overleving en toxineproductie van bacillus cereus in het...

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2010-2011

Overleving en toxineproductie van Bacillus cereusin het bovenste gastro-intestinaal stelsel

Katrien Drieskens

Promotoren:Prof. dr. ir. Mieke UyttendaeleProf. dr. ir. Tom Van De Wiele

Tutor:ir. Siele Ceuppens

Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad vanBio-ingenieur in de levensmiddelenwetenschappen en voeding

Woord vooraf

Eerst en vooral wil ik Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele en Prof. dr. ir. Tom Van De Wiele

bedanken omdat zij het promotorschap van deze scriptie op zich hebben willen nemen. De

combinatie van beide labo’s en de verschillende aspecten die daardoor aan bod kwamen waren

zeer leerrijk en boeiend.

Een speciale dankjewel voor ir. Siele Ceuppens, mijn begeleidster. Siele, bedankt voor de raad

en voor de verklaringen wanneer ik iets niet begreep, voor de bemoedigende woorden tijdens

mijn confrontaties met de wet van Murphy en voor alle toffe en soms hilarische momenten in

het labo.

Ook wil ik dr. ir. Sam Possemier bedanken voor het duwtje in de juiste richting, An De Coen

voor de opleiding en Ellen Verbeke voor het praktische SHIME gerelateerde advies.

Ook de hele thesisploeg van “’t vierde verdiep” mag ik niet vergeten. Dankzij jullie was er

geen saai moment te bespeuren tijdens het praktische werk.

Verder wil ik al mijn vrienden bedanken om de afgelopen 5 jaar superleuk te maken waardoor

het “boerekot” voor altijd in mijn geheugen gegrift zal staan. De invulling van ontspannende

uren was nooit een probleem en altijd even geslaagd. Telkens wanneer ik de lichtjes aan de

Coupure zie, zal mijn hartje sneller slaan!

Wie zeker ook niet in het rijtje mogen ontbreken, zijn mijn ouders en zus.

Mama en papa, jullie hebben me altijd gesteund en gemotiveerd tijdens m’n studietijd en

jullie stonden altijd klaar met een luisterend oor voor zowel de studie- als VLK-verhalen. Het

rondrijden voor het herbariummateriaal, de warme ontvangst elke vrijdagavond, het lekkere

eten tijdens de blok en het begrip en de steun tijdens de zwaardere periodes, dankjewel

daarvoor. En na deze 5 jaar moet ik jullie echt gelijk geven: het was de tofste tijd in m’n

leven, tot nu toe...

Leen, 80 % van mijn studentenleven heb ik samen met jou op kot doorgebracht. Bedankt

voor de steun en alle leuke momenten samen! Ik zou me geen betere zus kunnen wensen!

i

Een speciale en hele grote dankjewel behoort toe aan Jeff. Je bleef rustig toen ik stress had

en je hoorde mijn verhalen aan, ook al kreeg je er kop noch staart aan. Je herinnerde me

er op tijd en stond aan dat eens afstand nemen van het “T-woord” wonderen kan doen. Je

kleurde 90% van mijn studententijd, hopelijk 100% van alle jaren die nog komen.

“Your love is king, crown you in my heart...”

Katrien Drieskens, Gent, juni 2011

“ The scientist is not a person who gives the right answers, he’s one who asks the

right questions ”

Claude Levi-Strauss

ii

Toelating tot bruikleen

“De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaarte stellen en delen ervan te kopieren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onderde beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting debron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie”

Gent, juni 2011

De auteur, De promotor, De co-promotor,

Katrien Drieskens Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele Prof. dr. ir. Tom Van De Wiele

iii

Inhoudsopgave

Woord vooraf i

Toelating tot bruikleen iii

Lijst van figuren vi

Lijst van tabellen vii

1 Inleiding 1

2 Literatuurstudie 32.1 Bacillus cereus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1.1 Algemene kenmerken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.1.2 Voedselvergiftigingen door B. cereus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.1.3 De toxines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2 Het menselijk gastro-intestinaal stelsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.3 De simulatie van het menselijk gastro-intestinaal stelsel . . . . . . . . . . . . 92.4 Continue simulatiemodellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.5 Reabsorptie van galzouten in het ileum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.5.1 Filtratie doorheen een kunstnier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.5.2 Detectie van galzouten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3 Materiaal en methoden 163.1 Stammen van B. cereus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3.1.1 Standaardopkweek van de stammen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.1.2 Bepaling van de B. cereus concentratie . . . . . . . . . . . . . . . . . 173.1.3 Opkweek van B. cereus in voedselmedium . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.2 Samenstelling en pH van de gastro-intestinale simulatiemedia . . . . . . . . . 173.3 Ontwikkeling van de simulatie van het bovenste gastro-intestinaal stelsel . . 20

3.3.1 Maaglediging en -verzuring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.3.2 Dialyse van het darmmedium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.3.2.1 Reabsorptie van galzouten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213.3.2.2 Dialyse met B. subtilis en B. cereus . . . . . . . . . . . . . . 21

3.3.3 Gedrag van SHIME microbiota in het ileum . . . . . . . . . . . . . . . 223.4 B. cereus in het simulatiemodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.4.1 Opbouw van de proefopstelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233.4.2 Verloop van de simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

iv

3.4.3 Maaglediging en -verzuring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263.4.4 B. cereus (1.1) in de exponentiele fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263.4.5 B. cereus (1.1) in de stationaire fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263.4.6 Overleving van B. cereus (1.1) in darmsapmedium . . . . . . . . . . . 263.4.7 Opkweek van sporen voor de simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273.4.8 Sporen van B. cereus (stam 1.2) zonder SHIME bacterien . . . . . . . 273.4.9 Sporen van B. cereus (stam 1.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273.4.10 Sporen van 4 B. cereus stammen in het simulatiemodel . . . . . . . . 273.4.11 Toxinedetectie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283.4.12 Statistische analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

4 Resultaten en bespreking 294.1 Opkweek van B. cereus in voedselmedium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294.2 Samenstelling en pH van de gastro-intestinale simulatiemedia . . . . . . . . . 314.3 Ontwikkeling van de simulatie van het bovenste gastro-intestinaal stelsel . . . 32

4.3.1 Maaglediging en -verzuring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324.3.2 Dialyse van het darmmedium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.3.2.1 Volumeveranderingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334.3.2.2 Reabsorptie van galzouten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344.3.2.3 Dialyse met B. subtilis en B. cereus . . . . . . . . . . . . . . 36

4.3.3 Gedrag van SHIME microbiota in de ileumfase . . . . . . . . . . . . . 374.4 B. cereus in het simulatiemodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.4.1 B. cereus (1.1) in de exponentiele fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384.4.2 B. cereus (1.1) in de stationaire fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384.4.3 Overleving van B. cereus (1.1) in darmsapmedium . . . . . . . . . . . 394.4.4 Opkweek van sporen voor de simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404.4.5 Sporen van B. cereus (stam 1.2) zonder SHIME bacterien . . . . . . . 404.4.6 Sporen van B. cereus (stam 1.2) met SHIME bacterien . . . . . . . . 414.4.7 Sporen van 4 B. cereus stammen in het simulatiemodel . . . . . . . . 41

4.4.7.1 Mond- en maagfase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424.4.7.2 Duodenum/jenunumfase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.4.7.3 Ileumfase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.4.8 Toxinedetectie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 484.5 Bespreking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.5.1 Opkweek van B. cereus in voedselmedium . . . . . . . . . . . . . . . . 504.5.2 Ontwikkeling van het simulatiemodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504.5.3 Overleving van B. cereus in het simulatiemodel . . . . . . . . . . . . . 524.5.4 Toxinevorming . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

5 Besluiten 59

6 Lijst met afkortingen 61

Literatuurlijst 62

v

Lijst van figuren

2.1 Lediging van de maag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.1 Algemene opbouw van het simulatiemodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233.2 Algemeen verloop van de simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253.3 De maagfase met maagverzuring en -lediging . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.1 Aanpassing van de pH van de simulatiemedia . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314.2 De buffercapaciteit van 250ml maagmedium zonder enzymen . . . . . . . . . 324.3 De pH-daling van volledig maagmedium met pH 5 . . . . . . . . . . . . . . . 334.4 Standaardcurve van 10g/L galzouten in gedestilleerd water . . . . . . . . . . 344.5 Reabsorptie van een 10g/L galoplossing (Oxgall) via dialyse . . . . . . . . . . 344.6 Standaardcurve van gal(zouten) (Oxgall) in ileummedium zonder andere kleur-

componenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354.7 Reabsorptie van galzouten uit ileummedium zonder kleurcomponenten door

dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354.8 Kleurverlies van het darmmedium zonder galzouten tijdens de dialyse . . . . 364.9 Overleving van B. subtilis in gedialyseerd ileummedium . . . . . . . . . . . . 364.10 Overleving van SHIME microbiota in het ileummedium . . . . . . . . . . . . 374.11 De overleving van vegetatieve B. cereus cellen in de exponentiele groeifase

(stam 1.1) tijdens de gastro-intestinale simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . 384.12 De overleving van vegetatieve B. cereus cellen in de stationaire groeifase (stam

1.1) tijdens de gastro-intestinale simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394.13 De overleving van B. cereus sporen (stam 1.2) tijdens de gastro-intestinale

simulatie zonder toevoeging van SHIME bacterien in de ileumfase . . . . . . . 404.14 De overleving van B. cereus sporen (stam 1.2) tijdens de gastro-intestinale

simulatie met toevoeging van SHIME bacterien in de ileumfase . . . . . . . . 414.15 De overleving van B. cereus sporen (stam 1.1) tijdens de gastro-intestinale

simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.16 De overleving van B. cereus sporen (stam 2.1) tijdens de gastro-intestinale

simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444.17 De overleving van B. cereus sporen (stam 1.2) tijdens de gastro-intestinale

simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444.18 De overleving van B. cereus sporen (stam 2.2) tijdens de gastro-intestinale

simulatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

vi

Lijst van tabellen

2.1 Samenstelling van simulatiemedia voor gastro-intestinale vloeistoffen (g/L) . 112.2 Samenstelling van SHIME voeding (g/L) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.1 Eigenschappen van de 4 B. cereus stammen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.2 Samenstelling van de voedingsoplossing (g/L) . . . . . . . . . . . . . . . . . 183.3 De samenstelling van de gebruikte simulatiemedia (g/L) . . . . . . . . . . . . 19

4.1 De groeicuve van de 4 B. cereus stammen in voedselmedium bij 22℃. . . . . 304.2 De sporulatie bij 30℃ van stam NHV 1230-88 in voedselmedium. . . . . . . 304.3 Maaglediging gebaseerd op Clarkston et al. (1997) . . . . . . . . . . . . . . . 324.4 Overleving van B. cereus (stam 1.1) in darmsapmedium met 5g/L galzouten 394.5 Sporenvorming in voedselmedium bij 30℃. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404.6 Overzicht van de drie detectiekits voor het haemolitisch (Hbl) en niet-haemolitisch

(Nhe) toxine* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494.7 Toxineproductie van B. cereus in BHI bij 30℃ en 36℃en in TSB bij 30℃ . . 49

vii

Hoofdstuk 1

Inleiding

B. cereus is een voedselgebonden pathogeen die gevaarlijk wordt van zodra hij in hoge aantal-

len aanwezig is in een levensmiddel aangezien dan enterotoxines kunnen geproduceerd worden

in de dunne darm van de mens. Momenteel wordt de infectieve dosis geschat op 5-8 log kve/ml.

Een belangrijke eigenschap van B. cereus is dat deze bacterie endosporen kan vormen. Door

de hogere resistentie tegen allerhande stressfactoren ligt de infectieve dosis van sporen waar-

schijnlijk lager dan deze van vegetatieve cellen (Arnesen et al., 2008). Om de risico’s beter

te kunnen inschatten is kennis nodig omtrent de overleving in het menselijk lichaam tijdens

de vertering. Vooral het in kaart brengen van de toxineproductie tijdens het verteringsproces

zou meer duidelijkheid kunnen brengen over de voedselvergiftigingen door B. cereus.

Om dit te bewerkstelligen is er nood aan een simulatiemodel waarin zo goed mogelijk alle

aspecten van de vertering aan bod komen. Het beschikbare continue simulatiemodel, het

SHIME-model, concentreert zich echter op het colon. Aangezien voedselvergiftigingen met B.

cereus zich afspelen in de dunne darm, is er nood aan een nieuw model dat zich concentreert

op het bovenste deel van de gastro-intestinaal kanaal.

Het doel van deze scriptie heeft twee grote luiken: enerzijds de onwikkeling van een simula-

tiemodel van het bovenste deel van het gastro-intestinaal kanaal en anderzijds het in kaart

brengen van de overleving van B. cereus in dit simulatiemodel.

Een eerste aspect bestaat uit het selecteren en samenstellen van de juiste simulatiemedia zodat

de composities beantwoorden aan degene die het best overeenkomen met de verteringssappen

wanneer een maaltijd geconsumeerd wordt. B. cereus wordt opgekweekt in een voedselmatrix

en hierin door het model gestuurd zodanig dat de eventuele beschermende invloed van de

matrix ook in rekening wordt gebracht. De bouw van het model omvat de ontwikkeling van een

geleidelijke maagverzuring en -lediging die zo dicht mogelijk aansluit bij deze van het menselijk

lichaam zodanig dat B. cereus de correcte toenemende stressfactoren kan ondergaan in de

1

1. INLEIDING 2

maagfase. Naast deze twee factoren wordt een dialysemethode ontwikkeld om de galzouten

en enzymen uit het darmmedium te verwijderen zodanig dat de stress van de galzouten

in de duodenumfase kan verwijderd worden in de ileumfase zoals dit eveneens het geval is

in het menselijke lichaam door galzoutreabsorptie (Silbernagl & Despopoulos, 2007). Ook

de competitie met de intestinale microbiota wordt gesimuleerd door toevoeging van SHIME

bacterien.

Na het volbrengen van het eerste aspect wordt de overleving van verschillende vormen (vege-

tatieve cellen en sporen) van B. cereus bepaald. De overleving van vier B. cereus stammen

in het simulatiemodel en de hiermee gepaard gaande toxineproductie worden onderzocht en

met elkaar vergeleken.

Hoofdstuk 2

Literatuurstudie

2.1 Bacillus cereus

2.1.1 Algemene kenmerken

Bacillus cereus is een Gram-positieve, sporenvormende, facultatief anaerobe voedselpathogeen

die afkomstig is uit de bodem en ook vaak op planten terug te vinden is. Via de bodem komt B.

cereus in de voedselketen terecht doordat gewassen zoals graan, aardappelen en verschillende

groenten besmet raken. Ook dieren kunnen zorgen voor introductie in de voedselketen als ze

besmet zijn, onder andere via de melkproductie (Arnesen et al., 2008). B. cereus kan over

flagellen beschikken waardoor het zich kan voorbewegen en aanhechten aan oppervlakken

(Ghelardi et al., 2007).

Bij de sporulatie van B. cereus worden endosporen gevormd. De naam is afkomstig van

het feit dat de sporen binnenin de cel gevormd worden (de Vries, 2006). De sporulatie wordt

geınduceerd door twee belangrijke factoren, nl. een tekort aan nutrienten en/of de celdensiteit

die d.m.v. quorum sensing aangevoeld wordt door de populatie. De sporen van B. cereus zijn

hitteresistent en bieden bescherming tegen extreme pH’s, enzymen, chemicalien, mechanische

stress, straling en hoge druk (Setlow, 2003). B. cereus sporen bezitten resistentie tegen

al deze barre omgevingsfactoren dankzij de speciale sporenstructuur. Deze structuur laat

toe dat sporen heel lange tijd dormant in de natuur kunnen overleven (aan een gematigd

stressniveau) maar tegelijk kunnen ze ook kortere tijd aan grotere stressfactoren weerstaan

(Setlow, 2006). De sporen bezitten een grote omhullende structuur die niet bij alle endosporen

teruggevonden wordt, nl. het exosporium (Setlow, 2006). De kieming wordt geınduceerd door

kiemingsfactoren zoals het beschikbaar worden van nutrienten (aminozuren en suikers) maar

ook door het wegvallen van de stressfactoren of het beschikbaar zijn van zouten, dipicolinezuur

met Ca-ionen en lysosyme (Setlow, 2003). Daarnaast komt het ook voor dat de sporen eerst

3

2. LITERATUURSTUDIE 4

geactiveerd moeten worden eer ze kunnen ontkiemen. De meest gekende vorm van activatie is

door middel van hittebehandeling. Dit kan zowel door een hoge temperatuur en korte tijd als

door een lagere temperatuur voor een kortere tijd. Andere factoren om sporen te activeren

zijn gammastraling, reducerende agentia of oxiderende agentia (Shaheen, 2009; Keynan et al.,

1964).

2.1.2 Voedselvergiftigingen door B. cereus

De meest recente rapporteringsdata over uitbraken in de Europese Unie dateren uit het jaar

2008. In dat jaar waren er 45 uitbraken met 1132 patienten waarvan 41 in het ziekenhuis

moesten opgenomen worden. Vergeleken met het jaar 2007, waar er 102 uitbraken waren

met 1062 gevallen (29 gehospitaliseerd), kan vastgesteld worden dat het aantal uitbraken

wel gedaald is maar dat elke uitbraak meer slachtoffers gemaakt heeft (EFSA, 2009, 2010).

Doordat er zowel psychrotrofe als mesofiele stammen zijn, kunnen ook gekoelde producten

aanleiding geven tot een voedselvergiftiging. B. cereus dankt zijn pathogeneciteit aan verschil-

lende soorten toxines die het produceert: een emetisch toxine en minstens drie verschillende

enterotoxines kunnen voor problemen zorgen in het gastro-intestinaal stelsel van de mens.

2.1.3 De toxines

Het emetisch toxine van B. cereus is een klein cyclisch peptide, nl. cereulide. Dit toxine

wordt in het levensmiddel zelf geproduceerd en zo opgenomen door de mens. Na 0,5 tot 6 uur

kunnen de eerste symptomen optreden en deze kunnen 6 tot 24 uur aanhouden. Cereulide is

zuur- en hitteresistent, weerstaat aan proteolyse en wordt dus niet afgebroken in het gastro-

intestinaal stelsel. Hierdoor kan het braken veroorzaken en in ergere gevallen zelfs leverfalen

door inhibitie van vetzuuroxidatie en schade aan de cellen waarmee het in contact komt

(Arnesen et al., 2008).

Problemen in de darm met diaree als hoofdsymptoom worden veroorzaakt door de entero-

toxines haemolysine BL (Hbl), niet-haemolytisch enterotoxine (Nhe), cytotoxine K en enkele

haemolysines, fosfolipases en proteolytische enzymen.

De enterotoxines worden geproduceerd door vegetatieve cellen in het lichaam. Wanneer deze

cellen van B. cereus over flagellen beschikken, kunnen ze zich aanhechten aan de darmwand

waardoor de toxineproductie veel dichter bij deze wand kan gebeuren en de toxines sneller hun

werkterrein bereiken (Andersson et al., 1998; Pielaat et al., 2006). De incubatieperiode is hier

meestal 8-16 uur en de symptomen verdwijnen meestal binnen de 24 uur (Andersson et al.,

1998). De infectieve dosis van cellen of sporen wordt geschat op 105−8 kve/ml. De infectieve

dosis van sporen ligt wellicht lager omdat deze veel makkelijker het zure milieu van de maag


overleven en dus met grotere aantallen de dunne darm bereiken. Vegetatieve cellen zullen in

zekere mate afsterven door het maagzuur. Hierdoor hebben mensen met een verhoogde pH in

de maag een grotere kans om een infectieve dosis op te nemen. Oudere mensen en mensen die

lijden aan hypochloorhydrie (“hypochorhydria”) kunnen hier last van hebben (Clavel et al.,

2004). Hypochloorhydrie is de algemene verzamelnaam voor een verhoogde pH in de maag

en kan o.a. veroorzaakt worden door een infectie met Helicobacter pylori (Machado et al.,

2010). Een andere oorzaak kan de inname zijn van een grote maaltijd of bepaalde medicatie

(Clavel et al., 2004; Pereira et al., 1998).

Hbl en Nhe bestaan elk uit 3 proteınen. Bij Hbl zijn dit L1,L2 en B, Nhe bestaat uit NheA,

NheB en NheC. De twee toxinecomplexen vertonen gelijkenissen op vlak van aminozuursa-

menstelling. De overeenkomst tussen de 6 verschillende proteıneonderdelen varieert van 18%

tot 44% (Arnesen et al., 2008). Door de structurele en functionele gelijkenissen wordt in

de studie van Fagerlund et al. (2008) besloten dat Hbl en Nhe deel uitmaken van eenzelfde

superfamilie van porienvormende toxines en dat dus de werking van Hbl analoog is aan deze

van Nhe. Wanneer een infectieve dosis opgenomen wordt en deze enterotoxines geproduceerd

worden, zal het hoofdsymptoom diaree zijn doordat de cellen van de dunne darm aangetast

worden.

In een studie van Beecher et al. (1995) wordt aangetoond dat Hbl vochtophopingen veroor-

zaakt in het ileum van het konijn en dat deze ophopingen het grootst zijn wanneer de drie

componenten van Hbl aanwezig zijn. Naast cytotoxisch is Hbl ook nog een hemolytisch toxine

en het is aangetoond dat het dermonecrotisch is en vasculaire permeaties kan veroorzaken bij

konijnen (Beecher & Wong, 1994). De hemo- en cytolytische activiteit van beide toxines is te

wijten aan een osmotisch mechanisme door de vorming van een “membrane attack complex”

door de drie componenten, nadat ze zich elk afzonderlijk aan een erythrocyt of een andere

cel gehecht hebben. Hierdoor verschijnen transmembrane porien in het plasmamembraan van

het epitheel gevolgd door een osmotisch verschijnsel waarbij de cel eerst zwelt en uiteindelijk

barst. (Beecher & Wong, 1997; Fagerlund et al., 2008).

Cytotoxine K is ontdekt bij een B. cereus stam die voor een uitbraak met 3 dodelijke slacht-

offers had gezorgd. Het bestaat uit een wateroplosbaar peptide van 34 kDa en heeft een

“β-barrel” structuur (Arnesen et al., 2008). Het vertoont gelijkenissen met andere “β-barrel”

toxines zoals α-hemolysine en leucocicines van Staphylococcus aureus. Dit toxine bezit naast

dermonecrotische en hemolytische activiteit ook een cytolytische activiteit in de dunne darm

(Lund et al., 2000).


2.2 Het menselijk gastro-intestinaal stelsel

Wanneer de mens een maaltijd opneemt, start het verteringsproces al gedeeltelijk in de mond.

De mondholte heeft meestal een pH van 6,5 (Oomen et al., 2002). In het speeksel zitten o.a.

de verteringsenzymen amylase en lipase, verschillende elektrolieten zoals Na+, K+ en HCO−3 ,

immunoglobulinen en mucines. Voor de vertering zelf zijn vooral de aanwezige enzymen en de

mucines belangrijk. De mucines zorgen ervoor dat de voedselprop de slokdarm in kan glijden

en de enzymen zorgen al voor een eerste afbraak van de voedselcomponenten in de maag.

Door de korte verblijftijd in de mondholte zullen de enzymen het merendeel van hun afbraak

verrichten in de maag. Lipase kan actief blijven bij de lage pH van de maag en amylase kan

15-30 minuten zijn activiteit behouden bij de lage pH. Daarboven komt nog eens dat in de

maag een verhoogde pH heerst na de inname van een maaltijd, waardoor de vertering door

speekselenzymen wellicht langer doorgaat in de maag (Verstraete et al., 2009-2010).

Na het vermalen en kauwen in de mondholte gaat de voedselprop naar de maag waar de

excretie van maagsap hormonaal gestimuleerd wordt door het opnemen van voedsel. In het

maagsap zitten pepsinogenen, lipasen, mucines, HCl en HCO−3 . Zo wordt de pH van de maag

teruggebracht van een hogere pH naar 1 a 2 en worden de vetten en proteınen al gedeeltelijk

afgebroken. De pH van de maag na opname van een maaltijd kan volgens de studie van

Versantvoort et al. (2004) schommelen tussen 3 en 7. In andere studies wordt er echter een

lagere maximale pH teruggevonden. Zo vermeldt Dressman et al. (1998) 5,5 als maximale pH

en wordt in Oomen et al. (2002) pH 5 vermeld als hoogste pH bij inname van een maaltijd.

Elke andere waarde tussen 2 en 5 is echter mogelijk naargelang de grootte van de maaltijd en

de samenstelling. De gemiddelde verblijftijd in de maag is 10 minuten voor water en 1 tot 4

uur voor vast voedsel. De volledige lediging van de maag kan dus tot 8 uur in beslag nemen.

De verblijftijd stijgt naarmate er meer koolhydraten, proteınen of vetten in de maaltijd zitten.

Ook het volume van de maaltijd en de osmolaliteit van de maaltijd spelen een rol. Als de mens

een hypertone maaltijd inneemt, zal het een langere verblijftijd hebben in de maag aangezien

het duodenum isotoniciteit nastreeft (Versantvoort et al., 2004; Silbernagl & Despopoulos,

2007).

De maaglediging verloopt licht exponentieel. In figuur 2.1 is te zien dat bij jong volwassenen

(lege driehoek) na 111 minuten 50% lediging bereikt wordt. Bij oudere mensen wordt dit

percentage pas na 132 minuten bereikt (Clarkston et al., 1997; Takumi et al., 2000).

Van zodra het voedsel doorgestuwd wordt naar de dunne darm worden andere verteringsen-

zymen uitgescheiden door de pancreas en de galblaas. Deze laatste reageert op vet dat in

het duodenum terecht komt. Zo komt er eerst een hoge concentratie geconjugeerde galzou-


Figuur 2.1: Lediging van de maag

(Takumi et al., 2000), M= jong volwassenen en N= ouderen

ten (15mM) in de dunne darm terecht, daarna gaat de secretie dalen en stagneren (Dressman

et al., 1998). Geconjugeerde galzouten bestaan uit twee delen: taurine (40%) of glycine (60%)

en een primair galzout, cholaat (60%) of chenodeoxycholaat (40%), dat gevormd wordt uit

cholesterine in de lever (Hill, 1995; Silbernagl & Despopoulos, 2007). Het pancreassap be-

staat uit tal van precursoren van enzymes waarvan het merendeel door trypsine geactiveerd

wordt: procarboxypeptidase A en B, pro-elastase en chymotrypisogeen. Trypsine wordt ge-

vormd uit de precursor trypsinogeen onder invloed van het enteropeptidase enterokinase. De

verzameling van lipasen, proteasen en amylasen uit het pancreassap en uitgescheiden door de

dunne darmwand zijn samen in staat de drie grote voedselcomponenten tot monomeren af

te breken. Verder speelt het bicarbonaation een belangrijke rol omdat dit ion zorgt voor de

pH-verhoging in het duodenum zodat de enzymes in hun werkzaam pH-gebied terechtkomen.

De pH’s van het duodenum, jenunum en ileum bevinden zich respectievelijk rond 5,3 , 5,7 en

7,5 (Versantvoort et al., 2004). In de studie van Oomen et al. (2002) worden gemiddelde pH’s

vermeld van respectievelijk 4,75, 6,25 en 7,25. De gemiddelde verblijftijden zijn achtereen-

volgens 30-45 min (duodenum), 1,5-2 uur (jenunum) en 5-7 uur (ileum). De geconjugeerde

galzouten worden in het terminale ileum gereabsorbeerd door een actief transportmechanisme

(enterohepatische cyclus). Niet-geconjugeerde galzouten die aanwezig zijn in het jenunum en

ileum kunnen door een passief diffusieproces gereabsorbeerd worden (Northfield & McColl,

1973). Volgens Silbernagl & Despopoulos (2007) zijn er in een menselijk lichaam 2-3 gram

geconjugeerde galzouten aanwezig en heeft het lichaam ongeveer 20-30 gram nodig per dag,

wat leidt tot 6-10 reabsorptiecycli. In de studie van Northfield & McColl (1973) wordt een

reabsorptiepercentage van 95% vermeld voor alle gesecreteerde galzouten.

Het bovenste deel van het gastro-intestinaal kanaal omvat de mond, de slokdarm, de maag


en de dunne darm. Het opgenomen voedsel legt dit traject snel af in vergelijking met de pas-

sagesnelheid in het colon. De microbiota die in de slokdarm en maag terechtkomen, zijn dan

ook grotendeels afkomstig uit de mond en uit het opgenomen voedsel zelf. In de mucosa van

de slokdarm worden ongeveer 4 log bacterien per mm2 gedetecteerd. De meest voorkomende

microbiota zijn Lactobacilli. In de maag wordt een groot deel van de bacterien die meeko-

men met het voedsel gedood door de zure pH. Degene die het best tegen zuur bestand zijn,

overleven. Voorbeelden hiervan zijn sommige Streptococci (Streptococcus salivarius en S. san-

uinis) en Lactobacilli (L. plantarum, L. salivarius, L. fermentum en L. gasseri). Naast deze

organismen zijn ook Staphylococci spp., Neisseria spp., Bacteroides spp., Micrococcus spp.,

Bifidobacterium spp.,Haemophilus spp. en Veillonella spp. gedetecteerd in de mucosa van

de maag. Ook Helicobacter pylori kan in de maag teruggevonden worden, maar deze bacterie

wordt als pathogeen en cancerogeen beschouwd en behoort niet tot de normale microbiota in

de maag (Wilson, 2008; Machado et al., 2010).

In de eerste twee delen van de dunne darm, het duodenum en jenunum, komen geen hoge

aantallen microbiota voor. Dit komt door de zure impact van de maaginhoud, de snelle peri-

staltiek in deze delen, de secretie van darm- en pancreassap samen met gal en bacteriostatische

componenten in deze sappen. De cultiveerbare microbiota die, ondanks deze vier factoren, wel

voorkomen in de duodenale mucosa zijn voornamelijk Lactobacillus spp., Streptococcus spp. en

Enterococcus spp.. Het totale kiemgetal in het duodenum ligt rond 2-4 log kve/ml. In de mu-

cosa van het jenunum worden hoofdzakelijk Streptococcus spp. teruggevonden (54%), gevolgd

door Lactobacillus spp. (20%). Hiernaast worden relatief hoge aantallen Haemophilus spp.

(7%) en Veillonella spp. (6%) teruggevonden. Deze percentages zijn gebaseerd op het totale

aantal cultiveerbare microbiota uit de mucosa van het jenunum. Uit cultuur-onafhankelijk

onderzoek blijkt dat het aandeel van Streptococcus spp. rond 69% ligt, Lactobacillus spp.

werd niet teruggevonden en Haemophilus spp. (4,7%) en Veillonella spp. (7%) behouden

ongeveer hetzelfde aandeel in de mucosa van het jenunum. De onderlinge verhoudingen in de

inhoud van het jenunum verschillen van deze in de mucosa. Zo zijn de overheersende species

bij de cultuurafhankelijke analyse Neisseria spp. en Fusobacterium nucleatum samen met

Streptococcus spp. terwijl op basis van cultuuronafhankelijke analyse Klebsiella spp., Entero-

bacter spp. en Lactobacillus spp. de bovenhand halen. In Wilson (2008) wordt er echter op

gewezen dat de verhoudingen tussen de aanwezige microbiota sterk kunnen verschillen tus-

sen populaties of personen en dat de analyseresultaten kunnen verschillen wanneer voor de

analyse een cultuur-afhankelijke of -onafhankelijke methode gebruikt wordt (Wilson, 2008).

In het ileum komen kiemgetallen voor van 6-8 log kve/ml. De vier factoren die verantwoor-

delijk zijn voor de lage kiemgetallen in de vorige delen van het intestinaal stelsel worden hier

teniet gedaan. Er is een tragere peristaltiek in het ileum, de bacteriostatische componenten


worden verdund door het darmsap, de galzouten worden gereabsorbeerd en de pH wordt neu-

traal tot licht alkalisch. Hierdoor wordt het voor de microbiota makkelijker om te overleven

en te groeien. In het ileum overheersen volgens een cultuuronafhankelijke analyse Klebsiella

spp. en Enterococcus spp.. Van de totaal teruggevonden bacterien behoorden er 36% tot de

Bacteroidetes en 34% tot de Clostridium cluster XIVa (Wilson, 2008).

In het colon heerst er een nog grotere diversiteit van microbiota. Deze is al deels terug te

vinden in het terminale ileum doordat er een reflux vanuit het colon optreedt. De grote

diversiteit komt voor omdat de transit tijd trager is in het colon dan in de dunne darm

waardoor het totale kiemgetal om 13-14 log kve/ml kan komen. De twee grote fyla waartoe

de microbiota behoren zijn de Bacteroidetes en de Firmicutes waarvan er 95% tot de Costridia

behoren (Wilson, 2008).

2.3 De simulatie van het menselijk gastro-intestinaal stelsel

Om het menselijk gastro-intestinaal stelsel te simuleren bestaan er verschillende methoden,

o.a. batch modellen of continue modellen. Zo worden er in Oomen et al. (2003a), Wijnands

et al. (2006), de biobeschikbaarheidsonderzoeken van het “Nederlandse Rijksinstituut voor

Volksgezondheid en Milieu” (RIVM) en het BARGE-protocol (“BioAccessibility Research

Group of Europe”) batch modellen beschreven waarbij de mond-, maag-, dunne darmfase

telkens na elkaar worden gesimuleerd (Oomen et al., 2003b; Versantvoort et al., 2004; Hagens

et al., 2007).

Het BARGE-protocol is een protocol om de biobeschikbaarheid van bepaalde stoffen in bo-

demsediment te bepalen. Hier wordt de mondfase gesimuleerd door een speekselmedium bij

het te onderzoeken sediment te voegen en gedurende een korte tijd (5-15 min) te incuberen

bij 37℃. Daarna wordt er maagsapmedium bijgevoegd en 1 uur geıncubeerd (pH= 1,2-1,7)

gevolgd door een toevoeging van een darmsap- en galmedium en een incubatie van 4 uur

(pH= 6,3 ± 0,5). Bij Oomen et al. (2003a) duurt de incubatie van het bodemsediment in het

speeksel 5 min bij 37℃ met een pH= 6,5 ± 0,2. Hierna wordt het maagsap toegevoegd (pH=

1,07 ± 0,07) en is de incubatietijd 2 uur. Na toevoeging van het darmsap- en galmedium

(resp. pH= 7,8 ± 0,2 en 8,0 ± 0,2) wordt nog eens 2 uur geıncubeerd. Het RIVM-rapport

van Hagens et al. (2007) handelt ook over bodemsediment en stelt een verteringsmodel voor

een “fed”-toestand voor in tegenstelling tot de vorige twee modellen die een “fasted”-toestand

weergeven. Het verschil tussen de twee toestanden is dat bij het eerstgenoemde model rekening

wordt gehouden met het feit dat de maag voedsel te verwerken krijgt. Bij een fasted-toestand

wordt verondersteld dat de maag in rust is. In dit “fed”-model heeft het speeksel een pH

van 6,8 ± 0,2 en wordt het terug 5 min bij 37℃ geıncubeerd. Vervolgens wordt een maagsap


met pH= 1,3 ± 0,1 toegevoegd en 2 uur geıncubeerd. De totale pH van het mengsel moet op

2,5 ± 0,5 gehouden worden. Het vervolg is analoog aan het model beschreven door Oomen

et al. (2003a) behalve de pH’s van het darmsap- en galmedium. Deze liggen resp. 0,3 en 0,2

eenheden hoger.

De samenstellingen van de media die gebruikt worden, vertonen weinig verschil (tabel 2.1).

Een eerste verschil is de pH-instelling door toevoeging van HCl of NaOH. Daarnaast komen

er nog verschillen voor tussen het “fed” model en de “fasted” modellen op vlak van de enzy-

men. De concentratie van amylase, pepsine, lipase en pancreatine liggen telkens 2 tot 3 keer

hoger bij het “fed” model terwijl mucine in de mondfase daalt. De verklaring hiervoor kan

in het eerdere RIVM-rapport 320102002 teruggevonden worden (Versantvoort et al., 2004).

Wanneer voedsel opgenomen wordt, zal de speekseltoevoer stijgen en de samenstelling ervan

veranderen waarbij onder andere de amylaseconcentratie stijgt en die van mucine daalt. De

pepsineconcentratie wordt 2,5 keer verhoogd bij inname van een maaltijd en in het darmsap-

medium worden alle enzymes verdrievoudigd. Dit is een gemiddeld genomen waarde van de

enzymsecretie als respons op een voedselopname. Ook de galzoutconcentratie is gestegen in

het “fed” model. Zoals eerder vermeld bereikt de galzoutconcentratie in de dunne darm een

piek van 15 mM wanneer er voedsel in terecht komt. Wanneer de eerder vernoemde samen-

stelling van galzouten in acht genomen wordt, correspondeert deze concentratie met 10 g/L

galzouten in de dunne darm (Parks et al., 1999). Omdat de verhouding darmsap en galme-

dium 2:1 is, moet de concentratie in het galmedium 30 g/L zijn. Een laatste verschil doet

zich voor tussen het BARGE-protocol en de overige twee studies. De concentratie NaHCO3

ligt in het darmsap van het BARGE-protocol ruim 2 g/L hoger.

De volumeverhouding tussen het speeksel-, maagsap-, darmsap- en galmedium vertoont tussen

de drie studies een lichte variatie. Het BARGE-protocol en de studie van Oomen et al. (2003a)

vermelden dezelfde verhoudingen, namelijk 1:1,5:3:1. In de studie van Hagens et al. (2007)

wordt de verhouding 1:2:2:1 gebruikt. Ondanks het feit dat in deze laatste studie rekening

wordt gehouden met voedselopname, is er geen verhouding vermeld waarin het voedsel en de

verteringssappen aanwezig zijn. In het eerdere verschenen RIVM-rapport van (Versantvoort

et al., 2004) wordt er wel een verhouding weergegeven nl. 1,5:1:2:2:1 voor resp. het voedsel,

het speeksel-, maagsap-, darmsap- en galmedium.


Tabel 2.1: Samenstelling van simulatiemedia voor gastro-intestinale vloeistoffen (g/L)

Hagens et al. (2007) Oomen et al. (2003a) BARGE v.12

SPEEKSEL

KCl 0,896 0,896 0,896

NaH2PO4 0,888 0,888 0,888

KSCN 0,200 0,200 0,200

Na2SO4 0,570 0,570 0,570

NaCl 0,298 0,298 0,298

Ureum 0,200 0,200 0,200

Mucine 0,025 0,050 0,050

Amylase 0,290 0,145 0,145

Urinezuur 0,015 0,015 0,015

MAAG

NaCl 2,752 2,752 2,752

NaH2PO4 0,266 0,266 0,266

KCl 0,824 0,824 0,824

CaCl2 · 2 H2O 0,400 0,400 0,400

NH4Cl 0,306 0,306 0,306

D-glucuronzuur 0,020 0,020 0,020

Ureum 0,085 0,085 0,085

D-(+)-glucosamine-

hydrochloride

0,330 0,330 0,330

Mucine 3,000 3,000 3,000

Bovine Serum Albumine 1,000 1,000 1,000

Pepsine 2,500 1,000 1,000

glucose 0,650 0,650 0,650

DARM (duodenum/bile)

NaCl 7,012 / 5,259 7,012 / 5,259 7,012 / 5,259

NaHCO3 3,388 / 5,785 3,388 / 5,819 5,607 / 5,785

KH2PO4 0,080 / 0,000 0,080 / 0,000 0,080 / 0,000

KCl 0,564 / 0,376 0,564 / 0,376 0,564 / 0,376

MgCl2 · 6 H2O 0,050 / 0,000 0,050 / 0,000 0,050 / 0,000

CaCl2 · 2 H2O 0,200 / 0,222 0,200 / 0,222 0,200 / 0,222

Ureum 0,100 / 0,250 0,100 / 0,250 0,100 / 0,250

Bovine Serum Albumine 1,000 / 1,800 1,000 / 1,800 1,000 / 1,800

Pancreatine 9,000 / 0,000 3,000 / 0,000 3,000 / 0,000

Lipase 1,500 / 0,000 0,500 / 0,000 0,500 / 0,000

Galzouten (Oxgall) 0,000 / 30,00 0,000 / 6,000 0,000 / 6,000


2.4 Continue simulatiemodellen

De vorige besproken simulatiemodellen zijn allemaal batch modellen. Het SHIME-model

(“simulation of the human intestinal microbial ecosystem”) en het TIM-model zijn continue

modellen om de microbiele gemeenschap op te volgen. De SHIME bestaat uit vijf vaten

(maag, dunne darm en drie vaten colon) waarin een microbieel ecossysteem ingebracht wordt

afkomstig van een menselijk fecaal staal. Tabel 2.2 geeft de samenstelling van de SHIME

voeding en de evolutie ervan doorheen de jaren. De polysacchariden worden toegevoegd om

een optimale microbiele diversiteit en activiteit te behouden in de colonvaten (Molly et al.,

1993). De respectievelijke pH’s van de colonvaten (ascendens, transversum en descendens)

worden ingesteld op 5.6–5.9, 6.2–6.5 en 6.6–6.9 en worden dan met behulp van pH-controllers

op peil gehouden (Van de Wiele et al., 2004). De maag en dunne darm zijn niet zo optimaal

uitgebouwd als de drie colonvaten. De voeding, waarvan de pH vooraf op 2 gezet wordt,

komt in het maagvat terecht waaruit het in fasen naar het tweede vat overgepompt wordt

(Possemiers et al., 2004). In het tweede vat, dat de dunne darm voorstelt, wordt er dan 100

ml pancreas- en galmedium toegevoegd bij 200 ml voeding. De fase doorheen de maag en

dunne darm duurt ongeveer 4 uur (De Boever et al., 2000). De totale duur van de doortocht

van de SHIME-voeding door de drie colonvaten is ongeveer 76 uur. De gemiddelde verblijftijd

in het colon ascendens, transversum en descendens is respectievelijk 20, 32 en 24 uur. Om

de lichaamstemperatuur ideaal na te bootsen bezitten de vaten een dubbele wand waardoor

een gesloten watercircuit van 37℃ kan stromen. Om de anaerobe condities in het intestinaal

stelsel na te bootsen wordt de headspace van de vaten gespoeld met N2-gas. (De Boever et al.,

2000; Molly et al., 1993).

Het TIM-simulatiemodel (“TNO Intestinal Model”) bestaat uit twee delen. Een eerste deel

(TIM-1) simuleert de maag en de dunne darm en het bestaat uit acht verschillende delen

waarvan er telkens twee aan elkaar bevestigd zijn. Het tweede stuk (TIM-2) simuleert het

proximale colon en bestaat uit vier delen. Het grote verschil met het vorige simulatiemodel

is dat de peristaltiek van de dunne en dikke darm gesimuleerd wordt met behulp van een

computer gestuurd systeem en dat de absorptie van componenten en water gesimuleerd wordt

door middel van een dialysemembraan. In elk compartiment is er een pH-controle. Bij TIM-1

stellen de eerste twee delen de maag voor waar de pH van 5 naar 1,8 daalt in 80 minuten. De

pH in het duodenum wordt in dit model op 6,5 gezet. In TIM-2 wordt een fecaal inoculum

geıntroduceerd en wordt de pH om 5,8 gehouden. Een ander verschil met het SHIME-model

is de duur van het totale experiment. Een TIM-simulatie duurt enkele dagen, terwijl een

SHIME-experiment enkele weken loopt (Minekus et al., 1995; Verstraete et al., 2009-2010).


Tabel 2.2: Samenstelling van SHIME voeding (g/L)

Molly et al. (1993) De Boever et al. (2000) Van de Wiele et al. (2004)

Arabinogalactaan 0,0-1,0 1,0 1,0

Cysteıne 0,5 0,0 0,5

Gistextract 3,0 0,0 3,0

Glucose 0,4 0,4 0,4

Mucine 4,0 4,0 4,0

Pectine 2,0 2,0 2,0

Proteose Pepton 1,0 0,0 1,0

Xylaan 1,0 1,0 1,0

Zetmeel 3,0 3,0 4,2

2.5 Reabsorptie van galzouten in het ileum

Ter hoogte van het ileum worden de galzouten gereabsorbeerd. Niet-geconjugeerde galzouten

worden door passieve diffusie terug opgenomen en deze galzouten vervullen geen fysiologische

functie meer. De geconjugeerde galzouten worden door een actief transportmechanisme terug

opgenomen. In totaal wordt 95% van alle galzouten terug gereabsorbeerd (Northfield &

McColl, 1973). Dit proces is nodig om de hoeveelheid galzouten in het lichaam op peil te

houden (Silbernagl & Despopoulos, 2007).

2.5.1 Filtratie doorheen een kunstnier

Een kunstnier is een filter die toelaat bepaalde componenten (zoals ureum en andere toxische

verbindingen uit het lichaam) uit het bloed van een nierpatient te filteren door een dialysaat

langs het bloed te sturen. In Rambod et al. (2010) wordt er als dialysaat in een draagbare

kunstnier een isotonische oplossing gebruikt. Dit staat gelijk aan een concentratie van 290

mosmol zout (Silbernagl & Despopoulos, 2007). Verder werden in deze studie 40 en 80 ml/min

vermeld als de snelheid doorheen de kunstnier van respectievelijk het bloed en het dialysaat.

In Lee & Roberts (2008) wordt er een commercieel beschikbaar peritoneaal dialysaat (Dianeal,

Baxter Health Care corporation) vermeld voor een geautomatiseerde draagbare kunstnier.

Het mechanisme achter de filtratie bestaat uit drie grote delen: convectie, diffusie en osmose,

waarbij diffusie als enige niet drukafhankelijk is. De andere twee factoren worden verhoogd

wanneer de druk over het membraan stijgt. De snelheid waarmee een component gezuiverd


wordt, is afhankelijk van de grootte, aangezien de weerstand over het membraan groter wordt

bij grotere moleculen. Wanneer bij een kunstnier het bloed doorheen de vezels wordt gestuurd

en de dialysevloeistof door het omhullende compartiment, treedt er een zeker “shear” op.

Hoe hoger deze “shear stress” in de vezels, hoe makkelijker de convectie en diffusie verloopt

aangezien het laagje proteınen dat zich opstapelt op de wand van de vezels klein gehouden

wordt. Zo wordt de permeabiliteit van het membraan beter behouden. De opstapeling van

de proteınen op de wand van de vezel gebeurt door adsorptie aan de vezels en onderlinge

polarisatie van de proteınen. Het compartiment waar de dialysevloeistof doorgestuurd wordt

is een ruimte. Hierdoor is kanaalvorming een regelmatig optredend probleem waardoor de

uitwisseling niet maximaal verloopt (Ronco et al., 1998).

2.5.2 Detectie van galzouten

De geconjugeerde galzouten in het duodenum kunnen in theorie door verschillende technie-

ken gedetecteerd worden (Roda et al., 1998). Aangezien geconjugeerde galzouten een goede

absorptie vertonen in het UV-gebied of het zichtbare gebied kunnen deze gedurende een

HPLC-analyse (“High Performance Liquid Chromatography”) gevolgd worden door een con-

ventionele UV-detector. Hiervoor moeten de galzouten echter in een pure vorm beschikbaar

zijn, zodat alle galzouten van elkaar gescheiden worden. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren door

voorafgaand op de HPLC-scheiding een SPE (“reversed-phase solid-phase extraction”) uit te

voeren gecombineerd met een anionenuitwisseling. Een nadeel van deze opzuivering is dat

alle elutiebuffers grondig getest en allemaal gestandaardiseerd moeten worden vooraleer de

techniek kan uitgevoerd worden. HPLC kan eventueel gecombineerd worden met een fluores-

cente labeling van de galzouten waardoor een iets hogere gevoeligheid kan bekomen worden.

Wanneer uitsluitend massaspectrometrie (MS) toegepast wordt, geeft deze niet voldoende

kwalitatieve en kwantitatieve informatie. HPLC kan gecombineerd worden met MS en zo

meer gedetailleerde informatie verschaffen dan een enkele HPLC. Zo kan er afzonderlijke kwa-

litatieve en kwantitatieve informatie bekomen worden van vrije, glyco- en taurogeconjugeerde

galzouten.

Een andere scheidingstechnieken is gaschromatografie (GC). GC wordt voornamelijk gebruikt

voor identificatie en kwantificatie van galzouten uit lichaamsvloeistoffen maar de galzouten

moeten hiervoor vluchtig en thermostabiel zijn. Dit vergt een uitgebreid onderzoek voor-

afgaand aan de GC. “Thin layer chromatography” (TLC) geeft het voordeel dat er minder

voorafgaande handelingen nodig zijn maar deze techniek is doorgaans alleen geschikt voor

identificatie van galzouten, niet voor kwantificatie ervan. MS wordt ook gebruikt in combi-

natie met GC. Bij deze techniek gelden dezelfde voorwaarden als bij een enkele GC en is dus

enkel toepasbaar voor vluchtige en thermostabiele galzouten.


Het grote probleem blijft echter de eerste opzuivering (eluering) van de galzouten uit de matrix

waarin ze zich bevinden aangezien er zeer weinig contaminerende en mogelijks interagerende

stoffen mogen aanwezig zijn om deze mogelijke technieken toe te passen. Het vraagt doorgaans

veel tijd om een opzuivering te realiseren en op punt te stellen.

Hoofdstuk 3

Materiaal en methoden

3.1 Stammen van B. cereus

Er werden 4 stammen gebruikt van B. cereus afkomstig uit de collectie van LFMFP (Labora-

tory of Food Microbiology and Food Preservation, Ghent University). Er werd geopteerd voor

telkens een mesofiele en psychrotrofe stam van een klinisch en een voedselisolaat. Psychrotroof

werd hier beschouwd als zijnde bacterien die kunnen groeien bij ≤ 7℃.

Tabel 3.1: Eigenschappen van de 4 B. cereus stammen

Stam Ref.nr. Oorsprong Minimale groei- Origine Collectie

temperatuur in TSB

1230-88 1.1 klinisch isolaat 8℃ (mesofiel) humane faeces NVH*

9903295-4 2.1 klinisch isolaat 7 ℃ (psychrotroof) humane faeces RIVM**

P1494.3 1.2 voedselisolaat >10 ℃ (mesofiel) aardappelvlokken LFMFP

1.3 2.2 voedselisolaat 7 ℃ (psychrotroof) REPFED aardappel- LFMFP

puree***

*NVH= “Norwegian School of Veterinary Science”

**RIVM = Nederlands Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu

***REPFED= “Refrigerated processed foods of extented durability”

3.1.1 Standaardopkweek van de stammen

Eerst werd de stam opgekweekt vanuit de cultuurstock bij -80℃ of slant in 9ml TSB (Tryptic

Soy Broth). Na een incubatie van 24uur bij 30℃ werd er 0,1ml overgezet in 9ml TSB en werd

een 4x4 gemaakt op TSA (Tryptic Soy Agar) om de zuiverheid te controleren. De subcultuur

en de 4x4 werden 24uur geıncubeerd bij 30℃.

16

3. MATERIAAL EN METHODEN 17

3.1.2 Bepaling van de B. cereus concentratie

Het totaal kiemgetal werd bepaald door uitplatingen uit te voeren op TSA-medium. De

verdunningsreeksen werden gemaakt in “peptone physiological salt solution” (pps, 0,1% pep-

ton, 0,85%NaCl). Het sporenaantal werd bepaald door de verdunningen 10min bij 80℃ te

verhitten en uit te platen op TSA-medium. Stalen van het voedselmedium werden vooraf

gehomogeniseerd door 30s te stomacheren (Colworth 400) voor incubatie en 1min voor de

verdunning en uitplating.

Voor de kwantificatie van B. cereus in aanwezigheid van hoge aantallen intestinale microbiota

(ileumfase) werd het totaal DNA geextraheerd uit 1ml staal (CTAB-extractie, hexadecyltri-

methylammonium bromide) waarna er een specifieke B. cereus “quantitative real-time poly-

merase chain reaction” (qPCR) op uitgevoerd werd volgens het protocol in Ceuppens et al.

(2010).

3.1.3 Opkweek van B. cereus in voedselmedium

De groeicurve van de 4 stammen in het voedselmedium werd opgesteld om inocula in verschil-

lende groeifasen te kunnen produceren: vegetatieve cellen in de exponentiele fase, stationaire

fase en sporen.

Steriel voedselmedium (83ml) werd in tweevoud geınoculeerd met 1ml van de subcultuur na

de standaardopkweek (zie 3.1.1), vooraf 10x verdund voor de psychrotrofe stammen en 100x

voor de mesofiele en geıncubeerd bij 22℃.

Om exponentiele cellen van stam 1.1 te verkrijgen, werd 1ml van de 10− 3 verdunde subcultuur

bij 20ml voedselmedium gevoegd en overnacht (15u) geıncubeerd bij 22℃.

Om stationaire cellen te verkrijgen van stam 1.1 in voedselmedium (83ml) werd 1ml van de

subcultuur toegevoegd, vooraf 100x verdund en 24-25u geıncubeerd bij 22℃.

De sporulatie van stam 1.1 bij 30℃ werd opgevolgd door in drievoud 83ml voedselmedium te

inoculeren met 1ml van een 100x verdunde subcultuur afkomstig van een standaardopkweek.

3.2 Samenstelling en pH van de gastro-intestinale simulatie-

media

Het voedselmedium bestond uit kant-en-klare aardappelpuree (Maggi, Mousseline aardappel-

vlokken) en een voedingsoplossing gebaseerd op de samenstelling van de conventionele SHIME

voeding (tabel 3.2) (Van de Wiele et al., 2004). De puree werd bereid zoals voorgeschreven

in het recept: 125 g aardappelvlokken, gemengd met 250 ml koude melk (Milbona,volle melk,

3,5% vet) en 500 ml kokend water. De gewichtsverhouding puree/voedingsoplossing was 1:1,


wat overeen kwam met ongeveer 500 ml oplossing gemengd met 500 g puree. De samen-

stelling van de voedingsoplossing is te zien in tabel 3.2. De arabinogalactaan-, xylaan- en

cysteıneconcentraties bleven onveranderd omdat deze componenten nodig zijn voor de mi-

crobiele groei en een essentieel onderdeel vormen van de voedingsoplossing. De concentraties

van pectine en het gist-extract werden gehalveerd en de toegevoegde concentratie proteose

pepton werd viermaal verminderd omdat de puree in de voedingsoplossing al een extra voe-

dingsbron was. Mucine werd niet toegevoegd omdat dit in het speeksel- en maagsapmedium

aanwezig was. Het voedingsmedium werd na de samenvoeging van de puree en de voedings-

oplossing geautoclaveerd (15 min aan 121℃).

Tabel 3.2: Samenstelling van de voedingsoplossing (g/L)

voedingsoplossing SHIME voeding Merk

(Van de Wiele et al., 2004)

Arabinogalactaan 2,0 1,0 Sigma 10830

Cysteıne 1,0 0,5 Sigma C7352

Gistextract 3,0 3,0 Oxoid LP0021

NaCl 2,8 - Analur normapur 27810.95

Pectine 2,0 2,0 Sigma 7628.2

Proteose pepton 0,5 1,0 Oxoid LP0085

Xylaan 2,0 1,0 Sigma X0502

Mucine - 4,0 Sigma M2378

Zetmeel - 4,2 -

Glucose - 0,4 -

Uit het onderzoek van Hagens et al. (2007), Oomen et al. (2003a) en het BARGE-protocol

v.12 werden de samenstellingen van de overige media vergeleken en uit deze vergelijking werd

een keuze gemaakt. De meeste waarden werden door de verschillende bronnen bevestigd en

daarom overgenomen. Het duodenum- en galmedium werden samengevoegd in de verhouding

die hiervoor vermeld werd, nl. 2/1. Er werd in dit onderzoek met toevoeging van voeding

gewerkt, daarom lagen de concentraties van alle enzymen twee tot driemaal hoger, zoals in

Versantvoort et al. (2004) en Hagens et al. (2007) kan worden teruggevonden. De enzymen

werden nogmaals verhoogd om de verdunning die optrad in het model door de toevoeging van

het voedselmedium tegen te gaan, zodat de absolute concentratie van de enzymen in elke fase

gelijk was aan deze vermeld in Hagens et al. (2007). Zoals in de literatuurstudie geschreven

werd, was er een verschil in NaHCO3-concentratie in het duodenummedium binnen de drie


referenties. In Knutson & Flemstrom (1989) worden concentraties NaHCO3 in het secreet

van de duodenale mucosa weergegeven van 135 tot 220 µmol/cm/u. De concentratie vermeld

in het BARGE-protocol benaderde deze gegevens het best. De volledige samenstelling van

elk medium is te zien in tabel 3.3. De oplossingen werden telkens bereid zonder de enzymen,

galzouten en urinezuur en geautoclaveerd. Vlak voor gebruik werden deze componenten aan

de media toegevoegd en werd indien nodig de pH aangepast.

Tabel 3.3: De samenstelling van de gebruikte simulatiemedia (g/L)

Speeksel Maagsap Darmsap Merk

CaCl2 · 2 H2O - 0,400 0,207 Merck 142.005.000

D-(+)-glucosamine-hydrochloride - 0,330 - Sigma G4875

D-glucuronzuur - 0,020 - Fluka 49335

KCl 0,896 0,824 0,501 ucb 8006

KH2PO4 - - 0,053 vwr prolabo 26.925.364

KSCN 0,200 - - ucb 1639

MgCl2 · 6 H2O - - 0,033 Analur normapur 25.108.295

Mucine 0,050 3,000 - Sigma M2378

NaCl 0,298 2,752 6,428 Analur normapur 27810.95

NaH2PO4 · 2 H2O 1,154 0,346 - vwr prolabo 28014.291

NaHCO3 - - 5,666 Analur normapur 27.778.293

Na2SO4 · 10 H2O 1,292 - - vwr prolabo 28117.298

NH4Cl - 0,306 - gpr rectapur 21.235.366

Ureum 0,200 0,085 0,150 Sigma 200-315-5

Urinezuur 0,015 - - Sigma 200-720-7

Amylase 0,725 - - Sigma A6814-5MU

Bovine Serum Albumine (BSA) - 2,250 1,267 vwr 422351S

Pepsine - 4,500 - Sigma P7000-25G

Pancreatine - - 6,000 Sigma P1750-25G

Lipase - - 1,000 Sigma L3126-25G

Galzouten (Oxgall) - - 10,000 Difco 212820

De verhouding tussen de media werd vastgelegd op 1,5/1/2/4,5 voor respectievelijk het

voedings-, speeksel-, maagsap- en darmsapmedium. In Hagens et al. (2007) werd de ver-

houding 1,5/1/2/3 gebruikt. Hier werd er echter verondersteld dat het voedsel vast was en

de hoeveelheid darmsapmedium de som van het speeksel- en maagsapmedium was. Omdat


er in dit onderzoek gewerkt werd met een vloeibare voeding die veel meer plaats innam dan

vast voedsel en dus voor een grotere ’maaginhoud’ zorgde, werd de som van het voedings-,

speeksel- en maagsapmedium genomen als hoeveelheid voor het darmsapmedium.

Voor de dialysevloeistof werd een isotone zoutoplossing gebruikt (8,4176g/L NaCl) waarbij

ook BSA werd toegevoegd in eenzelfde concentratie als deze die op het moment van de dialyse

in het darmmedium aanwezig is, nl. 1,133g/L. De keuze om BSA als extra component toe te

voegen, was gebaseerd op het feit dat alleen dit serum albumine ook voorkomt in het bloed

van de mens en dat de enzymen op het tijdstip van de dialyse hun werk gedaan hebben

(Silbernagl & Despopoulos, 2007).

Zoals vermeld in de literatuurstudie heeft elk deel van het gastro-intestinaal kanaal zijn speci-

fieke pH-waarde. Om de gastro-intestinale simulatiemedia op de correcte fysiologische pH in

te stellen, werden deze met een zure (1M HCl) en een alkalische (1M NaOH) oplossing bijge-

steld (pH meter: Ankersmit, Orion 525A). De pH van het speeksel werd ingesteld op 6,5 naar

analogie met de algemene pH van de mondholte. De pH van het maagsap werd op 2 ingesteld

zodat het mengsel van voedings-, speeksel- en maagmedium een pH bezat van 5. De pH van

het darmsapmedium werd aangepast naar pH 5 vlak voor de simulatie (HCl, 5M) en bin-

nen de ingestelde grenzen gehouden tijdens de simulatie door een automatische pH-controller

(Elektrolab Fermac 260). De invloed van de temperatuur werd onderzocht door de pH van

elk medium en elk mengsel te meten bij kamertemperatuur en 37℃, de lichaamstemperatuur.

3.3 Ontwikkeling van de simulatie van het bovenste gastro-

intestinaal stelsel

3.3.1 Maaglediging en -verzuring

De maaglediging is gebaseerd op de data uit het onderzoek van Clarkston et al. (1997).

De buffercapaciteit van het maagmedium waarin enkel enzymen afwezig waren, werd bepaald

door herhaaldelijk 25µl HCl (5M) toe te voegen en de pH op te volgen bij kamertemperatuur

(pH-meter: Ankersmit, orion 525A). De richtwaarden voor de pH-daling in de maag in functie

van de tijd werden overgenomen uit Russell et al. (1993). Door deze twee datareeksen te

combineren met de gegevens van de maaglediging werd de hoeveelheid maagzuur afgeleid die

toegevoegd moest worden aan het maagmedium in een bepaalde tijdspanne om een correcte

daling te krijgen.


3.3.2 Dialyse van het darmmedium

Voor het ontwerp werd een filter gebruikt die in de medische wereld als kunstnier bekend

staat (DiacapHiFlo, 18, Braun). Deze werd aangesloten na het eerste deel van de duode-

num/jenunumfase en vormde de overgang naar het ileum. Voor een optimale reabsorptie van

componenten werd een tegenstroomconfiguratie gebruikt waarbij de dialysevloeistof van bo-

ven naar onder doorheen de vezels stroomde en het darmmedium tegengesteld doorheen het

buitenste compartiment omdat het ileummedium te dens was om door de vezels te stromen.

De dialysevloeistof werd gedurende de hele filtratie aangevoerd, het darmmedium recircu-

leerde. Beiden werden doorheen de filter geduwd en getrokken door dubbele pompen: twee

pompkoppen/circuit.

3.3.2.1 Reabsorptie van galzouten

Er werd een standaardcurve opgesteld om te kunnen bepalen hoeveel galzouten gereab-

sorbeerd werden door de dialyse. Er werd een verdunningsreeks gemaakt van een 10g/L-

galzoutoplossing door 300µl in een 96-wellplaat (Greiner bio-one, cellstar 655180) te brengen

en de optische densiteit (OD) bij golflengte 350 nm te meten (Molecular devices; Versamax

EXT, BN02030; tunable microplate reader).

Om de reabsorptie van galzouten in water te volgen werd 0,5L van een 10g/L-galzoutoplossing

aan een dialyse onderworpen en via OD-metingen (350nm) opgevolgd.

Om de reabsorptie van de galzouten te detecteren in het darmmedium werd een oplossing

gemaakt naar analogie met het normale darmmedium maar er werden geen kleurcomponenten

of enzymen in opgenomen. Voedselmedium werd vervangen door gedestilleerd water en het

maagsapmedium bevatte geen mucine. Er werd een standaardcurve opgesteld (analoog met

de vorige) en een dialyse uitgevoerd met het medium (5g/L galzouten). Het dialysemedium

was een isotone zoutoplossing.

Om de kleurinvloed van alle andere kleurcomponenten (voedselmedium, mucine, enzymen)

werd het darmmedium zonder galzouten gedialyseerd. Na een centrifugatie van 3min bij

13000rpm werd het supernatans aan een ultrafiltratie van 0,45µm onderworpen (Whatman

FP30/0,45 CA-S). De OD van het filtraat (300µl) werd bij 350nm gemeten in een 96-well

plaat met gedestilleerd water als blanco.

3.3.2.2 Dialyse met B. subtilis en B. cereus

Om te testen of bacteriele cellen de dialyse zouden overleven en of ze doorheen de filter in het

dialysemedium terecht konden komen, werden enkele verkennende experimenten uitgevoerd,

eerst met B. subtilis en daarna met B. cereus.


B. subtilis werd opgekweekt (standaardprocedure 3.1.1) en van de 100x verdunde subcultuur

in tweevoud 100µl overgezet in 9ml TSB (24u, 30 ℃). Na incubatie werden beide bij 500ml

darmmedium gevoegd. Als controle werd 18ml afgezonderd en statisch geıncubeerd zonder

dialyse. Er werd 3u 28min gedialyseerd. De snelheden van het dialyse- en darmmedium

waren 10 en 80ml/min (Masterflexpomp L/S, digital economy drive, Cole-Parmer instrument

company). Het darmmedium werd verder door de filter gepompt na de stopzetting van de

dialyse om de overleving van B. subtilis te volgen. Er werden stalen van het dialysemedium

genomen om te kijken of B. subtilis doorheen de filter kon komen.

Hetzelfde experiment werd uitgevoerd met B. cereus. Dezelfde media werden gebruikt als

bij het experiment met B. subtilis en er werden stalen genomen van het wel gedialyseerd

darmmedium, het niet gedialyseerd darmedium en het dialysemedium. De snelheden van

het dialyse- en darmmedium werden resp. ingesteld op 100ml/min en 62,5ml/min gedurende

87min.

3.3.3 Gedrag van SHIME microbiota in het ileum

Om na te gaan of de SHIME microbiota in normale verhoudingen aanwezig bleven tijdens

hun uitgroei in het darmmedium, werd een standaard experiment (zie 3.4.2) zonder B. ce-

reus opgezet waarbij de dialyse 80min duurde en het volume van nabij gevolgd werd. De

ileumfase had een constante pH van 6,5, gecontroleerd door de pH-controller. Gedurende de

ileumfase werden de verschillende grote groepen SHIME microbiota opgevolgd door elk uur

een staal te nemen en uit te platen op de volgende (niet) selectieve media. Het totaal ae-

roob kiemgetal werd opgevolgd door uitplatingen op BHI-agar (“Brain Heart Infusion”-agar,

OXOID CM0225), Staphylococci door uitplatingen op MSA (“Mannitol Salt Agar”, OXOID

CM0085), coliformen door uitplatingen op Mc (97% “MacConkey agar”, OXOID CM0007

en 3% Agar, VMR 20.768.292) en Enterococci door uitplatingen op EA (89%“Enterococcus

Agar” (Difco 274620) en 11%Agar). Deze platen ondergingen allemaal een aerobe incubatie

van 24uur bij 37℃ , behalve de MSA-platen, deze werden 48uur geıncubeerd. Het totaal

anaeroob kiemgetal en het aantal Clostridia werden repectievelijk bepaald door uitplatingen

op BHI (70%BHI en 29% Agar) met cysteıne (1%, Fluka biochemica 30130) en resasurine

(500µl/L) en op TSC (“Tryptose Sulfite Cycloserine” met toevoeging van een Clostridium

perfringens selectief supplement (Oxoid SR0088E)). Deze platen werden gedurende 24uur

anaeroob geıncubeerd (Oxoid Anaerogen AN0025A). De verdunningen werden gemaakt in

pps met 0,5g/L cysteıne om de anaeroben in leven te houden tijdens de uitplatingen.


3.4 B. cereus in het simulatiemodel

B. cereus werd in verschillende groeifasen door het simulatiemodel gestuurd. Eerst werden

exponentiele cellen gebruikt, daarna cellen in de stationaire fase en vervolgens werden sporen

gebruikt.

3.4.1 Opbouw van de proefopstelling

Figuur 3.1: Algemene opbouw van het simulatiemodel

Het huidige SHIME-systeem (Simulation of the Human Intestinal Microbial Ecosystem) werd

uitgebreid door een meer geoptimaliseerde simulatie te ontwikkelen voor de maag en de dunne

darm. In de opstelling werden maar twee vaten gebruikt (maag en dunne darm) en geen colon-

vaten. De vaten waren dubbelwandig waardoor er water van 37℃ tussen de twee wanden kon

stromen (Lauda E100, Ecoline staredition) en de simulatiemedia op een correcte temperatuur

werden gehouden. Er werd een pH-daling voor het maagmedium ontwikkeld (HCl-oplossing

van 0,18M) en het maagvat werd gradueel geledigd. Voor de maagverzuring werd een Master-

flexpomp L/S (digital economy drive, Cole-Parmer instrument company) gebruikt waarin een

darm werd ingebracht met een inwendige diameter van 0,51mm (Pharmed BPT, 070539-05)

om te pompen aan snelheden van resp. 0,24ml/min en 0,1ml/min. Voor de maaglediging werd

een Masterflexpomp L/S (digital standard drive, Cole-Parmer instrument company) gebruikt

met een inwendige darmdiameter van 4mm (Masterflex 96410-16) die door een voorgepro-

grammeerde timer (Chacon SE-115) aan en uit gezet werd aan een snelheid van 2ml/min.

In het maagvat werd een pH-meter (Consort R305 multichannel controller) ingebracht zo-

dat de pH-daling tijdens de maagfase gevolgd kon worden. In het tweede vat, het dunne

darmvat, gingen achtereenvolgens twee fasen door, resp. de duodenum/jenunumfase en de

ileumfase. Om de simulatie dichter bij de werkelijkheid te brengen, werden de hoge concen-

traties enzymen en galzouten aanwezig tijdens de duodenumfase voor de overgang naar het


ileum verwijderd door een dialyse waarvoor twee Masterflexpompen L/S (digital economy

drive / digital standard drive) gebruikt werden aan snelheden van 40 en 80 ml/min voor

resp. het darmmedium en het dialysemedium. Om de pH tijdens deze fasen te veranderen en

constant te houden, werd er aan het tweede vat een pH-controller (Elektrolab Fermac 260)

gekoppeld met als zuur en base resp. 1M HCl en 1M NaOH. De pH-meter en -controller

werden bij aanvang van elk experiment gecallibreerd met callibratievloeistoffen met pH 4 en

7, bij 37℃ (Hanna instruments, HI7004 en HI7007).

3.4.2 Verloop van de simulatie

In figuur 3.2 is het verloop schematisch weergegeven. In een stomacherzak werd 83ml voed-

selmedium met het gewenste aantal van de gewenste stam gebracht. Bij aanvang van het

experiment werd deze zak 30s gestomacherd voor een goede menging. Hierna werd het speek-

selmedium (37℃) toegevoegd aan de stomacherzak en het geheel werd 1min gestomacherd

om het kauwen te simuleren, gevolgd door 10 min incubatie (mondfase). Daarna werd het

mondmedium overgepompt (40ml/min) in het eerste vat waarin het maagsapmedium al op

37℃ gebracht was. Eerst werd de pH manueel op exact 5 ±0,02 gebracht met NaOH (1M).

Dan werd de automatische zuurtoevoeging in het maagvat gestart. De maagfase, met zowel

de zuurtoevoeging als de maaglediging, duurde 180min. De zuurtoevoeging liep 75min aan

0,24ml/min, op pH 5,0 tot pH 3,0 te brengen, en daarna 105min aan 0,1ml/min om van pH

3,0 tot pH 2,0 te dalen. Op het einde van de maagfase werd de zuurtoevoeging stopgezet en

werd het resterende maagmedium snel (40ml/min) naar het tweede darmvat overgepompt.

In het tweede vat werd vooraf het darmsapmedium manueel op exact 5 ±0,02 gebracht met

HCl (5M) waarna het pH-bereik van de pH-controller werd ingesteld op 4,9 - 5,1. De duo-

denum/jenunumfase startte 30min na de maagfase, bij het begin van de maaglediging. Deze

fase duurde in totaal 4uur. Na 45 min werd het pH-bereik van het darmmedium tussen 5,9 en

6,1 ingesteld. Tien minuten na het einde van maagfase, dus wanneer de volledige maaginhoud

zich in de dudenumfase bevond, startte de dialyse van het darmmedium om de galzouten te

verwijderen (pH-bereik: 6,4 - 6,6). De dialyse duurde 75min. Vijf minuten na het einde van

de dialyse werd 1ml SHIME-suspensie van het colon ascendens toegevoegd en het pH-bereik

op 7,2 - 7,4 gezet. Dit was de start van de ileumfase die 4uur duurde.

De analyses werden uitgevoerd zoals vermeld in paragraaf 3.1.2. De toxinestalen werden eerst

door een filter van 0,20 µm (Whatman FP30/0,2 CA-S) geduwd en ingevroren bij -20℃. De

latere analyse wordt besproken in paragraaf 3.4.11.


Figuur 3.2: Algemeen verloop van de simulatie



De algemene pH-daling en de maaglediging tijdens de simulatie zijn weergegeven in figuur 3.3.

Het weergegeven pH-profiel zijn de gemiddelde waarden tijdens de 12 definitieve simulaties.

Figuur 3.3: De maagfase met maagverzuring en -lediging

3.4.4 B. cereus (1.1) in de exponentiele fase

Het voedselmedium bestond uit 3ml van het voedselmedium waarin exponentiele cellen van

B. cereus waren opgekweekt (zie 3.1.3) en 80ml steriel voedselmedium. De simulatie werd

volgens de standaardbeschrijving uitgevoerd (zie 3.4.2) maar de pH van het darmmedium was

doorlopend 6,5 en de start-pH van het maagmedium was 4,81. De pH-daling week maximaal

-0,26 (op 1u) af van het gemiddelde (figuur 3.3) en na 3u was het verschil +0,11.

3.4.5 B. cereus (1.1) in de stationaire fase

Het voedselmedium werd gemaakt zoals vermeld in paragraaf 3.1.3. De media hadden de

standaard samenstelling en de simulatie verliep volgens de algemene beschrijving (zie 3.4.2)

uitgezonderd de zuurtoevoeging. De snelheid werd na 85min verlaagd en dit gaf aanleiding

tot een gelijkaardige pH-daling met het verloop weergegeven in figuur 3.3 met een maximaal

pH-verschil van -0,3 op 120min.

3.4.6 Overleving van B. cereus (1.1) in darmsapmedium

Om te onderzoeken of B. cereus kon overleven bij de galzoutconcentratie in het ileummedium

werd de overleving opgevolgd in darmsapmedium met 5g/L Oxgall. Het experiment werd in


drievoud uitgevoerd bij 37℃ met vegetatieve cellen in de stationaire fase volgens de standaard

opkweek met resp. 7,7 en tweemaal 7,4 log kve/ml. Er werd 0,1ml van het inoculum bij 9,9ml

darmsapmedium gevoegd met 5g/L galzouten (Oxgall) en een pH van 6,5.

3.4.7 Opkweek van sporen voor de simulatie

Voor de opkweek van de sporen werd het voedselmedium (85ml) geınoculeerd met 1ml van de

100x verdunde subcultuur (opkweek volgens 3.1.1) en geıncubeerd bij 30℃. De incubatieduur

was verschillend per stam aangezien de ene stam sneller sporuleerde dan de andere. Voor

het samenstellen van het finale voedselmedium werd de zak met het meest geschikte aantal

sporen/ml genomen en werd er een mengsel gemaakt van dit geınoculeerd voedselmedium

en steriel voedselmedium zodat het gewenste aantal bekomen werd. Dit mengsel werd 1min

gestomacherd en bij 2℃ geplaatst tot gebruik.

3.4.8 Sporen van B. cereus (stam 1.2) zonder SHIME bacterien

Het simulatiemodel zoals beschreven in paragraaf 3.4.2 werd uitgevoerd met stam 1.2. Bij

aanvang van de ileumfase werden echter geen SHIME microbiota toegevoegd. In het voedsel-

medium waren initieel 6,5 log sporen/ml aanwezig en bij de maagverzuring was de maximale

pH-afwijking tegenover het algemene profiel (zie 3.3) +0,18 na 75min.

3.4.9 Sporen van B. cereus (stam 1.2)

Het simulatiemodel zoals beschreven in paragraaf 3.4.2 werd uitgevoerd met stam 1.2 maar nu

werden wel SHIME bacterien toegevoegd bij aanvang van de ileumfase. In het voedselmedium

waren initieel 6,0 log sporen/ml aanwezig en bij de maagverzuring was de maximale pH-

afwijking tegenover het algemene profiel (zie 3.3) -0,6 na 120min.

3.4.10 Sporen van 4 B. cereus stammen in het simulatiemodel

Het simulatiemodel zoals beschreven in paragraaf 3.4.2 werd in drievoud uitgevoerd voor

vier B. cereus stammen (zie 3.1). De analyses werden uitgevoerd zoals in paragraaf 3.1.2.

In het voedselmedium waren telkens 7,0 log sporen/ml aanwezig. In 3.4.11 wordt beschre-

ven welke analyses op de toxinestalen uitgevoerd werden. In figuur 3.3 werd de gemiddelde

maagverzuring van alle simulaties weergegeven.


3.4.11 Toxinedetectie

De toxineproductie in de ileumfase werd bij opgevolgd bij de simulaties met de 4 B. cereus

stammen. Twee verschillende toxines, het haemolitisch (Hbl) en niet-haemolitisch (Nhe) wer-

den getest met drie verschillende kits. “Duopath Cereus Enterotoxins GLISA” kit (Merck)

controleerde op beide toxines, de “Oxoid BCET-RPLA” kit op Hbl en de “Tecra Bacillus

Diarrhoeal Enterotoxin VIA” kit op Nhe. Deze tests werden rechtstreeks uitgevoerd met de

gefilterde stalen dus er werd geen aanrijking uitgevoerd zoals beschreven staat in de handlei-

ding van deze kits. Als positieve controle werd TSB gebruikt waarin elke stam opgekweekt

volgens de standaardprocedure. De TSB werd vooraf, net zoals de andere stalen, gefilterd

doorheen een filter van 0,22 µm. Alle stalen hadden de vereiste pH tussen 7 en 8.

3.4.12 Statistische analyses

De statistische test voor het vergelijken van 2 groepen die uitgevoerd werd op de resultaten

van het voedselmedium, de mond-, maag- en duodenum/jenunumfase is de niet-parametrische

test “Mann-Whitney” met 95%-betrouwbaarheidsinterval, voor het vergelijken van meer dan 2

groepen werd de Kruskal-Wallistest uitgevoerd. Er werd geopteerd voor een niet-parametrische

methode omdat de varianties van de meeste populaties niet gelijk waren en het aantal data-

punten per populatie zeer laag was.

Voor de ileumfase werd een ’one-way ANOVA’ toegepast omdat alle populaties normaal ver-

deeld waren en gelijke varianties hadden. Hierdoor werd aan de voorwaarden voldaan om een

ANOVA-test uit te voeren. Het aantal datapunten per populatie was echter 3 ipv 30 maar 30

herhalingen in microbiologisch onderzoek is praktisch onhaalbaar.

Hoofdstuk 4

Resultaten en bespreking

4.1 Opkweek van B. cereus in voedselmedium

In tabel 4.1 is te zien elke stam gegroeid was tot 8,0 log kve/ml en zich na 28 uur in de

stationaire fase bevond. Uit praktische overwegingen werd besloten om de stammen 24 uur in

het voedselmedium te incuberen bij 22℃ voor de simulaties met stationaire cellen. De sporen

van alle stammen bleven onder 10 kve/ml, behalve bij stam 2.2, waar het aantal sporen tussen

10 en 100 kve/ml lag bij alle staalnames.

Na 14 dagen bij 22℃ waren de sporenpopulaties van alle stammen kleiner dan 6,0 log kve/ml.

Van de psychrotrofe stammen was ook het totaal kiemgetal gedaald tot < 6,0 log kve/ml.

Van de mesofiele voedsel- en klinische isolaat was het totale kiemgetal respectievelijk 7,0 en

6,3 log kve/ml.

Bij 30℃ werd betere sporulatie en overleving bekomen (tabel 4.2). De mesofiele klinische

stam van B. cereus (stam 1.1) sporuleerde al na 24 uur maar een 8,0 log kve/ml werd pas

verkregen na 8 dagen. De verschillen in sporulatie bij 30℃ tussen 8 en 14 dagen (tabel 4.2)

vallen binnen de meetfout van de uitplatingsmethode dus er kan gesteld worden dat de extra

6 dagen geen invloed meer hebben op de sporenpopulatie.

29

4. RESULTATEN EN BESPREKING 30

Tabel 4.1: De groeicuve van de 4 B. cereus stammen in voedselmedium bij 22℃.

1.1* 1.2* 2.1* 2.2*

Tijd (uur) Gem. St.afw. Gem. St.afw. Gem. St.afw. Gem. St.afw.

0 3,4 0,2 3,5 <0,05 3,7 0,2 3,8 0,1

22 7,6 0,2 8,2 0,1 8,3 0,1 8,0 0,2

23 7,9 0,1 8,0 0,1 8,1 <0,05 8,1 <0,05

24 8,0 <0,05 8,1 <0,05 8,2 0,1 8,1 0,1

25 8,0 <0,05 8,2 <0,05 8,1 <0,05 8,1 <0,05

26 8,1 0,0 8,3 <0,05 8,2 0,3 8,1 0,1

27 8,2 0,1 8,4 0,1 8,1 <0,05 8,1 <0,05

28 8,3 <0,05 8,3 0,1 8,2 <0,05 8,3 <0,05

29 8,4 0,2 8,4 <0,05 8,4 0,1 8,4 0,2

30 8,4 <0,05 8,4 0,1 8,3 <0,05 8,4 0,1

31 8,3 0,1 8,3 0,1 8,4 0,1 8,4 0,2

*1.1=mesofiel klinisch isolaat (NHV 1230-88), 1.2=mesofiel voedselisolaat (P1494.3 5A3),

2.1=psychrotroof klinisch isolaat (9903295-4), 2.2=psychrotroof voedselisolaat (1.3)

Tabel 4.2: De sporulatie bij 30℃ van stam NHV 1230-88 in voedselmedium.

(log kve/ml) Sporen Totaal kiemgetal

Tijd (dagen) Gem. St.afw. Gem. St.afw.

0 - - 3,9 <0,05

1 1,7 0,8 8,3 <0,05

2 >0,0 <0,05 8,0 <0,05

8* 7,9 0,0 8,2 0,0

14 8,0 0,1 8,5 <0,05

*Deze data zijn afkomstig van 1 meting


4.2 Samenstelling en pH van de gastro-intestinale simulatie-

media

De pH van het voedingsmedium werd niet aangepast en had een pH van 5,82±0,02. Bij

het speekselmedium werd 0,67ml NaOH (1M) per liter gevoegd voor een pH-stijging van

6,25±0,02 naar 6,48±0,02. De temperatuur had zo goed als geen invloed op de pH van het

speeksel terwijl de pH van het voedingsmedium daalde van 5,82 tot 5,72. De pH van het

maagsap daalde van 4,66±0,02 naar 2,56±0,02 door toevoeging van 5ml HCl per liter toe te

voegen. De temperatuursstijging naar 37℃ zorgde voor een extra daling naar 2,39±0,02.

Figuur 4.1: Aanpassing van de pH van de simulatiemedia

Door het voedselmedium en het aangepaste speeksel- en maagsapmedium samen te voegen,

werd de ideale maagpH bekomen bij kamertemperatuur. De temperatuursstijging had een

verwaarloosbaar effect. Het darmsapmedium werd net voor de simulatie aangepast naar pH

5 (HCl, 5M) en had een initiele pH van 8,88 en 8,96 bij resp. kamertemperatuur en 37℃.


4.3 Ontwikkeling van de simulatie van het bovenste gastro-

intestinaal stelsel


Tabel 4.3: Maaglediging gebaseerd op Clarkston et al. (1997)

Fractie Tijd (min) Volume maaginhoud (ml) % maaglediging

1 30-60 250-190 24

2 90-120 190-150 40

3 104-120 150-118 52,8

4 137-150 118-92 63,2

5 170-180 92-72 71,2

Restfractie 180-186 72-0 100

De pH van het maagmedium (fig 4.2) heeft een log-lineair verband met de hoeveelheid toege-

voegd zuur.

Figuur 4.2: De buffercapaciteit van 250ml maagmedium zonder enzymen

De startpH van het maagmedium was 4,98±0,02 en de toevoegsnelheden van het zuur (HCl,

0,18M) waren 0,24ml/min (0-70min) en 0,1ml/min (70-174min). De toevoeging van het zuur

en het tegelijkertijd wegpompen van het maagmedium volgens tabel 4.3 zorgde voor een

lineaire daling van de pH van het achtergebleven maagmedium bij eenzelfde snelheid (fig 4.3).


Figuur 4.3: De pH-daling van volledig maagmedium met pH 5

4.3.2 Dialyse van het darmmedium

4.3.2.1 Volumeveranderingen

Bij het gebruik van een pompkop/circuit werd er tijdens de dialyse van een 10g/L-galoplossing

(Oxgall) een volumeverandering vastgesteld: het volume was na 117min verzesvoudigd

(+21,36ml/min). Bij de dialyse van 500ml darmmedium met Bacillus subtilis (stam 623,

LFMFP) steeg het volume van 500ml naar 770ml na 3u28min (+1,18ml/min).

Wanneer darmmedium met B. cereus aan een dialyse met twee dubbele pompen onderworpen

werd, werd er een wisselend resultaat verkregen. Bij een eerste experiment was er geen

volumeverandering, bij de volgende dialyse experimenten daalde het volume met -1,72ml/min,

-1,3ml/min en -0,52ml/min. Tijdens de 12 uiteindelijke simulatie experimenten met sporen

(4.4.7) werd een gemiddelde daling bekomen van 0,30ml/min met standaard afwijking van

0,08ml/min.

Verschillende circulatiesnelheden werden uitgetest: 40-100ml/min voor het darmmedium en

10-60ml/min voor het dialysemedium. Dit had echter geen consistente invloed op de volume-

verandering.

Er werd dus geen oplossing gevonden om het volumeprobleem volledig op te lossen maar om

de duur van de dialyse te bepalen, werd er rekening gehouden met dit probleem en waar nodig

gecorrigeerd in de berekeningen.


4.3.2.2 Reabsorptie van galzouten

Aan de standaardcurve (zie figuur 4.4) kon een lineaire functie gefit worden.

Figuur 4.4: Standaardcurve van 10g/L galzouten in gedestilleerd water

Uit de dialyse van een zuivere galoplossing (10g/L Oxgall in water, fig 4.5) blijkt dat na 80min

een verwijdering van 95% bereikt werd. Dit geeft aan dat het mogelijk is om galzouten te

verwijderen via dialyse en deze verwijdering te kwantificeren via OD-metingen wanneer de

galzouten (Oxgall) zich in een pure oplossing bevinden.

Figuur 4.5: Reabsorptie van een 10g/L galoplossing (Oxgall) via dialyse

De standaardcurve van galzouten in het darmmedium zonder kleurcomponenten of enzymen

is een rechte (fig 4.6). De kwantificatielimiet ligt op 0,53g/L galzouten. Hierdoor kon met ze-


kerheid een verwijderingsefficientie van 90% gedetecteerd worden. Wanneer de OD-metingen

van de dialyse gelinkt worden aan de standaardcurve (figuur 4.7), wordt duidelijk dat deze

bereikt wordt na 54min. Een efficientie van 95% wordt na 70min bereikt maar valt buiten

het kwantificatiegebied.

Figuur 4.6: Standaardcurve van gal(zouten) (Oxgall) in ileummedium zonder andere kleurcompo-

nenten

Figuur 4.7: Reabsorptie van galzouten uit ileummedium zonder kleurcomponenten door dialyse

Uit de dialyse van darmmedium zonder galzouten bleek dat het darmmedium kleur verloor

doordat ook gekleurde componenten uit het voedsel werden verwijderd (fig 4.8). Na verloop

van tijd werd dit verlies van kleur constant en bedroeg dan een OD-daling van 0,07. Ter

vergelijking, de OD-daling tijdens de dialyse van ileummedium met galzouten was 0,26.


Figuur 4.8: Kleurverlies van het darmmedium zonder galzouten tijdens de dialyse

4.3.2.3 Dialyse met B. subtilis en B. cereus

De overleving van B. subtilis kan gevolgd worden in figuur 4.9. Tijdens de eerste 8u in

het gedialyseerd ileummedium was er een daling van ongeveer 1 log kve/ml, bij het niet

gedialyseerd ileummedium bleef deze beperkt tot 0,6 log kve/ml.

B. subtilis kon door de vezels van de filter naar het dialysemedium. Na 15min en 1u waren er

resp. 3,2 en 2,9 log kve/ml aanwezig. Dit was respectievelijk 0,9% en 0,8% van de concentratie

in het gedialyseerd ileummedium.

Figuur 4.9: Overleving van B. subtilis in gedialyseerd ileummedium

De beginconcentratie van B. cereus was in beide media (gedialyseerd en niet gedialyseerd

ileummedium) dezelfde, resp. 5,4 en 5,5 log kve/ml. Gedurende de dialyse bleef het aantal


kve/ml ongeveer gelijk. Na 60 min waren er in het gedialyseerd en niet gedialyseerd ileumme-

dium resp. 5,5 en 5,7 log kve/ml aanwezig. Na 4u kon een stijging gedetecteerd worden in het

niet gedialyseerd ileummedium (6,2 log kve/ml) maar niet in het gedialyseerd ileummedium

(5,5 log kve/ml). Dezelfde situatie deed zich voor bij 8u (resp. 6,4 en 5,3 log kve/ml).

Na 25u, was B. cereus in beide media in even grote aantallen aanwezig (8,1 log kve/ml). In

het dialysemedium werden zeer weinig kve gedetecteerd: 1,3 log kve/ml na 30min en na dit

tijdstip < 1,0 log kve/ml.

4.3.3 Gedrag van SHIME microbiota in de ileumfase

Bij de SHIME microbiota was er geen groep die anderen onderdrukte door te sterk uit te

groeien (zie figuur 4.10). De Enterococcen waren minder talrijk aanwezig dan de anderen maar

groeiden op 4u ook uit tot boven hun beginconcentratie. Op 2uur en 3uur is de detectielimiet

van 2,0 log kve/ml weergegeven.

Figuur 4.10: Overleving van SHIME microbiota in het ileummedium


4.4 B. cereus in het simulatiemodel

4.4.1 B. cereus (1.1) in de exponentiele fase

In het geıncoculeerd voedselmedium waren 6,4 log kve/ml aanwezig. Door de verdunning met

het speeksel- en maagsapmedium verlaagde de concentratie B. cereus naar 5,8 log kve/ml in

de maagfase. Er werd na 30min, bij pH 4,13, een afsterving van B. cereus gedetecteerd (zie

figuur 4.11). Na 2u werd B. cereus niet meer teruggevonden in de maag (detectielimiet 10

kve/ml) en in het duodenum/jenunum (detectielimiet van 100 kve/ml). Ook de daling van

B. cereus in de ileumfase duidde op de afsterving van de cellen.

Figuur 4.11: De overleving van vegetatieve B. cereus cellen in de exponentiele groeifase (stam 1.1)

tijdens de gastro-intestinale simulatie

� = voedselmedium; × = mondfase; • = maagfase;

� = duodenum/jenunumfase; N = ileumfase

4.4.2 B. cereus (1.1) in de stationaire fase

In het geınoculeerd voedselmedium waren 8,7 log kve/ml aanwezig. Na verdunning waren er

8,0 log kve/ml aanwezig bij de start van maagfase. De afsterving in de maagfase begon na

30 min bij pH 4,28 en stagneerde rond 2,0 log kve/ml na 120 min (figuur 4.12). Tijdens de

duodenumfase werden 2,0 log kve/ml gedetecteerd. De waarden op tijdstippen 190 en 275

zijn detectielimieten. In de ileumfase was er duidelijk DNA-afbraak en dus afsterving van B.

cereus. De resultaten van de qPCR geven een hoger resultaat dan de uitplatingen omdat het

DNA-materiaal van de afgestorven cellen waarschijnlijk nog aanwezig was.


Figuur 4.12: De overleving van vegetatieve B. cereus cellen in de stationaire groeifase (stam 1.1)

tijdens de gastro-intestinale simulatie

� = voedselmedium; × = mondfase; • = maagfase;

� = duodenum/jenunumfase; N = ileumfase

4.4.3 Overleving van B. cereus (1.1) in darmsapmedium

Uit tabel 4.4 kan afgeleid worden dat de B. cereus cellen na 30min 1,0 logeenheid gedaald

waren maar zich daarna herstelden en na 2uur terug begonnen met groeien. Hieruit kan

besloten worden dat de cellen kunnen overleven in darmsapmedium met een galconcentratie

van 5g/L (Oxgall), de finale concentratie in het ileummedium.

Tabel 4.4: Overleving van B. cereus (stam 1.1) in darmsapmedium met 5g/L galzouten

Tijd (min) Gemiddelde Standaardafwijking

0 5,5 0,2

15 4,5 0,4

30 4,4 0,4

60 4,5 0,4

120 4,4 0,4

180 4,7 0,5

240 5,3 0,5


4.4.4 Opkweek van sporen voor de simulatie

De gemiddelde data van de opkweek van de verschillende stammen is te zien in tabel 4.5.

Tabel 4.5: Sporenvorming in voedselmedium bij 30℃.

(log kve/ml) Sporen Totaal kiemgetal

Stam Tijd (dagen) Initieel Gem. St.afw. Gem. St.afw.

1.1 6 2,9 5,6 0,8 7,8 0,2

1.1 9 2,9 7,9 0,1 8,3 0,1

1.2 8 2,9 8,3 0,1 8,8 0,1

2.1 10 3,5 7,0 0,2 7,1 0,4

2.2 14 2,7 7,2 0,5 7,2 0,8

1.1=mesofiel klinisch isolaat, 1.2=mesofiel voedselisolaat, 2.1=psychrotroof klinisch isolaat,

2.2=psychrotroof voedselisolaat

4.4.5 Sporen van B. cereus (stam 1.2) zonder SHIME bacterien

Figuur 4.13: De overleving van B. cereus sporen (stam 1.2) tijdens de gastro-intestinale simulatie

zonder toevoeging van SHIME bacterien in de ileumfase

� = voedselmedium, sporen; � = voedselmedium, totaal kiemgetal; × = mondfase, sporen;

+ = mondfase, totaal kiemgetal; • = maagfase, sporen; ◦ = mond- en maagfase, totaal kiem-

getal; � = duodenum/jenunumfase, sporen; � = duodenum/jenunumfase, totaal kiemgetal;

N = ileumfase, sporen; 4 = ileumfase, totaal kiemgetal


In het voedselmedium waren 6,5 log sporen/ml aanwezig (fig 4.13). In de mond- en maagfase

naderden de sporenconcentraties resp. 6,2 en 6,0 log kve/ml door verdunning. Na 2u was er

een uitschieter bij de sporen van de duodenum/jenunumfase. Op het einde van deze fase was

de ontkieming gestart, te zien aan het dalende sporenaantal. Ook het totaal kiemgetal daalde

tijdens de dialyse. Gedurende de ileumfase werd de ontkieming vervolledigd en was er groei

van de vegetatieve cellen.

4.4.6 Sporen van B. cereus (stam 1.2) met SHIME bacterien

In het voedselmedium waren 5,9 log sporen/ml aanwezig (fig 4.14). In de duodenum/jenu-

numfase startte de ontkieming tijdens de dialyse. Gedurende de ileumfase was er een lichte

stijging van het aantal kve/ml.


met toevoeging van SHIME bacterien in de ileumfase





4.4.7 Sporen van 4 B. cereus stammen in het simulatiemodel

De volledige simulatie experimenten met sporen van de 4 B. cereus stammen werden uitge-

voerd met een hoger inoculum van 7,0 log sporen/ml in het voedselmedium, aangezien met

ongeveer 6,0 log sporen/ml overleving/lichte groei werd bekomen (fig 4.14).

Algemeen kon uit de overzichten van de 4 stammen (figuren 4.15, 4.16, 4.17, 4.18) afgeleid


worden dat er geen verschil was tussen het aantal sporen in het voedselmedium en dat de

verdunningen door het speeksel- en maagmedium gelijk verliepen. Tijdens de maagfase ble-

ven de sporenconcentraties van 4 stammen constant en verschilden ze niet van elkaar. De

sporenconcentraties en totale kiemgetallen waren nagenoeg identiek gedurende de maagfase,

uitgezonderd bij stam 2.2.

Bij stam 2.2 lag het totaal kiemgetal consequent >0,5 log kve/ml lager dan de sporencon-

centratie gedurende de hele simulatie. Aangezien hierdoor niet de volledige sporenaantallen

geıncorporeerd zijn in de tellingen konden geen vergelijkingen gemaakt worden tussen de spo-

renconcentratie en het totaal kiemgetal van deze stam en tussen het totaal kiemgetal van deze

stam en een andere stam. Sporenconcentraties konden wel vergeleken worden.

De stijging van de B. cereus concentratie tijdens de duodenum/jenunumfase is geen groei

maar louter het gevolg van de continue maaglediging en de daarbij horende toevoeging van

sporen uit het maagvat. Tijdens de dialyse was er bij stam 1.1 en 2.1 een evenwijdige daling

en bij stam 1.2 daalde het sporenaantal iets sneller. Op het einde van de dialyse was het

totaal kiemgetal bij alle stammen (behalve bij 2.2) groter dan de sporenconcentratie.

De aantallen kve/ml in de ileumfase sluiten min of meer aan bij de laatste waarden van de

duodenum/jenunumfase. Bij het ileumverloop is te zien hoe de mesofiele stammen ongeveer

constant bleven in aantal terwijl de psychrotrofe stammen dalen met stam 2.2 als sterkste

daler.

In de volgende paragrafen worden de stammen met elkaar vergeleken op statistisch en micro-

biologisch vlak. Twee punten zijn pas microbiologisch verschillend als het verschil groter is

dan 0,5 log kve/ml omdat dit aantal gelijk is aan de meetfout bij een uitplatingsmethode.

4.4.7.1 Mond- en maagfase

Het verschil tussen de stammen in aantal sporen/ml voedselmedium was niet significant. Het

verschil tussen het sporenaantal en het totaal kiemgetal in het voedselmedium was bij 3 van

de 4 stammen niet statistisch significant of microbiologisch verschillend.

In de mondfase lag enkel bij stam 1.2 de sporenconcentratie statistisch significant lager dan

het totaal kiemgetal maar het verschil had geen microbiologische betekenis. De sporencon-

centraties tussen de stammen waren niet statistisch, noch microbiologisch verschillend. De

totale kiemgetallen van stammen 1.2 en 2.1 waren wel statistisch maar niet microbiologisch

verschillend.

Bij aanvang van de maagfase waren de sporenconcentratie en het totaal kiemgetal van stam


1.1 en stam 1.2 statistisch significant maar niet microbiologisch verschillend van elkaar. Na

3uur maagfase waren ze enkel bij stam 1.1 statistisch significant verschillend.

De concentratie sporen bleef gedurende de maagfase bij elke stam constant. Enkel bij stam

1.1 was er alleen een statistisch significante daling tussen de aanvang van de maagfase en 3uur

maagfase maar deze daling was microbiologisch niet significant.

Verschillen tussen de stammen op vlak van sporenconcentratie zijn alleen statistisch significant

maar nooit microbiologisch verschillend bij aanvang van de maagfase tussen stam 1.1 & 2.1;

2.1 & 1.2 en 2.1 & 2.2 en na 3u maagfase tussen stam 1.1 & 2.1.

Er kan dus geconcludeerd worden dat de sporenconcentraties van de 4 stammen tijdens de

mond- en maagfase gelijk waren en dat gedurende de maagfase alle sporenconcentraties con-

stant bleven rond 6,3-6,4 log sporen/ml.












4.4.7.2 Duodenum/jenunumfase

Er werden geen statistische analyses uitgevoerd om sporenconcentraties of totale kiemgetallen

van een stam op verschillende tijdspunten te vergelijken aangezien elk tijdspunt een andere

situatie weerspiegelt omwille van het dynamische model.

Verschillen binnen de stammen Er werd onderzocht of de dialyse (tijdstip 200 tot

275min) een significante daling van het totaal kiemgetal en/of de sporenconcentratie teweeg

bracht. Bij stam 1.1 was deze daling alleen statistisch significant bij het totaal kiemgetal maar

nergens microbiologisch. Dit komt door de grote standaardafwijking bij de sporenconcentratie

op 275min. Bij stammen 2.1 en 1.2 waren beide dalingen statistisch en microbiologisch signi-

ficant. Bij stam 2.2 was de sporenconcentratie statistisch en microbiologisch niet significant

gedaald.

Om vast te stellen of er ontkieming plaatsgevonden had, werden de verschillen tussen het

totaal kiemgetal en de sporenconcentratie bekeken. Voor stam 1.1 werd alleen een statistisch

significant verschil gedetecteerd na 130min maar geen microbiologisch verschil. De absolute

verschillen op 200min en 275min bedroegen resp. 0,5 en 0,7 log kve/ml. De standaardaf-

wijkingen zorgden ervoor dat op deze tijdstippen geen verschil echt detecteerbaar was. Op


275min was dit echter te wijten aan een afwijkend resultaat bij 1 van de 3 herhalingen waar-

bij het sporenaantal even hoog zat als het totaal kiemgetal. Ook wanneer dit punt buiten

beschouwing gelaten werd, was er geen statistisch significant resultaat (p=0,08). Bij stam 2.1

was er op tijdstip 190 en 275 een statistisch significant verschil, maar microbiologisch alleen

op 275min. Bij stam 1.2 was het verschil statistisch significant vanaf 200min, microbiologisch

alleen op 275min.

Algemeen toont voorgaande analyse aan dat de psychrotrofe klinische isolaat en de mesofiele

voedselisolaat een significante daling ondervonden tijdens de dialyse en dat bij deze twee

stammen de ontkieming gestart was op het einde van de duodenum/jenunumfase.

Verschillen tussen de stammen Om vast te stellen welke stammen het meest gelijke

verloop kenden en welke stammen verschilden van elkaar, werden tussen de stammen onderling

de sporenconcentraties en totale kiemgetallen met elkaar vergeleken.

De mesofiele stammen 1.1 en 1.2 verschilden op geen enkel punt statistisch of microbiologisch

significant van elkaar. Buiten de significante daling en ontkieming van stam 1.2 tijdens de

dialyse, kenden de 2 mesofiele stammen dus een grotendeels gelijk verloop. In fig 4.15 en 4.17

vertaalt dit zich in een evenwijdige daling van sporen en totaal kiemgetal bij stam 1.1 en een

sterkere daling van sporen bij stam 1.2.

Door het gelijklopend gedrag van stam 1.1 en 1.2 verlopen de vergelijkingen tussen 2.1 &

1.1 en 2.1 & 1.2 ook gelijkaardig. Stammen 1.1 en 2.1, beide klinische isolaten, vertoonden

op 70min en 130min een statistisch significant maar geen microbiologisch verschil tussen de

totale kiemgetallen. Tussen stam 1.2 en 2.1 was het totaal kiemgetal op 70min statistisch

niet significant. Op 190min en 200min waren er tussen 1.1 en 2.1 statistisch significante

verschillen zowel bij de sporenconcentraties als bij de totale kiemgetallen waarbij enkel de

sporenconcentratie op 190min niet microbiologisch verschillend was. Dezelfde situatie deed

zich voor tussen 1.2 en 2.1. Op tijdstip 200 lagen de sporenconcentratie en het totaal kiemgetal

van stam 2.1 resp. 0,6 en 0,7 log kve/ml hoger dan bij stam 1.1 en tweemaal 0,6 log kve/ml

hoger dan bij stam 1.2. Op tijdstip 275 was het (statistisch en microbiologisch) significant

verschil tussen de sporenconcentraties en de totale kiemgetallen tussen stam 1.1 en 2.1 teniet

gedaan aangezien stam 2.1 veel sneller daalde tijdens de dialyse dan stam 1.1. De concentraties

van deze twee stammen waren dus terug gelijk in het begin van de ileumfase. Tussen stam 1.2

en 2.1 was de sporenconcentratie wel statistisch significant en microbiologisch verschillend.

Deze lag bij stam 1.2 0,7 log kve/ml lager dan bij stam 2.1.


Tijdens de dialyse daalden de sporenconcentratie en het totaal kiemgetal bij stam 2.1 even-

wijdig, bij stam 1.1 daalde de sporenconcentratie iets sneller en bij stam 1.2 daalde de spo-

renconcentratie duidelijk sneller dan het totaal kiemgetal, wat op ontkieming van de sporen

wijst. Op het einde van de dialyse was het totaal kiemgetal bij stam 1.2 minder sterk gedaald

dan bij stam 2.1: 0,6 log kve/ml i.p.v. 1,0 log kve/ml. De sporenconcentraties daalden wel

even sterk, resp. 1,1 log kve/ml en 1,0 log kve/ml. Het verschil in vegetatieve cellen tussen

stam 1.2 en 2.1 op 275min bedroeg dus 0,5 log kve/ml.

De conclusie is dat stam 1.1 en 1.2 een gelijkaardig verloop hebben, de sporenconcentratie en

het totaal kiemgetal tot 200min hoger lagen bij stam 2.1 dan bij stam 1.1 & 1.2 en dat stam

1.2 het sterkst ontkiemd was op 275min.

4.4.7.3 Ileumfase

In het algemeen sluiten qPCR-data goed aan bij de laatste gegevens van de duodenum/jenu-

numfase die verkregen werden door uitplatingen. Deze data werden statistisch niet vergeleken

aangezien het om twee verschillende detectiemethoden gaat.

Verschillen binnen de stammen Uit de statistische analyse bleek dat er bij stammen

1.1, 2.1 en 1.2 geen verschil was tussen de verschillende tijdspunten. Bij stam 2.2 werd er

wel een statistisch significante daling gedetecteerd tijdens de hele ileumfase. De daling in het

aantal kve/ml op 0u, 1u & 2u bedroeg resp. 1,4; 1,2 en 1,0 log kve/ml, dus deze daling was

ook microbiologisch significant.

Verschillen tussen de stammen Stam 1.1 en 1.2, beiden mesofiel, waren de hele fase

statistisch significant verschillend van elkaar waarbij stam 1.1 ongeveer 1,2 log kve/ml hoger

lag dan stam 1.2. Stam 1.1 en 2.1, beiden klinische isolaten, verschilden ook statistisch van

elkaar bij het begin van de ileumfase, na 3u en na 4u ileumfase dus er kan besloten worden

dat ze gedurende de hele ileumfase verschillend waren van elkaar waarbij stam 1.1 ongeveer

1,0 log kve/ml hoger lag. Verder verschilde stam 1.1 significant van stam 2.2 na 3u en 4u

ileumfase. Deze twee stammen startten in de ileumfase ongeveer op gelijke hoogte maar door

de daling van stam 2.2 wordt het verschil na 3u ileumfase significant. Zo lag stam 1.1 1,3 log

kve/ml en 1,8 log kve/ml hoger na resp. 3u en 4u ileumfase.

Tussen stam 2.1 en 1.2 waren statistisch geen verschillen detecteerbaar en stam 2.1 ligt alleen

bij aanvang van de ileumfase significant lager dan stam 2.2, na 1u naderen ze elkaar doordat

stam 2.2 daalt en dit zet zich door gedurende de rest van de fase. Stam 1.2 en 2.2, beiden

voedselisolaten, verschillen statistisch ook alleen maar bij de start hoewel na 1u stam 2.2 1,1

log kve/ml hoger ligt dan stam 1.2. Bij aanvang ligt stam 1.2 significant lager dan stam 2.2.


Uit deze analyses kan besloten worden dat vanaf 2u ileumfase stam 2.2 begint af te sterven

daar waar de andere stammen een constante overleving hebben. De concentratie van de

mesofiele klinische isolaat (stam 1.1) lag hoger dan die van de mesofiele voedselisolaat en de

psychrotrofe klinische isolaat. De overleving van de mesofiele voedselisolaat en de psychrotrofe

klinische isolaat vertonen het meest gelijkaardig verloop.

4.4.8 Toxinedetectie

Uit de resultaten (zie tabel 4.6) kan afgeleid worden dat geen enkele kit reageert op steriele

TSB en dat enkel de detectiekit van Oxoid een licht vals positief resultaat geeft voor het

ileummedium. Hierdoor moeten de positieve reacties van de stammen met voorzichtigheid

benaderd worden. De positieve reacties van de Oxoid-kit terzijde gelaten, reageerden alle

stalen van de simulaties negatief op de toxinekits uitgezonderd stam 1.2 na 4u ileumfase bij

de Tecra-kit. De TSB-culturen gaven telkens een zeer sterk positief resultaat, behalve degene

van stam 2.2.

De verdunningen die nodig waren om de positieve resultaten bij de Oxoidkit te doen verdwij-

nen waren voor stam 1.1, 2.1, 1.2 en 2.2 resp. >128x, 16x, >128x en 2x. Bij het ileumstaal

was het effect na 2x verdunning verdwenen. Bij alle andere positieve resultaten van de stalen

(behalve een) was het effect te zien tot en met 2x verdunning. Hoewel de sterkte hier geredu-

ceerd wat tot een “±”. Bij het staal van 4u ileumfase van stam 2.2 was het niet meer te zien

bij de eerste verdunning. Verder kan afgeleid worden dat de TSB-culturen van de stammen

1.1 en 1.2 het meest Hbl-toxine geproduceerd hebben. Stam 2.1 bevindt zich tussen deze twee

uitersten. De TSB-cultuur van stam 2.2 is ook zwak positief maar hier zal meer aanwezig

geweest zijn dan bij de ileumstalen aangezien TSB geen vals positief resultaat gaf.

Wanneer de Oxoid-resultaten vergeleken worden met degene van de Duopathkit, kan gesteld

worden dat het merendeel van de zwak positieve resultaten van de Oxoidkit waarschijnlijk vals

positief waren. Bij de positieve resultaten van de TSB-culturen kan dit niet gezegd worden.

De twee kits vertonen nog grotere tegenstellingen. Zo zijn bij de Oxoidkit de TSB-culturen

van stammen 1.2 en 2.1 duidelijk positief, waar dat de Duopathkit een negatief resultaat

geeft.

De resultaten voor het Nhe-toxine zijn iets eenduidiger behalve voor het laatste staal van de

ileumfase en de TSB-cultuur van stam 1.2. Hierbij geven de Tecra- en Duopath kit tegen-

strijdige resultaten.

Wanneer TSB-culturen vergeleken worden met de data waarbij de stammen opgekweekt wer-

den in BHI bij 30 en 36℃ (tabel 4.7), wordt duidelijk dat deze resultaten niet altijd overeen-


stemmen. De mogelijke oorzaken worden besproken in paragraaf 4.5.4.

Tabel 4.6: Overzicht van de drie detectiekits voor het haemolitisch (Hbl) en niet-haemolitisch (Nhe)

toxine*

Oxoid Duopath Tecra

Staal Hbl Hbl Nhe Nhe

Ileummedium +- - - -

1.1 0u + - - -

4u + - - -

2.1 0u + - - -

4u - - - -

1.2 0u +- - - -

4u - - - +

2.2 0u + - - -

4u + - - -

*Deze data zijn afkomstig van enkelvoudige metingen met onverdunde stalen

Tabel 4.7: Toxineproductie van B. cereus in BHI bij 30℃ en 36℃en in TSB bij 30℃

BHI-culturen* TSB-culturen**

Oxoid (Hbl) Tecra (Nhe) Oxoid (Hbl) Tecra (Nhe) Duopath, 30℃

Stam 36℃ 30℃ 30℃ 30℃ 30℃ Hbl Nhe

1.1 ++ / + +++ ++ ++ ++

2.1 - - + ++ ++ - ++

1.2 + / + ++ - - +

2.2 - + - + ++ +- ++

Steriel medium - - - - - - -

*Ongepubliceerd materiaal afkomstig van enkelvoudige metingen (Ceuppens, S.)

**Deze data zijn afkomstig van enkelvoudige metingen


4.5 Bespreking

4.5.1 Opkweek van B. cereus in voedselmedium

Wanneer de sporulatie in het voedselmedium bij 30℃ vergeleken wordt met die bij 22℃, dan

kan afgeleid worden dat B. cereus makkelijker sporuleert bij 30℃ dan bij 22℃. De betere

sporulatie kan echter niet alleen aan de temperatuur gelegen hebben, maar ook aan het

recipient waarin het voedselmedium zat. Bij 22℃ zat het voedselmedium in een plastic

recipient met draaideksel terwijl de incubatie bij 30℃ in een stomacherzak gebeurde. Deze

laatste is meer doorlaatbaar voor O2 dus het is mogelijk dat door het ontstaan van een

anaerobe atmosfeer in de potjes de groei/sporulatie afgeremd werd.

Bij de overleving van stationaire cellen van B. cereus (zie 4.4.2) blijven in de maagfase vanaf

120min 2,0 log kve/ml detecteerbaar, terwijl alle cellen van de exponentiele fase op dit tijdstip

afgestorven waren. Dit wijst sterk op een sporenpopulatie die ontstaan is bij de opkweek van

stationaire cellen van stam 1.1 (22℃, 24-25u). Dit versterkt de hypothese dat het ontbreken

van sporulatie bij 22℃ bij de groeicurveproef eerder aan het recipient te wijten was dan aan

de opkweektemperatuur.

4.5.2 Ontwikkeling van het simulatiemodel

Bij de ontwikkeling van het simulatiemodel was de ambitie om een exponentieel dalende maag-

verzuring te ontwikkelen om zo goed mogelijk de werkelijkheid te benaderen. Het volume dat

toegevoegd werd, kon niet te groot zijn omdat anders teveel verdunning van de componenten

zou optreden. Hierdoor was de toevoegingssnelheid zeer traag waardoor extra dunne pomp-

tubing moest gebruikt worden. Omdat de timing van de zuurtoevoeging niet tot op seconden

kon gecontroleerd worden, werd uiteindelijk geopteerd voor een lineaire pH-daling in de maag

met twee snelheden.

Het zuurprofiel varieerde in de realiteit (fig 3.3) met het theoretisch berekende profiel (fig

4.3). Dit kan zijn oorzaak vinden in het feit dat het theoretisch berekend profiel met steriel

voedselmedium opgesteld werd en dat voor de simulaties zelf elke stam in het voedselmedium

werd opgekweekt. Hierbij werden sowieso metabolieten gevormd die het medium konden

veranderen in zuurtegraad en buffercapaciteit. De stammen werden ook nooit exact even lang

geıncubeerd aangezien de incubatie stopgezet werd eens het gewenste aantal sporen bereikt

was. Omdat de hoeveelheid steriel voedselmedium die moest toegevoegd worden om dit aantal

te verkrijgen telkens verschilde, kwam er nog een extra variabele bij. Dit alles resulteerde in

een algemeen vlakkere pH-daling dan initieel ontworpen was maar aan de andere kant bleef

het een aanzienlijke verbetering in vergelijking met de constante pH van 2 die in het bestaande

SHIME systeem gebruikt werd om de maag te simuleren.


Het pH-profiel van de duodenum/jenunumfase en de ileumfase verliep wel telkens identiek en

zonder problemen met behulp van de pH-controller.

De dialyse werd voor de ileumfase geplaatst omdat daar de galzouten gereabsorbeerd werden

en de enzymen het grootste deel van hun werk gedaan hadden zodat deze uit het medium

gefilterd mochten worden. De mogelijkheid tot filtratie hangt niet alleen van de poriengrootte

af. Ook de lading van het deeltje en het membraan beınvloeden de twee grote fenomenen

voor de absorptie van opgeloste stoffen, nl. diffusie en convectie (Ronco et al., 1998). De

poriengrootte en de “cut-off” van de “high-flux” filters (Diacap Polysulfone, Braun) waren

resp. 3nm en 10-60kDa (persoonlijke communicatie, Vedefar NV, Vanoverwalle A., product

manager). De grootte van BSA, pepsine, lipase en amylase is resp. 69kDa, 41kDa (pepsine

A, varken), 50kDa (varken) en 59kDa (α-amylase, Bacillus spp.) (Uniprot Consortium, 2002-

2011). Pancreatine bestaat grotendeels uit amylase, lipase en protease en bevindt zich dus ook

rond 50-60kDa (Rengman et al., 2010). De grootst mogelijke “cut-off” ligt voor de grootte

van albumine wat impliceert dat dit eiwit niet verwijderd werd. De enzymen liggen tussen de

twee uitersten dus kunnen uit het medium gefilterd zijn tijdens de dialyse.

In het darmsapmedium zat een hoge concentratie galzouten die achteraf terug verlaagd werd

via dialyse. Er werd aangenomen dat na 75min dialyseren 95% van de galzouten gereabsor-

beerd zou zijn. Dit is gebaseerd op de reabsorptie van galzouten uit darmmedium zonder

andere kleurcomponenten (zie 4.3.2.2). Het was niet mogelijk de exacte galzoutconcentraties

in het darmmedium te volgen aan de hand van OD-metingen, aangezien er andere kleur-

componenten in het medium aanwezig waren die ook gedeeltelijk verwijderd werden via dia-

lyse. Een gele kleur werd afgegeven door het voedselmedium en de andere kleurcomponenten

waardoor de afname gedetecteerd via OD-metingen niet volledig te wijten zou zijn aan de

galzoutreabsorptie. Na verloop van tijd stabiliseerde de kleurafname dus er zou kunnen ge-

corrigeerd worden voor de fout (fig 4.8). Wanneer de afname in OD-waarde (0,6) via de

standaardcurve van “ileummedium zonder kleurcomponenten” (fig 4.6) omgezet wordt in gal-

zoutconcentraties, betekent dit een verschil van 1g/L. Maar de troebelheid, veroorzaakt door

het voedselmedium, zorgde ook voor een vertekend beeld bij de OD-metingen. Centrifugatie

van de stalen nam het probleem van de troebelheid weg maar de galzouten werden bij de

centrifugatie mee neergeslaan. Op deze manier kon de reabsorptie van galzouten uit het me-

dium niet aangetoond worden. Zoals in de literatuurstudie beschreven werd, zijn er andere

methoden om galzouten te detecteren maar deze zijn duur en vooral tijdsintensief om uit

te voeren dus waren deze moeilijk op punt te stellen in de tijdspanne beschikbaar voor dit

onderzoek.


In paragraaf 4.3.2.1 werden de volumeveranderingen tijdens de dialyse besproken. Het vo-

lume van het ileummedium steeg gemiddeld met 4,5% ±1,2% tijdens de dialyse. Dit volume

is enigszins aanvaarbaar aangezien de kwantificatie van de hoge aantallen B. cereus er niet in

grote mate door beınvloed wordt, maar de oorzaak van het probleem werd niet opgelost. De

twee vloeistofcircuits waren aangesloten op een dubbele pomp maar de dialysevloeistof had

een debiet dat tweemaal zo groot was als het ileummedium. De dialysevloeistof werd dus met

een druk die dubbel zo groot was door de dialysefilter gestuurd. Dit zou een drukverschil

kunnen veroorzaakt hebben over het membraan waardoor er vloeistof door de porien van de

filter geduwd werd. Een andere factor die een rol kan gespeeld hebben is osmose. Aangezien

er in het ileummedium tal van opgeloste stoffen zitten, kan de osmotische druk van het ile-

ummedium groter geweest zijn dan deze van het dialysemedium waardoor er water migreerde

door de filter naar het ileummedium. De osmotische druk berekenen van het ileummedium is

echter een zeer complexe zaak door de vele zouten, het voedselmedium en de andere compo-

nenten aanwezig (zie 3.2) maar deze kan ook gemeten worden. Door de osmotische druk van

beide vloeistoffen te meten, zou deze hypothese versterkt of verworpen kunnen worden. Dit

kan door middel van vriespuntosmometrie, dampdrukosmometrie. Deze methodes vereisen

slecht enkele microliters staal maar zijn indirecte methodes. Membraanosmometrie is een

directe methode maar kan moeilijk gebruikt worden bij zoutoplossingen door de “cut-off” van

150-200 Da (Grattoni et al., 2008).

4.5.3 Overleving van B. cereus in het simulatiemodel

De exponentiele en stationaire cellen van B. cereus overleefden de gastro-intestinale passage in

het simulatiemodel niet (4.4.1, 4.4.2). Gemiddeld waren 7,0 log kve/ml aanwezig in maagme-

dium dat overgepompt werd tussen 40-70min (60ml). Er zou dus theoretisch 6,3 log kve/ml

in het darmmedium moeten gedetecteerd zijn. Omdat het effectief gedetecteerde aantal veel

lager lag, kan gesteld worden dat de cellen verder dood gingen in het darmmedium.

In 4.4.3 werd duidelijk dat stationaire cellen kunnen overleven bij de finale concentratie Oxgall

in het ileummedium (5g/L). Maar de concentratie waarbij de B. cereus cellen van de eerste

fractie terecht kwamen bedroeg 10g/L. Dit werd echter pas na de uitvoering van de simulatie

experimenten opgemerkt. Dat dit de oorzaak is voor het afsterven van de cellen bij de start

van de duodenumfase is dus een mogelijkheid. Een oplossing hiervoor is het darmmedium

simultaan met het maagmedium in het darmvat toevoegen zodat het darmmedium telkens

tweemaal verdund wordt en de concentratie galzouten (Oxgall) continu 5g/L bedraagt.

Bij de simulaties met sporen viel op dat de sporenconcentratie bij stam 2.2 hoger lag dan

het totaal kiemgetal. Dit is waarschijnlijk gelegen aan de verhitting van 10min bij 80℃ voor


de sporenbepaling. Hierdoor kregen de sporen de nodige activatieprikkels waardoor deze uit-

groeiden tijdens incubatie. Uit Keynan et al. (1964) en Shaheen (2009) blijkt dat verscheidene

stammen van B. cereus eerst een activatie moeten ondergaan vooraleer ze kunnen ontkiemen.

Een hoge temperatuur gedurende korte tijd is de meest gekende vorm van sporenactivatie

maar ook bij lagere temperaturen gedurende langere tijd kan een activatie ontstaan, bv. 48u

bij 37℃. Dit fenomeen is reversibel dus de mogelijkheid bestaat dat door de sporen in de koe-

ling te bewaren, deze terug naar een inactieve staat overschakelden waardoor ze bij 37℃ meer

tijd nodig hadden om tot ontkieming te komen ondanks de aanwezigheid van nutrienten. Dit

wordt ondersteund door het feit dat na 14 dagen opkweek in het voedselmedium dit fenomeen

nog niet te zien was (tabel 4.5). De inactiviteit van de sporen is een van de hoofdoorzaken

voor het uitblijven van de ontkieming bij stam 2.2 tijdens de duodenum/jenunumfase.

Stam 1.1 ontkiemde ook niet in de duodenum/jenunumfase en had geen inactieve sporen.

Deze tragere ontkieming kan te wijten zijn aan de variatie die tussen verschillende stammen

van B. cereus bestaat (Abee et al., 2011). Ook eventuele gevoeligheid op stamniveau aan de

contaminatie (zie verder) of “shear stress” door de dialyse kunnen het niet ontkiemen in de

hand gewerkt hebben (Faille et al., 2007).

De concentraties B. cereus in de duodenum/jenunumfase werden niet statistisch vergeleken in

tijd aangezien gedurende 62,5% van deze fase sporen uit de maagfase werden toegevoegd en de

stijgende concentraties dus geen groei weergeven. Aangezien de dialyse de enige veranderde

factor was tussen 200min en 275min konden deze punten wel vergeleken worden.

Bij stam 2.1 en 1.2 werden telkens significante dalingen vastgesteld tijdens de dialyse. Uit

figuren 4.16 en 4.17 blijkt dat de daling van de sporenconcentratie en het totaal kiemgetal bij

stam 2.1 evenwijdig verliep, wat er op wijst dat er geen verdere ontkieming plaatsvond tijdens

de dialyse. Bij stam 1.2 daalde de curve van de sporenconcentratie sneller wat wel wijst op

verdere ontkieming tijdens de dialyse. Hierdoor kan er met enige voorzichtigheid besloten

worden dat stam 1.2 een grotere ontkieming ondergaan heeft dan stam 2.1 op het einde van

de duodenum/jenunumfase. Stam 1.2 is een mesofiele stam en stam 2.1 een psychrotrofe.

Dat deze laatste trager ontkiemde bij 37℃ is door deze eigenschap logisch te verklaren. Een

mesofiele stam zal nl. veel makkelijker uitgroeien bij deze temperatuur dan een psychrotrofe

(Wijnands et al., 2006).

De snelheid van ontkiemen kan dus wel bepaald worden door het psychrotroof/mesofiel karak-

ter maar deze correlatie treedt niet duidelijk naar voren tijdens de experimenten uitgevoerd in

het kader van deze thesis. met de oorsprong van de stammen. Verder kan ook geen duidelijke

link gelegd worden tussen de overleving, de activatie en de ontkieming van sporen en hun

oorspron (klinisch of voedselisolaat).


De daling tijdens de dialyse kan komen doordat B. cereus achterbleef in de filter. De vezels

van de filter bestonden uit polysulfon, een hydrofoob polymeer (technische data filter, Ronco

et al., 1998). B. cereus sporen zijn omgeven door een exosporium, een hydrofobe proteıne-

en glycoproteınestructuur (Setlow, 2006). Uit Faille et al. (2010) blijkt dat het hydrofoob

karakter van het exosporium, wat samenhangt met de grootte ervan, kan verschillen tussen

verschillende B. cereus stammen. Maar niet alleen deze factor speelt een rol in de aanhech-

ting aan hydrofobe oppervlakken, ook het aantal uitsteeksels van het exosporium zijn van

belang. Hoe meer van deze, hoe makkelijker en meer B. cereus cellen zich kunnen aanhechten

(Faille et al., 2010). Deze twee factoren kunnen ervoor gezorgd hebben dan B. cereus sporen

achterbleven in de filter doordat ze zich gehecht hadden aan de hydrofobe vezels waardoor

de sporenconcentratie daalde. In Faille et al. (2002) wordt een werkwijze beschreven om de

hydrofobiciteit van sporen te bepalen door middel van hun voorkeur voor apolaire solventen

via OD-metingen.

Enkel bij de psychrotrofe voedselisolaat werd dus geen duidelijke daling vastgesteld tijdens de

dialyse. In Faille et al. (2007) wordt beschreven hoe het exosporium kan beschadigd worden

door “shear stress”. Dit kan een verklaring zijn waarom stam 2.2 niet daalde tijdens de

dialyse. Wanneer het exosporium helemaal beschadigd werd, zullen de sporen veel minder

neiging gehad hebben zich aan een hydrofoob oppervlak te hechten (Faille et al., 2007). Een

andere hypothese is dat hun exosporium niet zo groot en dus minder hydrofoob was als die

van de anderen (Faille et al., 2010).

Ook op vlak van aanhechting kan geen onderscheid gemaakt worden op vlak van oorsprong

of psychrotroof/mesofiel karakter van de stam.

Via de q-PCRmethode werden 5,0-6,0 log kve/ml gedetecteerd bij aanvang van de ileumfase

(zie figuren 4.15, 4.16, 4.17, 4.18). Dit ligt telkens in de buurt van de waargenomen aantallen

bij de uitplatingen. Een mogelijke theorie is dat DNA afkomstig van de sporen geextraheerd

is tijdens de CTAB-extractie. Uit Ceuppens et al. (2010) blijkt echter dat DNA-extractie uit

sporen via het CTAB-protocol niet goed verloopt. De detectielimiet van sporen via qPCR

met CTAB-extractie ligt rond 5,0 log kve/ml en de kwantificatie met een standaardcurve

levert geen goede resultaten op. De Ct-waarde voor 5,0 log sporen/ml is 30. De Ct-waarden

bekomen bij de qPCR-analyses van de 4 stammen lagen echter tussen 20 en 27. Dit leidt tot

de hypothese dat de sporen ofwel beschadigd waren ofwel aan het ontkiemen waren bij de

start van de ileumfase waardoor meer DNA-materiaal uit de sporen geextraheerd kon worden.

Wanneer het exosporium beschadigd zou geweest zijn door de dialyse, zou dit waarschijnlijk

weinig invloed gehad hebben op de extractie aangezien dan de sporenmantel zeker nog intact

was. Dit blijkt uit het feit dat de sporen nog de hittebehandeling overleefden op het einde


van de duodenum/jenunumfase. Daardoor lijkt de hypothese van ontkiemende sporen sterker

te staan.

Een andere verklaring voor de hogere aantallen, is de detectie van dode cellen die in het

voedselmedium aanwezig waren door de opkweek en sporulatie van de stam in het voedsel-

medium. Dode cellen en hun DNA worden echter wel afgebroken na enkele uren (4.13, 4.14)

dus de invloed van de dode cellen door de opkweek in het voedselmedium zal nog maar een

minieme rol gespeeld hebben in de ileumfase. De mogelijke ontkieming van sporen gedurende

de ileumfase kon niet vastgesteld worden aangezien de hoeveelheid geextraheerd DNA gelijk

blijft tijdens de ontkieming. Momenteel bestaat er dus geen eenduidige methode om in aan-

wezigheid van sterke achtergrondflora een onderscheid te maken tussen sporen en cellen van

B. cereus. Het volgen van de overleving van stationaire cellen in het simulatiemodel (zie pa-

ragraaf 4.4.2) zou een deel van de detectiemoeilijkheden kunnen wegwerken maar dan zou er

nog gewerkt moeten worden aan enkele punten. Zo zou de zuurtoevoeging gestandaardiseerd

moeten worden zodat de afwijking tussen de verschillende simulaties geminimaliseerd wordt

en zou de maximale galzoutconcentratie waarbij de cellen kunnen overleven, bepaald moeten

worden.

Een duidelijke aanwijzing waarom de sporen niet ontkiemden/uitgroeiden tijdens de ileumfase

is er niet. De aantallen waren bij aanvang van de ileumfase niet van die aard dat de celdensiteit

te hoog lag voor de sporen om te ontkiemen en er waren genoeg nutrienten aanwezig (4.4.5,

4.4.6). Wanneer fig 4.14 vergeleken wordt met fig 4.17 kan gesteld worden dat de ontkieming

verder zat op 275min bij eerste simulatie (1,9% sporen t.o.v. 11% sporen). Tijdens de

ileumfase is er een licht stijgende trend bij de eerste simulatie en een licht dalende bij de latere

simulaties. Bij de eerste simulatie was er met de operationele “single-SHIME” een incident

waardoor de SHIME bacterien mogelijks uitverdund of minder sterk waren dan normaal. Dit

kan B. cereus een voordeel in de competitiestrijd gegeven hebben waardoor hij ook in de

ileumfase sterker ontkiemd en lichtjes uitgegroeid is. Uit Ceuppens et al. (2011b) blijkt dat

vegetatieve cellen van B. cereus de competiestrijd verliezen wanneer er 30-3000 keer meer

intestinale bacterien aanwezig zijn. Bij sporen bleef de DNA-concentratie gelijk wanneer er

30 keer meer intestinale microbiota aanwezig waren, wat wijst op geen duidelijke uitgroei.

Ontkieming kan hier plaatsgevonden hebben maar was niet duidelijk te zien door de qPCR

analyse. Bij elke simulatie werd 1ml met ongeveer 8,2-8,3 log kve/ml SHIME bacterien

toegevoegd. Dit betekent dat er ongeveer 5,5-5,6 log kve/ml SHIME bacterien bij de start

van het ileumfase aanwezig waren die verder uitgroeiden tot 8,2-8,3 log kve/ml (fig 4.10). Bij

aanvang van de fase was dus de verhouding met B. cereus 1:1. Deze competitie kan B. cereus

normaal aan (fig 4.14).


Er was echter op het einde van de duodenum/jenunumfase telkens sterke contaminatie gede-

tecteerd bij de uitplatingen. De hoeveelheid contaminerende bacterien zat op het einde van

de duodenum/jenunum in dezelfde grootteorde tot 1 grootteorde hoger als B. cereus: rond

5,0-7,0 log kve/ml. Indien de initiele hoeveelheid SHIME bacterien 5,6 log kve/ml was, werd

de competitie voor B. cereus te zwaar vanaf 7,0 log kve/ml contaminerende bacterien (1:32).

Dit kan dus de oorzaak zijn waarom B. cereus niet ontkiemd/uitgegroeid is.

Mogelijke oorzaken van deze contaminatie zijn het flushen (anaeroob maken van de headspace

in het darmvat) en het voedselmedium. Het flushen gebeurde met de darm waarmee de

SHIME-installatie geflusht werd waardoor er intestinale bacterien al bij aanvang van de si-

mulatie in het darmmedium konden terechtkomen. Het voedselmedium bevatte zeer hitte-

resistente sporen die de autoclavering overleefden en na verloop van tijd konden uitgroeien

ondanks de bewaring bij 2℃. Bij het merendeel van de simulaties werd de contaminatie pas na

2u duodenum/jenunumfase gedetecteerd maar een enkele keer ook al in het speekselmedium

of voedselmedium zelf. Dit staaft de hypothese dat de contaminatie van het voedselmedium

afkomstig was. Het aantal sporen lag dan meestal tot voor 2u duodenumfase onder de detec-

tielimiet en eens ze boven de detectielimiet kwamen, waren het vegetatieve cellen. Bij de start

van de ileumfase waren 5,0-7,0 log kve/ml aanwezig. Hun verdere groei tijdens de ileumfase

kan dus voor een te zware competitie gezorgd hebben.

Doordat alleen stam 2.2 een duidelijke afsterving vertoont kan besloten worden dat de psy-

chrotrofe voedselisolaat het gevoeligste is aan de omstandigheden in het ileum. De kans dat

het de sporen waren die afstierven is groot aangezien deze stam geen ontkieming vertoonde bij

aanvang van de ileumfase en omdat de omstandigheden in het ileum omwille van de compe-

titie en contaminatie niet gunstig waren om ontkieming te starten. De andere drie stammen

konden zich handhaven maar tot groei was B. cereus niet in staat, waarschijnlijk door de

te sterke competitie. Verder stak stam 1.1 boven de rest uit aangezien deze significant ho-

gere aantallen heeft dan de andere stammen maar een eenduidige oorzaak hiervoor kan niet

gegeven worden.

Algemeen is er geen duidelijk verband tussen mesofiel/psychrotroof karakter of oorsprong

en de overleving in de simulatie van het gastro-intestinaal stelsel. Dit wil dus zeggen dat

voorlopig er geen aanwijzingen zijn dat sporen van bepaalde stammen gevaarlijker zijn dan

andere in het gastro-intestinaal stelsel.

Door de sterke aanwijzingen dat de stammen niet ten volle ontkiemen en vooral niet uitgroeien

bij te sterke competitie in het gastro-intestinaal kanaal kan geopperd worden dat de ontkie-

ming van B. cereus sporen al voldoende ver gevorderd moet zijn voor het terminale ileum om

een gevaar te vormen op vlak van enterotoxineproductie. Dit zou echter nog gestaafd moeten


worden in simulaties zonder dat de extra contaminatie uit aanwezig is om een overtuigender

besluit te kunnen trekken.

4.5.4 Toxinevorming

Uit de resultaten van de toxinedetectie (zie 4.4.8) blijkt dat de toxinekits niet altijd eenduidige

resultaten geven. Bij de detectie van het Nhe-toxine werden voor een TSB-cultuur en een staal

tegenstrijdige resultaten bekomen tussen de Tecra- en Duopathkit. Bij de Tecrakit waren er

ook tegenstrijdige resultaten tussen TSB- en BHI-culturen.

Ook bij de detectie van het Hbl-toxine met de Oxoidkit werd dit vastgesteld. Er waren

tegengestelde resultaten bij eenzelfde stam en temperatuur maar een ander medium (stam

2.1, 30℃) en bij eenzelfde stam en medium maar andere temperatuur (stam 2.2, BHI).

Hieruit kan besloten worden dat het medium mogelijks een invloed heeft op de toxineproductie

maar dat ook de tijd en temperatuur een rol kunnen spelen. Het tegenstrijdig resultaat bij

de Oxoidkit (stam 2.2, BHI) valt te verklaren door het feit dat een psychrotrofe stam niet

zo goed groeit bij 36℃ als bij 30℃ waardoor de vereiste aantallen waarop B. cereus toxines

begint te produceren, niet bereikt zullen geweest zijn.

De detectielimiet van de Tecrakit ligt lager dan deze van de Duopathkit, resp. <1ng/ml

NheA en 6ng/ml NheB (Krause et al., 2010). Dit kan verklaren waarom er een positief

resultaat bekomen wordt bij de Tecrakit maar niet bij de Duopathkit. Maar aangezien het

zeer onwaarschijnlijk lijkt dat stam 1.2 toxine geproduceerd heeft na 4u ileumfase, blijft

het mogelijks vals positief resultaat onverklaarbaar. Het omgekeerde scenario, waarbij de

Duopathkit positief en de Tecrakit negatief is (TSB-cultuur stam 1.2), valt momenteel niet te

verklaren. De Tecrakit focust op de NheA-subeenheid van Nhe (41kDa) terwijl de Duopathkit

focust op de NheB-subeenheid. Dat de twee kits elk op een andere subeenheid testen van het

toxine, zou in principe geen invloed mogen hebben op de performantie van de kit aangezien

in geval van expressie van het toxine Nhe alle componenten samen aanwezig zijn (Ceuppens

et al., 2011a).

De kits voor de detectie van Hbl testen wel elk op dezelfde subeenheid, nl. Hbl-L2 en de

detectielimieten voor de Oxoid- en Duopathkit zijn resp. 2 en 20ng/ml (Krause et al., 2010).

Aan de hand van deze detectielimieten zou kunnen besloten worden dat het merendeel van

de Hbl-concentraties in de stalen tussen deze twee limieten lagen, ware het niet dat het

ileummedium zonder toxines ook een licht positief resultaat gaf bij de Oxoidkit. Hierdoor

moeten alle positieve resultaten met het ileummedium zeer kritisch bekeken worden en kan

het besluit getrokken worden dat het Hbl-toxine waarschijnlijk in geen enkel staal van de

simulaties aanwezig was.


De ileumstalen moesten bij de Oxoidkit minstens tweemaal verdund worden om een correct

resultaat weer te geven. Hierdoor wordt de detectielimiet 4ng/ml. Wanneer de Duopathkit

een duidelijk negatief resultaat geeft en de Oxoidkit een sterk positief is de kans groot dat

de hoeveelheid toxine tussen de twee detectielimieten (4 en 20ng/ml) ligt (TSB-cultuur stam

2.1).

De verklaring voor de negatieve resultaten van de verschillende stammen gedurende de simu-

latie zijn de lage aantallen. Voor toxineproductie moeten B. cereus 5,0-8,0 log kve/ml levende

vegetatieve cellen hebben (Arnesen et al., 2008). Bij de overleving van de 4 stammen in de

ileumfase is geen groei vastgesteld en mochten alle gedetecteerde kve/ml levende vegetatieve

cellen geweest zijn, dan lag de concentratie B. cereus nog tegen de ondergrens aan voor de

productie van toxines. Maar dat was zeker niet het geval omdat er op het einde van de duode-

numfase nog grote aantallen sporen aanwezig waren bij alle stammen. De echte concentratie

lag dus in werkelijkheid veel lager.

Het tot expressie komen van de virulentiegenen wordt beınvloed door een quorum sensing sys-

teem (de fosfolipase C regulator (PlcR)) dat naarmate het celaantal verhoogt, ervoor zorgt

dat de enterotoxinegenen, maar ook andere genen zoals deze voor metabolische enzymen,

proteınen voor chemotaxis en beweeglijkheid en allerlei extracellulaire proteınen voor be-

scherming, voedselvoorziening en het aanvoelen van de omgeving, tot expressie komen. Over

het moment in de groeifase waarop cellen maximaal toxines beginnen produceren, is er nog

geen consensus gevonden aangezien er tegenstrijdige onderzoeksresultaten bekomen werden:

in volle exponentiele groeifase of in de vroege stationaire groeifase. Verder zijn er nog tal

van andere factoren bekend die een rol spelen in toxineproductie. Zo hebben de groeisnel-

heid, pH en zuurstofbeschikbaarheid ook een invloed naast de beweeglijkheid en de nutrienten

(Ceuppens et al., 2011a).

Hoofdstuk 5

Besluiten

In deze scriptie werd een simulatiemodel ontwikkeld van het bovenste gastro-intestinaal kanaal

om de overleving en toxineproductie van B. cereus te kunnen opvolgen.

Bij de ontwikkeling van het simulatiemodel werd met succes een benadering voor de maag-

lediging tot stand gebracht. De initieel ontwikkelde maagverzuring beantwoordde aan de

vereisten maar tijdens de verschillende simulaties bleek dat er variabele factoren waren in het

voedselmedium waardoor de maagverzuring niet telkens gelijk verliep. Om in de toekomst het

zuurprofiel van de maag exponentieel te laten verlopen, lijkt de enige optie een computerge-

stuurde pH-daling waardoor alle variabele factoren van het voedselmedium en de praktische

ongemakken zouden kunnen weggewerkt worden.

De dialyse om de hoge concentratie galzouten te reabsorberen was enerzijds geslaagd omdat

de galzouten (Oxgall) in 75 minuten voor minstens 90% reabsorbeerd werden. Anderzijds

kon de verwijdering van de galzouten niet bevestigd worden in aanwezigheid van het troebele

voedselmedium. In de toekomst zou er een HPLC-protocol gemaakt kunnen worden ter

bevestiging en kwantificatie van de individuele galzouten. Verder zou inzicht in de echte

oorzaak van de volumeverandering verdere problemen weten te voorkomen.

Vegetatieve cellen van B. cereus konden niet overleven in het simulatiemodel. Alle expo-

nentiele cellen stierven af in de maagfase. Een deel van de stationaire cellen bereikte de

duodenumfase maar was niet bestand tegen het darmmedium en stierf daar verder af.

B. cereus sporen overleefden de simulatie van het gastro-intestinaal kanaal en zonder toe-

voeging van SHIME bacterien ontkiemden en groeiden ze uit in de ileumfase. Dit toont aan

dat het algemene ontwerp van het model niet dodelijk of inhiberend werkt op sporen van B.

cereus. Tijdens de 12 sporensimulaties werd er echter geen uitgroei bekomen in de ileum-

fase. Waarschijnlijk was er een te grote competitie van SHIME bacterien en contaminerende

bacterien, afkomstig uit de pureevlokken.

59

5. BESLUITEN 60

Tijdens de dialyse bleven de sporen waarschijnlijk achter op de hydrofobe vezels van de filter

doordat de B. cereus endosporen omgeven zijn door een hydrofoob exosporium. Hierdoor

ontstond er een daling van de sporenconcentraties tijdens de dialyse. Tussen de stammen on-

derling waren er kleine verschillen in daling maar er was geen duidelijk verband met oorsprong

of psychrotroof/mesofiel karakter. Ook het starten van de ontkieming en de inactiviteit van

sporen was eveneens niet duidelijk afhankelijk van een van deze factoren.

Door de sterke aanwijzingen dat de stammen niet ten volle ontkiemen en vooral niet uitgroeien

bij te sterke competitie in het gastro-intestinaal kanaal kan dus geopperd worden dat de ontkie-

ming van B. cereus sporen al voldoende ver gevorderd moet zijn voor het terminale ileum om

een gevaar te vormen op vlak van enterotoxineproductie.

De stalen afkomstig van de simulatie experimenten testten negatief voor de aanwezigheid

van de enterotoxines Nhe en Hbl, omdat geen van de verschillende B. cereus stammen in

voldoende mate was uitgegroeid voor toxineproductie.

De verschillende kits voor eenzelfde toxine blijken soms tegenstrijdige resultaten geven. Dit

kan veroorzaakt worden door de verschillende detectielimieten van deze kits, maar ook door

eventueel vals positieve of negatieve resultaten. Zo moeten bv. de stalen bij de Oxoidkit

minstens een tweevoudige verdunning ondergaan om de vals positieven door het ileumme-

dium te vermijden. De verschillende resultaten die eenzelfde kit geeft voor eenzelfde stam

bij dezelfde temperatuur in een ander opkweekmedium wijst op het feit dat er nutritionele

factoren bestaan die een invloed hebben op de productie van toxines, waar nog bijkomend

onderzoek naar moet verricht worden.

Hoofdstuk 6

Lijst met afkortingen

BARGE “BioAccessibility Research Group of Europe”BHI “Brain Heart Infusion”BSA “Bovine Serum Albumin”CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromideDNA “Deoxyribonucleic acid”EA Enterococcus AgarGC GaschromatografieGLISA “Gold labelled immunosorbent assay”HPLC “High performance liquid chromatography”LFMFP “Laboratory of food microbiology and food preservation”Mc MacConkey AgarMS MassaspectrometrieMSA ‘Mannitol Salt Agar”NVH “Norwegian School of Veterinary Science”OD Optische densiteitpps “peptone physiological salt solution”qPCR “quantitative Polymerase Chain Reaction”REPFED Refrigerated processed foods of extended durabilityRIVM Nederlandse Rijksinstituut voor Volksgezondheid en MilieuRPLA “Reversed passive latex agglutination”SHIME “Simulation of the human intestinal microbial ecosystem”SPE “Reversed-phase solid-phase extraction”TIM “TNO Intestinal Model”TLC “Thin layer chromatography”TNO Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk OnderzoekTSA “Tryptic Soy Agar”TSB “Tryptic Soy Broth”TSC ‘Tryptose Sulfite Cycloserine”UV UltravioletVIA “Visual immunoassay”

61

Literatuurlijst

T. Abee, M. N. Groot, M. Tempelaars, M. Zwietering, R. Moezelaar & M. van der Voort

(2011). Germination and outgrowth of spores of B. cereus group members: diversity and

role of germinant receptors. Food Microbiology, 28(2):199–208.

A. Andersson, P. E. Granum & U. Ronner (1998). The adhesion of Bacillus cereus spores to

epithelial cells might be an additional virulence mechanism. International Journal of Food

Microbiology, 39(1-2):93–99.

L. P. S. Arnesen, A. Fagerlund & P. E. Granum (2008). From soil to gut: Bacillus cereus and

its food poisoning toxins. Fems Microbiology Reviews, 32(4):579–606.

D. J. Beecher, J. L. Schoeni & A. C. L. Wong (1995). Enterotoxic activity of hemolysin bl

from Bacillus cereus. Infection and Immunity, 63(11):4423–4428.

D. J. Beecher & A. C. L. Wong (1994). Identification of hemolysin bl-producing Bacillus cereus

isolates by a discontinuous hemolytic pattern in blood agar. Applied and Environmental

Microbiology, 60(5):1646–1651.

D. J. Beecher & A. C. L. Wong (1997). Tripartite hemolysin bl from Bacillus cereus- hemo-

lytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone

phenomenon. Journal of Biological Chemistry, 272(1):233–239.

S. Ceuppens, N. Boon, A. Rajkovic, M. Heyndrickx, T. Van de Wiele & M. Uyttendaele

(2010). Quantification methods for Bacillus cereus vegetative cells and spores in the

gastrointestinal environment. Journal of Microbiological Methods, 83(2):202–210.

S. Ceuppens, A. Rajkovic, M. Heyndrickx, V. Tsilia, T. Van De Wiele, N. Boon & M. Uyt-

tendaele (2011a). Regulation of toxin production by Bacillus cereus and its food safety

implications. Critical Reviews in Microbiology, Early Online:1–26.

S. Ceuppens, T. Van De Wiele, A. Rajkovic, T. Cabaceran, M. Heyndrickx, N. Boon &

62

LITERATUURLIJST 63

M. Uyttendaele (2011b). Survival of Bacillus cereus vegetative cells and spores in the

gastrointestinal environment. (submitted).

W. K. Clarkston, M. M. Pantano, J. E. Morley, M. Horowitz, J. M. Littlefield & F. R.

Burton (1997). Evidence for the anorexia of aging: gastrointestinal transit and hunger in

healthy elderly vs young adults. American Journal of Physiology-regulatory Integrative and

Comparative Physiology, 272(1):R243–R248.

T. Clavel, F. Carlin, D. Lairon, C. Nguyen-The & P. Schmitt (2004). Survival of Bacillus

cereus spores and vegetative cells in acid media simulating human stomach. Journal of

Applied Microbiology, 97(1):214–219.

P. De Boever, B. Deplancke & W. Verstraete (2000). Fermentation by gut microbiota cultured

in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem is improved by supplementing

a soygerm powder. Journal of Nutrition, 130(10):2599–2606.

Y. P. de Vries (2006). Bacillus cereus spore formation, structure and germination. Ph.D.

thesis, Wageningen University, The Netherlands.

J. B. Dressman, G. L. Amidon, C. Reppas & V. P. Shah (1998). Dissolution testing as a

prognostic tool for oral drug absorption: immediate release dosage forms. Pharmaceutical

Research, 15(1):11–22.

EFSA (2009). Food-borne outbreaks in the European Union in 2007. Report.

EFSA (2010). The community summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic

agents and food-borne outbreaks in the European Union in 2008. EFSA Journal, 8(1):1496–

1866.

A. Fagerlund, T. Lindback, A. K. Storset, P. E. Granum & S. P. Hardy (2008). B. cereus nhe

is a pore-forming toxin with structural and functional properties similar to the clya (hiye,

shea) family of haemolysins, able to induce osmotic lysis in epithelia. Microbiology-sgm,

154:693–704.

C. Faille, C. Jullien, F. Fontaine, M. N. Bellon-Fontaine, C. Slomianny & T. Benezech (2002).

Adhesion of Bacillus spores and Escherichia coli cells to inert surfaces: role of surface

hydrophobicity. Canadian Journal of Microbiology, 48(8):728–738.

C. Faille, Y. Lequette, A. Ronse, C. Slomianny, E. Garenaux & Y. Guerardel (2010). Morp-

hology and physico-chemical properties of Bacillus spores surrounded or not with an exo-

sporium: consequences on their ability to adhere to stainless steel. International Journal

of Food Microbiology, 143(3):125–135.

LITERATUURLIJST 64

C. Faille, G. Tauveron, C. L. Gentil-Lelievre & C. Slomianny (2007). Occurrence of B. cereus

spores with a damaged exosporium: consequences on the spore adhesion on surfaces of food

processing lines. Journal of Food Protection, 70(10):2346–2353.

E. Ghelardi, F. Celandroni, S. Salvetti, M. Ceragioli, D. J. Beecher, S. Senesi & A. C. L.

Wong (2007). Swarming behavior of and hemolysin bl secretion by Bacillus cereus. Applied

And Environmental Microbiology, 73(12):4089–4093.

A. Grattoni, G. Canavese, F. M. Montevecchi & M. Ferrari (2008). Fast membrane osmome-

ter as alternative to freezing point and vapor pressure osmometry. Analytical Chemistry,

80(7):2617–2622.

W. Hagens, A. J. A. M. Sips, L. J. P. A. & A. G. Oomen (2007). Richtlijn: bepalen van de

orale biobeschikbaarheid van lood in de bodem (rivm 711701060).

M. J. Hill (1995). Role of gut bacteria in human toxicology and pharmacology. Taylor&Francis

Ltd. London, United Kingdom. 1st edition.

A. Keynan, H. O. Halvorson, Z. Evenchik & J. W. Hastings (1964). Activation of bacterial

endospores. Journal of Bacteriology, 88(2):313–318.

L. Knutson & G. Flemstrom (1989). Duodenal mucosal bicarbonate secretion in man -

stimulation by acid and inhibition by the alpha-2-adrenoceptor agonist clonidine. Gut,

30(12):1708–1715.

N. Krause, M. Moravek, R. Dietrich, E. Wehrle, J. Slaghuis & E. Martlbauer (2010). Perfor-

mance characteristics of the Duopath ® B. cereus enterotoxins assay for rapid detection

of enterotoxinogenic Bacillus cereus strains. International Journal of Food Microbiology,

144(2):322–326.

D. B. N. Lee & M. Roberts (2008). A peritoneal-based automated wearable artificial kidney.

Clinical and Experimental Nephrology, 12(3):171–180.

T. Lund, M. L. De Buyser & P. E. Granum (2000). A new cytotoxin from Bacillus cereus

that may cause necrotic enteritis. Molecular Microbiology, 38(2):254–261.

A. M. D. Machado, C. Figueiredo, R. Seruca & L. J. Rasmussen (2010). Helicobacter pylori in-

fection generates genetic instability in gastric cells. Biochimica Et Biophysica Acta-reviews

On Cancer, 1806(1):58–65.

M. Minekus, P. Marteau, R. Havenaar & J. H. J. Huisintveld (1995). A multicompartmental

dynamic computer-controlled model simulating the stomach and small-intestine. Atla-

Alternatives To Laboratory Animals, 23(2):197–209.

LITERATUURLIJST 65

K. Molly, M. Vande Woestyne & V. W. (1993). Development of a 5-step multi-chamber

reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology

And Biotechnology, 39:254–258.

T. C. Northfield & I. McColl (1973). Postprandial concentrations of free and conjugated

bile-acids down length of normal human small-intestine. Gut, 14(7):513–518.

A. G. Oomen, A. Hack, M. Minekus, E. Zeijdner, C. Cornelis, G. Schoeters, W. Verstraete,

T. Van de Wiele, J. Wragg, C. J. M. Rompelberg, A. J. A. M. Sips & J. H. Van Wijnen

(2002). Comparison of five in-vitro digestion models to study the bioaccessibility of soil

contaminants. Environmental Science & Technology, 36:3326–3334.

A. G. Oomen, C. J. M. Rompelberg, M. A. Bruil, C. J. G. Dobbe, D. P. K. H. Pereboom

& A. J. A. M. Sips (2003a). Development of an in-vitro digestion model for estimating

the bioaccessibility of soil contaminants. Archives of Environmental Contamination and

Toxicology, 44(3):281–287.

A. G. Oomen, K. van Twillert, H. M. F. A., C. Rompelberg & C. H. M. Versantvoort (2003b).

Development and suitability of in vitro digestion models is assessing bioaccessibility of lead

from toy matrices (rivm 320102001).

D. J. Parks, S. G. Blanchard, R. K. Bledsoe, G. Chandra, T. G. Consler, S. A. Kliewer, J. B.

Stimmel, T. M. Willson, A. M. Zavacki, D. D. Moore & J. M. Lehmann (1999). Bile acids:

natural ligands for an orphan nuclear receptor. Science, 284(5418):1365–1368.

S. P. Pereira, N. Gainsborough & D. R. H. (1998). Drug-induced hypochlorhydria causes

high duodenal bacterial counts in the elderly. Alimentary Pharmacology & Therapeutics,

12(1):99–104.

A. Pielaat, L. M. Wijnands, K. Takumi, M. J. Nauta & F. M. Van Leusden (2006). The fate

of Bacillus cereus in the gastro-intestinal tract (RIVM report 250912005, 2006).

S. Possemiers, K. Verthe, S. Uyttendaele & W. Verstraete (2004). PCR-DGGE-based quan-

tification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal

microbial ecosystem. Fems Microbiology Ecology, 49(3):495–507.

E. Rambod, M. Beizai & M. Rosenfeld (2010). An experimental and numerical study of the

flow and mass transfer in a model of the wearable artificial kidney dialyzer. Biomedical

Engineering OnLine, pp. 9–21.

LITERATUURLIJST 66

S. Rengman, O. Fedkiv, J. Botermans, J. Svendsen, B. Westrom & S. Pierzynowski (2010).

The growth of exocrine pancreatic insufficient young pigs fed an elemental diet is dependent

on enteral pancreatin supplementation. Livestock Science, 134(1-3):50–52.

A. Roda, F. Piazza & M. Baraldini (1998). Separation techniques for bile salts analysis.

Journal of Chromatography B-analytical Technologies In the Biomedical and Life Sciences,

717(1-2):263–278.

C. Ronco, P. M. Ghezzi, A. Brendolan, C. Crepaldi & G. La Greca (1998). The haemodialysis

system: basic mechanisms of water and solute transport in extracorporeal renal replacement

therapies. Nephrology Dialysis Transplantation, 13:3–9.

T. L. Russell, R. R. Berardi, J. L. Barnett, L. C. Dermentzoglou, K. M. Jarvenpaa, S. P.

Schmaltz & J. B. Dressman (1993). Upper gastrointestinal ph in seventy-nine healthy,

elderly, north american men and women. Pharmaceutical research, 10(2):187–196.

P. Setlow (2003). Spore germination. Current Opinion In Microbiology, 6(6):550–556.

P. Setlow (2006). Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat

and chemicals. Journal of Applied Microbiology, 101:514–525.

R. Shaheen (2009). Bacillus cereus spores and cereulide in food-borne illness. Ph.D. thesis,

Department of Applied Chemistry and Microbiology, Faculty of Agriculture and Forestry,

University of Helsinki.

S. Silbernagl & A. Despopoulos (2007). Atlas van de fysiologie. ThiemeMeulenhoff. Baarn,

The Netherlands. 15th edition.

K. Takumi, R. de Jonge & A. Havelaar (2000). Modelling inactivation of Escherichia coli by

low pH: application to passage through the stomach of young and elderly people. Journal

of Applied Microbiology, 89(6):935–943.

Uniprot Consortium (2002-2011). Protein knowledgebase, swiss-prot. 2011-05-20.

http://www.uniprot.org/help/uniprotkb.

T. Van de Wiele, N. Boon, S. Possemiers, H. Jacobs & W. Verstraete (2004). Prebiotic

effects of chicory inulin in the simulator of the human intestinal microbial ecosystem. Fems

Microbiology Ecology, 51(1):143–153.

C. H. M. Versantvoort, E. van de Kamp & C. J. Rompelberg (2004). Development and

applicability of an in-vitro digestion model in assessing the bioaccessibility of contaminants

from food (RIVM report 320102002, 2004).

LITERATUURLIJST 67

W. Verstraete, N. Boon & T. Van De Wiele (2009-2010). Microbe-host interphase processes.

Course notes. Ghent University.

L. M. Wijnands, J. B. Dufrenne, M. H. Zwietering & F. M. van Leusden (2006). Spores from

mesophilic Bacillus cereus strains germinate better and grow faster in simulated gastro-

intestinal conditions than spores from psychrotrophic strains. International Journal of Food

Microbiology, 112(2):120–128.

M. Wilson (2008). Bacteriology of humans: an ecological perspective. Blackwell Publishing.

University College London, United Kingdom. 1st edition.

overleving en toxineproductie van bacillus cereus in het...

Documents