Молекулярная биология - mipt · this 1.9-mb amplification containing myc is...
TRANSCRIPT
![Page 1: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/1.jpg)
Марахонов Андрей Владимирович
Молекулярная биология
Лекция 13. Молекулярно-биологические методы.
![Page 2: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/2.jpg)
Место молекулярной биологии
RNA
![Page 3: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/3.jpg)
Central dogma of molecular biology
![Page 4: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/4.jpg)
Этапы любого анализа
• Выделение того или иного компонента (ДНК/РНК/белки/…)
• Разделение компонентов
• Визуализация
![Page 5: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/5.jpg)
Методы основаны на:
Собственных свойствах
• Различные физико-химические свойства разных компонентов клетки (заряд, размер, масса, состав, растворимость в различных соединениях)
• Эти свойства используются для выделения, разделения и анализа компонентов
(Электрофорез, комплементарность НК)
Неферментативные реакции
Специфичных реакциях
• Специальные ферменты узнают и изменяют только конкретные последовательности
(Пример: Рестриктазы разрезают только ДНК только в определенном месте.)
Ферментативные реакции
![Page 6: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/6.jpg)
Гель-электрофорез
• метод анализа или разделения веществ под действием электрического поля, когда в качестве носителя используется гель.
![Page 7: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/7.jpg)
Гель-электрофорез
![Page 8: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/8.jpg)
Гель-электрофорез
• В агарозном или полиакриламидном геле
• Капиллярный или обычный
• В денатурирующих или нативных условиях
• В градиентном или обычном геле
• В постоянном поле или пульс-электрофорез
• Одно- и двухмерный (в случае белков)
![Page 9: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/9.jpg)
Изоэлектрофокусирование белков
• Разделение белков происходит в зависимости от их заряда в градиенте pH создаваемом с помощью синтетических смесей (амфолитов) под действием электрического поля.
![Page 10: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/10.jpg)
Изучение ДНК
• Гибридизация — соединение комплементарных одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот в одну двухцепочечную молекулу
![Page 11: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/11.jpg)
Гибридизация НК Southern blot: фрагментированную ДНК переносят на подходящий носитель и затем с помощью зонда с известной нуклеотидной последовательностью определяют содержание целевой последовательности в образце
Sir Edwin Mellor Southern
![Page 12: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/12.jpg)
Source: Neuromuscular Disorders 2012; 22:463-470 (DOI:10.1016/j.nmd.2011.09.004 )
Copyright © 2012 Elsevier B.V. Terms and Conditions
Клинический случай — FSHD (Facioscapulohumeral dystrophy)
![Page 13: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/13.jpg)
Гибридизация НК
• Southern blot — гибридизация ДНК
• Northern blot — гибридизация РНК
• Western blot — определение белков с помощью антител
• Far-western blot — определение белок-белковых
взаимодействий с помощью взаимодействующих белков
• Eastern blot — детекция посттрансляционных модификаций белков
• Far-Eastern blot — определение липидов
![Page 14: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/14.jpg)
Гибридизация НК: ДНК-микрочип
• Современный ДНК-микрочип состоит из зондов, или проб, закреплённых на твёрдой подложке. Каждая проба имеет определённую нуклеотидной последовательностью. Гибридизация зонда и мишени регистрируется и при помощи флюоресценции, что позволяет определять относительное количество НК с заданной последовательностью в образце.
![Page 15: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/15.jpg)
Гибридизация НК
Tilling DNA-Microarray — пробы (зонды) комплементарны участкам, расположенным вдоль всех хромосом
Amplification of chromosome 8q24. 12−13 in colorectal cancer cell line COLO320. This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are scale bars indicating log2 ratios of +0.5 and -0.5, respectively.
![Page 16: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/16.jpg)
Гибридизация НК: кариотипирование
![Page 17: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/17.jpg)
Гибридизация НК: Northern blot
• Определение альтернативных вариантов транскриптов
• Полуколичественное измерение экспрессии
• Определение размера/ориентации транскрипта
Northern blot analysis of brain and spleen β-adducin (membrane skeleton protein).
![Page 18: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/18.jpg)
Гибридизация НК: expression microarray
![Page 19: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/19.jpg)
Гибридизация НК: expression microarray
• Определение относительного уровня экспрессии всех белок-кодирующих генов человека
• Дифференциация различных состояний
• Поиск биомаркеров
Hierarchical clustering of data from the microarray analysis of gene expression in minor salivary glands from patients with primary Sjögren's syndrome (SS) and from healthy control subjects (Ctrl 1-10).
Синдром Шегрена
![Page 20: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/20.jpg)
Гибридизация НК: FISH (fluorescent in situ hybridization)
Drosophila embryo
Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink) in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green)
Subcellular localization
Human tissue and cell
![Page 21: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/21.jpg)
Protein analysis
Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) — это особый класс гликопротеинов, присутствующих на поверхности B-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и в сыворотке крови и тканевой жидкости в виде растворимых молекул, и обладающих способностью очень избирательно связываться с конкретными видами молекул, которые в связи с этим называют антигенами.
![Page 22: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/22.jpg)
Western blot analysis
![Page 23: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/23.jpg)
Protein analysis: immunofluorescence (IF)
Tissue distribution and organization
(mouse intestine)
Subcellular localization
(hepatocytes)
![Page 24: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/24.jpg)
Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)
![Page 25: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/25.jpg)
Co-immumoprecipitation (co-IP)
![Page 26: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/26.jpg)
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
![Page 27: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/27.jpg)
Enzymes for molecular biology analysis
• Синтезирующие (полимеразы, обратные транскриптазы, …)
• Модифицирующие (лигазы, рестриктазы, нуклеазы, никазы, …)
Преимущества: высокая активность и специфичность, что позволяет достигать высокой скорости реакции и большого выхода
![Page 28: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/28.jpg)
Почему ферментативные методы?
• Малое количество исходного материала для анализа, необходимость увеличить его кол-во (->> синтезирующие ферменты)
• Специфичность действия используется для анализа только интересующих последовательностей (модифицирующие ферменты узнают только определенные последовательности)
![Page 29: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/29.jpg)
PCR — полимеразная цепная реакция
1983
![Page 30: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/30.jpg)
PCR — полимеразная цепная реакция
![Page 31: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/31.jpg)
PCR — полимеразная цепная реакция
2
4
16
𝑃𝑛 = 𝑃0𝑛−1
![Page 32: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/32.jpg)
Real-Time PCR — ПЦР в «реальном времени»
![Page 33: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/33.jpg)
Real-Time PCR — ПЦР в «реальном времени»
• Определение абсолютного количества молекул ДНК в исходном образце
• Определение относительного уровня экспрессии генов в образце
![Page 34: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/34.jpg)
Виды ПЦР • ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse
Transcription PCR, RT-PCR) • Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR)
или ПЦР в реальном времени • Метилспецифическая, метилчувствительная
ПЦР • ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) • Вложенная ПЦР (Nested PCR) • Ступенчатая ПЦР (Touchdown, stepdown PCR) • RAPD (Random Amplification of Polymorphic
DNA) — fingerprinting • Инвертированная ПЦР (Inverse PCR),
асимметричная ПЦР (asymmetric PCR)
![Page 35: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/35.jpg)
PCR для медицины
• Инфекционные агенты, мутантные гены, перестройки, …
• Отцовство
• Судебная медицина (идентификация личности)
DNA fingerprint
![Page 36: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/36.jpg)
PCR для науки • Кроме всего
предыдущего…
• Молекулярное клонирование
![Page 37: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/37.jpg)
Использование молекулярного клонирования
![Page 38: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/38.jpg)
Использование молекулярного клонирования
• А также:
• Биотехнология и биоинженерия (получение трансгенных организмов, рекомбинантных лекарственных препаратов, вакцин)
![Page 39: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/39.jpg)
Использование молекулярного клонирования
• А также:
• Функциональный анализ генов
Гиперэкспрессия Knock-out, knock-in
Knock-down
![Page 40: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/40.jpg)
Использование ПЦР: секвенирование
![Page 41: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/41.jpg)
Использование ПЦР: секвенирование
![Page 42: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/42.jpg)
Колоссальный научно-технический прогресс!
Как оно было Как оно стало
Продолжительность >3650 дней 3 дня
Стоимость 3 000 000 000 $ 2 000 $
Участники Сотни
лабораторий 1 человек
Качество 1 прочтение 100 прочтений
![Page 43: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/43.jpg)
Современные секвенаторы
HiSeq 2500
![Page 44: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/44.jpg)
Применение метода массивного параллельного секвенирования
В геномике
• Секвенирование de novo • Ресеквенирование • Секвенирование экзома • Таргетное
секвенирование • Метагеномное
В транскриптомике
• Исследование профиля экспрессии (RNA-seq)
• Исследование профиля трансляции (TRAP-seq)
• Исследование RBP (CLIP-Seq)
• Секвенирование малых РНК (miRNA, siRNA, piRNA)
В эпигенетике
• ChIP-seq (транскрипционные факторы, модифицированные гистоны)
• Анализ метилирования (Methyl-Seq)
• Анализ иммунной системы (Immuno-Seq)
• Анализ архитектоники ядра (Hi-C)
![Page 45: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/45.jpg)
Разнообразие применения NGS
![Page 46: Молекулярная биология - MIPT · This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060322/5f0d87717e708231d43acf71/html5/thumbnails/46.jpg)
RNA-seq