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Genetisches GrundpraktikumTeil 3: Mausgenetik

Dr. Joachim FensterleDr. Joachim Fensterle Prof. Dr. Albrecht MProf. Dr. Albrecht M üüllerller

und Mitarbeiterund Mitarbeiter und Mitarbeiterund Mitarbeiter

Fensterle 2006

Übersicht

Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – quantitative GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse

Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren

Ø Einführung in den experimentellen Teil

Fensterle 2006



Ø Einführung in den experimentellen TeilFensterle 2006

Vom Feld ins Labor...

Mäuse Kulturfolger des MenschenEnde 19. Jahrh. Zucht von „Haustiermäusen“ mit spez. Merkmalen (Fellfarbe etc.)Um 1900 erste genetische Experimente mit Mäusen (Cuénot, Castle)1909 Etablierung der ersten Inzucht-Laborlinie („DBA“, Clarence Little)Heute viele Inzuchtlinien, beziehbar über spezialisierte FirmenJahr 2000: 975.885 Tierversuche an Mäusen in Deutschland

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Fensterle 2006 Fensterle 2006

Fensterle 2006

Warum Maus??

eines der kleinsten Säugetiere, und “fast” schonMensch (60 Mio. Jahre gemeinsamer Vorfahr)Geschlechtsreif nach 6-8 WochenGroße Würfe (durchschnittlich 6-9 Junge pro Wurf)Zeitpunkt der Schwangerschaft leicht feststellbar(Vaginalpfropf); wichtig für Entwicklungsstudiengenetisch identische Mäuse durch Inzuchtviele Techniken für genetische ManipulationKomplettgenom verfügbar (seit 5. Dez. 2002)!...

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Kurze Wiederholung: klassische Genetik - Mendel

Mausgenetik: Vererbungslehre der Maus.

GF Mendel (* 22.7.1822, † 6.1.1884)Gregor Mendel hat im Jahr 1865 drei Grundregeln aufgestellt. Sie sind verbindlich für alle Vererbungstheorien; mit ihnen kann vorhergesagt, welche Eigenschaften vom einem Elternpaar auf Nachkommen übertragen werden.

1.Mendelsche Regel (Uniformit ätsregel) Kreuzt man zwei reinerbige Individuen einer Art, die sich in einem Merkmal unterscheiden, so sind alle Nachkommen in der 1.Fillialgeneration bez üglich dieses Merkmals gleich (uniform). Tragen alle Nachkommen in der 1.Fillialgeneration das Merkmals e ines Elters, so ist dieses Merkmal dominant. (dominant-rezessiver Erbgang) Tragen alle Nachkommen in der 1.Fillialgeneration ein Merkmal, das beide Merkmale der Eltern vereinigt, so verhalten sich diese beide Merkmale intermedi är zu einander. (intermediärer Erbgang)

3.Mendelsche Regel (Unabhängigkeitsregel)

Kreuzt man zwei reine Linien, die sich in mehr als einem Merkmal unterscheiden, dann wird jede Merkmals-anlage unabhängig von der anderen vererbt. Dabei treten in der F2-Generation Rekombinanten auf.

2.Mendelsche Regel (Spaltungsregel)

Kreuzt man die Nachkommen der 1. Fillialgeneration, die sich in einem Merkmal unter-scheiden, miteinander, so spalten sich die Merkmale in bestimmte Zahlenverh ältnisse auf. (Phänotypenverhältnis: dominant-rezessiver Erbgang 3 :1, intermediärer Erbgang 1 : 2 .

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Was beinhaltet „Maus-Genetik“?

Umfasst praktisch alle Arbeitsgebiete mit Mäusen„klassische“ Genetik:n Kartieren von Merkmalen (RFLP, Mikrosatelliten,

SNP‘s) n Zucht und Inzucht von Mäusenn Mutagenese

Molekulare Genetik:n Generation von Transgenen und Knockout Mäusenn Maus Genomanalyse

...

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Heutige Rolle der Mausgenetik

Hauptgebiet der Mausgenetiker heute: molekulare GenetikDurch Mausgenom (à high density microsatelitemaps, SNP‘s) „Renaissance“ klassischer Methoden

ABER:Alle Studien an Mäusen basieren auf genetischen Prinzipien (zumindest Zucht immer notwendig)Daher Verständnis wichtig für jegliche Arbeiten mit Mäusen

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Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse



Zucht: 1. Auszucht - Stämme

Linien mit nicht definiertem genetischen StatusHäufig Einsatz als „Leihmutter“ (z. B. CD1 Stämme)

Zuchtziel:Möglichst hohe genetische VariabilitätVerwendung von Zuchtstrategien, um Variabilität über Generationen zu erhalten

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Zucht: 2. Inzucht - Linien

Linien mit definiertem genetischen Status, Experimente mit diesen Tieren vergleichbarErzeugung durch sukzessive Geschwister-Verpaarung

Grundlage für Generierung von Inzuchtlinien

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Genetische Stabilisierung durch fort-währende Geschwister Verpaarung

ab 20. Generation: 98,7 % loci Homozygotab 60. Generation: praktisch 100% Homozygot

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Beispiel: Wichtige Inzuchtstämme

Stamm Farbe Verwendung Ursprung Generation

129/sv Agouti Gewinnung von ES Zellen 1930 (Dunn) F79 (Jax Lab)BALB/c Albino Immunologie, Hybridoma-Produktion 1913 ( Bragg) F180 (Jax Lab)C57Bl/6 schwarz genetische Studien, Transplantationen 1921 (Little) F192 (Jax Lab)

Stamm MHC Isotypen

129/sv b IgG a,Gpi (a)BALB/c d IgG b, Gpi (a)C57Bl/6 b IgG b, Gpi (b)

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Beispiel: Immunantworten gegen PSA DNA-Impfstoff in BALB/c oder C57Bl/6 Mäusen

pCDNA3 PSA pCDNA30

50

100

150 MediumPSA

IFN

- γ s

ecre

ting

cells

per

4x10

5 spl

enoc

ytes

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0 pcDNA3 PSA/1pcDNA3 PSA/2pcDNA3 PSA/3pcDNA3/1pcDNA3/2

1:100 1:300 1:900 1:2700serum dilution

OD

40

5

pCDNA3 PSA pCDNA30

25

50

75

100 MediumPPSA/24

IFN

-γ s

ecre

ting

cells

per

105 s

plen

ocyt

es

pCDNA3 PSA pCDNA30

50

100

150 MediumPSA

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- γ s

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per

4x10

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plen

ocyt

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0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0 pcDNA3 PSA/1pcDNA3 PSA/2pcDNA3 PSA/3pcDNA3/1pcDNA3/2

1:100 1:300 1:900 1:2700

serum dilution

OD

40

5

CD8 CD4 antibodies

BA

LB/c

pCDNA3 PSA pCDNA30

50

100

150 Medium

EPSA/1

EL4PSA64-72

IFN

-γ s

ecre

ting

cells

per

105 s

plen

ocyt

es

C57B

L/6

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Zucht+Genetik: 3. Spezielle Linien

Koisogene LinienKongene LinienKonsomische LinienKonplastische Linien

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Kongenisch, konsomisch, komisch! Kon-wie? Kon-so!

Rogner and Avner (2003): Nat Rev Immunol. 3:243

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Zucht: 3b. Kongene Linien

klassischer Grund für Einführung:• Suche nach Histoinkompati-

bilitätsgruppen(Einziger Nobelpreis für Mausgenetik

1980: George Snell)

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Beispiel: NRAMP

Nramp1: Gen, das für Sensivität gegenüber intrazellulären Bakterien verantwortlich ist. Entdeckung durch „positional cloning“ in der Maus 1993, kodiert wahrscheinlich für Eisentransporter. Unterschied: Punktmutation.Effect of the mouse Nramp1 genotype on the expression of IFN- gene in early response to Salmonella infection.Anne-Christine Lalmanach, , Annick Montagne, Pierrette Menanteau and Frederic Lantier (2001) Microbes and Infection, 3: 639-644.

Erster Schritt: Erzeugung Kongener Tiere

DBANrampI/ NrampI

BALB/cNramps/ Nramps

xBALB/c

Nramps/ Nramps

x xF20

NrampI/ Nramps

F1NrampI/ Nramps

1xF20

NrampI/ Nramps

20x C.CBNrampI/ NrampI

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Beispiel 2: NRAMP

Figure 1. Time course evolution of thenumber of live Salmonella in the liverof susceptible or resistant mice. Congenic Nramp1s (red squares) or Nramp1r (bluesquares) mice were inoculated subcutaneously with S. abortusovis in multiplication phase as detailed in the Materials and methods . Results , corresponding to a reproducibleexperiment, are expressed as thelog of the mean number of Salmonella ± SEM (n = 3) in the liver at the indicated time in hours (h) or in days (d) p.i. * Significant differencebetweenNramp1s and Nramp1r mice according to Student's t-test, P < 0.05.

2. Messung der Unterschiede in den kongenen Stämmen

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Quantitative Genetik

Ausprägung klar abgrenzbarAusprägungen zählbar (Mendel)

(z. B. Albino Phänotyp)

graduelle Variabilität der AusprägungAusprägung ist messbar

(z. B. Körpergröße)

Diskrete / qualitative Diskrete / qualitative MerkmaleMerkmale

Kontinuierliche / quantitative Kontinuierliche / quantitative Merkmale (quantitative Merkmale (quantitative traitstraits))

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Quantitative Genetik - QTL

Ursachen fUrsachen füür quantitative Vererbung: r quantitative Vererbung: Beeinflussung eines Merkmals durch viele Gene (polygenesMerkmal)Relevanter Einfluss durch nicht genetisch bedingte Faktoren (Umweltwirkungen)

Und wie kommt man an die Gene??Und wie kommt man an die Gene??1923 (Sax): erste Demonstration (in Bohnen, nicht Mäusen...), dass der Effekt eines individuellen Lokus auf ein quantitatives Merkmal (hier: Samenmasse) durch sukzessive Kreuzungen isoliert werden kann

à das war dann somit der erste „„Quantitative Quantitative TraitTrait LocusLocus““ (QTL)(QTL)also ein Locus, der eine quantitative Eigenschaft beschreibt

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QTL

damit war Prinzip bewiesenviele statistische Methoden waren auch bekannt

ABER: 60 Jahre passierte praktisch gar nigs. Und in der Maus schon gleich überhaupt nigs .

Grund:Grund:essentiell für Analyse sind hochwertige genetische Karten (Maps)

Wendepunkt 1989 Wendepunkt 1989 –– Entdeckung von MikrosatellitenEntdeckung von MikrosatellitenMikrosatelliten: repetetive Elemente (meist TG repeats), die stark polymorph sindEinfache Analyse durch PCR

à Hochwertige genetische Karten sind jetzt verfügbarà Statistische Methoden sind verfügbarà dicke Computer sind verfügbarà es kann losgehen!

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Was sind eigentlich „Marker“ für die Kartierung?

Grundsätzlich ist ein Marker ein genetisches Element, welches eine eindeutige Position in einer genetischen Karte und/oder Genom aufweistFür die Kartierung muss der Marker einen Polymorphismus aufweisen, also in verschiedenen Populationen (oder bsp. zwei Mausinzuchtstämmen) unterscheidbar seinDatenbanken wie UniSTSenthalten eine Vielzahl von Markern, die unterschiedlich definiert sein könnenHeute werden für Analysen mit hoher Auflösung hauptsächlich Mikrosatellitenmarker und SNPs verwendet

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Mikrosatelliten und SNPs

Mikrosatelliten:n kurze, repetitive Sequenzen, die in unterschiedlichen

Individuen einen Längenpolymorphismus aufweisenn liegen meist nicht in kodierenden Bereichenn Analyse mittels spezifischer PCR Primer

SNPsn „Single Nucleotide Polymorphism“n können auch in kodierenden Bereichen liegenn haben die höchste Dichten Analyse mittels Sequenzierung, MicroArray, o.ä.

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Mapping: SNP <-> microsatellite

(Quelle: Affymetrix )Fensterle 2006

Wieviele „Zentimeter“ liegen zwischen zwei Markern?

Sind Marker verbunden (werden also nicht unabh ängig vererbt), so kann über die Rekombinationsfrequenz der genetische Abstand bestimmt werden1 cM (centi-Morgan) entspricht dabei einer Rekombinationsfrequenz von 1%

ABAB ababXP

ABab ababXintercross

backcross

391243Beobachtet

0,250,250,250,25Erwartet

abababaBAbabABabab

abaBAbABGameten Im Beispiel:Rekombinationsfrequenz 3/85 = 3,53%

à Abstand 3,53 cM.

(näherungsweise, nicht auf Doppelcrossover korrigiert)

In der Praxis: hunderte Marker gleichzeitig à Macht alles der Computer!

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Kurz nochmal zu den Abständen…

Abstand alleine aus Rekombinationsfrequenz, ist nicht korrigiertAlternativen: bsp. Kosambi’s mapping Funktion

n

n θ: Rekombinationsfrequenz

−+=

θθ

2121ln*25,0d 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

θ

cM

cM Kosambiθ

cM Haldano

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Und da waren dann noch die lod-scores...

lod (logarithm of the odds) scores sind … Statistik!die lod Score gibt an, wie wahrscheinlich das beobachtete Vererbungsmuster für eine gegebene Rekombinationshäufigkeit ist

damit fließt zur Berechnung die „Familienstruktur“ des Versuchs und die beobachteten Verteilungen der Marker und des Phänotyps mit ein, während die Rekombinationshäufigkeit θ variiert wird.Berechnung erfolgt mit Computerle

=

<=

)5,0,_()5,0,(

lgθ

θverlinktnichtP

verlinktPZ

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Und da waren dann noch die lod-scores...

Beispiel:lod score wird für 0 < θ < 0,5 berechnet.ist Z>3 sind Gene verlinktθ des Maximums gibt praktisch Abstand an.MERKE: Z ist eine Funktion von θ, wobei die Funktion aus dem Experiment hervorgeht!Cave: Statistik – werden mit dem Computerle mehrere Marker gleichzeitig analysiert (siehe Paper) sollte man vor der Publikation lieber mal einen Statistiker fragen!

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Kartierung mit vielen F2‘s – der Klassiker!

Kartierung mit F2‘s:n zu analysierenden Phänotyp von F2 ‘s

bestimmenn Marker bestimmenn Phänotyp mit Markern korrelieren, fertig.

Vorteil:n schnell!

Nachteile (Auszug ;-) ):n Ergebnisse nicht reproduzierbarn Marker müssen jedesmal neu bestimmt

werdenn nur geringe Rekombinationsfrequenzà

Auflösung auch bei großen Tierzahlen begrenzt

xP

F1

outcross

x

F2

intercross

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Lösung 1: Kartierung mit „recombinant inbred strains“

„Fixierung“ der F2 Merkmale durch InzuchtVorteil:n Ergebnisse

reproduzierbarn Marker m üssen

nur einmal bestimmt werden

n RI‘s kann man kaufen

Nachteil:n Auflösung geringn teuer!

C57BL/6J (B) DBA/2J (D)fully

inbred

female male

chromosome pair

F1isogenic

BXD

20 generations

brother - sister

matings

BXD1 BXD2 BXD80+ … +

BXD RIStrain set

Recombined chromosomes are needed for

mappingInbredIsogenicsiblings

F2

hetero-geneous

BXD RI = C57BL6 (B) x DBA2 (D) F2 recombinant inbred strainFensterle 2006

„Advanced intercross strains“: das Plus an Auflösung

Kreuzen der F2 über mindestens 8 weitere Generationen (ohne Geschwisterverpaarungen)n wesentlich erhöhte

Rekombinations-frequenz

Vorteil:n stark erhöhte Auflösung

gegenüber F2

Nachteile:n bis auf Auflösung wie F2n aber auch teuer und

aufwändig!

x

x

P

F1

F2

outcross

intercross

intercross over >8 generations (no brother-sistermating!)

...

> F10

10

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Recombinant Inbred - Advanced IntercrossStrains (RI – AIS): das non-plus Ultra

Inzucht von F11 aus AdvancedIntercrossn Merkmale werden fixiert

Vorteil:n ganz einfach: Vorteile AIS +

Vorteile RI

Nachteil:n im Prinzip nur noch einer:

schweineteuer und dauert Jahre!

n Aus praktischen Gründen ist Anzahl von unterschiedlichen RI Linien begrenzt à limit für Auflösung

x

x

P

F1

F2

outcross

intercross

...

> F10

x

x

P

F1

F2

outcross

intercross

...

inbreeding 20 generations

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BXD RIs im weniger trockenen Beispiel...

Untersuchung Untersuchung genetischer Faktoren der genetischer Faktoren der

Alkoholsucht im Alkoholsucht im TiermodellTiermodell

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Vom Drink zum Lokus...

1959 McClearn et al.: C57Bl/6 „extreme alcohol preferrers“ , DBA/2 „extreme alcoholavoiders“

1971 Goldstein and Pal:C57Bl/6 schwache Entzugserscheinungen, DBA/2 starke Entzugserscheinungen

1996 Melo et al. (Nature Genetics): Analyse der „Trinkgewohnheit“ von C57BL/6 x DBA/2 F2;

1997 Buck et al.:QTL Analyse in BxD RI Mäusen auf akute Alkoholentzugssymptome

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Trinkverhalten (Melo et. al):Annahme: B6 Präferenz

ist rezessivàbackcross mit B6àin N2: Bestimmung

der TrinkpräferenzàGenerieren von maps

für jede Maus (!)àKorrelation (n > 330)

mit MarkernàFeinkartierung

à ganz schön aufwändig...

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Entzug (Buck et al.), vereinfacht:

Alkohol in BxD RI Panel injizierenàwie stark zittert Maus nach 4 -12 h?

Zittern mit Markern korrelieren

groben Lokus durch weitere Kreuzungen einengen

Kandidatengene untersuchen(Microarrays, transgene Maus, biochemische Tests...)

Auflösung Aufwand

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Fensterle 2006 Fensterle 2006

Whitehead Institute: sample preparation assembly line.

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Maus Genom in der Praxis...

http://www.ensembl.org/Mus_musculus /

mehr zum Genom am Computer:n wie finde ich mich in den 2.267.775.209 Basen

zurecht?n was kann ich mit der Information anfangen?n „elektronische Mausgenetik“:

Mikrosatellitenmarker, SNPs...

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Transgene Mäuse

Tiere mit künstlich eingefügtem GensegmentEinsatz:

Sehr vielseitig, je nach Gen Beispiele:n „Krebsmäuse“ (z. B. Raf, Ras, HER-2 transgene

Mäuse)n Grüne Mäuse (GFP transgen)

n T-Zellrezeptor transgene Mäusen ...

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Strategien für die Erzeugung transgener Tiere

ubiquitäre konstitutive Expression (z. B. CMV Promotor; GFP transgene Mäuse)gewebespezische Expression (z. B. SP-C Promotor – lungenspezifische Expression )regulierte ubiquitäre Expression regulierte gewebespezifische Expression

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transgene MäuseMethoden

Retrovirale Vektoren die frühe embryonale Stadien infizierenMikroinjektion von DNA in den Nukleus einer befruchteten EizelleEinführung genetisch modifizierter embryonaler Stammzelllinien (ES Zellen) in frühe Embryonen

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Transgene MäuseRetrovirale Methode

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Transgene MäuseMikroinjektion

Analyse

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Knockout-Mäuse

Tiere mit gentechnisch entferntem Gensegment

Einsatz:Studie von Genfunktionen im Organismusn Immunologie: CD4 -/- Mäusen Entwicklungsbiologie/Krebsforschung: p53 -/-

Mäuse

„Reverse Genetics“: vom Gen zur Funktion

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Generierung von Knockout Mäusen

aus: http://www.memorec.com/technolo%20KNOCKOUT.htm

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Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – quantitative GenetikØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse



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Raf als central player…Rezeptor

Ras RafMek

ErkErk

TFTF cyclins

Etc.

c-myc

ccApoptose

IapsBcl -Xl

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Raf transgene Tiere

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BxB Raf transgene Mäuse

Exprimieren lungenspezifisch aktive Raf-Variante (C-Raf BxB)Entwickeln ab 2. Monat LungenadenomeZur Studie von Raf- basierten Therapiestrategien (Raf Inhibitoren bereits in Phase II klinische Studien)

wild type SP-C-craf BXB SP-C-craf BXB/p53-/-

solidcuboidal

papillarycolumnar

1 mm 1 mm 1 mm

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Zucht transgener Tiere

Direkt nach Generierung:aus praktischen Gründen meist unterschiedliche Mauslinien (transgen in 129/Sv eingefügt, Rückkreuzung in C57BL/6)

Für Erhaltung:oft heterozygote Zucht notwendig (je nach Genfunktion homozygot nicht lebensfähig o.ä.)

àMeist muss während gesamter Zucht transgen-Status bestimmt werden

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Möglichkeit zur Bestimmung des Transgenstatus abhängig von Gen:Phänotypisch (selten, z. B. GFP-Mäuse)Genotypischn Northern Blot Analysen RFLPn PCR (Gold-Standard)

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Experimenteller Teil: Praktisches Vorgehen bei der Zucht von (BxB-Raf) transgenen Mäusen:DNA IsolierungBestimmung des Transgenstatus durch PCRBestimmung des Geschlechts durch PCR

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Zum Schluss: die Take-homemessage! (1/3)

Maus als Versuchstier:n so schön klein und doch ein Säugetiern Inzucht Linien, genetisch gut charakterisiert, Maus-Genom

verfügbar

Mauszucht + Mausgenetikn im Prinzip wie beim Mensch (Kartierung etc.), nur dank Zucht und

Inzucht viel mehr Möglichkeitenn Inzuchtlinien: Geschwisterverpaarung (> 20 Generationen) n Kongene Linien: Rückkreuzung auf ein Elterntier, Selektion auf

ein Merkmal (> 10 Generationen); enthalten einen (oder mehrere) veränderten Lokus; breite Verwendbarkeit

n Koisogene Linien: enthalten punktuelle Veränderungen (Mutation, Insertion etc.) gegenüber Parentallinie

n qualitative Merkmale = klar abgegrenzt + z ählbar; quantitative Merkmale = graduelle; messbar

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Mapping bei der Mausn prinzipiell: Analyse der Assoziation eines Merkmals mit Markernn Marker: alles, was eindeutige Position hat; für Mapping muss jedoch

Polymorphismus vorhanden seinn Mikrosatelliten: definiert durch PCR Primerpaare, Polymorphismus in

Länge (meist repetetive Elemente)n SNP: Polymorphismus auf Basenebene. Analyse durch Sequenzierung etc.n Mapping mit F2 Generation; schnell, aber niedrige

Rekombinationsfrequenz und nicht reproduzierbarn Mapping mit recombinant inbred strains: RI = Fixierung von F2

Merkmalen durch Geschwisterverpaarungen; Bestimmung von Markern muss nur einmal durchgeführt werden; Versuche reproduzierbar; aber Auflösung niedrig (wie F2);

n Mapping mit Advanced intercross strains : AIS = Erhöhte Rekombinationsfrequenz [=Auflösung] durch weitere ("outcross ") Verpaarung F2; hohe Auflö sung, teuer, nicht reproduzierbar

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Transgene Tieren Erzeugung durch Einführung von DNA in Eizelle/ES Zelle und

zufälliger Integrationn Durch Auswahl Promotor / Gen à praktisch Expression von

beliebigen Genen an beliebiger Stelle möglichn Hauptnachteil: durch zufällige Integration / Kopienzahl starke

Streuung von Expression

Knockout-Tieren Tiere mit künstlich entferntem Gensegmentn Erzeugung durch homologe Rekombination in ES Zellenn Studie der Bedeutung eines Gens im Gesamtorganismusn aufwändige Technologie

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