R.; PERRINS, C.M. Migration and stopover in a
small pelagic seabird, the Manx shearwater Puffinus puffinus: insights from
machine learning. Proceedings of the Royal Society B: Biological
Sciences, v. 276, p. 1215-1223. 2009.
Pág. 193 / 203
IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
GURUGE, K.S.; TANABE, S. Congener specific accumulation and toxic
assessment of polychlorinated biphenyls in common cormorants, Phalacrocorax
carbo, from Lake Biwa, Japan. Environmental Pollution, v. 96, p. 425-433. 1997.
GUSTAFSSON, J.A.; MODE, A.; NORSTEDT, G.; SKETT, P. Sex steroid induced
changes in hepatic enzymes. Annual Review Physiology, v. 45, p. 51-60. 1983.
HABIG, W.H.; JAKOBY, W.B. Assays for differentiation of glutathione S-
transferases. Methods in Enzymology, v. 77, p. 398-405. 1981.
HAMMOND, P.S.; BEARZI, G.; BJØRGE, A.; FORNEY, K.A.; KARKZMARSKI, L.;
KASUYA, T.; PERRIN, W.F.; SCOTT, M.D.; WANG, J.Y.; WELLS, R.S.; WILSON,
B. 2012. Stenella frontalis. The IUCN Red List of Threatened Species 2012:
e.T20732A17832795.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2012.RLTS.T20732A178
32795.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.
HANNEMANN, F.; BICHET, A; EWEN, K.M.; BERNHARDT, R. Cytochrome P450
systems-biological variations of electron transport chains. Biochimica et
Biophysica Acta - General Subjects, v. 1770, p. 330-344. 2007.
HERNANDEZ-FERNANDEZ, J. Data of first de-novo transcriptome assembly of a
non-model species, hawksbill sea turtle, Eretmochelys imbricate, nesting of the
Colombian Caribean. Data in Brief, v. 15, p. 573-576. 2017.
HERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ, J.; PINZÓN, A.; MARIÑO-RAMÍREZ, L. De novo
transcriptome assembly of loggerhead sea turtle nesting of the Colombian
Caribbean. Genomic Data, v. 13, p. 18-20. 2017.
HIRTH, H.F. Synopsis of the biological data on Green Turtle Chelonia mydas
(Linnaeus 1758). U.S. Fish and Wildlife Service. 1997.
HUGGETT, R.J.; KIMERLE, R.A.; MEHRLE, R.A.; BERGMAN, H.L. Biomarkers:
Biochemical, physiological, and histological markers of anthropogenic stress.
Lewis Publishers. 1992. 347 p.
IUCN, 2016a. BirdLife International. Larus dominicanus. The IUCN Red List of
Threatened Species 2016: e.T22694329A93448691.
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-3.RLTS.T22694329A93448691.en.
Acesso em: 10 de dezembro de 2017.
IUCN, 2016b. BirdLife International. Puffinus puffinus. The IUCN Red List of
Threatened Species 2016: e.T22698226A86238815.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IX. Bibliografia Pág. 194 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-3.RLTS.T22698226A86238815.en.
Acesso em: 10 de dezembro de 2017.
IUCN, 2017a. BirdLife International. Spheniscus magellanicus. (amended version
published in 2016) The IUCN Red List of Threatened Species 2017:
e.T22697822A119167908. Acesso em: 10 de dezembro de 2017.
IUCN, 2017b. BirdLife International. Sula leucogaster. (amended version
published in 2016) The IUCN Red List of Threatened Species 2017:
e.T22696698A111794509. http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2017-
1.RLTS.T22696698A111794509.en. Acesso em: 10 de dezembro de 2017.
JENKO, K.; KAROUNA-RENIER, N.K.; HOFFMAN, D.J. Gene expression,
glutathione status, and indicators of hepatic oxidative stress in laughing gull (Larus
atricilla) hatchlings exposed to methylmercury. Environmental Toxicology and
Chemistry, v. 31, n. 11, p. 2588-2596. 2012.
JIAO, X.; YANG, K.; AN, Y.; TENG, X.; TENG, X. Alleviation of lead-induced
oxidative stress and immune damage by selenium in chicken bursa of Fabricius.
Environmental Science and Pollution Research, v. 24, n. 8, p. 7555-7564.
2017.
KEEN, J.H.; HABIG, W.H.; JAKOBY, W.B. Mechanism for the several activities of
the glutathione S-transferase. Journal of Biological Chemistry, v. 251, p. 6183-
6188. 1976.
KEHRIG, H.A.; HAUSER-DAVIS, R.A.; SEIXAS, T.G.; FILLMANN, G. Trace-
elements, methylmercury and metallothionein levels in Magellanic penguin
(Spheniscus magellanicus) found stranded on the Southern Brazilian coast.
Marine Pollution Bulletin, v. 96, p. 450-455. 2015.
KEMP, C.J.; KÜLTZ, D. Controlling proteome degradation in Daphnia pulex.
Journal of Experimental Zoology, v. 317, p. 645-651. 2012.
KENNEDY, S.W.; FOX, G.A.; JONES, S.P.; TRUDEAU, S.F. Hepatic EROD
activity is not a useful biomarker of polychlorinated biphenyl exposure in the adult
herring gull (Larus argentatus). Ecotoxicology, v. 12, p.153-161. 2003.
KLOTZ, A.V.; STEGEMAN, J.J.; WALSH, C. An alternative 7-Ethoxyresorufin O-
deethylase activity assay: A continuous visible spectrophotometric method for
Pág. 195 / 203
IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
measurement of cytochrome P-450 monooxygenase activity. Analytical
Biochemistry, v. 140, p. 138-145. 1984.
KUBOTA, K.; KIM, E.Y.; IWATA, H. Alkoxyresorufin (methoxy-, ethoxy-, pentoxy-
and benzyloxyresorufin) O-dealkylase activities by in vitro-expressed cytochrome
P450 1A4 and 1A5 from common cormorant (Phalacrocorax carbo). Comparative
Biochemistry and Physiology, Part C, v. 149, p. 544-551. 2009.
LABRADA-MARTAGNÓN, V.; RODRÍGUEZ, T.; MÉNDEZ-RODRÍGUEZ, L.C.;
ZENTENO-SAVÍN, T. Oxidative stress indicators and chemical contaminants in
East Pacific green turtles (Chelonia mydas) inhabiting two foraging coastal
lagoons in the Baja California peninsula. Comparative Biochemistry and
Physiology Part C, v. 154, p. 65-75. 2011.
LEE, D.S. The pelagic ecology of Manx Shearwaters Puffinus puffinus off the
southeastern. United States of America. Marine Ornithology, v. 23, p. 107-119,
1995.
LIN, Y.; LU, P.; TANG, C.; MEI, Q.; SANDIG, G.; RODRIGUES, A.D.;
RUSHMORE, T.H.; SHOU, M. Substrate inhibition kinectics for cytochrome P450-
catalyzed reactions. Drug Metabolism and Disposition, v. 29, p. 368-374. 2001.
LIUKKONEN-ANTTILA, T.; HONKANEN, H.; PELTOKANGAS, P.; PELKONEN,
O.; HOHTOLA, E. Cytochrome P450 enzyme activity in five herbivorous, non-
passerine bird species. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:
Toxicology & Pharmacology, v. 134, p. 69-77. 2003.
LOPES, X.M.; SANTOS, M.C.O.; SILVA, E.; BASSOI, M.; SANTOS, R.A. Feeding
habits of the atlantic spotted dolphin, Stenella frontalis, in southeastern
Brazil. Brazilian Journal of Oceanography, v. 60, p. 189-198. 2012.
LÜCHMANN, K.H.; MATTOS, J.J.; SIEBERT, M.N.; GRANUCCI, N.;
DORRINGTON, T.S.; BÍCEGO, M.C.; TANIGUCHI, S.; SASAKI, S.T.; DAURA-
JORGE, F.G.; BAINY, A.C.D. Biochemical biomarkers and hydrocarbons
concentrations in the mangrove oyster Crassostrea brasiliana following exposure
to diesel fuel water-accomodated fraction. Aquatic Toxicology, v. 105, p. 652-
660. 2011.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IX. Bibliografia Pág. 196 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
LUDYNIA, K.; GARTHE, S.; LUNA-JORQUERA, G. Seasonal and Regional
Variation in the Diet of the Kelp Gull in Northern Chile. Waterbirds, v. 28, p. 359-
365. 2005.
MATEO, R.; BEYER, W.N.; SPANN, J.W.; HOFFMAN, D.J.; RAMIS, A.
Relationship between oxidative stress, pathology, and behavioral signs of lead
poisoning in mallards. Journal of Toxicology and Environmental Health Part A,
v. 66, p. 1371-1389. 2003.
McKINNEY, M.A.; ARUKWE, A.; De GUISE, S.; MARTINEAU, D.; BÉLAND, P.;
DALLAIRE, A.; LAIR, S.; LEBEUF, M.; LETCHER, R.J. Characterization and
profiling of hepatic cytochromes P450 and phase II xenobiotic-metabolizing
enzymes in beluga whales (Delphinapterus leucas) from the St. Lawrence River
Estuary and the Canadian Arctic. Aquatic Toxicology, v. 69, p. 35-49. 2004
MILLER, K.A.; ASSUNÇAO, A.G.L.; DANGERFIELD, N.J.; BANDIERA, S.M.;
ROSS, P.S. Assessment of cytochrome P450 1A in harbor seals (Phoca vitulina)
using a minimally-invasive biopsy approach. Marine Environmental Research, v.
60, p. 153-169. 2005
MOREY, J.; NEELY, M.G.; LUNARDI, D.; ANDERSON, P.E.; SCHWACKE, L.H.;
CAMPBELL, M.; VAN DOLAH, F. RNA-Seq analysis of seasonal and individual
variation in blood transcriptomes of healthy managed bottlenose dolphins. BMC
Genomics, v. 17. 2016.
NASH, S.B.; DAWSON, A.; BURKHARD, M.; WAUGH, C.; HUSTON, W.
Detoxification enzyme activities (CYP1A1 and GST) in the skin of humpback
whales as a function of organochlorine burdens and migration status. Aquatic
Toxicology, v. 155, p. 207-212. 2014.
NUMATA, M.; FAWCETT, J.P.; ROSENGREN, R.J. Induction of in vitro EROD
activity and in vivo caffeine metabolism in two species of New Zealand
birds. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 25, p. 358-364. 2008.
NYMAN, M.; RAUNIO, H.; PELKONEN, O. Expression and inducibility of members
in the cytochrome P4501 (CYP1) family in ringed and grey seals from polluted and
less polluted waters. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 8, p.
217-225. 2000.
Pág. 197 / 203
IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
PANTI, C.; SPINSANTI, G.; MARSILI, L.; CASINI, S.; FRATI, F.; FOSSI, M.C.
Ecotoxicological diagnosis of striped dolphin (Stenella coeruleoalba) from the
Mediterranean basin by skin biopsy and gene expression approach.
Ecotoxicology, v. 20, p. 1791-1800. 2011.
PETROBRAS. 2º RELATÓRIO ANUAL do PROJETO DE MONITORAMENTO DE
CETÁCEOS NA BACIA DE SANTOS – PMC-BS. Volume único. 2017.
PINTO, M.B.L.C.; SICILIANO, S.; DI BENEDITTO, APM. Stomach contents of the
Magellanic Penguin Spheniscus magellanicus from the northern distribution limit
on the Atlantic coast of Brazil. Marine Ornithology, v. 35, p. 77-78. 2007.
POLOZ, Y.O.; O’DAY, D.H. Determining time of death: temperature-dependent
postmortem changes in calcineurin A, MARCKS, CaMKII, and protein phosphate
2A in mouse. International Journal of Legal Medicine, v. 123, p. 305-314. 2009.
RAINIO, M.J.; KANERVA, M.; WAHLBERG, N.; NIKINMAA, M.; EEVA, T.
Variation of basal EROD activities in ten passerine bird species-relationships with
diet and migration status. PLoS ONE, v. 7, p. e33926. 2012.
REDDY, S.; KIMBALL, R.T.; PANDEY, A.; HOSNER, P.A.; BRAUN, M.J.;
HACKETT, S.J.; HAN, K.L.; HARSHMAN, J.; HUDDLESTON, C.J.; KINGSTON,
S.; MARKS, B.D.; MIGLIA, K.J.; MOORE, W.S.; SHELDON, F.H.; WITT, C.C.;
YURI, T.; BRAUN, E.L. Why do phylogenomic data sets yield conflicting trees?
Data type influences the avian tree of life more than taxon sampling. Systematic
Biology, v. 66, p. 857-879. 2017.
REILLY, S.B.; BANNISTER, J.L.; BEST, P.B.; BROWN, M.; BROWNELL JR.,
R.L.; BUTTERWORTH, D.S.; CLAPHAM, P.J.; COOKE, J.; DONOVAN, G.P.;
URBÁN, J.; ZERBINI, A.N. 2008a. Balaenoptera borealis. The IUCN Red List of
Threatened Species 2008: e.T2475A9445100.
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2008.RLTS.T2475A9445100.en. Acesso em:
11 de dezembro de 2017.
REILLY, S.B.; BANNISTER, J.L.; BEST, P.B.; BROWN, M.; BROWNELL JR.,
R.L.; BUTTERWORTH, D.S.; CLAPHAM, P.J.; COOKE, J.; DONOVAN, G.P.;
URBÁN, J.; ZERBINI, A.N. 2008b. Megaptera novaeangliae. The IUCN Red List
of Threatened Species 2008: e.T13006A3405371.
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2008.RLTS.T13006A3405371.en. Acesso em:
11 de dezembro de 2017.
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IX. Bibliografia Pág. 198 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
RICHARDSON, K.L.; GOLD-BOUCHOT, G.; SCHLENK, D. The characterization
of cytosolic glutathione transferase from four species of sea turtles: Loggerhead
(Caretta caretta), green (Chelonia mydas), olive ridley (Lepidochelys olivacea),
and hawksbill (Eretmochelys imbricata). Comparative Biochemistry and
Physiology, Part C, v. 150, p. 279-284. 2009.
RICHARDSON, K.L.; LOPEZ CASTRO, M.; GARDNER, S.C.; SCHLENK, D.
Polychlorinated biphenyls and biotransformation enzymes in three species of sea
turtles from the Baja California, Peninsula of Mexico. Archives in Environmental
Contamination and Toxicology, v. 58, p. 183-193. 2010.
RIE, M.T.; LENDAS, K.A.; WOODIN, B.R.; STEGEMAN, J.J.; CALLARD, I.P.
Hepatic biotransformation enzymes in a sentinel species, the painted turtle
(Chrysemys picta), from Cape Cod, Massachusetts: seasonal-, sex- and location
related differences. Biomarkers, v. 5, p. 382-394. 2000.
ROUTTI, H.; LETCHER, R.J.; ARUKWE, A.; VAN BAVEL, B.; YOCCOZ, N.G.;
CHU, S.; GABRIELSEN, G.W. Biotransformation of PCBs in relation to phase I
and II xenobiotic-metabolizing enzyme activities in Ringed Seals (Phoca hispida)
from Svalbard and the Baltic Sea. Environmental Science and Technology, v.
42, p.8952-8958. 2008.
ROUTTI, H.; HELGASON, L.B.; ARUKWE, A.; WOLKERS, H.; HEIMSTAD, E.S.;
HARJU, M.; BERG, V.; GABRIELSEN, G.W. Effect of reduced food intake on
toxicokinetics of halogenated organic contaminants in herring gull (Larus
argentatus) chicks. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 32, p.156-164.
2013.
RUUS, A.; SANDVIK, M.; UGLAND, K.I.; SKAARE, J.U. Factors influencing
activities of biotransformation enzymes, concentrations and compositional patterns
of organochlorine contaminants in members of a marine food web. Aquatic
Toxicology, v. 61, p. 73-87. 2002.
SECCHI, E. 2012. Sotalia guianensis. The IUCN Red List of Threatened
Species
2012:e.T181359A17583662.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2012.RLTS.T1813
59A17583662.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.
Pág. 199 / 203
IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
SEMINOFF, J.A. (Southwest Fisheries Science Center, U.S.). Chelonia mydas.
The IUCN Red List of Threatened Species 2004: e.T4615A11037468.
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2004.RLTS.T4615A11037468.en. Acesso em:
11 de dezembro de 2017.
SMITS, J.E.; WAYLAND, M.E.; MILLER, M.J.; LIBER, K.; TRUDEAU, S.
Reproductive, immune, and physiological end points in tree swallows on reclaimed
oil sands mine sites. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 19, p. 2951-
2960. 2000.
SNAPE, J.R.; MAUND, S.J.; PICKFORD, D.B.; HUTCHINSON, T.H.
Ecotoxicogenomics: the challenge of integrating genomics into aquatic and
terrestrial ecotoxicology. Aquatic Toxicology, v. 67, p. 143-154. 2004.
STROMME, J.H.; THEODORSEN, L. γ-Glutamyltransferase: Substrate Inhibition,
Kinetic Mechanism, and assay conditions. Clinical Chemistry, v. 22, p. 417-421.
1976.
TREMBLAY, N.; ARANA, A.O.; JÁUREGUI, M.G.; OSTEN, J.R. Relationship
between organochlorine pesticides and stress indicators in hawksbill sea turtle
(Eretmochelys imbricata) nesting at Punta Xen (Campeche), Southern Gulf of
Mexico. Ecotoxicology, v. 126, p. 173-183. 2017.
TROISI, G.M.; MASON, C.F. Cytochromes P450, P420 and mixed-function
oxidases as biomarkers of polychlorinated biphenyl (PCB) exposure in harbor
seals (Phoca vitulina). Chemosphere, v. 35, p. 1933-1946. 1997.
TRUST, K.A.; ESLER, D.; WOODIN, B.R.; STEGEMAN, J.J. Cytochrome P450 1A
induction in sea ducks inhabiting nearshore areas of Prince William Sound,
Alaska. Marine Pollution Bulletin, v. 40, p. 397-403. 2000.
VALDIVIA, P.A.; ZENTENO-SAVÍN, T.; GARDNER, S.C.; AGUIRRE, A.A. Basic
oxidative stress metabolites in eastern Pacific green turtles (Chelonia mydas
agassizii). Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, v. 146, p. 111-
117. 2007
VAN DOLAH, F.M.; NEELY, M.G.; MCGEORGE, L.E.; BALMER, B.C.; YITALO,
G.M.; ZOLMAN, E.S.; SPEAKMAN, T.; SINCLAIR, C.; KELLAR, N.M.; ROSEL,
P.E.; MULLIN, K.D.; SCHWACKE, L.H. Seasonal variation in the skin
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
IX. Bibliografia Pág. 200 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
transcriptome of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) from the
northern Gulf of Mexico. PlosOne, v.10, n. 6, p. 1-21. 2015.
VENANCIO, L.P.; SILVA, M.I.A.; DA SILVA, T.L.; MOSCHETTA, V.A.; DE
CAMPOS ZUCCARI, D.A.; ALMEIDA, E.A.; BONINI-DOMINGOS, C.R. Pollution-
induced metabolic responses in hypoxia-tolerant freshwater turtles.
Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 97, p. 1-9. 2013.
WALKER, C.H. Biochemical biomarkers in ecotoxicology - some recent
developments. The Science of the total environment, v. 171, p. 189-195. 1995.
WANG, Z.; PASCUAL-ANAYA, J.; ZADISSA, A.; LI, W.; NIIMURA, Y.; HUANG, Z.;
LI, C.; WHITE, S.; XIONG, Z.; FANG, D.; WANG, B.; MING, Y.; CHEN, Y.;
ZHENG, Y.; KURAKU, S.; PIGNATELLI, M.; HERRERO, J.; BEAL, K.; NOZAWA,
M.; LI, Q.; WANG, J.; ZHANG, H.; YU, L.; SHIGENOBU, S.; WANG, J.; LIU, J.;
FLICEK, P.; SEARLE, S.; WANG, J.; KURATANI, S.; YIN, Y.; AKEN, B.; ZHANG,
G.; IRIE, N. The draft genomes of soft-shell turtle and green sea turtle yield
insights into the development and evolution of the turtle-specific body plan. Nature
Genetics, v. 45, p. 701-706. 2013.
WANWIMOLRUK, S.; WANWIMOLRUK, P. Characterization of CYP1A enzyme in
Adélie penguin liver. Comparative Biochemistry And Physiology Part C:
Toxicology & Pharmacology, v. 144, p. 148-154. 2006.
WHITE, R.D.; HAHN, M.E.; LOCKHART, W.L.; STEGEMAN, J.J. Catalytic and
Immunochemical characterization of hepatic microsomal cytochromes P450 in
Beluga whale (Delphinapterus leucas). Toxicology and Applied Pharmacology,
v. 126, p. 45-57. 1994.
WHITE, R.D.; SHEA, D.; SCHLEZINGER, J.J.; HAHN, M.E.; STEGEMAN, J.J. In
vitro metabolism of polychlorinated biphenyl congeners by beluga whale
(Delphinapterus leucas) and pilot whale (Globicephala melas) and relationship to
cytochrome P450 expression. Comparative Biochemistry and Physiology Part
C, v. 126, p. 267-284. 2000.
WIECZOREK, D.; DELAURIERE, L.; SCHAGAT, T. Methods of RNA Quality
Assessment. 2012. Promega Corporation Web site. Disponível em:
<https://www.promega.com.br/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-
assessment/>. Acesso em: 08 dez. 2017.
Pág. 201 / 203
IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
WILKINSON, J.H. Enzyme kinetics and its relevance to enzyme assay. Journal of
Clinical Pathology, v. 24, p. 14-21. 1971.
WILSON, J.Y.; MOORE, M.J.; STEGEMAN, J.J. Catalytic and immunochemical
destection of hepatic and extrahepatic microsomal cytochrome P450 1A1
(CYP1A1) in white-sided dolphin (Lagenorhyncus acutus). Aquatic Toxicology, v.
96, p. 216-224. 2010.
WOLKERS, J.; WITKAMP, R.F.; NIJMEIJER, S.M.; BURKOW, I.C.; DE GROENE,
E.M.; LYDERSEN, C.; DAHLE, S.; MONSHOUWER, M. Phase I and phase II
enzyme activities in Ringed seals (Phoca hispida): characterization of hepatic
cytochrome P450 by activity patterns, inhibition studies, mRNA analyses, and
western blotting. Aquatic Toxicology, v. 44, p. 103-115. 1998.
YAWETZ, A.; WOODIN, B.; STEGEMAN, J.J. Cytochromes P450 in liver of the
turtle Chrysemys picta picta and the induction and partial purification of CYP1A-
likeproteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, v. 1381,
p. 12-26. 1998.
YAMAZAKI, M.; WAKASUGI, C. Postmortem changes in drug-metabolizing
enzymes of rat liver microsome. Forensic Science International, v. 67, p. 155-
168. 1994.
ZERBINI, A.N.; SECCHI, E.; CRESPO, E.; DANILEWICZ, D.; REEVES, R. 2017.
Pontoporia blainvillei. The IUCN Red List of Threatened Species 2017:
e.T17978A50371075.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2017-
3.RLTS.T17978A50371075.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.
Declaramos verdadeiras as informações constantes nesse 1º Relatório Técnico
Anual.
Afonso Celso Dias Bainy Jacó Joaquim Mattos
Coordenador da equipe Técnico Responsável
Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS X. Equipe Técnica
Pág. 202 / 203
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 01 06/2018
X – EQUIPE TÉCNICA
Profissional Afonso Celso Dias Bainy
Formação Oceanógrafo e doutor em
Bioquímica
Função Coordenador
Registro no Conselho de Classe
Cadastro Técnico Federal de Atividades
e Instrumentos de Defesa Ambiental
Responsável pela(s) Seção(ões)
Assinatura
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Profissional Karim Hahn Lüchmann
Formação Bióloga e doutora em Bioquímica
Função Vice-coordenadora
Registro no Conselho de Classe
Cadastro Técnico Federal de Atividades
e Instrumentos de Defesa Ambiental
Responsável pela(s) Seção(ões)
Assinatura
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Profissional Jacó Joaquim Mattos
Formação Biólogo e mestre em Bioquímica
Função Técnico de laboratório
Registro no Conselho de Classe 63534-03D
Cadastro Técnico Federal de Atividades
e Instrumentos de Defesa Ambiental
Responsável pela(s) Seção(ões)
Assinatura
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Profissional Bárbara Pacheco Harrison Righetti
Formação Bióloga e mestre em Bioquímica
Função Técnica de laboratório
Pág. 203 / 203
X. Equipe Técnica Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes
Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS
______________________
Coordenador da Equipe ______________________
Técnico Responsável
1º Relatório Técnico Anual
Revisão 02 06/2018
Registro no Conselho de Classe 89632-01D
Cadastro Técnico Federal de Atividades
e Instrumentos de Defesa Ambiental
3300918
Responsável pela(s) Seção(ões)
Assinatura
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Profissional Vera Helena Vidal Dias
Formação
Função Bolsista de Extensão da
Graduação
Registro no Conselho de Classe
Cadastro Técnico Federal de Atividades
e Instrumentos de Defesa Ambiental
Responsável pela(s) Seção(ões)
Assinatura
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Profissional Luiz Otávio de Barros Villas Bôas
Formação
Função Bolsista de Extensão da
Graduação
Registro no Conselho de Classe
Cadastro Técnico Federal de Atividades
e Instrumentos de Defesa Ambiental
Responsável pela(s) Seção(ões)
Assinatura
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Profissional Daína de Lima
Formação Química Ambiental e doutora em
Bioquímica
Função Assistente administrativa
Registro no Conselho de Classe
Cadastro Técnico Federal de Atividades
e Instrumentos de Defesa Ambiental
Responsável pela(s) Seção(ões)
Assinatura
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _