p3 - reaksi uji protein kita
TRANSCRIPT
REAKSI UJI PROTEIN
I. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari beberapa reaksi uji terhadap protein.
Memahami metode identifikasi protein dengan uji biuret.
Memahami metode identifikasi protein dengan pengedapan oleh logam.
Memahami metode identifikasi protein dengan pengendapan oleh garam.
Memahami metode identifikasi protein dengan pengendapan oleh alkohol.
Memahami metode identifikasi protein dengan uji koagulasi.
Memahami metode identifikasi protein dengan denaturasi protein.
II. Teori Dasar
Protein merupakan biopolimer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam
amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan biopolimer yang
multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai
enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika
melalui biomembran sel dan sebagai zat pengatur.
protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena
zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dn
pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan
peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang
mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).
Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari
5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat
mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang
menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven
organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).
Selain itu protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di
dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua
organisme. Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik
Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-
bahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh,
mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya
tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak.
Struktur asam amino digambarkan sebagai berikut:
(Lehninger, 1995).
Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi yaitu
keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun
ireversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH, panas, pelarut,
kekuatan ion, terlarut, dan radiasi. Denaturasi yang berbahaya yaitu raksa (Hg) untuk
pemurnian emas seperti yang terjadi di Minamata, Jepang. Protein ada yang reaktif
karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH,
-OH, NH2, dan –COOH. Contoh protein aktif adalah enzim, hormon, antibodi, dan
protein transport. Reaksi protein aktif bersifat selektif dan spesifik, gugus sampingnya
yang selektif dan susunan khas makromolekulnya.
Ciri- Ciri Protein yaitu :
1. Susunan kimia yang khas
Setiap protein individual merupakan senyawa murni
2. Bobot molecular yang khas
Semua molekul dalam suatu contoh tertentu dari protein murni mempunyai bobot
molecular yang sama. Karena molekulnya yang besar maka protein mudah sekali
mengalami perubahan fisik atau aktivitas biologisnya.
3. Urutan asam amino yang khas
Urutan asam amino dari protein tertentu adalah terinci secara genetic. Akan tetapi,
perubahan-perubahan kecil dalam urutan asam amino dari protein tertentu.
( Page,D.S. 1997 ).
Jenis- jenis protein
a. Kolagen, protein struktur yang diperlukan untuk membentuk kulit, tulang,
dan ikatan tisu.
b. Antibodi, protein system pertahanan yang melindungi badan dari pada
serangan penyakit.
c. Dismutase superoxide, protein yang membersihkan darah kita.
d. Ovulbumin, protein simpanan yang memelihara badan.
e. Hemoglobin, protein yang berfungsi membawa sebagai pembawa oksigen.
f. Toksin, protein racun yang digunakan untuk membunuh kuman.
g. Insulin, protein hormone yang mengawal arah glukosa dalam darah.
h. Tripsin, protein yang mencernakan makanan protein.
Penggolongan protein berdasarkan Struktur molekulnya :
1. Struktur Primer ( struktur utama)
Struktur ini terdiri dari asam-asam amino yang dihubungkan satu
sama lain secara kovalen melalui ikatan peptida.
2. Struktur sekunder
Protein sudah mengalami interaksi intermolekul, melalui rantai
samping asam amino. Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi
oleh ikatan hidrogen antar rantai samping yang membentuk pola
tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya. Ada dua jenis
struktur sekunder, yaitu: -heliks dan -sheet.
3. Struktur Tersier
Terbentuk karena adanya pelipatan membentuk struktur yang
kompleks. Pelipatan distabilkan oleh ikatan hidrogen, ikatan disulfida,
interaksi ionik, ikatan hidrofobik, ikatan hidrofilik.
4. Struktur Kuartener
Terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan kata lain multi sub
unit. Interaksi intermolekul antar sub unit protein ini membentuk
struktur keempat/kuartener
Fungsi dan Peranan Protein
Protein memegang peranan penting dalam berbagai proses biologi. Peran-
peran tersebut antara lain:
1. Katalisis enzimatik
Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh enzim dan
hampir semua enzim adalah protein.
2. Transportasi dan penyimpanan
Berbagai molekul kecil dan ion-ion ditansport oleh protein spesifik. Misalnya
transportasi oksigen di dalam eritrosit oleh hemoglobin dan transportasi
oksigen di dalam otot oleh mioglobin.
3. Koordinasi gerak
Kontraksi otot dapat terjadi karena pergeseran dua filamen protein. Contoh
lainnya adalah pergerakan kromosom saat proses mitosis dan pergerakan
sperma oleh flagela.
4. Penunjang mekanis
Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh kolagen yang merupakan protein
fibrosa.
5. Proteksi imun
Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal serta
berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel dari organisma
lain.
6. Membangkitkan dan menghantarkan impuls saraf
Respon sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantarai oleh oleh protein
reseptor. Misalnya rodopsin adalah protein yang sensitif terhadap cahaya
ditemukan pada sel batang retina. Contoh lainnya adalah protein reseptor pada
sinapsis.
7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi
Pada organisme tingkat tinggi, pertumbuhan dan diferensiasi diatur faktor
pertumbuhan. Misalnya faktor pertumbuhan saraf mengendalikan
pertumbuhan jaringan saraf. Selain itu, banyak hormon merupakan protein
(Santoso, H. 2008)
Ada berbagai cara dalam pengujian terhadap protein yaitu dengan reaksi uji
asam amino dan reaksi uji protein. Reaksi uji asam amino sendiri terdiri dari 6 macam
uji yaitu: uji millon, uji hopkins cole, uji belerang, uji xantroproteat, dan uji biuret.
Sedangkan untuk uji protein, berdasarkan pada uji biuret, pengendapan oleh garam,
pengendapan oleh logam dan alkohol. Serta uji koagulasi dan denaturasi protein
A. Uji Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSo4
encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus
amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan rekasi
positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.
B. Uji Xantroprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein.
Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila
dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada
molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin
dan triptofan.
C. Uji Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi
Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam
oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi
Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di
bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas
antara kedua lapisan tersebut.
D. Uji Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila
pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang
dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk
fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang
berwarna.
E. Uji denaturasi
Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur
sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan
kovelen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen,
interaksi hidrofobik, ikatan garam dan aterbukanya lipatan atau wiru molekul protein
(Winarno, 1992).
III. Alat dan Bahan
Bahan Alat
Pereaksi Molisch Tabung reaksi
Reagent Benedict Pipet tetes
Reagent Barfoed Gelas ukur
Pereaksi Seliwanoff Erlenmeyer
Larutan Iodium Penangas air
Larutan Asam Sulfat Pekat
9 Jenis Larutan Karbohirat :
- Larutan 0,1 M Glukosa
- Larutan 0,1 M Fruktosa
- Larutan 0,1 M Galaktosa
- Larutan 0,1 M Arabinosa
- Larutan 0,1 M Sukrosa
- Larutan 0,1 M Maltosa
- Larutan 0,1 M Laktosa
- Larutan 1℅ pati/amilum
- Suspensi selulosa (kapas) dalam air
HCl 6 N
NaOH 6 N
Air
IV. Prosedur Percobaan Uji Biuret
Dalam tabung reaksi dimasukan 3 ml larutan protein (gelatin dan albumin).
Lalu ditambahkan 1 ml NaOH 2,5 N, aduk. Ditambahkan pula setetes larutan CuSO 4
0,01 M, aduk. Bila tidak timbul warna, tambahkan lagi setetes atau 2 tetes larutan
CuSO4.
Pengendapan Dengan Logam
Dalam tabung reaksi dimasukan 3 ml larutan protein (gelatin dan albumin).
Lalu ditambahkan 5 tetes HgCl2 0,2 M. Ulangi percobaan dengan menggunakan Pb
asatat 0,2 M.
Pengendapan Dengan Garam
Larutan protein (gelatin dan albumin) sebanyak 5 ml dijenuhkan dengan
ammonium sulfat. Untuk pekerjaan ini: Pertama ditambahkan sedikit garam tersebut
kedalam larutan protein (gelatin dan albumin), aduk hingga melarut. Lalu
ditambahkan lagi sedikit ammonium sulfat dan aduk lagi, lakukan sehingga sedikit
garam tertinggal tidak terlarut. Setelah larutan jenuh, lalu disaring. Uji kelarutan
endapan di dalam air. Uji pula endapan dengan reagen Millon dan filtrat dengan uji
biuret.
Pengendapan Dengan Alkohol
Disiapkan 3 tabung reaksi:
Tabung 1: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, buffer asetat pH 4,7 (1M)
sebanyak 1 ml dan etil alkohol 95% sebanyak 6 ml.
Tabung 2: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, HCl 0,1 M sebanyak 1 ml dan
etil alkohol 95% sebanyak 6 ml.
Tabung 3: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, NaOH 0,1 M sebanyak 1 ml
dan etil alkohol 95% sebanyak 6 ml.
Uji Koagulasi
Dalam tabung reaksi dimasukan 5 ml larutan protein, lalu ditambahkan 2 tetes
CH3COOH 1M. Tabung kemudian diletakan dalam air mendidih selama 5 menit. Lalu
endapan diambil dengan batang pengaduk. Uji kelarutan endapan di dalam air, uji
pula endapan dengan reagen Millon.
Denaturasi Protein
Disiapkan 3 tabung reaksi:
Tabung 1: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan HCl 0,1 M sebanyak 1 ml
Tabung 2: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan NaOH 0,1 M sebanyak 1
ml
Tabung 3: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan buffer asetat pH 4,7 (1M)
sebanyak 1 ml.
Lalu ketiga tabung tersebut ditempatkan didalam air mendidih selama 15 menit dan
dinginkan pada temperatur kamar. Pada tabung 1 dan 2 ditambahkan 10 ml buffer
asetat pH 4,7 lalu ditulis hasilnya.
V. Data Pengamatan
Tabel 1. Uji Biuret
Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 3 ml larutan gelatin + 1
ml NaOH 2,5 N → diaduk → ditambah 6 tetes CuSO4 0,01 M → diaduk
Larutan gelatin yang berwarna kuning bening menjadi berwarna agak bening setelah ditambah NaOH 2,5 N. Setelah ditambah 6 tetes CuSO4,
Permukaan larutan berwarna ungu
3 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 2,5 N → diaduk → ditambah 6 tetes CuSO4 0,01 M → diaduk
Larutan albumin yang berwarna putih keruh menjadi berwarna bening setelah ditambah NaOH 2,5 N. Setelah ditambah 6 tetes CuSO4,
Permukaan larutan berwarna ungu lebih tua
Tabel 2. Uji Pengendapan dengan Logam
Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 3 ml larutan gelatin + 5
tetes HgCl2 0,2 M Larutan berwarna kuning
pudar dan keruh Tidak terbentuk endapan
(-)
3 ml larutan gelatin + 5 tetes Pb asetat 0,2 M
Larutan berwarna kuning pudar dan keruh
Tidak terbentuk endapan (-)
3 ml larutan albumin + 5 tetes HgCl2 0,2 M
Larutan berwarna putih susu
Terbentuk endapan berwarna putih di bagian bawah larutan lebih banyak (++) dari endapan oleh Pb asetat
HgCl2 → Hg2+ + 2 Cl-
3 ml larutan albumin + 5 tetes Pb asetat 0,2 M
Larutan berwarna putih susu
Terbentuk endapan (+) di bagian bawah berwarna putih
Pb(COOH)2 → Pb2+ + 2 COOH-
Tabel 3. Uji Pengendapan dengan Garam
Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 5 ml gelatin + 10
tetes (NH4)2SO4
hingga terjadi pengendapan
↓Menyaring endapan
↓Menguji kelarutan endapan di dalam air
↓Menguji endapan dengan reagent Millon
↓Menguji filtrat dengan uji Biuret
Terbentuk endapan (+) warna putih
Endapan yang dihasilkan larut dalam air
Endapan yang diuji dengan reagent millon memberikan warna kuning muda
Filtrat yang diuji dengan reagent biuret menjadikan permukaan larutan filtrat berwarna ungu
Terbentuk endapan gelatin
Filtrat gelatin dengan uji biuret
5 ml albumin + 10 tetes (NH4)2SO4
hingga terjadi pengendapan
↓
Terbentuk endapan warna putih yang lebih banyak (++) daripada endapan yang dihasilkan
Menyaring endapan↓
Menguji kelarutan endapan di dalam air
↓Menguji endapan dengan reagent Millon
↓Menguji filtrat dengan uji Biuret
reaksi gelatin dengan (NH4)2SO4
Endapan yang dihasilkan larut dalam air
Endapan yang diuji dengan reagent millon memberikan warna kuning kemerah-merahan
Filtrat yang diuji dengan reagent biuret menjadikan permukaan larutan filtrat berwarna ungu Albumin Millon (merah bata) dan
Gelatin Millon (kuning)
Filtrat albumin dengan uji biuret
Tabel 4. Uji Pengendapan dengan alkohol
Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 5 ml larutan albumin + 1
ml buffer asetat pH 4,7 (1 M) + 6 ml etil alkohol 95 %
Terjadi dua fase warna pada larutan. - Di bagian atas terbentuk
endapan (+++) berwarna putih
- Di bagian bawah berwarna keruh
Ketiga larutan sebelum ditambahkan alkohol 95%Tabung dari kiri ke kanan-Tabung 1 albumin+buffer-Tabung 2 albumin+HCl-Tabung 3 albumin+NaOH
Ketiga larutan setelah ditambahkan alkohol 95%Tabung dari kiri ke kanan-Tabung 1 albumin+buffer+alkohol 95%-Tabung 2 albumin+HCl+alkohol 95%-Tabung 3 albumin+NaOH+alkohol 95%
5 ml larutan albumin + 1 ml HCl 0,1 M + 6 ml etil alkohol 95 %
Terjadi dua fase warna pada larutan. - Di bagian atas terbentuk
endapan (++) berwarna putih
- Di bagian bawah berwarna keruh
5 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 0,1 M + 6 ml etil alkohol 95 %
Larutan berwarna bening dan tidak terjadi endapan (-)
Tabel 5. Uji Koagulasi
Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 5 ml larutan gelatin + 2
tetes asam asetat 1 M → diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit → ambil endapan dengan spatula
↓Menguji kelarutan endapan di dalam air
↓Menguji endapan dengan reagent Millon
Warna larutan gelatin yang ditambahkan 2 tetes asam asetat 0,1 M tetap berwarna kuning, begitu pula setelah dipanaskan selama 5 menit, larutan tidak membentuk endapan
Karena tidak terbentuk endapan, maka tidak dilakukan uji kelarutan endapan dalam air maupun uji endapan dengan reagen Millon
Gelatin Setelah dipanaskan selama 5 menit
5 ml larutan albumin + 2 tetes asam asetat 1 M → diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit → ambil endapan dengan spatula
↓Menguji kelarutan endapan di dalam air
↓Menguji endapan dengan reagent Millon
Warna larutan albumin yang ditambahkan 2 tetes asam asetat 0,1 M tetap berwarna putih keruh, dan setelah dipanaskan selama 5 menit, larutan membentuk endapan (gumpalan) berwarna putih
Endapan albumin yang diuji kelarutannya dalam air memberikan hasil bahwa endapan albumin tidak larut dalam air
Endapan albumin yang diuji dengan regent Millon memberikan warna merah bata
Albumin Setelah dipanaskan selama 5 menit
Uji kelarutan endapan dalam air
Uji endapan Millon
Tabel 6. Uji Denaturasi Protein
Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 9 ml larutan albumin + 1
ml HCl 0,1 M → menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit → mendinginkan pada temperatur kamar → melihat ada atau tidak adanya endapan→ ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7
Larutan albumin yang ditambahkan HCl 0,1 M, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi warna putih susu dan terbentuk endapan.
Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7, warna larutan tetap berwarna putih susu
Gambar setelah ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7
9 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 0,1 M → menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit → mendinginkan pada temperatur kamar → melihat ada atau tidak adanya endapan→ ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7
Larutan albumin yang ditambahkan NaOH 0,1 M, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi warna kuning bening dan tidak terbentuk endapan.
Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7 warna larutan menjadi warna putih susu dan terbentuk sedikit endapan
Gambar setelah ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7
9 ml larutan albumin + 1 ml buffer asetat pH 4,7 → menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit → mendinginkan pada temperatur kamar → melihat ada atau tidak adanya endapan ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7
Larutan albumin yang ditambahkan 1 ml buffer asetat pH 4,7, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi gumpalan berwarna putih susu
Ketiga larutan sebelum dipanaskan
Tabung 1 albumin+HCl+ dipanaskan selama 15 menit (sebelum ditambah buffer asetat)
Tabung 2 albumin+NaOH+ dipanaskan selama 15 menit (sebelum ditambah buffer asetat)
Tabung 3 albumin+buffer asetat pH 4,7+dipanaskan selama 15 menit
VI. Pembahasan
Pada berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein,
semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein,
yaitu asam amino. Gugus amino dan gugus karboksil yang ada pada asam amino akan
menunjukkan sifat-sifat spesifiknya pada reaksi kimia yang dilakukan. Asam amino
juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton
kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari asam
kuat. Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama,
yaitu gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing
berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur,
ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai
reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui
komponen asam amino suatu protein. Pada praktikum Biokimia “ Reaksi Uji Protein”
ini akan dipelajari cara identifikasi protein dengan memanfaatkan ikatan yang khas
pada protein, yaitu ikatan peptida dan juga akan diamati pengaruh perubahan fisik
seperti suhu, pH, dan zat-zat kimia terhadap struktur protein. Adapun larutan protein
yang kami uji adalah larutan gelatin dan larutan albumin.
1. Uji Biuret
Pada uji biuret, baik pada larutan protein gelatin dan albumin yang diujikan
memberikan hasil positif, ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada permukaan
larutan setelah ditambah NaOH dan CuSO4. Uji biuret hanya akan memberikan hasil
positif pada protein yang memiliki ikatan peptida, artinya jika hanya terdiri dari satu
asam amino saja (contoh: Glisin, alanin, valin), uji biuret akan memberikan hasil
negatif. Larutan Gelatin dan albumin memiliki rumus bangunan yang kompleks dan
mengikat dua atau lebih asam amino esensial, sehingga terbentuk ikatan peptida.
Gelatin termasuk pada protein fiber yang terdiri atas beberapa rantai polipeptida yang
memanjang dan dihubungkan satu dengan lain oleh beberapa ikatan silang hingga
merupakan bentuk serat atau serabut yang stabil. Sementara itu, albumin merupakan
protein globular yang terdiri atas rantai polipeptida yang berlipat (Poedjiadi, 1994).
Jadi, dengan adanya ikatan peptida (polipeptida) inilah, hasil uji biuret pada gelatin
dan albumin positif. Pada uji Biuret, maksud ditambahkannya NaOH dalam larutan
uji adalah untuk mengkondisikan suasana basa, sehingga Cu dapat bereaksi dengan
larutan protein. NaOH mencegah endapan Cu(OH)2, memecah ikatan protein sehingga
terbentuk urea, sbg katalisator
Reaksi menghasilkan warna violet pada permukaan larutan protein yang
menandakan terbentuknya senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada
asam amino dalam protein. Biuret merupakan senyawa dengan dua ikatan peptida yang
terbentuk pada pemanasan dua molekul urea dan mempunyai struktur mirip dengan struktur
peptida dari protein (Routh, 1969), sehingga ion Cu2+ dari pereaksi biuret dalam suasana basa
akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein
membentuk senyawa kompleks berwarna ungu
2. Uji Pengendapan dengan Logam
Pada uji protein pengendapan dengan logam, kami menguji larutan protein
(gelatin dan albumin) dengan larutan HgCl2 0,2 M dan Pb asetat 0,2 M. HgCl2 dan Pb
asetat merupakan garam logam berat yang dapat mendenaturasi protein sama dengan
halnya asam dan basa. Reaksi yang terjadi antara garam logam berat akan
mengakibatkan terbentuknya garam protein-logam yang tidak larut. Garam logam
berat seperti Pb dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang
terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein
mengalami denaturasi. Secara bersama, gugus –COOH dan gugus –NH2 yang terdapat
dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat Hg dan Pb membentuk senyawa
kelat. Selain gugus –COOH dan gugus –NH2, gugus –R pada molekul asam amino
tertentu dapat pula mengadakan reaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus
sulfihidril (-SH) pada molekul sistein akan bereaksi dengan ion Ag+ atau Hg++
(Poedjiadi, 1994).
Dari hasil percobaan kami, diketahui bahwa reaksi antara logam berat Hg dan
Pb dengan albumin menghasilkan endapan berwarna putih susu, sedangkan reaksi
pada gelatin dengan logam Hg dan Pb tidak membentuk endapan. Tidak terbentuknya
endapan oleh logam Hg dan Pb pada gelatin mungkin disebabkan konsentrasi gelatin
yang rendah, sehingga kalaupun ada endapan jumlahnya sangat sedikit, sehingga
hampir tidak ada endapan. Albumin merupakan protein yang jauh lebih kompleks
daripada gelatin karena albumin lebih banyak tersusun atas asam amino. Hal ini juga
mempengaruhi sifat albumin yang lebih cepat membentuk endapan dengan logam
daripada gelatin. Pada albumin, endapan yang paling banyak dihasilkan adalah dari
reaksi albumin dengan HgCl2 daripada dengan Pb asetat. Hal ini karena tetapan
disosiasi Hg lebih tinggi daripada Pb, sehingga lebih banyak ion Hg2+ yang berada
dalam bentuk bebas yang bereaksi dengan protein membentuk endapan. Sistein dan
Metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya. Reaksi
Pb-asetat dengan protein tersebut akan membentuk endapan berwarna putih
kekuningan, yaitu garam PbS. Dari hasil terbentuknya endapan albumin yang
berwarna putih oleh Pb asetat, yakni endapan PbS, sehingga dapat disimpulkan
albumin mengandung Sistein ataupun Metionin.
3. Uji Pengendapan dengan Garam
Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein ditambahkan
garam-garam anorganik, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Pada
percobaan yang kami lakukan, terjadi pengendapan pada masing-masing 5ml larutan
protein albumin dan gelatin dengan penambahan garam amonium sulfat hingga jenuh,
yaitu sebanyak 10 tetes, peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out
(penurunan kelarutan). Menurut literatur, bila garam anorganik yang ditambahkan
berkonsentrasi tinggi, maka protein akan mengendap, pengendapan terus terjadi
karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara
garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam
anorganik lebih menarik air, maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein
akan berkurang (Winarno, 2002). Pada larutan albumin yang memiliki struktur lebih
komplek daripada gelatin, maka endapan yang terbentuk lebih banyak. Setelah larutan
albumin dan gelatin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4 dan terjadi pengendapan,
selanjutnya dilakukan uji kelarutan endapan dalam air, uji endapan dengan reagent
Millon, dan uji filtrat dengan reagent biuret.
Pada endapan albumin, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air
menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran
endapan direaksikan dengan pereaksi Millon, untuk mengetahui ada tidaknya
kandungan tirosin pada albumin. Prinsip dari uji Millon adalah pembentukan garam
merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai
molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan
pereaksi millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin mengandung
tirosin sebagai salah satu asam amino penyusunnya, karena hasil reaksinya positif,
ditandai endapan berwarna kuning kemerahan. Uji filtrat albumin dengan pereaksi
biuret juga menunjukkan hasil positif yang ditandai larutan berwarna ungu violet,
pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya
gugus amida pada filtrat yang dihasilkan. Hasil positif uji filtrat albumin dengan
reagent biuret ini menunjukkan bahwa masih ada protein yang belum terendapkan
oleh garam amonium sulfat, sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida.
Pada endapan gelatin, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air
menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran
endapan direaksikan dengan pereaksi Millon, untuk mengetahui ada tidaknya
kandungan tirosin pada gelatin. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein gelatin
tidak mengandung tirosin pada asam amino penyusunnya, karena hasil reaksinya
dengan reagent Millon negatif, ditandai endapan berwarna kuning. Pada Uji filtrat
gelatin dengan pereaksi biuret menunjukkan hasil positif yang ditandai larutan
berwarna ungu violet. Hasil positif uji filtrat gelatin dengan reagent biuret ini
menunjukkan bahwa masih ada protein yang belum terendapkan oleh garam amonium
sulfat, sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida.
4.Uji Pengendapan dengan Alkohol
Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Alkohol merupakan
pelarut organik yang akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air,
sehingga terjadi daya tarik-menarik yang terjadi lebih besar antar molekul. Adanya
alkohol memaksa gugus positif pada protein berikatan dengan ion positif lain pada
larutan, sehingga kelarutan protein berkurang dan terjadi pengendapan. Pada uji
pengendapan protein oleh alkohol pada tabung 1 (larutan albumin+Baffer asetat pH
4,7+etil alkohol 95%), endapan yang dihasilkan paling banyak dibandingkan tabung
lainnya, karena buffer asetat memiliki pH 4,7 yang sama dengan pH isolistrik albumin
(4,55-4,90). Pada titik isoelektrik, protein akan membentuk zwittterion sehingga dapat
mengendap. Pada uji pengendapan protein oleh alkohol pada tabung 2 (larutan
albumin+HCl 0,1 M+etil alkohol 95%), juga terbentuk endapan protein, hal ini karena
HCl mempunyai muatan positif yang dapat berikatan dengan protein yang
dikondisikan oleh alkohol untuk mengendap. Pada uji pengendapan protein oleh
alkohol pada tabung 3 (larutan albumin+NaOH 0,1 M+etil alkohol 95%), tidak
terbentuk endapan protein, karena NaOH tidak mempunyai muatan positif, sehingga
tidak terjadi pengendapan dengan alkohol.
5. Uji Koagulasi
Prinsip kerja koagulasi yaitu merusak ikatan peptida atau memutus ikatan
protein menjadi asam amino dan merupakan suatu sistem irrevesible yang tidak dapat
kembali ke bentuk semula. Protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan
pada suhu 50oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi bila larutan protein berada titik
isolistriknya (Poedjiadi, 1994). PH isoelektrik adalah pH larutan tertentu di mana
protein mempunyai muatan positif dan negatif sama, sehingga saling menetralkan.
Pada pH isoelektrik, kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. PH isolistrik
albumin adalah 4,55-4,90 sedangkan pH isoelektrik 4,80-4,85. Pada pH isoelektrik,
kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. Pada temperatur diatas 60oC
kelarutan protein akan berkurang (koagulasi) karena pada temperatur yang tinggi
energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat
untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tertier dan kuartener yang menyebabkan
koagulasi (Blogspot, 2007). Pada uji koagulasi, penambahan asam asetat bertujuan
agar larutan protein mencapai pH isolistriknya sehingga bisa terkoagulasi. asam asetat
berfungsi untuk mengkondisikan atau merusak protein dan memberikan hasil positif
ketika direaksikan dengan pereaksi millon. Pada larutan albumin, setelah penambahan
asam asetat dan dididihkan dalam air mendidih selama 5 menit, terbentuk gumpalan
berwarna putih yang menunjukkan albumin terkoogulasi, sedangkan pada gelatin
setelah penambahan asam asetat dan dididihkan dalam air mendidih selama 5 menit,
tidak terbentuk endapan sama sekali, yang menunjukkan gelatin tidak terkoogulasi.
Tidak terjadinya koagulasi pada gelatin mungkin disebabkan belum tercapainya pH
isoelektrik gelatin yang cukup tinggi.
Pada endapan albumin yang terbentuk dilakukan uji endapan dalam air dan uji
endapan dengan reagent Millon. Untuk uji kelarutan endapan dengan air
menunjukkan hasil negatif, sedangkan endapan yang direaksikan dengan pereaksi
millon memberikan hasil positif, ditandai dengan warna endapan berubah menjadi
merah bata yang artinya ada kandungan tirosin. Pada uji koagulasi, endapan albumin
yang terjadi setelah penambahan asam asetat dan dipanaskan, menunjukkan bahwa
endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perubahan
struktur tersier ataupun kwartener sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan
struktur tersier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula, ini bisa
dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air.
6. Uji Denaturasi protein
Protein akan terdenaturasi atau mengendap bila berada pada titik
isoelektriknya, yaitu pH dimana jumlah muatan positif sama dengan jumlah muatan
negatifnya. Pemanasan yang berlangsung selama 15 menit, pada ketiga tabung yang masing-
masing berisi albumin dan pereaksinya berguna untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan
interaksi hidrofobik non polar, hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi
kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak sangat cepat sehingga
mengacaukan ikatan molekul tersebut.
Pada uji denaturasi, protein yang dilarutkan dalam buffer asetat pH 4,7 (tabung
3) dan dipanaskan selama 15 menit menunjukkan adanya banyak endapan. Protein
yang ditambahkan HCl 0,1 M (tabung 1) dan dipanaskan selama 15 menit, masih
menghasilkan endapan karena dengan penambahan HCl 0,1 M larutan jadi memiliki
pH 1, masih mendekati titik isoelektrik albumin, sehingga albumin dapat mengendap
atau terdenaturasi. Protein yang ditambahkan NaOH 0,1 M (tabung 2) dan dipanaskan
selama 15 menit, tidak menghasilkan endapan karena pada penambahan NaOH 0,1 M,
pH larutan jadi memiliki pH 13, sangat jauh dari titik isoelektrik albumin, sehingga
albumin tidak mengendap. Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7 dengan volume
berlebih pada tabung 1 dan 2, terjadi perubahan. Endapan yang terdapat pada tabung
yang 1 menjadi lebih banyak berisi endapan, sedangkan pada tabung 2 yang semula
tidak ada endapan, dengan penambahan buffer asetat ini protein pun mengendap.
Penambahan buffer asetat dengan volume yang berlebih akan membentuk dan merubah
albumin kepada titik isoelektriknya yaitu pH 4,7, hal ini menunjukkan bahwa protein
albumin mengendap pada titik isoelektriknya, yaitu sekitar pH 4,7.
VII. Kesimpulan
Pada uji biuret, pada larutan gelatin dan larutan albumin sama-sama menunjukkan
hasil positif, ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada permukaan larutan
setelah ditambahkan NaOH dan CuSO4
Pada uji Biuret, maksud ditambahkannya NaOH dalam larutan uji adalah untuk
mengkondisikan suasana basa, sehingga Cu dapat bereaksi dengan larutan protein.
Reaksi menghasilkan warna violet pada permukaan larutan protein yang
menandakan terbentuknya senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada
asam amino dalam protein.
reaksi antara logam berat Hg dan Pb dengan albumin menghasilkan endapan
berwarna putih susu, sedangkan reaksi pada gelatin dengan logam Hg dan Pb tidak
membentuk endapan. Tidak terbentuknya endapan oleh logam Hg dan Pb pada
gelatin mungkin disebabkan konsentrasi gelatin yang rendah, sehingga kalaupun
ada endapan jumlahnya sangat sedikit, sehingga hampir tidak ada endapan
Pada albumin, endapan yang lebih banyak dihasilkan adalah dari reaksi albumin
dengan HgCl2 daripada dengan Pb asetat. Hal ini karena tetapan disosiasi Hg lebih
tinggi daripada Pb, sehingga lebih banyak ion Hg2+ yang berada dalam bentuk
bebas yang bereaksi dengan protein membentuk endapan
Pada larutan albumin yang memiliki struktur lebih komplek daripada gelatin, maka
pada saat uji pengendapan dengan garam amonium sulfat, endapan yang terbentuk
lebih banyak.
protein albumin mengandung tirosin sebagai salah satu asam amino penyusunnya,
karena hasil reaksinya dengan reagent Millon positif, ditandai endapan berwarna
kuning kemerahan
Hasil positif uji filtrat albumin dan gelatin dengan reagent biuret menunjukkan
bahwa masih ada protein yang belum terendapkan oleh garam amonium sulfat,
sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida
Alkohol merupakan pelarut organik yang akan mengubah (mengurangi) konstanta
dielektrika dari air, sehingga terjadi daya tarik-menarik yang terjadi lebih besar
antar molekul. Adanya alkohol memaksa gugus positif pada protein berikatan
dengan ion positif lain pada larutan, sehingga kelarutan protein berkurang dan
terjadi pengendapan
Pada denaturasi, yang dirusak adalah ikatan hidrogen dan ikatan tiol, proses
denaturasi ini kadang-kadang dapat berlangsung secara reversibel, kadang-kadang
tidak
Pada koagulasi, yang dirusak adalah ikatan peptida, dan perubahan protein
irreversibel akibat dari pengaruh pemanasan. Jika suatu enzim terkoagulasi, maka
enzim tersebut tidak dapat berfungsi lagi
VIII. Daftar Pustaka
Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.
Winarno, F. G., 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia: Jakarta.
Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia, Jakarta.
Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy
Thenawidjaya. Erlangga, Jakarta