określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych przykłady
DESCRIPTION
Enzymologia-6. Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady. Enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii. Lizozym. Schemat struktury peptydoglikanu. Reakcja katalizowana przez enzym. Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węgla - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych
Przykłady
Enzymologia-6
Lizozym
Reakcja katalizowana przez enzym
Schemat struktury peptydoglikanu
Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węglaC-1 reszt kwasu N-acetylomuraminowego i atomęm C-4 N-acetyloglukozaminy
Enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii
Model przestrzenny cząsteczki lizozymu
Wiązania wodorowe pomiędzy (NAG)3 i lizozymem
Sposób wiązania (NAG)6 z lizozymemKolor żółty - (NAG)6 ; kolor niebieski – reszty aminokwasowe enzymu; Kolor czerwony – reszty aminokwasowe enzymu biorące bezpośredni udział w katalizie
Struktura części centrum aktywnegolizozymu.
Kolorem żółtym oznaczono atomypierścieni D i E substratu (NAG)6
Porównanie szybkości hydrolizy oligomerów NAG
NAG2 0 NAG5 4 000NAG3 1 NAG6 30 000NAG4 8 NAG8 30 000
Produkty hydrolizy: NAG6 NAG4 + NAG2
Badanie specyficzności substratowej lizozymu
Analog substratu, laktonowa pochodna (NAG)4, wiąże się z enzymem 3 600 razy silniej niż (NAG)4.
Wniosek: związek jest analogiem stanu przejściowego
Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM.
Ligand zajmuje miejsce B-C-D, a nie A-B-C, bo NAM jest zbyt duży aby zająć miejsce C. NAM w miejscu D przyjmuje konformację półkrzesłową
A B C D E FB C D
A B C D E FA B C
Określenie miejsca hydrolizy substratu
Które wiązanie ulega hydrolizie?
Informacje wyjściowe:
- w peptydoglikanie hydrolizowane jest wiązanie NAM-NAG- (NAG)3 nie ulega hydrolizie;- NAM nie może zajmować miejsca C (zawada przestrzenna)
A B C D E F
?
NAMNAG NAG NAGNAM NAM
Ustalenie roli reszt katalitycznych
Profil zależności szybkości reakcji od pH
Klasyczna krzywa dzwonowa. Maksimum około pH = 5.0Spadek aktywności po stronie alkalicznej – wynik jonizacji Glu-35Spadek aktywności po stronie kwasowej – wynik protonowania Asp52
Modyfikacja chemiczna
Estryfikacja Asp52 – całkowita utrata aktywności;związanie substratu chroni enzym przed inaktywacją
Mechanizm reakcji katalizowanej przez lizozym
Etap I – protonowanie atomu tlenu wiązania glikozydowego przez Glu 35
Etap II – przyłączenie anionu OH- z wody do jonu karboniowego i H+ do grupy COO- reszty Glu 35
Chymotrypsyna
Enzym proteolityczny, wytwarzany przez trzustkęw formie proenzymu (chymotrypsynogen).
X Y Z
Y = Phe, Trp lub Tyr
Specyficzność substratowaustalona na podstawiepeptydów modelowych
Chymotrypsyna należy do grupyproteaz serynowych
Reszta seryny 195 jest szczególnie reaktywna.Selektywna modyfikacja przez DIPF oraz PMSF
C CH2Cl
O
C
H
NH
S OO
CH3
CH2
TPCK – specyficzny inaktywatorchymotrypsyny
Modyfikacja chemiczna
TPCK alkiluje resztę His 57
Ukierunkowana mutageneza
Mutant Asp102Asnwykazuje kkat 5000 razy niższeniż enzym typu dzikiego
Ser195, His57 i Asp102 tworzątriadę katalityczną
Struktura przestrzenna chymotrypsyny
Wiązanie substratu
Hydrofobowa kieszeń chymotrypsyny;miejsce rozpoznania i wiązania substratu
Porównanie miejsc wiązania substratuw niektórych proteazach serynowych
Określenie mechanizmu katalizy
Detekcja intermediatów - acyloenzym
E CH2 OH + O2N O CO
CH3
Faza I
CH2 O CO
CH3E O2N OH+
H2O
CH3COOHFaza II
Acyloenzym powstający w wyniku działania octanu p-nitrofenylu na chymotrypsynęmożna wyizolować, jeżeli reakcję prowadzi się w niskim pH
Określenie mechanizmu katalizy
Detekcja intermediatów – tetraedryczny stan przejściowy
1. Niskotemperaturowy 13C NMR
2. Inhibitory – analogi stanu przejściowego
O
O
N
H
PHO O
N
H
O
H
H
Przejściowy produkt reakcji można wykryćpoprzez identyfikację sygnału pochodzącego od znakowanego atomu węgla
O
LeuN
PheN
O
H
N
N
HN
HH
H
H
+ E OHH
LeuN
H
OH
EO
Mechanizm reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę
Stabilizacja stanu przejściowego w centrum aktywnym
Analogi stanu przejściowego w medycynie
Enzym Tetraedryczny związek pośredni
Stan przejściowy
Stan przejściowy
Analog stanu przejściowego
Lepszy analog stanu przejściowego ale
chemicznie niestabilny
Penicylina – analog stanu przejściowego D-alanylo-D-alaniny