ĐÁnh giÁ khẢ nĂng diỆt tuyẾn trÙng vÀ kÍch thÍch sinh

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Đào Thùy Dương

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG

VÀ KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA

CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Đào Thùy Dương

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG

VÀ KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA

CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà

Hà Nội, 2020

i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do tôi trực tiếp thực hiện.

Các số liệu và kết quả là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất

kỳ một công trình nghiên cứu nào.

.

Tác giả

Đào Thùy Dương

ii

Lời cảm ơn

Trong quá trình học tập, thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp, tôi đã

nhận được sự giúp đỡ tận tình của các đoàn thể, cá nhân trong và ngoài

trường. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy

giáo PGS.TS. Chu Hoàng Hà cùng các cán bộ, nghiên cứu sinh của Phòng

Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa

học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được

học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc

trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm

vi sinh CAFE-HTD01 và HOTIEU-HTD03 và sử dụng tích hợp các chế phẩm

sinh, hóa học nhằm phát triển hiệu quả và bền vững cây cà phê và hồ tiêu ở

Tây Nguyên” mã số KHCN-TN/16-20, thuộc Chương trình Tây Nguyên 3 do

TS. Hà Việt Sơn làm Chủ nhiệm.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân

trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và

khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tác giả

Đào Thùy Dương

iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Chữ viết tắt/ký hiệu Giải nghĩa đầy đủ

B. megaterium 18 Bacillus megaterium 18

CMC Carboxymethyl Cellulose

IU International Unit

ICO International Coffee Organization

IAA Indole-3-acetic acid

PTSH Phòng trừ sinh học

Gr Gram

OD Optical Density (Mật độ quang học của dung dịch)

VSV Vi sinh vật

VSVNS Vi sinh vật nội sinh

VK Vi khuẩn

M Molar

DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid

- Không có hiệu lực

+ Có hiệu lực

ĐC Đối chứng

TN Thí nghiệm

TN1 Thí nghiệm 1

TN2 Thí nghiệm 2

iv

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Thành phần các loài tuyến trùng ký sinh hại cà phê 8

Bảng 3.1. Khả năng lên men sinh axit từ các nguồn cơ chất của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium 18 dựa trên kít

chuẩn API 50CHB

33

Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của

chủng Bacillus megaterium 18 theo thời gian

36

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp

enzym của chủng Bacillus megaterium 18

37

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng

của chủng vi khuẩn

38

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng

của chủng vi khuẩn

39

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ đến khả năng sinh

chất kháng sinh của chủng Bacillus megaterium 18

39

Bảng 3.7. Khả năng kháng tuyến trùng sau 24 giờ nuôi cấy trong

phòng thí nghiệm

41

Bảng 3.8. Sinh trưởng của thuốc lá K326 sau lây nhiễm vi sinh vật 44

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều cao và

số cặp lá của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm vi

khuẩn nội sinh

46

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều dài rễ

chính và số rễ nhánh của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây

nhiễm

48

Bảng 3.11. Sinh trưởng của cây cà phê tại vườn ươm sau 3,6 và 9

tháng

49

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh tới khả năng sinh trưởng và phát triển của cây cà phê

50

v

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Tác dụng của vi khuẩn nội sinh thực vật và ứng dụng 13

Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld 27

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng Bacillus megaterium

18

32

Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của chủng vi khuẩn 34

Hình 3.3. Khả năng làm loãng gelatin của chủng Bacillus megaterium

18

35

Hình 3.4. Ảnh thử nghiệm khả năng ức chế trứng nở sau 7 ngày của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ

10%

42

Hình 3.5. Ảnh thử nghiệm khả năng giết chết ấu trùng sau 7 ngày của

chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ

10%

42

Hình 3.6. Cây thuốc lá ở các công thức sau 15 ngày lây nhiễm 45

Hình 3.7 Cây thuốc lá ở các công thức sau 30 ngày lây nhiễm 45

Hình 3.8. Cây cà phê ở công thức ĐC, TN1 và TN2 sau 28 ngày lây

nhiễm

47

Hình 3.8. Cà phê tại vườn ươm sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng 50

vi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ ........................................................... 3

1.1.1. Lịch sử phát triển của cây cà phê......................................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây cà phê ....................................................................... 4

1.1.3. Một số bệnh thường gặp ở cây cà phê ................................................................ 5

1.2. TUYẾN TRÙNG THỰC VẬT VÀ TUYẾN TRÙNG HẠI CÂY CÀ PHÊ

....................................................................................................................... 7

1.2.1. Cấu tạo và phân loại tuyến trùng thực vật .......................................................... 7

1.2.2. Thành phần các loài tuyến trùng gây hại cây cà phê ......................................... 8

1.2.3. Tình hình tuyến trùng hại cây cà phê ở Việt Nam ............................................. 9

1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN NỘI SINH THỰC VẬT ...................... 11

1.3.1. Vi khuẩn nội sinh thực vật ................................................................................. 11

1.3.1.1. Định nghĩa ........................................................................................................ 11

1.3.1.2. Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh thực vật ........................................................... 11

1.3.2. Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật .............................................................. 12

1.3.2. Một số ứng dụng của vi sinh vật trong phòng trừ tuyến trùng ....................... 14

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ PHÊ ...... 18

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ..................................................................... 18

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ...................................................................... 21

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 23

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 23

2.2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................. 23

2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................. 23

vii

2.4. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT................................................................... 24

2.4.1. Thiết bị chính....................................................................................................... 24

2.4.2. Hóa chất chính..................................................................................................... 24

2.4.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................... 24

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 24

2.5.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật [53]......................................................... 24

2.5.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn . 24

2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi

khuẩn [53] ...................................................................................................................... 26

2.5.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym ...................................................... 27

2.5.2. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với thực vật của chủng

Bacillus megaterium 18 ................................................................................................ 28

2.5.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng

cây thuốc lá .................................................................................................................... 28

2.5.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium

18 đến sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vườn ươm. ................................ 28

2.5.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh

trưởng cây cà phê giai đoạn cây con và giai đoạn cây 1,5 tuổi ........................... 29

2.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU................................................................................... 31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 32

3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NGHIÊN CỨU ................. 32

3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào ............................................................ 32

3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................................................. 32

3.1.3. Khả năng phân giải cơ chất của chủng nghiên cứu ......................................... 34

3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus

megaterium 18 ............................................................................................................... 35

viii

3.1.4.1. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của

chủng vi khuẩn nghiên cứu .......................................................................................... 35

3.1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng

hợp chitinase của chủng vi khuẩn ................................................................................ 37

3.1.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp

chitinase của chủng vi khuẩn........................................................................................ 38

3.1.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng của các chủng vi

khuẩn .............................................................................................................................. 39

3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG CỦA CHỦNG

Bacillus megaterium 18 Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM ....................... 40

3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY

CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium 18 ..... 44

3.3.1. Kết quả thử nghiệm trên cây thuốc lá in vitro .................................................. 44

3.3.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 lên sinh trưởng của cây

cà phê ở giai đoạn vườn ươm ....................................................................................... 46

3.3.2.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 đến sinh trưởng của

cây cà phê sau 1 tháng theo dõi .................................................................................... 46

3.3.2.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium đến sinh trưởng của cây

cà phê sau 3,6,9 tháng theo dõi. ................................................................................... 49

3.3.2.3. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. Megaterium 18 đến sinh trưởng của

cây cà phê 1,5 tuổi ......................................................................................................... 51

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................. 53

4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 53

4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 54

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, sự phát triển của ngành nông nghiệp đang đi vào mức độ

thâm canh, với việc sử dụng ngày càng nhiều phân hóa học, thuốc bảo vệ thực

vật hóa học, phá rừng canh tác cây công nghiệp chạy theo năng suất, sản

lượng…đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối,

mất cân bằng hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các

chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh trong đất ngày càng tích

lũy….Ðể đối phó với vấn đề này, việc kiểm soát sâu, bệnh hại bằng biện pháp

sinh học ngày càng được chú ý đến và đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện

trong thời gian gần đây [1].

Cà phê là một trong những mặt hàng nông sản chiến lược, đóng góp

hơn 3,5 tỷ USD cho ngân sách nhà nước [2]. Chủ trương của Nhà nước là

hình thành các vùng trồng cà phê lớn, sản xuất bền vững, đạt các tiêu chuẩn

của cà phê chứng chỉ quốc tế đáp ứng nhu cầu xuất khẩu và mang lại giá trị

lợi nhuận cao [3]. Tuy nhiên, sản xuất cà phê Việt Nam nói chung hiện đang

phải đối mặt với nhiều thách thức, trong đó có vấn đề lạm dụng phân bón hóa

học [4]. Điều này chẳng những làm gia tăng chi phí sản xuất mà còn đã và

đang làm giảm khả năng chống chịu của cây cà phê dẫn đến bùng nổ dịch

bệnh, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng cà phê Việt Nam trên thị trường

thế giới và cũng là nguyên nhân có thể dẫn đến thoái hóa đất canh tác, ô

nhiễm nguồn nước và môi trường sống. Ngoài ra, dư lượng hóa học còn làm

giảm chất lượng hạt cà phê nhân, làm sản phẩm khó có thể đi vào các thị

trường đòi hỏi chất lượng cao. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các giải pháp

thay thế một phần phân bón và thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong sản xuất

cà phê hiện đang là vấn đề quan tâm của nhiều nhà khoa học.

Một trong những bệnh điển hình của cây cà phê đang phải đối mặt đó là

bệnh sần rễ gây vàng lá rồi chết, bệnh chủ yếu do tuyến trùng gây sần rễ gây

ra. Tuyến trùng Meloidogyne incognita là một trong những tuyến trùng gây

sần rễ, là tác nhân chủ yếu gây hại cho cây trồng trong đó có cây cà phê.

Vi sinh vật nội sinh được xem là một trong những đối tượng quan

trọng, được phân lập và sàng lọc để làm chế phẩm sinh học dùng cho việc

2

phòng trừ các loại nấm bệnh. Lợi dụng đặc tính vi sinh vật sống nội sinh

trong tế bào mô thực vật đã rút ngắn được thời gian thích nghi của chế phẩm

sinh học. Vi sinh vật nội sinh có thể đối kháng với nấm bệnh, kích thích sự

sinh trưởng cho cây và đồng thời không ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe

cộng đồng [5]. Khảo sát về vi sinh vật nội sinh đã được nghiên cứu trong

nhiều loại cây trồng quan trọng như lúa mỳ, chuối, đậu nành và cà chua,

nhưng phần lớn vi sinh vật nội sinh trên cây cà phê vẫn còn chưa nhiều

nghiên cứu sâu [6].

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá khả

năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng

vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium”

Mục đích, yêu cầu:

- Mục đích: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh

trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium.

- Yêu cầu: Sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh và hóa sinh để

thử nghiệm và đánh giá: khả năng diệt tuyến trùng, khả năng sinh tổng hợp

enzyme chitinase và cellulase cao, sinh tổng hợp hàm lượng IAA.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ

1.1.1. Lịch sử phát triển của cây cà phê

Cà phê thuộc bộ Rubiales, họ Rubiacea, chi Coffea. Theo phân loại

thực vật học cà phê có khoảng 500 loài với trên 6.000 loại. Tất cả các loại cà

phê đều có nguồn gốc từ Châu Phi, loại sống hoang dại đã nổi tiếng và lâu đời

nhất là cà phê chè (Coffea arabica). Cây cà phê chè mọc hoang dại được biết

đến đầu tiên ở vùng biên giới giáp cao nguyên Boma và Sudan. Năm 1889 đã

tìm thấy cà phê vối (Coffea canephora) mọc hoang dại ở vùng thuộc Công Gô

và mọc rải rác ở một số vùng khác thuộc Tây Phi gần xích đạo. Cây cà phê

được trồng trọt từ thế kỷ XIV tại vùng Arabica (Yêmen). Theo Vesling, quả

cà phê được đem từ Yêmen sang bán ở vùng Ai Cập duới dạng quả khô và coi

đây là thứ hàng rất xa xỉ. Vào thế kỷ XVII người ta đã lấy cà phê đã rang xay

trộn vào dầu mỡ được chứa trong các túi làm thực phẩm để vuợt sa mạc.

Hiện nay trên thế giới đang trồng các loài cà phê có giá trị kinh tế sau:

Cà phê chè (Coffea arabica Line): Ðược trồng có hệ thống đầu tiên vào

khoảng thế kỷ XV tại các khu vườn ở miền nam Yêmen. Từ giữa thế kỷ XVII

người Ả-rập mất vị trí độc tôn trong việc trồng cà phê và cà phê chè được lan

rộng khắp thế giới. Nguồn gốc từ Ethiopia đến Yêmen sang Yava (1960) đến

Amsterdam (Hà Lan) năm 1706, sang Trung Mỹ Năm 1724, đến Colombia

năm 1724, từ Yêmen sang Brazil năm 1715 và từ Yava sang Papua New

Guinea vào năm 1770. Hiện nay cà phê chè được trồng tập trung chủ yếu tại

Brazil, Colombia, Mêhicô và các nước Trung Phi. Cà phê chè bao gồm các

chủng phổ biến như: Coffea arabica L. var. Typica, Coffea arabica L. var.

Bourbon, Coffea arabica L. var. Amarello chev, Coffea arabica L. var.

Caturra, Coffea arabica L. var. Mokka, Coffea arabica L. var. Mundonovo,

Coffea arabica L. var. Catuai, Coffea arabica L. var. Catimor [7].

Cà phê vối (Coffea canephora Piere): Cà phê vối từ Tây Phi và

Madagascar đưa sang Nam Mỹ và Amsterdam, Hà Lan vào năm 1899. Cà phê

vối không chịu được lạnh như cà phê chè vì vậy việc gieo trồng chỉ hạn chế

tại một số vùng có điều kiện sinh thái đặc trưng, đồn điền cà phê vối đầu tiên

4

xuất hiện tại Java năm 1900. Cà phê vối chủ yếu được trồng nhiều ở một số

nước là Indonesia, Bờ Biển Nga, Uganda, Việt Nam. Cây cà phê vối chịu

được nhiệt độ nóng ẩm, năng suất cao nhưng hương vị nước uống kém hơn cà

phê chè. Khác với cây cà phê chè, cà phê vối là cây thụ phấn chéo và chỉ ra

hoa một lần trên nách của cành ngang.

Cà phê mít (Coffea excelsa Chev): Cà phê mít dâu da (Coffea liberica

Bull in Hiern). Hai loại cà phê này chỉ được trồng tại các nước Châu Phi như

Liberia, Sierra Leon, Cộng Hòa Trung Phi, Benin và các nước Châu Á như

Philipin, Indonesia, Việt Nam. Hai loại cà phê này sinh trưởng khỏe, khả năng

thích ứng rộng, ít sâu bệnh, nhưng chất lượng nước uống kém, hàm lượng

caffein thấp. So với cà phê chè và cà phê vối thì sản lượng của hai loại cà phê

này không đáng kể [8].

1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây cà phê

Thân: Cây cà phê chè có thể cao tới 6 m, cà phê vối tới 10 m. Tuy

nhiên ở các trang trại cà phê người ta thường phải cắt tỉa để giữ được độ cao

từ 2-4 m, thuận lợi cho việc thu hoạch. Cây cà phê có cành thon dài, lá cuống

ngắn, xanh đậm, hình ovan. Mặt trên lá có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh

nhạt hơn. Chiều dài của lá khoảng 8-15 cm, rộng 4-6 cm. Rễ cây cà phê là

loại rễ cọc, cắm sâu vào lòng đất từ 1 - 2,5 m với rất nhiều rễ phụ tỏa ra xung

quanh làm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng nuôi cây [6].

Hoa: Hoa cà phê màu trắng, có năm cánh, thường nở thành chùm đôi

hoặc chùm ba. Màu hoa và hương hoa dễ làm ta liên tưởng tới hoa nhài. Hoa

chỉ nở trong vòng 3 đến 4 ngày và thời gian thụ phấn chỉ vài ba tiếng. Một

cây cà phê trưởng thành có từ 30.000 đến 40.000 bông hoa. Ngay từ khi cây

cà phê ra hoa kết quả người ta đã có những đánh giá đầu tiên về vụ mùa cà

phê. Ở các nước sản xuất cà phê lớn điều này đặc biệt quan trọng trong việc

đưa ra những nhận định về giá cả và thị trường. Tuy vậy những đợt rét đậm

hoặc hạn hán có thể làm đảo lộn mọi sự tính toán và đẩy thị trường vào tình

thế hoàn toàn khác [6].

Quả: Cà phê là loài cây tự thụ phấn, do đó gió và côn trùng có ảnh

hưởng lớn tới quá trình sinh sản của cây. Sau khi thụ phấn quả sẽ phát triển

https://vi.wikipedia.org/wiki/Trang_tr%E1%BA%A1i

https://vi.wikipedia.org/wiki/Xanh

https://vi.wikipedia.org/wiki/Xentim%C3%A9t

https://vi.wikipedia.org/wiki/Tr%E1%BA%AFng

https://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_Nh%C3%A0i

https://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%A5_ph%E1%BA%A5n

https://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A0_ph%C3%AA#.C3.9D_ngh.C4.A9a_kinh_t.E1.BA.BF

https://vi.wikipedia.org/wiki/Gi%C3%A1_c%E1%BA%A3

https://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%8B_tr%C6%B0%E1%BB%9Dng

https://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BA%A1n_h%C3%A1n

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=T%E1%BB%B1_th%E1%BB%A5_ph%E1%BA%A5n&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/wiki/Gi%C3%B3

https://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%B4n_tr%C3%B9ng

5

trong 7 đến 9 tháng và có hình bầu dục, bề ngoài giống như quả anh đào.

Trong thời gian chín, màu sắc của quả thay đổi từ xanh sang vàng rồi cuối

cùng là đỏ. Quả có màu đen khi đã chín nẫu. Do thời gian đâm hoa kết trái lâu

như vậy mà một vụ cà phê kéo dài gần một năm trời và có thể xảy ra trường

hợp trên một cây vừa có hoa, vừa có quả. Thông thường một quả cà phê chứa

hai hạt. Chúng được bao bọc bởi lớp thịt quả bên ngoài [6].

1.1.3. Một số bệnh thường gặp ở cây cà phê

Một vấn đề đáng quan tâm trong những năm qua là tình hình phát sinh

sâu bệnh trên cây cà phê đang diễn biến hết sức phức tạp, việc áp dụng các

biện pháp phòng trừ sâu bệnh vẫn còn nhiều hạn chế, nhiều loại bệnh chưa có

thuốc đặc trị, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên cây cà phê cũng có

nhiều vấn đề đáng bàn…

Một ví dụ cụ thể như sự xuất hiện của loại ve sầu gây hại cà phê mới đây

đã huỷ diệt trên diện rộng đến hàng chục ngàn ha cà phê tại nhiều tỉnh thành trên

cả nước, trong đó đặc biệt là ở các vùng chuyên canh cây cà phê như Đắk Lắk,

Lâm Đồng, Gia Lai, Đắk Nông… gây thiệt hại lớn cho người dân và làm cho sự

phát triển của cây cà phê trong thời gian tới chưa được bền vững. Cho nên, để

cho cây cà phê phát triển ổn định và bền vững thì vấn đề bảo vệ thực vật cho cây

cà phê là hết sức cần thiết và đáng quan tâm nhất hiện nay [9].

Theo kinh nghiệm thực tế thì sâu bệnh thường sẽ xuất hiện sau khi thu

hoạch xong cà phê cho đến cuối mùa nắng, đầu mùa mưa. Đây là giai đoạn

phát triển khá nhanh và khá nhiều loại sâu bệnh trên cây cà phê.

Theo Cục Bảo vệ thực vật cho biết, tập đoàn sâu bệnh hại trên cây cà

phê rất phong phú và đa dạng gồm 18 loại sâu bệnh chính. Các loài sâu hại

quan trọng thuộc 6 họ của 3 bộ gồm: bộ cánh cứng, bộ cánh đều, bộ cánh vảy.

Trong đó xuất hiện phổ biến nhất là các loại bệnh sau: rệp sáp, ve sầu hại rễ,

sâu đục thân, đục cành, đục quả; bệnh gỉ sắt và các loại bệnh nấm…[10]. Một

trong số những bệnh gây hậu quả nghiêm trọng trên cây cà phê đó là 2 loại

bệnh sau:

a, Bệnh rễ do tuyến trùng (Nematodes)

Một số loại tuyến trùng gây hại đối với cà phê ở Việt Nam là:

https://vi.wikipedia.org/wiki/Anh_%C4%91%C3%A0o

https://vi.wikipedia.org/wiki/V%C3%A0ng_(m%C3%A0u)

https://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BB%8F

https://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90en

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Th%E1%BB%8Bt_qu%E1%BA%A3&action=edit&redlink=1

6

- Tuyến trùng gây vết thương: Pratylenchus coffea.

- Tuyến trùng gây nốt sần: Meloidogyne spp.

- Tuyến trùng nội sinh và nửa nội sinh là: Tylenchus và Pratylenchus,…

Tuyến trùng có thể gây tác hại trong thời kỳ vườn ươm nhưng chủ yếu

là ở trên vườn trồng. Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa

khô thường bị vàng héo, cây bị nặng có thể chết khô ngay ở trên lô trồng.

Triệu chứng của tuyến trùng gây vết thương là làm cho rễ bị sưng u, có những

đường nứt nẻ. Còn tuyến trùng gây nốt sần chỉ ở trên các rễ phụ có những u

dạng nốt sần.

Biện pháp phòng trừ:

Những cây bị bệnh nặng nhổ đem đi đốt. Những vùng đã bị bệnh nặng

cần luân canh với cây trồng khác, hoặc cải tạo đất bằng cây phân xanh ít nhất từ

2 - 3 năm sau mới trồng lại cà phê. Con đường chọn lọc giống chống bệnh dùng

gốc ghép chống bệnh cũng thường được chú ý để phòng chống bệnh này. Những

cây bị bệnh nhẹ tăng cường bón phân hữu cơ, có thể dùng một số loại thuốc sau

đây để bơm vào đất xử lý: Nemaphos, Teracur, Nemagon, Methylbromid. Cây

cúc vạn thọ cũng là cây có khả năng diệt tuyến trùng. Trồng cây này trong vùng

cây bị bệnh hoặc xung quanh gốc cây cà phê để chúng tiết ra các chất diệt tuyến

trùng trong đất hoặc ở vùng xung quanh bộ rễ của nó. Có thể đem băm thân và

rễ cây cúc vạn thọ sau đem vùi vào gốc cà phê.

b, Bệnh thối rễ

Một số loại nấm ở trong đất thuộc chi Rhizoctonia, Fusarium... tấn

công gây tác hại vào bộ rễ của cây cà phê. Triệu chứng: Trên các rễ ngang,

chóp rễ, phần rễ đuôi chuột xuất hiện những vết thối mềm có màu thâm đen.

Cây bị bệnh sinh trưởng cằn cỗi, lá vàng, héo, cây bị nặng sẽ bị chết [19].

Biện pháp phòng trừ: Chú ý tới biện pháp thâm canh, tăng cường bón

phân hữu cơ, cải thiện đặc điểm lý và hóa tính của đất đặc biệt là giảm độ

chua của đất. Hiện nay chưa có những loại thuốc hóa học để phòng trừ bệnh

thối rễ có hiệu quả [11].

7

1.2. TUYẾN TRÙNG THỰC VẬT VÀ TUYẾN TRÙNG HẠI CÂY CÀ PHÊ

1.2.1. Cấu tạo và phân loại tuyến trùng thực vật

Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống có đặc điểm

sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có

một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm

sinh thái khác, như có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút

chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước

của trứng lớn hơn kích thước của cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt

buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút

chuyển hóa là khác biệt quan trọng nhất. Về mặt phân loại học, tuyến trùng ký

sinh thực vật gồm 4 nhóm liên quan đến 4 bộ tuyến trùng là: Bộ Tylenchida

(chỉ trừ một số loài tuyến trùng họ Tylenchidae); Bộ Aphelenchida; Các loài

tuyến trùng họ Longidoridae của bộ Dorylaimida; Các loài tuyến trùng họ

Trichodoridae thuộc bộ Triplonchida. Trong các nhóm ký sinh trên thì nhóm

loài thuộc bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng ký sinh đông đảo nhất và có

tầm quan trọng nhất đối với sản xuất nông nghiệp.

Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật

đang phát triển, hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm

tuyến trùng ký sinh nhất. Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán

dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của

thực vật, một số khác thâm nhập vào các mô sâu hơn, và một số khác có thể

làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng đặc biệt tại nơi chúng ký

sinh. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ,

tuy nhiên khi mật độ lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng

có thể gây chết thực vật. Ngoài ra, một vài tuyến trùng có thể làm giảm khả

năng của thực vật trong việc kháng lại sự xâm nhập của các tác nhân vi sinh

vật gây bệnh khác và làm cho tác hại của chúng đối với thực vật càng trầm

trọng thêm. Một số tuyến trùng ký sinh chuyển hóa có khả năng lan truyền

virus gây bệnh cho thực vật. Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5% sản

lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng ký sinh đối với cây trồng nông

nghiệp ước tính hàng trăm tỷ đô la Mỹ mỗi năm.

8

Về hình thức ký sinh trên thực vật, tuyến trùng có thể phân thành 3

nhóm ký sinh như sau:

- Ngoại ký sinh: tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong mô thực

vật mà bám bên ngoài bề mặt của rễ, dinh dưỡng của tuyến trùng bằng việc sử

dụng kim chích châm chích và hút chất dinh dưỡng trong tế bào thực vật.

- Bán nội ký sinh: chỉ phần đầu của tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ,

còn phần sau cơ thể tuyến trùng vẫn ở ngoài đất.

- Nội ký sinh: toàn bộ tuyến trùng xâm nhập vào bên trong rễ. Nhóm

này được chia thành 2 nhóm nhỏ:

+ Nội ký sinh di chuyển: tuyến trùng vẫn giữ khả năng di chuyển trong

mô thực vật và chúng chuyển động từ mô này đến mô khác để hút dinh dưỡng.

+ Nội ký sinh cố định: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh

dưỡng tại một nơi cố định tạo nên các tế bào dinh dưỡng, chúng mất khả năng

di chuyển và trở nên phình to ra (béo phì).

1.2.2. Thành phần các loài tuyến trùng gây hại cây cà phê

Theo White T., thì thành phần tuyến trùng kí sinh hại cà phê gồm các loài

như sau:

Bảng 1.1. Thành phần các loài tuyến trùng ký sinh hại cà phê [12].

Loài Cà phê chè

(Coffea arabica Line)

Cà phê vối

(Coffea canephora Line)

Nội kí sinh

(endoparasit) ∗Meloidogyne sp. , M.africana,

M. exigua, M. coffeicola,

M. decalineata, M. megadora.

∗Pratylenchus sp., P. coffea. ∗ Radopholus similis ∗ Rotylenchulus reniformis

∗Meloidogyne sp., M. megadora.

∗Pratylenchus sp., P. brachyurus,

P. coffea.

∗Radopholus similis

Bán ký sinh

(semi – ectoparasit) và

ngoại sinh

(ectoparasit)

∗Ditylenchus procerus. ∗ Helicotylenchus erythrinea.

∗ Paratylenchus besoekianus, Paratylenchus acrophallus.

∗ Trichodorus christiae, T. monchystera .

∗ Xiphinema mericantum, X.brevicola, X.insigne, X.radicicola

* Ditylenchus procerus.

∗Helicotylenchus erythrinea.

9

1.2.3. Tình hình tuyến trùng hại cây cà phê ở Việt Nam

Việc đẩy mạnh tái canh, thay thế vườn cây già cỗi đang đứng trước

không ít trở ngại cho ngành cà phê Việt Nam do chi phí trong quá trình tái

canh cao, tỷ lệ sâu bệnh nhiều, đặc biệt nghiêm trọng là bệnh tuyến trùng hại

rễ - một trong những khó khăn chính ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất cà

phê trên thế giới. Các nhóm tuyến trùng phổ biến nhất và gây hại nhiều nhất

trên cà phê là Meloidogyne và Pratylenchus. Tại Việt Nam các loài tuyến

trùng Pratylenchus coffea, Meloidogyne spp. và Radopholus arabocoffea

được biết đến là tác nhân chính gây hại cho 24%, 9% and 12% các mẫu rễ cà

phê được phân tích. Tại Việt Nam vào những năm 1970, tuyến trùng

Pratylenchus coffeae đã làm suy yếu và chết hàng loạt các vườn cà phê chè tại

Phủ Quỳ - Nghệ An. Đến năm 1994, hiện tượng vàng lá do các bệnh hại rễ

xuất hiện phổ biến tại một số tỉnh trồng cà phê của tỉnh Đăk Lăk và sau đó là

các vùng trồng khác của Tây Nguyên, gây hại hàng trăm ha cà phê tại Đăk

Lăk. Năm 1997, ở Đăk Lăk có trên 3.000 ha cà phê bị vàng lá, trong đó có

gần 50% diện tích vàng lá do các bệnh hại rễ. Gần đây nhất, trong năm 2008

tại vùng Phủ Quỳ - Nghệ An đã có gần 100ha cà phê chè Catimor được trồng

lại trên đất cà phê được thanh lý cũng đã bị tuyến trùng gây hại và chết hàng

loạt. Tuyến trùng có thể gây tác hại trong thời kỳ vườn ươm nhưng chủ yếu là

ở trên đồng ruộng. Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa

khô thường bị vàng héo, cây bị nặng có thể chết khô ngay ở trên lô trồng.

Triệu chứng của tuyến trùng gây vết thương là làm cho rễ bị sưng u, có những

đường nứt nẻ. Còn tuyến trùng gây nốt sần chỉ ở trên các rễ phụ có những u

dạng nốt sần [13].

Việc phòng trừ nhóm tuyến trùng gây hại rất khó khăn ngay cả khi sử

dụng các biện pháp hóa học, sinh học. Ngoài ra các biện pháp canh tác để hạn

chế nhóm tuyến trùng được sử dụng như việc để đất hoang hóa một thời gian

dài trước khi canh tác mới hay luân canh đều không mang lại hiệu quả cao do

ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập kinh tế của người trồng cà phê. Đây là vấn

đề nan giải đòi hỏi các biện pháp giải quyết triệt để nhằm đảm bảo sự phát

triển ổn định và bền vững của ngành cà phê Việt Nam [14].

10

Các nghiên cứu gần đây cho thấy chất đất và hệ vi sinh vật tồn tại trong

đất là một trong những nguyên nhân cơ bản tác động đến sự phân bố của

tuyến trùng. Số lượng và thành phần của tuyến trùng khác nhau trong các mẫu

đất có đặc điểm khác nhau P. Q. Trinh và đồng sự [15] đã xác định rằng tuyến

trùng thuộc nhóm Meloidogyne spp. được tìm thấy nhiều trong đất sét, trong

khi nhóm tuyến trùng R. Arabocoffeae tập trung chủ yếu trong đất cát và đất

mùn và Pratylenchus spp. tồn tại với số lượng lớn trong đất cát. Nhóm tác giả

này cũng chỉ ra rằng trong điều kiện nhà kính vi khuẩn Pasteuria penetrans

có khả năng hạn chế đáng kể số lượng tuyến trùng trong đất trồng cà phê.

Theo thống kê của Viện Khoa học kỹ thuật nông- lâm nghiệp Tây

Nguyên hiện có khoảng 30% diện tích trồng cà phê đang già cỗi cần phải tái

canh, tập trung chủ yếu tại Đắk Lắk và Lâm Đồng. Đắk Lắk hiện có trên

185.000 ha cà phê, sản lượng hàng năm đạt 380.000 tấn cà phê nhân. Tuy

nhiên, 51% diện tích cà phê ở tỉnh này có độ tuổi trên 15 năm, nên trong 5-10

năm nữa, cây sẽ bị “lão hóa”, hết chu kỳ kinh doanh cho hiệu quả, phải cưa

đốn, phục hồi, hoặc tái canh. Diện tích cà phê già cỗi cần phải trồng thay thế

và chuyển đổi trong 5 - 10 năm tới nếu không sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới năng

suất và chất lượng của cà phê Việt Nam.

Thực tế đã được chứng minh trong thực tiễn sản xuất cà phê ở Đắk

Lắk: Một số diện tích cà phê đã già cỗi hoặc bị sâu bệnh hại đã hủy đi để

trồng lại. Các diện tích này do không được luân canh với những cây trồng

khác mà sau khi nhổ cây cày bừa làm đất lại đem trồng mới cà phê ngay. Hậu

quả là các diện tích này khi bước sang năm thứ 2 thì đã có một số cây vàng

héo rồi chết, sang năm thứ 3 tỷ lệ cây chết tăng lên và cuối cùng phải hủy cả

vườn cây. Một số vườn cây chỉ hủy bỏ một vài cây xấu, bị sâu bệnh đem

trồng cây con cà phê ngay nhưng sau từ 2 đến 3 năm những cây trồng lại này

cũng già cỗi, vàng héo rồi chết.

Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nhiều loại sinh

vật gây hại cho cà phê như tuyến trùng, nấm, rệp sáp, mối…Ngoài ra chế độ

dinh dưỡng và chế độ canh tác cũng ảnh hưởng đến cây cà phê. Để có thể tái

canh bền vững phải phòng trừ được các yếu tố này. Theo Nguyễn Văn Tuất

và cộng sự [16], khi nghiên cứu nguyên nhân gây vàng lá, chết cây ở nhóm cà

11

phê tái canh ở Tây Nguyên đã xác định được tuyến trùng và nấm là nguyên

nhân chủ yếu gây ra bệnh vàng lá, thối rễ ở cây cà phê [16]. Trong đó hai loài

tuyến trùng gây bệnh Paratylenchus cofeae và Meloidogyne sp. là nguyên

nhân đầu tiên xâm nhiễm, sau đó nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia

solani xâm nhập làm bệnh trầm trọng thêm [17].

1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN NỘI SINH THỰC VẬT

1.3.1. Vi khuẩn nội sinh thực vật

1.3.1.1. Định nghĩa

Vi khuẩn nội sinh thực vật ("Endophytic bacteria") hiểu theo nghĩa đen

là vi khuẩn cư trú bên trong cây ("endon" = bên trong; "phyton" = cây). Kể từ

khi phát hiện ra các vi sinh vật nội sinh ở Đức vào năm 1904, các nhà nghiên

cứu đã định nghĩa vi sinh vật nội sinh theo nhiều cách khác nhau, thường là

tuỳ thuộc phương pháp vi sinh vật nội sinh được phân lập và đánh giá.

Hallmann et al. (1997) [18] mô tả vi khuẩn nội sinh là những sinh vật có thể

phân lập được từ các bộ phận đã khử trùng bề mặt của cây hoặc được chiết

xuất từ các nội mô thực vật và không gây thiệt hại cho cây chủ.

Kado (1992) [19] định nghĩa vi khuẩn nội sinh là những "vi khuẩn cư

trú trong mô thực vật sống mà không làm tổn hại đáng kể hoặc đạt được lợi

ích khác ngoài việc đảm bảo cư trú". Định nghĩa này được xem là quá hạn

chế, vì nó loại trừ khả năng các vi khuẩn nội sinh có thể hình thành các mối

quan hệ cộng sinh với kí chủ.

Bacon và White (2000) [20] đã đưa ra một định nghĩa về vi khuẩn nội

sinh thực vật toàn diện hơn và được chấp nhận rộng rãi như sau: "Vi khuẩn

nội sinh thực vật là những vi khuẩn xâm chiếm các mô sống và cư trú ở bên

trong thực vật mà không gây ra bất kỳ tác động tiêu cực tức thời rõ ràng nào".

Khái niệm này sẽ loại trừ các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật.

1.3.1.2. Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh thực vật

Vi khuẩn nội sinh thực vật hiện diện phổ biến trong hầu hết tất cả các

loài thực vật, chúng sống tiềm ẩn hoặc tích cực xâm chiếm nội mô thực vật

một cách cục bộ hoặc hệ thống (Hallmann et al., 1997) [18]. Vi khuẩn nội

12

sinh bắt nguồn từ các cộng đồng vi khuẩn biểu sinh vùng rễ và lá, cũng như từ

hạt hoặc các vật liệu nhân giống vô tính. Nhiều nghiên cứu cho rằng vùng rễ

là nguồn vi khuẩn nội sinh chính, từ đó chúng xâm chiếm vào bên trong mô tế

bào thực vật (Verma et al., 2001 [21], Bressan và Borges, 2004 [22]). Vì vậy,

vi khuẩn nội sinh thường được phát hiện ở rễ với mật độ cao ngay từ những

giai đoạn đầu của sự phát triển (McInroy và Kloepper, 1995) [23].

Rễ được xem là vị trí ưa thích nhất, từ đó vi khuẩn xâm nhập vào bên

trong cơ thể thực vật. Vi khuẩn nội sinh xâm chiếm tế bào nội mô từ các vị trí

như bề mặt rễ, lông hút, chóp rễ và điểm phát sinh rễ bên (Verma et al., 2001)

[21]. Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào cây thông qua các khe hở

tự nhiên như: khí khổng, thủy khổng (hydathode) và các lỗ xốp nhỏ trên mô

thực vật. Hơn nữa, chúng có thể di chuyển một cách hệ thống bên trong cây,

do đó, về mặt lý thuyết có thể dẫn đến tình trạng cân bằng mật độ vi khuẩn

bên trong cây. Sự thật là vi khuẩn nội sinh thường 7 tập trung với mật độ thấp

ở các bộ phận khí sinh có thể là một chỉ thị cho biết điều kiện môi trường ở

các mô này ít thích hợp hơn cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh do sự biến

động trong ngày lớn về nhiệt độ, hàm lượng nước, dinh dưỡng và tia UV.

Ngược lại, hệ thống rễ dường như tạo ra một môi trường sống ổn định hơn

nơi mà nhiệt độ và hàm lượng nước ổn định cho vi khuẩn cư trú (McInroy và

Kloepper, 1995) [23].

Sau khi xâm nhập được vào bên trong cây chủ, vi khuẩn nội sinh sẽ cư

trú ở các ổ nội sinh (endophytic niche). Các ổ nội sinh sẽ bảo vệ vi khuẩn nội

sinh khỏi các tác động xấu từ môi trường, đồng thời giúp chúng xâm chiếm và

thiết lập bên trong tế bào, mô thực vật. Những vi khuẩn nội sinh thường xâm

chiếm khoảng gian bào và được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây như rễ,

thân, lá, quả và kể cả hạt (Oliveira et al., 2013) [24].

1.3.2. Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật

Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật đã được ghi nhận trong nhiều

nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước. Tác dụng và ứng dụng của vi

khuẩn nội sinh thực vật được trình bày tóm tắt trong hình 1.1.

13

Hình 1.1. Tác dụng của vi khuẩn nội sinh thực vật và ứng dụng

(Ryan et al., 2008) [25]

Cơ chế của những tác động có lợi của vi khuẩn nội sinh đối với cây chủ

tương tự như của các vi khuẩn vùng rễ có khả năng thúc đẩy sinh trưởng thực

vật (Compant et al., 2010) [26]. Điều này là do hầu hết các vi khuẩn nội sinh

được phân lập từ nội mô các loài thực vật khỏe mạnh và có thể được xem như

nội sinh không bắt buộc và có khả năng sống bên ngoài mô thực vật như

những vi khuẩn vùng rễ (Di Fiori và Del Gallo, 1995, dẫn theo Lodewyckx et

al., 2002 [27]). Ngoài ra, nhiều chủng vi khuẩn nội sinh cây ngô ngọt và cây

bông vải được ghi nhận là những chủng vi khuẩn vùng rễ phổ biến (McInroy

và Kloepper, 1994) [23]. Vi khuẩn nội sinh thực vật thúc đẩy sinh trưởng của

cây chủ một cách trực tiếp thông qua tăng cường tổng hợp kích thích tố sinh

trưởng thực vật auxin (IAA), tăng hàm lượng các chất khoáng, giúp cố định

đạm sinh học, phân giải lân khó tan, (Jasim et al., 2013 [28], Nguyễn Thị

Huỳnh Như và cs., 2013 [29], Milca et al., 2014 [30]) hoặc gián tiếp thông qua

tăng Nuôi cấy Công nghiệp & y học Tăng trưởng & năng suất Bảo vệ cây trồng

Kiểm soát ô nhiễm & phân hủy sinh học Sản xuất chất kháng bệnh

Pseudomonas sp. Serratia sp. Clavibacter sp. Bacillus sp. Kích thích sinh

14

trưởng cây trồng Hòa tan & hấp thu dinh dưỡng Pseudomonas sp. Enterobacter

sp. Staphylococcus sp. Azotobacter sp. Azopirillum sp. Phenols Chlorophenols

MTBE TCE 2,4 D TNT BTEX Cupriavidus sp. Burkholderia sp.

Herbaspirillum sp. Pseudomonas sp. Kháng sinh, kháng virus, hợp chất miễn

dịch & chống ung thư, thuốc trừ sâu sinh học Serratia sp. Phomopsis sp.

Pseudomonas sp. VSV hữu ích 15 khả năng đối kháng với các tác nhân gây

bệnh, giảm sự thay đổi của thời tiết gây tổn hại cho cây (Ryan et al., 2008)

[25]. Ngoài ra, chúng còn có thể giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm

(Rosenblueth và Martínez-Romero, 2006 [31], Ryan et al., 2008 [25]. Trong

một số trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm của hạt, thúc đẩy

sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi (Chanway, 1997) [32]. Ngoài ra,

vi khuẩn nội sinh còn có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng

hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa

và các hợp chất hữu cơ mới. Vi khuẩn nội sinh cũng có thể có một số tác dụng

có lợi khác như sản sinh siderophore, giúp phần nào thoả mãn nhu cầu về sắt

của cây chủ, giúp cây phòng chống lây nhiễm các mầm bệnh (Murugappan et

al., 2013) [33]. Như vậy, có thể thấy rằng tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn

nội sinh trong sản xuất nông nghệp bền vững là rất lớn.

Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong các loài cây ở Việt

Nam như hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng,

Nguyễn Thị Thu Hà đã phân lập được vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ

chăn nuôi [34], phân lập tuyển chọn chủng Bacillus cho sản xuất phân bón vi

sinh vật chức năng [35]; Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp đã phân

lập được vi khuẩn nội sinh trong cúc xuyến chi (Wedelia Trilobata (L.)

Hitche) bằng kỹ thuật PCR [36]; Văn Thị Phương Như và cộng sư đã phân lập

vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất của tỉnh Phú Yên [37]; Cao

Ngọc Điệp và cộng sự đã phân lập và đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây

Khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh

Thuận, tỉnh Kiên Giang [38,39].

1.3.2. Một số ứng dụng của vi sinh vật trong phòng trừ tuyến trùng

Cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch, bền vững thì các

loại phân bón - thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh học đang

15

được đề cao nghiên cứu và phát triển. Để phòng trừ tuyến trùng gây hại trên cây

trồng có rất nhiều biện pháp như cơ giới, canh tác, hóa học và biện pháp sinh

học. Trong đó, biện pháp sinh học được xem là mang lại hiệu quả, thân thiện, an

toàn với môi trường. Có 2 dạng phòng trừ sinh học (PTSH): (a) PTSH nhân tạo

bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để đưa ra đồng ruộng; (b) PTSH tự

nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch sẵn có trong tự nhiên để hạn chế sự

sinh sản của tuyến trùng mà không cần nhân thả chuyên hóa nào.

Sử dụng thiên định như tác nhân trong phòng trừ sinh học ví dụ như vi

khuẩn Pasteuria penetrans và sinh vật đối kháng. Vi khuẩn Pasteuria

penetrans là loại vi khuẩn ký sinh bắt buộc ở một số tuyến trùng ký sinh

thực vật như các loại ấu trùng của Melodogyne spp., Pratylenchus spp.vv.,

ngoài ra chúng cũng ký sinh ở một số nhóm tuyến trùng sống tự do trong

đất. Tuyến trùng dễ dàng bị nhiễm với vi khuẩn này ở trong đất khi chúng

tiếp xúc với nội bào tử, những nội bào này bám dính trên bề mặt vỏ cutin

của tuyến trùng. Khi đã bị nhiễm vi khuẩn, ấu trùng tuổi 2 của

Meloidogyne xâm nhập vào rễ cây và bắt đầu dinh dưỡng trước khi bào tử

nảy mầm. Khi bào tử nảy mầm thì ống mầm sẽ xâm nhập qua vỏ cutin và

giải phóng các khuẩn lạc dinh dưỡng, các khuẩn lạc này tiếp tục vỡ ra, sinh

sôi nảy nở khắp toàn bộ xoang cơ thể tuyến trùng. Con cái cuối cùng trở

nên chứa đầy bào tử vi khuẩn và trứng. Vi khuẩn Pasteuria penetrans rất

độc và có thể giảm mật độ quần thể tuyến trùng Melodogyne trong chậu

đến 99% trong vòng 3 tuần. Vi khuẩn Pasteuria penetrans có thể tồn tại

một số năm trong đất được làm khô bằng khí mà không hề suy giảm khả

năng sống và bị ảnh hưởng rất ít bởi các điều kiện đất hoặc thuốc phòng trừ

tuyến trùng. Các bào tử dính bám ở nhiều loài tuyến trùng ký sinh thực vật

và thường chỉ 20-30% tạo mầm bệnh và sự dính bám không nhất thiết dẫn

đến nhiễm bệnh. Khi bổ sung đất đã nhiễm bào tử Pasteuria penetrans vào

đất chứa Pratylenchus scribneri làm giảm mật độ quần thể tuyến trùng

bằng 53% trong đất và 63% trong rễ đậu. Nồng độ bào tử và thời kỳ hoạt

động của tuyến trùng trong đất sẽ xác định bằng số lượng tuyến trùng bị

giết. Bào tử vi khuẩn không vận chuyển mà phát tán trong đất nhờ nước

hoặc bằng việc canh tác, làm đất để trồng trọt. Loại vi khuẩn này được xem

16

như một tác nhân sinh học có tiềm năng trong phòng trừ sinh học, nhưng

khả năng thương mại hiện gặp phải khó khăn do chưa có phương pháp sản

xuất sinh khối lớn. Hiệu quả phòng trừ với Pasteuria penetrans chỉ có thể

thành công sau khi làm chậm đáng kể sự phân bố bào tử. Hiện nay danh

sách các loài tuyến trùng bị nhiễm Pasteuria penetrans trên toàn thế giới

đã lên tới 300 loài. Một số kết quả điều tra bước đầu ở Việt Nam cũng cho

thấy có hơn 20 loài tuyến trùng trong tự nhiên bị nhiễm vi khuẩn Pasteuria

penetrans như Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Helicotylenchus spp.,

Rotylenchus reniformis, Tylenchorhynchus dalatensis, Xiphinema spp..

Vi sinh vật đối kháng (antagonist) là các loại nấm và vi khuẩn có khả

năng cạnh tranh chỗ ở hoặc thức ăn (cùng cây chủ) với tuyến trùng và như

vậy chúng có khả năng hạn chế hoạt động và sinh sản của tuyến trùng. Các vi

sinh vật đối kháng đã và đang được nghiên cứu trong PTSH như Trichoderma

viridae gây bệnh thực vật và có khả năng đối kháng hoặc tương hợp với tuyến

trùng tùy loài tuyến trùng, vi khuẩn Pseudomonas fluoresence có khả năng đối

kháng với một số tuyến trùng ký sinh. Thực tế, nhóm vsv đối kháng hiện nay

còn ít được nghiên cứu và chủ yếu còn nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà

chưa có kết quả áp dụng trong sản xuất.

Hiệu quả phòng trừ sinh học phụ thuộc vào các yếu tố sau: Các tác

nhân sinh học bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố môi trường. Mỗi tác

nhân thường có những điều kiện tối ưu về các điều kiện môi trường riêng

biệt như: pH, nhiệt độ, độ ẩm v.v. Vì vậy, việc áp dụng các chế phẩm sinh

học cần thỏa mãn các điều kiện môi trường phù hợp mới đạt hiệu quả.

Ngoài ra, biện pháp phòng trừ sinh học cần có điều kiện bởi sự sinh sản

của tuyến trùng và thời gian tuyến trùng có thể dễ dàng tiếp xúc với tác

nhân sinh học. Tuyến trùng nội ký sinh là đối tượng khó phòng trừ sinh học

do phần lớn thời gian chúng sống bên trong mô thực vật. Hạn chế chính lên

sự phát triển của phòng trừ sinh học là kết cấu đất đảm bảo cho sự tiếp xúc

giữa tác nhân sinh học và tuyến trùng. Các yếu tố nấm sợi được tạo ra bằng

các quần thể vi sinh có thể cản trở sự sinh trưởng và phát triển của các tác

nhân sinh học khi đưa vào đất.

Các chế phẩm sinh học: Các chế phẩm sinh học như vi sinh vật

17

Trichoderma và Nema Săn Tuyến Trùng. Chitosan là hoạt chất được chiết

xuất từ vỏ tôm cua, không độc với người và môi trường. Ngoài tác dụng diệt

tuyến trùng, Chitosan còn cung cấp cho cây một số dưỡng chất, giúp cây

phát triển,kích kháng cho cây trồng.

Vi sinh vật Trichoderma: có tác dụng kháng, làm giảm sự sinh sản

trứng của tuyến trùng, vì thế cần bón nhiều phân chuồng hoại mục có bổ

sung Trichoderma hay Pseudomonas thường xuyên sẽ làm giảm được đáng

kể lượng tuyến trùng.

NEMA Săn Tuyến Trùng: là loại chế phẩm sinh học mới nhất chống

lại tuyến trùng, có khả năng tìm và tiêu diệt tuyến trùng hại cây trồng, sản

phẩm được phối hợp 5 chủng vi nấm Arthrobotrys oligospora, Verticillium

sp, Peacilomyces sp, Paenibacillus chitinolyticus, Bacillus sp. Tác dụng

chính của 5 chủng trong sản phẩm NEMA là chuyên săn mồi, mỗi chủng

được huấn luyện và thích nghi ở 1 điều kiện khác nhau. Nên ở bất kỳ thời

tiết nào vẫn đảm bảo NEMA hoạt động tốt. NEMA Săn tuyến trùng không

gây hại bộ rễ, nó sẽ bảo vệ được sự phát triển tự nhiên của bộ rễ và làm cho

rễ phát triển dài hơn, sâu hơn.

Các enzyme tái tổ hợp có khả năng ức chế tuyến trùng: Một số

enzyme liên quan đến quá trình ký sinh của nấm vào tuyến trùng như

collagenase và protease đóng vai trò quan trọng. Proteases, chitinases và

lysosymes là enzyme sản xuất và tiết ra bởi nấm kí sinh tuyến trùng. Trong

đó vai trò tiềm năng của chitinase trong nấm kí sinh trứng tuyến trùng đầu

tiên được nghiên cứu. Nhiều nghiên cứu cho thấy enzyme chitinase đóng vai

trò rất quan trọng trong đấu tranh sinh học, Chitinase ngoại bào từ các loài

nấm kí sinh tuyến trùng có khả năng phân hủy màng trứng tuyến trùng và

phân hủy vách tế bào của các loài vi nấm gây hại. Nấm kí sinh côn trùng có

khả năng vượt qua hàng rào bảo vệ của côn trùng bằng cách sản xuất ra

nhiều enzyme ngoại bào nhằm phân giải protein và chitin tạo điều kiện

thuận lợi cho quá trình xâm nhập vào lớp biểu bì và gây nhiễm trùng. Ở

tuyến trùng Brugia malayi sử dụng chitinase để phá vỡ lớp vỏ chitin bảo vệ

và lớp niêm mạc để xâm nhập vào cơ thể muỗi kí sinh [7].

18

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ PHÊ

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Mặc dù vi khuẩn nội sinh thực vật đã được nghiên cứu từ rất lâu

nhưng gần đây, chúng mới được chú ý trên cây cà phê và đã thu được những

kết quả ban đầu rất khả quan. Vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở hầu hết các

bộ phận của cây cà phê ở khắp nơi trên thế giới với thành phần rất đa dạng: 87

dòng nội sinh cây cà phê chè ở Colombia, Hawaii và Mexico (Vega et al.,

2005) [40], 200 dòng vi khuẩn nội sinh rễ cà phê vối tại Ethiopia (Mekete et

al., 2009) [41], 18 dòng vi khuẩn nội sinh quả tại Brazil (Miguel et al., 2013)

[42], 217 dòng vi khuẩn nội sinh lá, cành và rễ cà phê chè và cà phê vối ở

Pedreira, Mococa, Pindorama và Brazil (Silva et al., 2012) [43]. Các dòng vi

khuẩn nội sinh phân lập được từ cây cà phê chủ yếu thuộc các chi:

Pseudomonas, Enterobacter, Agrobacterium, Stenotrophomonas và Bacillus,

trong đó chủ yếu là các vi khuẩn Gram (-) (Mekete et al., 2009) [41].

Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh cây cà phê tuỳ thuộc vào chế độ

canh tác của vườn cà phê. Những vườn cà phê thâm canh cao, sử dụng nhiều

phân hoá học và thuốc bảo vệ thực vật hoá học thì tính đa dạng của nhóm vi

khuẩn nội sinh giảm. Ngoài ra, các yếu tố vô sinh như: nhiệt độ, lượng mưa,

hàm lượng hữu cơ trong đất, kỹ thuật canh tác và cải tạo đất cũng ảnh hưởng

đến thành phần và mật độ vi khuẩn nội sinh (Hallmann et al., 1997 [18],

Garbeva et al., 2004 [44], Berg and Hallmann, 2006 [45], Mekete et al.,

2009 [41]. Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh trong quả còn tuỳ thuộc vào

các giai đoạn phát triển khác nhau của quả, đạt cao nhất vào giai đoạn quả

xanh và thấp nhất vào giai đoạn quả chín (Miguel et al., 2013) [42]. Trong

mùa mưa, mật độ vi khuẩn nội sinh cao hơn, đạt 5,2 x 103 - 2,07 x 106

CFU/g rễ tươi) với thành phần đa dạng lên đến 201 dòng; trong khi đó ở

mùa khô, mật độ chỉ đạt 2,7 x 103 - 1,23 x 104 CFU/g rễ tươi và chỉ có 114

dòng (Mekete et al., 2009) [41].

Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh còn phụ thuộc vào hình thức canh

tác, với chỉ số đa dạng Shannon (H) giảm dần theo các hình thức canh tác cà

phê như sau: canh tác tự nhiên, bán tự nhiên, canh tác bán thâm canh và

19

thâm canh cao. Sự khác biệt này chủ yếu là do những khác nhau về các kỹ

thuật canh tác. Nhìn chung, với hình thức canh tác đồn điền lớn, cây cà phê

được thâm canh, tăng cường sử dụng phân và thuốc hóa học, máy móc cơ

giới, do đó ảnh hưởng tiêu cực đến tính đa dạng của nhóm vi khuẩn nội sinh

(Mekete et al., 2009) [41].

Một số chủng vi khuẩn nội sinh đã thể hiện khả năng thúc đẩy sinh

trưởng cây cà phê như Acinetobacter calcoaceticus 161G, 163G, 160G,

150G và Salmonella enteric 109G. Chủng thể hiện khả năng thúc đẩy sinh

trưởng cây cà phê tốt nhất (Escherichia fergusonii 85G) có hoạt tính phân

giải phosphat, tổng hợp siderophores và IAA trong điều kiện in vitro. Những

đặc tính này hứa hẹn tiềm năng của chủng Escherichia fergusonii 85G trong

việc thúc đẩy sinh trưởng phát triển của cây cà phê vì sự hiện diện của các

siderophores (đại thực bào chứa sắt) làm gia tăng hàm lượng sắt dễ tiêu để rễ

hấp thu còn IAA ảnh hưởng trực tiếp đến các bộ phận trên không của cây

(Silva et al., 2012) [43].

Phần lớn các loài vi khuẩn nội sinh quả cà phê phân lập và tái thiết lập

được quần thể bên trong cây cà phê vối đều thuộc chi Bacillus, bao gồm: B.

subtilis, B. megaterium, B. licheniformis, B. cereus và B. thuringiensis.

Đáng chú ý là B. thuringiensis, loài vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất

hiện nay để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, cũng được ghi nhận nội sinh quả

cà phê (Miguel et al., 2013) [42].

Khi nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh rễ cây cà phê, Mekete et al.

(2009) [41] cho biết 33% số chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ rễ cây

cà phê có hoạt tính đối kháng với tuyến trùng nốt sưng M. incognita, trong

đó, đáng chú ý là các loài Bacillus pumilus và B. mycoides có khả năng làm

giảm 39% khả năng sinh sản của tuyến trùng và giảm 33% số bướu rễ gây ra

bởi tuyến trùng Meloidogyne incognita (Mekete et al., 2009) [41]. Những

kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy một số loài vi khuẩn nội sinh cây cà

phê (Bacillus lentimorbus và Bacillus cereus) có tiềm năng trong việc ức chế

khả năng nảy mầm và phát triển của bào tử hạ nấm Hemileia vastatrix gây

bệnh gỉ sắt cà phê (Shiomi et al., 2006 [46], Silva et al., 2012) [43]).

20

Thời điểm chủng vi khuẩn nội sinh cũng là một yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến hiệu quả ức chế các tác nhân gây bệnh. Chủng các vi khuẩn nội

sinh Brevibacillus choshinensis 64R và 137G vào cây cà phê ở thời điểm

72h hoặc 24h trước khi chủng nấm H. vastatrix gây bệnh gỉ sắt đã làm giảm

chỉ số bệnh gỉ sắt lần lượt là 100% và 97% nhưng nếu chủng đồng thời cả vi

khuẩn nội sinh và tác nhân gây bệnh, chỉ số bệnh không giảm (Shiomi et al.,

2006 [46], Silva et al., 2012 [43]). Việc chủng các vi khuẩn nội sinh trước

khi chủng các tác nhân gây bệnh sẽ đảm bảo khả năng xâm chiếm tế bào

biểu mô và nội mô của các chủng thích hợp kích thích tính kháng hệ thống

cảm ứng ISR nhờ làm nhạy cảm các mô, tăng cường cạnh tranh không gian

và dinh dưỡng trên bề mặt lá. Vi khuẩn nội sinh tiêu diệt các tác nhân gây

bệnh thông qua quá trình phân huỷ hoặc ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm

nhờ các chất kháng sinh do vi khuẩn sản sinh.

Trong điều kiện in vitro , ở 24oC, các chủng B. megaterium, A.

radiobacter và C. davisae cho hiệu quả diệt tuyến trùng tuổi 2

Meloidogyne incognita trên 90%. Các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê

như: Agrobacterium radiobacter, Bacillus l icheniform is, B. pumilus, B.

mycoides, B. megaterium, Pseudomonas syringae, Pantoea agglomerans,

Paenibacillus pabuli, Cellulomonas fimi và Pseudomonas coronafaciens

khi được chủng vào cây cà chua đã làm giảm hơn 54% số lượng u sưng trên

rễ gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne incognita. Tuy nhiên, các chủng này

lại không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh trưởng của cây, ngoại trừ P.

coronafaciens có khả năng làm tăng khối lượng thân tươi 51%.

Hiệu quả diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita của các chủng vi

khuẩn nội sinh trong cây cà phê dao động từ 38 - 98%. Trong đó, các chủng

Agrobacterium radiobacter, Bacillus pumilus, B. brevis, B. megaterium, B.

mycoides, B. licheniformis, Chryseobacterium balustinum, Cedecea davisae,

Cytophaga johnsonae, Lactobacillus paracasei, Micrococcus luteus,

Pseudomonas syringae và Stenotrophomonas maltophilia, M. halobius cho

hiệu quả diệt tuyến trùng > 80% trong điều kiện in vitro (Mekete et al.,

2009) [41]. Trong số các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê phân lập được,

chủng Bacillus spp. được coi là tác nhân sinh học tiềm năng để kiểm soát

21

tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. vì chúng sản sinh nội bào tử có khả

năng chịu được điều kiện nóng và khô (Kloepper et al., 2004) [47]. Chủng

Bacillus pumilus và B. mycoides hiệu quả nhất trong việc làm giảm số lượng

khối trứng và u sưng do tuyến trùng M. incognita gây ra trên cây cà chua

trồng trong nhà lưới (33 và 39%, một cách tương ứng) (Mekete et al., 2009)

[41]. Bacillus cereus làm giảm đến hơn 50% số lượng khối trứng và u sưng

gây ra bởi M. incognita, M. javanica và M. arenaria (Mahdy et al., 2000,

dẫn theo Mekete et al., 2009) [41].

Cơ chế đối kháng tuyến trùng của vi khuẩn nội sinh B. pumilus và B.

mycoides được cho là tương tự như đối với các vi khuẩn vùng rễ và nội

sinh khác, bao gồm: giảm khả năng xâm nhập, sản sinh chất kháng sinh

trực tiếp hoặc kháng hệ thống cảm ứng ISR (Sikora et al., 2007) [48].

Trong một tổng hợp gần đây, Kloepper và Ryu (2006) [49] đánh giá B.

pumilus là một trong những vi khuẩn nội sinh quan trọng nhất gây ra kháng

hệ thống cảm ứng đối với nhiều loại bệnh khác nhau. Vi khuẩn nội sinh

kích kháng hệ thống cảm ứng để kiểm soát hiệu quả một số tuyến trùng kí

sinh thực vật như G. pallida và M. incognita (Mekete et al., 2009) [41].

Trong một nghiên cứu khác, B. cereus được ghi nhận là có hiệu quả trong

việc kiểm soát bệnh gỉ sắt cà phê (Vega et al., 2005) [40].

Tuy nhiên, các tác giả chưa ghi nhận được bất kì sự liên hệ nào giữa

các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê có khả năng thúc đẩy sinh trưởng với

các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng đối kháng các tác nhân gây bệnh

(Silva et al., 2012) [43]. Do đó, việc nghiên cứu chủng có đặc tính tốt để sử

dụng là cần thiết nhằm vừa giúp cây sinh trưởng, phát triển tốt vừa khồng

chế tác hại của bệnh.

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại

học Tây Nguyên trong những năm qua đã tiến hành nghiên cứu và phân lập

các chủng vi khuẩn nội sinh trên cả cà phê chè và cà phê vối. Trên cà phê

chè ở Lâm Đồng, Nguyễn Ngọc Mỹ (2012) [50] đã phân lập được 30 chủng

vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ và tuyển chọn được chủng B. cereus

22

M15 là chủng có hoạt tính cố định N và phân giải P cao nhất. Hàm lượng N

và P trong lá cây con cà phê chè khi được xử lý với chủng này tăng 52% và

33,3% so với đối chứng. Kết quả nghiên cứu bước đầu khi chủng nhiễm

chủng vi khuẩn này vào hạt cà phê rồi trồng trong nhà lưới cho thấy các chỉ

tiêu sinh trưởng của cây cà phê chè giai đoạn vườn ươm như: chiều cao cây,

đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với đối chứng.

Trong rễ cây cà phê vối tại Đắk Lắk, 37 chủng vi khuẩn nội sinh cũng

đã được phân lập, trong các đó chủng B. subtilis EK17 và Enterobacter

cloace EK19 được tuyển chọn có khả năng cố định đạm và phân giải lân cao

nhất. Kết quả thử nghiệm bước đầu của các chủng này trên cây con cà phê

vối TR4 cho thấy hàm lượng đạm và lân trong lá cà phê đều cao hơn gấp 1,5

lần so với đối chứng. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cà phê con như: chiều

cao cây, đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với

đối chứng (Trương Vĩnh Thới, 2012) [51]. Ngô Văn Anh và cs. (2017) [52]

đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây cà phê vối. Trong

điều kiện invitro, các dòng Bacillus sp. BMT11 (1,574 μg/ml), B. pumilus

BMT4 (1,493 μg/ml), Bacillus sp. BMT8 (1,474 μg/ml), BH8 (1,434 μg/ml),

Bacillus cereus BMT7 (1,399 μgm/l) và Bacillus sp. Cư8 (1,372 μg/ml) có

hoạt tính cố định đạm cao nhất. Các dòng có hoạt tính phân giải lân cao nhất

là Bacillus sp. BMT11 (12,25 μg/ml), Bacillus sp. Cư8 (11,46 μg/ml) và

Cư2 (11,25 μg/ml). Ngoài ra, các chủng này còn có khả năng sinh tổng hợp

IAA khá cao: Bacillus sp. BMT11 (9,048 μg/ml), BH8 (8,876 μg/ml),

Bacillus sp. Cư8 (8,153 μg/ml), B. pumilus BMT4 (5,624 μg/ml).

Tóm lại, vi khuẩn nội sinh đóng vai trò quan trọng đối với sự sinh

trưởng và phát triển của thực vật do chúng có những đặc tính tốt như có khả

năng cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ

tốt chất dinh dưỡng, sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng, tăng hàm

lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất

gây ô nhiễm môi trường. Do đó, việc nghiên cứu chúng để sản xuất phân vi

sinh ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp bền vững là vấn đề đang được

quan tâm hiện nay.

23

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 nằm trong bộ sưu tập

của phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Đây là

chủng vi sinh vật nội sinh được phân lập từ rễ cây cà phê thu tại tỉnh Đăk Lăk,

đã được định danh bằng 16S (là kết quả nghiên cứu của đề tài mã số

TN16/C02 thuộc chương trình Tây Nguyên giai đoạn 2016-2020).

- Cây cà phê in vitro do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công

nghệ sinh học cung cấp

- Tuyến trùng Meloidogyne incognita ký sinh gây hại trên cây cà phê

2.2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Thời gian nghiên cứu: Từ 15/08/2018 đến 30/08/2020

- Địa điểm thu mẫu: Các mẫu đất, rễ, tuyến trùng đã được thu thập tại

vùng trồng cà phê bao gồm: Lô 8, vùng 36, đội 4 Eapok; Lô 3 vùng 51, đội 3

Eapok; Lô 4 vùng 19, đội 4 Eapok, Lô 2 vùng 51, đội 3 Eapok; Lô 1, vùng 6,

tái canh 2012 Eapok, Đăk Lăk.

- Địa điểm tiến hành thí nghiệm trồng cà phê ngoài đồng ruộng: Thí

nghiệm được tiến hành tại hộ gia đình ông: Nguyễn Quốc Bình, số CMND:

250568156. Địa chỉ: Tổ 7, xóm Sóc Sơn, xã Nam Hà, huyện Lâm Hà, tỉnh

Lâm Đồng.

- Thí nghiệm phân lập, đánh giá khả năng diệt tuyến trùng, đánh giá

hoạt tính: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy,

Hà Nội.

2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nội dung 1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn nội sinh

Bacillus megaterium 18

24

- Nội dung 2: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng trên cây cà phê của

chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18

- Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với cây cà

phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18

2.4. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.4.1. Thiết bị chính

Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo

pH, Metter Toledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ);

máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng

ướt (Trung Quốc); tủ sấy khô (Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD;

lò vi sóng; ống đong: 100 ml, 500 ml, 1000 ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml,

1000 ml, 2000 ml; máy sục khí; các dụng cụ khác …

2.4.2. Hóa chất chính

Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merch -

Đức); thạch (Merck- Đức); bột xenluloza (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại

đường: D-glucoza, saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô

cơ khác: NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3 …

+ Bộ kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB

2.4.3. Môi trường nuôi cấy

Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất

1.000ml.

Môi trường gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở

121oC trong 20 phút.

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật [53]

2.5.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa cua các chung vi

khuẩn

Đặc điểm hình thái

25

Đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi

điện tử và được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh bảo vệ

Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.

Nhuộm Gram vi khuẩn [53]

Xác định xem các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ

vào màu thuốc nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn bắt màu

hồng là Gr (-), màu tím là Gr (+).

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Kha năng sinh tổng hợp enzym

Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ

sung thêm 1% tinh bột. Nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc

thử Lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng

phân giải xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh trưởng [6].

Thủy phân xenluloza: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1%

bột giấy. Nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu

vi khuẩn có khả năng thủy phân xenluloza chúng sẽ tạo vòng phân giải

xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh trưởng.

Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng,

nuôi ở nhiệt độ 30oC, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4oC để trong 2 giờ.

Sau 2 giờ môi trường trong ống nghiệm không bị đông lại chứng tỏ chủng đó

có khả năng làm loãng gelatin.

Kha năng sư dung các nguồn đương, cacbon [5].

Nuôi vi sinh vật trên môi trường có bổ sung 1% nguồn đường, cacbon.

Xác định khả năng phát triển của chúng bằng chỉ số OD620 nm.

Kha năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH

Thay đổi nồng độ NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ, pH khác nhau.

Theo dõi khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số OD620 nm.

26

2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố anh hưởng đến sinh trưởng cua

vi khuẩn [53]

+ Ảnh hưởng cua thơi gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay

đổi môi trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sự thay đổi của các tế bào vi

sinh vật. Vì vậy, sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng

thời điểm lượng enzym sinh ra cũng khác nhau. Tiến hành thí nghiệm bằng

cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MPA, nuôi ở 37oC, điều kiện lắc

200 vòng/phút trong 60 giờ. Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng

sinh trưởng (OD620 nm).

+ Ảnh hưởng cua nhiệt độ: Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể.

Sau đó, cấy các chủng vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã

vô trùng và để ở các thang nhiệt độ: 25; 30; 35; 45; 55. Sau 48 giờ nuôi cấy,

xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm).

+ Ảnh hưởng cua pH: Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3;

4; 5; 6; 7; 8; và 9. Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37oC, sau 48 giờ xác định khả năng

sinh trưởng bằng cách đo OD620 nm.

+ Ảnh hưởng cua nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường

MPA sau đó bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1;

3; 5; 7; 9 và 11 nuôi ở 37 oC trong 48 giờ. Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số

(OD620nm).

+ Ảnh hưởng cua nguồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên

sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của các chủng vi sinh vật được tuyển

chọn trên các nguồn cơ chất khác nhau. Trên môi trường cơ sở có bổ sung

tinh bột, CMC-Na, glucoza, saccaroza, lactoza, rỉ đường.Vi khuẩn nuôi cấy

trên môi trường MPA trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh

trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm).

+ Ảnh hưởng cua nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi

trường cơ sở có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao

thịt, KNO3 và (NH4)2SO4. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong

27

48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng

chỉ số (OD620nm).

2.5.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym

Phương pháp đường khử: Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ:

0.5; 1; 1.5; 2; 3 (mg/ml). Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ

đến khi xấp xỉ nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng

bằng 1 ml). Bổ sung 1 ml cơ chất, mix đều và ủ ở 37oC trong 10 phút, sau đó

thêm 3 ml DNSA, mix đều rồi đun sôi các mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S

cùng nhau (khoảng 30 phút). Sau đó làm lạnh bằng cách ủ vào đá rồi đo OD

(540 nm). Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu tiếp.

Công thức pha hóa chất: Spectro zero: 1 ml cơ chất, 1 ml đệm, 3 ml

DNSA. Đường chuẩn: 1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 0,5 ml đường. Enzym blank:

1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 1 ml enzym. Đệm PBS 6,8: (a): NaH2PO4 0,2 M:

cân 27,8 g và định mức đến 1.000 ml, (b) NaH2PO4.7H20 0,2 M: cân 53,05 g

và định mức đến 100 ml, dung dịch đệm bằng tổng của 51 ml (a) và 49 ml (b)

định mức đến 200 ml. DNSA: DNSA 10,6 g, NaOH 19,8, Na2S2O5 8,3 g, N-

K-tatarat 306 g, phenol 7,6 ml. Kết quả thu được áp vào đường chuẩn hình

2.1 tính hoạt độ chitinase.

y = 2.8096x + 0.1064

R2 = 0.9982

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Đồ thị đường chuẩn glucose (mg/ml)

OD

540nm

Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld [54]

28

2.5.2. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với thực vật của

chủng Bacillus megaterium 18

Do thời gian sinh trưởng của cây cà phê khá dài (ít nhất 6 tháng) do vậy

tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sinh trưởng đối với thực vật của chủng

Bacillus megaterium 18 trên cây thuốc lá (thời gian sinh trưởng giai đoạn cây

con đến khi xuất vườn là từ 40-60 ngày) nhằm đảm bảo tiến độ thực hiện luận

văn.

2.5.2.1. Đánh giá anh hưởng cua chung Bacillus megaterium 18 đến sinh

trưởng cây thuốc lá

Hạt thuốc lá sau khi khử trùng được ủ nhiễm với dung dịch vi khuẩn

B.megaterium 18 mật độ quang OD đạt 0,6-1,0 trong thời gian 2 giờ. Hạt

thuốc lá sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng và đặt lên môi trường

½ MS (Murashige và Skoog, 1962) đặc có bổ sung sucrose 10 g/L [55]. Hạt

nảy mầm được quan sát hàng ngày, các chỉ tiêu về sinh trường như số lá,

chiều dài rễ, chiều dài thân được đo 2 tuần 1 lần. Mỗi công thức thí nghiệm

được thực hiện trên 5 cây cà phê.

Các chỉ tiêu theo dõi được đo đếm như sau:

+ Chiều dài thân (cm): đo từ gốc cây cà phê đến đỉnh sinh trưởng của cây

+ Số cặp lá (cặp lá/cây): đếm toàn bộ số cặp lá trên cây

+ Chiều dài rễ (cm): đo bằng thước có khắc vạch, chính xác đến mm.

2.5.2.2. Đánh giá anh hưởng cua chung vi sinh vật nội sinh Bacillus

megaterium 18 đến sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vươn ươm.

Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus

megaterium 18 đến sinh trưởng phát triển cây cà phê được triển khai tại

phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thí nghiệm được tiến hành theo phương

pháp như sau: tiến hành lây nhiễm vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium

18 vào cây cà phê in vitro (cây gieo hạt, 20 ngày tuổi) bằng cách nuôi cấy các

cà phê này trên môi trường thủy canh có bổ sung chế phẩm chủng vi sinh vật

nội sinh Bacillus megaterium 18 với nồng độ 1% trong 28 ngày. Theo dõi các

29

chỉ tiêu về chiều cao thân, số cặp lá mới mọc/cành, chiều dài rễ chính và số rễ

nhánh của cây như sau:

+ Chiều cao thân (cm): đo từ gốc cây cà phê đến đỉnh sinh trưởng của cây

+ Số cặp lá mới mọc/cành (cặp lá/cành): đếm toàn bộ số cặp lá mới

mọc/cành

+ Chiều dài rễ chính (cm): đo bằng thước có khắc vạch, chính xác đến mm

+ Số rễ nhánh (n): đếm toàn bộ số rễ nhánh trên cây.

Sau 28 ngày kiểm tra những cây cà phê nào có nồng độ vi sinh vật nội

sinh đạt 102 thì được lựa chọn để trồng vào các công thức thí nghiệm như sau:

- Công thức Đối chứng (ĐC): Cây cà phê không được lây nhiễm vi sinh

vật nội sinh Bacillus megaterium 18, sau đó được trồng trên đất và không bổ

sung phân bón;

- Công thức Thí nghiệm 1 (TN1): Cây cà phê không lây nhiễm vi sinh

vật nội sinh Bacillus megaterium 18. Sau đó được bón phân hóa học và chăm

sóc theo quy trình của ngành nông nghiệp 10TCN 478-2001 và cẩm nang

khuyến nông của sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Đắk Lắk.

- Công thức Thí nghiệm 2 (TN2): Cây cà phê đã được lây nhiễm vi sinh

vật nội sinh Bacillus megaterium 18, sau đó được trồng trên đất nhưng không

được bón phân hóa học mà sử dụng chế phẩm vi sinh vật Bacillus megaterium

18 với nồng độ 1g/100g đất và phun bổ sung chế phẩm này với nồng độ 1%,

cách phun ướt đẫm lá cây cà phê, phun trong 28 ngày.

Theo dõi các chỉ tiêu về chiều cao cây và số cặp lá/cây của cây cà phê

sau 3, 6 và 9 tháng trồng trong vườn ươm.

2.5.2.3. Đánh giá anh hưởng cua chung Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng

cây cà phê giai đoạn cây con và giai đoạn cây 1,5 tuổi

Cây cà phê

* Đối tượng nghiên cứu:

- Cây cà phê vối (Robusta); Tuổi cây cà phê 1,5 năm tuổi, cây đang

mang quả bói; tán lá cây phủ rộng > 0,5m.

30

- Thí nghiệm được thực hiện trên 20 cây cà phê/ công thức thí nghiệm,

các cây cà phê được trồng đồng đều nhau với khoảng cách 3m x 3m (tương

đương với mật độ trồng trung bình là: 1110 cây/ha).

- Chăm sóc về phân bón: Ở cả 2 công thức đều có cùng chế độ chăm

sóc bón phân hữu cơ và phân NPK như nhau theo quy trình tái canh cây cà

phê vối cụ thể như sau:

TT Phân hữu cơ ủ (kg/cây) Phân bón NPK nhả chậm

(kg/cây)

Tháng 5 - 0,3 kg/cây

Tháng 6 0,5 - 0,6kg/cây -

Tháng 7 - 0,3 kg/cây

Tháng 8 0,5 - 0,6kg/cây -

+ Đối với công thức đối chứng: Không bổ sung chế phẩm vi sinh vật nội

sinh trong suốt quá trình theo dõi thí nghiệm.

+ Đối với công thức thí nghiệm: Có sử dụng chế phẩm Vi sinh vật nội

sinh bón cho cây cà phê với lượng là: 0,5kg/cây vào tháng 7 của quá trình

theo dõi thí nghiệm.

* Địa điểm thực hiện thí nghiệm:

- Tại hộ gia đình ông: Nguyễn Quốc Bình, số CMND: 250568156;

- Địa chỉ: Tổ 7, xóm Sóc Sơn, xã Nam Hà, huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng.

+ Thời gian thực hiện thí nghiệm: 03 tháng, từ ngày 02 tháng 07 năm

2019 đến ngày 02 tháng 10 năm 2019.

* Phương pháp nghiên cứu.

- Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển:

Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện trên 20 cây cà phê. Các chỉ

tiêu về sinh trưởng, phát triển được theo dõi ở 15 cây cà phê trong thí nghiệm

(trừ bỏ 5 cây cà phê không thu số liệu là các cây cà phê tiếp giáp giữa công

31

thức thí nghiệm và công thức đối chứng). Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát

triển được theo dõi như: số cành/cây; chiều dài cành; số lá trên cành.

+ Số cành/cây: mỗi cây cà phê theo dõi được đếm toàn bộ số cành cấp

1 có trên cây.

+ Chiều dài cành: trên mỗi cây theo dõi đánh dấu cành số 3 và cành số

5 (tính từ ngọn xuống), tiến hành đo chiều dài cành (cm) tính từ đỉnh sinh

trưởng vào thân cây của các cây cà phê ở mỗi công thí nghiệm.

+ Số cặp lá/cành: tiến hành đếm toàn bộ số cặp lá có trên cành số 3 và

cành số 5 của các cây cà phê ở các công thức thí nghiệm.

2.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU

Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học

trên phần mềm excel năm 2017. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa

trên công thức thống kê:

Giá trị trung bình(X): X = I;

Độ lệch chuẩn (δ): δ = ; Sai số (m):

32

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng Bacillus

megaterium 18 được xác định khi nuôi cấy trên môi trường MPA, ở nhiệt độ

37oC, sau 48 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc và hình ảnh tế bào được chụp tại

Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương.

(a) (b)

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng Bacillus megaterium 18

(a): Hình thái khuẩn lạc của chủng Bacillus megaterium 18 trên đĩa thạch

(b): Hình thái tế bào chủng Bacillus megaterium 18 ở độ phóng đại x 5000

Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Bacillus

megaterium 18 cho thấy chủng nghiên cứu có tế bào hình que dài, kích thước

từ 1 ÷ 3 µm. Hình thái tế bào có khuẩn lạc lồi, không bóng, nhầy, hơi nhăn.

Dựa trên một số đặc điểm hình thái (Hình 3.1) cho thấy chủng Bacillus

megaterium 18 trong nghiên cứu này có đặc điểm khuẩn lạc và tế bào tương

tự như trong các nghiên cứu của Holt et al. (1994) [56] và Lee et al. (2017)

[57] về đặc điểm của dòng Bacilus sp.

3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Chủng Bacillus megaterium 18 cấy sau 24 giờ trên thạch nghiêng, lấy

2÷3 vòng que cấy hoà tan vào nước muối sinh lý, dùng pipet vô trùng hút 2

33

ml từ nước muối sinh lý đã có vi sinh vật vào môi trường API 50 CHB, lắc

đều. Dùng pipet hút dịch từ môi trường API 50 CHB cho vào các chíp (vạch

1), nhỏ parafin khoảng 5÷6 giọt cho đầy. Nuôi 37oC, sau 24 giờ và 48 giờ ghi

kết quả. Trong suốt quá trình nuôi cấy, các đường lên men tạo thành axit làm

giảm pH, được nhận biết bằng sự đổi màu chất chỉ thị. Kết quả được trình bày

tại bảng 3.1

Bảng 3.1. Khả năng lên men sinh axit từ các nguồn cơ chất của chủng

vi khuẩn Bacillus megaterium 18 dựa trên kít chuẩn API 50CHB

TT Đặc điểm B. megaterium TT Đặc điểm B. megaterium

1 Glycerol + 26 Salicin +

2 Erythritol - 27 Cellobiose +

3 D-Arabinoza - 28 Maltoza +

4 L- Arabinoza + 29 Lactoza ±

5 Ribose + 30 Melibiose +

6 D-Xyloza + 31 Sucroza +

7 L-Xyloza - 32 Trehalose +

8 Adonitol - 33 Inulin ±

9 β-Methylxylosit - 34 Melezitose -

10 Galactoza + 35 D-Raffinose +

11 D-Glucoza + 36 Tinh bột +

12 D-Fructoza + 37 Glycogen +

13 D-Mantose - 38 Xylitol -

14 L-Sorbose - 39 β-Gentiobiose ±

15 Rhamnoza - 40 D-Turanose ±

16 Dulcitol - 41 D-Lyxose -

17 Inositol ± 42 D-Tagatose -

18 Mannitol + 43 D-Fucose -

19 Sorbitol - 44 L-Fucose -

20 α-Methyl-D-mannosit - 45 D- Arabitol -

21 α-Methyl-D-glucosit - 46 L- Arabitol -

22 N-Axetylglucosamin + 47 Gluconate -

34

23 Amygdalin + 48 2-Ketogluconate -

24 Arbutin + 49 5-Ketogluconate -

25 Aesculin +

Chủng Bacillus megaterium 18 có khả năng lên men 12 loại đường trên

tổng số 49 loại đường và thử nghiệm để tạo thành axit là glycerol, L-

arabinose, Galactose, D-glucose, N-Acetylglucosamine, Arbutin, Aesculin,

Cellobiose, Melibiose, Sucrose, D-Raffinose và tinh bột.

3.1.3. Khả năng phân giải cơ chất của chủng nghiên cứu

Khả năng phân giải CMC của chủng Bacillus megaterium 18

Chủng Bacillus megaterium 18 được xác định khả năng phân giải cơ

chất là CMC và tinh bột: Môi trường MPA có bổ sung CMC và tinh bột 1%

khử trùng ở 0,8 atm trong 30 phút, sau đó đổ ra đĩa petri. Sử dụng phương pháp

cấy chấm điểm trên đĩa, mẫu ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. Sau đó nhuộm màu

bằng thuốc thử Lugol. Kết quả hình 3.1 cho thấy vi khuẩn có hoạt tính thủy

phân xenluloza và tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh

trưởng và đã được đo vòng phân giải có đường kính trung bình đạt 18mm.

Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của chủng vi khuẩn

Khả năng làm loãng gelatin của chủng Bacillus megaterium 18

35

Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium 18 nghiên cứu được cấy trong môi

trường MPA lỏng bổ sung 10% gelatin, nuôi ở nhiệt độ 37oC. Sau 2 ngày,

trước khi quan sát giữ mẫu ở 20oC trong khoảng 4 giờ, kiểm tra kết quả với vi

khuẩn. Dịch môi trường loãng chứng tỏ chủng có khả năng làm loãng gelatin.

Hình 3.3. Khả năng làm loãng gelatin của chủng Bacillus megaterium18

Kết quả được trình bày ở hình 3.3 cho thấy chủng Bacillus megaterium

18 sau 2 ngày cấy lên môi trường có khả năng làm loãng hoàn toàn so với ống

nghiệm đối chứng không cấy vi sinh vật.

3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng

Bacillus megaterium 18

3.1.4.1. Ảnh hưởng cua thơi gian đến sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase

cua chung vi khuẩn nghiên cứu

* Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn

Thời gian là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của bất cứ loài vi sinh

vật nào, thời gian nào là thời điểm vi sinh vật sinh trưởng mạnh nhất tùy

thuộc vào mỗi loài. Chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường

36

MPA, nhiệt độ 37oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút. Sau khi cấy giống thu mẫu

6 giờ một lần, tiến hành xác định khả năng sinh trưởng bằng cách đo OD với

bước sóng 620 nm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của chủng

Bacillus megaterium 18 theo thời gian

Thời gian (giờ) Khả năng sinh

trưởng (OD620nm)

Khả năng sinh

enzyme(IU/ml)

6 0,59 0,12

12 0,61 0,45

18 0,99 1,14

24 1,01 1,62

30 2,89 2,2

36 2,01 2,6

42 1,85 1,6

48 1,59 1,5

Kết quả bảng 3.2 cho thấy thời gian tối ưu cho sinh trưởng của chủng

vi khuẩn là 30 giờ, OD chủng đạt 2,89. Từ 6 ÷ 30 giờ các chủng sinh trưởng

rất nhanh. Từ 30 giờ trở đi sinh trưởng của các chủng nghiên cứu giảm dần.

* Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp chitinase của các chủng

vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi trong môi trường MPA lỏng có

bổ sung 0,1% CMC, nuôi 37oC, lắc 200 vòng/phút. Lấy mẫu dịch nuôi cấy cứ

sau 6 giờ một lần, bảo quản dưới 0oC để vi khuẩn không tiếp tục sinh trưởng.

Sau khi kết thúc tiến hành làm đường khử xác định hoạt tính chitinase của các

chủng nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 cho thấy chủng vi khuẩn

sau 6 giờ nuôi cấy, lượng enzym sinh ra tăng liên tục nhưng tương đối khác

nhau. Chủng sau 6 ÷ 24 giờ khả năng sinh tổng hợp chitinase tăng, tiếp tục tăng

nhanh từ 30 ÷ 36 giờ, lượng enzym sinh ra nhiều nhất tại thời điểm sau 36 giờ,

đạt 2,6 IU/ml. Sau 36 giờ lượng enzym sinh ra của chủng giảm.

37

3.1.4.2. Ảnh hưởng cua nhiệt độ nuôi cấy đến kha năng sinh trưởng và sinh

tổng hợp chitinase cua chung vi khuẩn

* Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của

vi khuẩn

Nhiệt độ là một yếu tố tác động trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn, mỗi chủng có một khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau.

Khả năng chịu được nhiệt độ cao là một trong những tiêu chí quan trọng trong

ứng dụng xử lý. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở dải nhiệt

độ: 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55 và 60oC. Các chủng vi khuẩn nuôi trên môi

trường MPA, lắc 200 vòng/phút. Sau 48 giờ nuôi cấy chúng tôi tiến hành

đánh giá sự sinh trưởng.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzym

của chủng Bacillus megaterium 18

Nhiệt độ (˚C) Khả năng sinh

trưởng (OD620nm)

Khả năng sinh

enzyme (IU/ml)

25 0,592 0,12

30 3,619 0,55

37 4,99 1,54

40 4,01 1,92

45 2,89 2,3

50 2,1

55 1,6

60 1,5

Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn có khả năng chịu được nhiệt độ khá

cao, ở nhiệt độ 25 ÷ 30oC và lớn hơn 50oC. Ở 55 ÷ 60oC chủng sinh trưởng yếu.

* Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của

chủng vi khuẩn

Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng, nó quyết định sự sinh trưởng và sinh

tổng hợp enzym của các chủng vi sinh vật. Thông thường ở nhiệt độ nào mà

vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất thì sẽ sinh enzym thủy phân cơ chất có trong

môi trường cao nhất. Tuy nhiên cũng có chủng vi khuẩn mặc dù ở nhiệt độ

38

sinh trưởng tốt nhưng lại không sinh tổng hợp enzym cao ở nhiệt độ đó. Vì

vậy, để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh chitinase, chủng

Bacillus megaterium 18 được nuôi trong môi trường MPA, lắc 200 vòng/phút

và nuôi ở các dải nhiệt độ 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55 và 60oC. Sau 54 giờ nuôi

cấy tiến hành lấy kết quả.

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy dải nhiệt độ sinh tổng hợp chitinase của

chủng Bacillus megaterium 18 từ 37 ÷ 50oC và nhiệt độ sinh tổng hợp

chitinase tối ưu là 45oC, chủng có hoạt tính đạt 2,3 IU/ml. Nếu nhiệt độ nuôi

cấy dưới 37oC và cao hơn 50oC thì khả năng sinh chitinase của chủng đều

giảm. Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh

tổng hợp chitinase cho thấy chủng lựa thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm.

3.1.4.3. Ảnh hưởng cua pH môi trương đến kha năng sinh trưởng và sinh

tổng hợp chitinase cua chung vi khuẩn

* Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus

megaterium 18

pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của các vi sinh vật,

đặc biệt đối với vi khuẩn. Các ion H+, OH- là hai ion có tác động lớn nhất đến

hoạt động của vi sinh vật, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng

cũng có ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật. Với mục tiêu chọn chủng

có khả năng phân giải xenluloza để xử lý nước thải thì chủng vi sinh vật có

khả năng tồn tại ở dải pH rộng là rất cần thiết. Chủng nghiên cứu được nuôi

trong môi trường MPA lỏng, nhiệt độ 37oC, lắc 200 vòng/phút và dải pH môi

trường là: 3; 4; 5; 6; 7; 8 và 9., bằng cách cho thêm NaOH 1N hoặc HCl 1N

và đo bằng máy đo pH 320 pH Metter. Nuôi trong thời gian 48 giờ thu dịch

đo OD620 nm kiểm tra sinh trưởng của chủng.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của

chủng vi khuẩn

pH 3 4 5 6 7 8 9 10

Khả năng sinh

trưởng (OD620nm)

0,103 0,155 0,645 0,925 1,2 0,66 0,575 0,179

Kết quả trên cho thấy chủng Bacillus megaterium 18 có thể sinh trưởng ở

dải pH rộng 3 ÷ 9, pH tối ưu của chủng ở pH 7, khả năng sinh trưởng OD đạt 1,2

khi giá trị pH <5 và ≥ 9 thì tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn bị yếu đi.

39

3.1.4.4. Ảnh hưởng cua nồng độ NaCl đến sinh trưởng cua các chung vi khuẩn

Ba chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường MPA nhưng thay thế

nồng độ NaCl từ 0,3% bằng dải nồng độ 1, 3, 5, 7, 9 và 11%, nuôi ở 37oC, lắc

200 vòng/phút, sau 48 giờ nuôi cấy lấy mẫu xác định sinh trưởng bằng

phương pháp đo mật độ quang OD620 nm.

Bảng 3.5. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh

trưởng của chủng vi khuẩn

Nồng độ NaCl % 1 3 5 7 9 11

Khả năng sinh trưởng

(OD620mm)

3,08 2,26 1,66 0,98 0,56 0,22

Kết quả trình bày trên cho thấy ở nồng độ 1 ÷ 5% chủng sinh trưởng

tốt, từ 7% NaCl các chủng sinh trưởng yếu và gần như không sinh trưởng ở

nồng độ 9 ÷ 11%.

3.1.4.5. Ảnh hưởng cua các nồng độ cacbon, nitơ đến kha năng sinh

trưởng và phát triển cua chung vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium18

a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Trên cơ sở môi trường MPA đã lựa chọn, thay đổi nguồn cacbon khác

nhau. Glucose, rỉ đường, saccharose, CMC, đối chứng để xác định mức độ

ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh trưởng và hình thành chất

kháng nấm chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến khả năng sinh chất

kháng sinh của chủng Bacillus megaterium 18

Nguồn cacbon Khả năng sinh

trưởng (OD620nm) Nguồn nitơ

Khả năng sinh

trưởng (OD620nm)

Glucose 3,885 KNO3 7,36

Rỉ đường 3,495 (NH4)+ 4,665

Saccharose 4,34 Pepton 3,18

CMC 3,285 Cao men 5,1

Đối chứng 2,7 Cao thịt 4,86

40

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy, trong các nguồn cacbon sử

dụng chủng Bacillus megaterium 18 nội sinh phát triển trong môi trường có

nguồn cacbon là saccharose cho các nghiên cứu tiếp theo.

b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 5 nguồn nitơ khác nhau như: KNO3.

(NH4)+, pepton, cao malt, cao thịt. Kết quả nghiên cứu thể hiện qua Bảng 3.6.

Chủng Bacillus megaterium 18 phát triển tốt nhất trên môi trường

tuyển chọn với nguồn nitơ là KNO3. Như vậy, trong các nguồn nitơ sử dụng

chủng Bacillus megaterium 18 phát triển trong môi trường có nguồn nitơ là

KNO3 cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tóm lại, chủng Bacillus megaterium 18 có thời gian sinh trưởng tối ưu

là 30 giờ, thời gian sinh tổng hợp chitinase ở 36 giờ lượng enzyme sinh ra

nhiều nhất; chủng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ từ 25-30oC, nhiệt độ sinh tổng

hợp chitinanse tối ưu ở 45oC; môi trưởng nuôi cấy thích hợp ở pH7, bổ sung

nồng độ NaCl 1%, môi trường có bổ sung nguồn cacbon là saccharose và

nguồn nito KNO3 chủng sinh trưởng tốt nhất.

3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG CỦA CHỦNG

Bacillus megaterium 18 Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Chủng Bacillus megaterium 18 được nuôi trên môi môi trường và điều

kiện lên men đã lựa chọn, sau 24 giờ, dịch nuôi cấy được thử nghiệm sơ bộ

khả năng kháng tuyến trùng.

Thí nghiệm được tiến hành ở 3 công thức với 3 nồng độ vi khuẩn khác

nhau là 10, 20, 30%. Mỗi công thức gồm 3 đĩa petri đường kính 35 cm. Mỗi

đĩa petri có 300 trứng tuyến trùng Meloidogyne incognita. Theo dõi tỷ lệ

trứng nở sau 7 ngày. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Thử nghiệm khả năng

tiêu diệt ấu trùng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18 trong

phòng thí nghiệm theo phương pháp Yoon et al. (2012) [58].

41

Bảng 3.7. Khả năng kháng tuyến trùng sau 24 giờ nuôi cấy trong phòng

thí nghiệm

Nồng

độ

VK

(%)

Số

lượng

trứng

ban

đầu

Tỷ lệ

(%)

trứng

nở sau

7 ngày

Nhận xét

Số

lượng

ấu

trùng

ban

đầu

Tỷ lệ

(%) ấu

trùng

sống

sau 7

ngày

Nhận xét

10 300 5,8 VSV phát triển,

trứng bị phân hủy

nhiều, ấu trùng nở ra cũng bị chết và

phân hủy, ấu trùng

chết kiểu bị co rút

cơ thể

250 28 Không có hiện

tượng ký sinh,

tỷ lệ ấu trùng chết cao, ấu

trùng chết

kiểu bị độc, cơ

thể bị co rút

20 300 4,2 250 22,3

30 300 5,8 250 15

ĐC 300 92,5

Ấu trùng nở ra vẫn

hoạt động bình

thường

250 100

Lượng ấu

trùng sống sót

còn nguyên

Hình 3.4. Ảnh thử nghiệm khả năng ức chế trứng nở sau 7 ngày của chủng vi

khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ 10%

42

Hình 3.5. Ảnh thử nghiệm khả năng giết chết ấu trùng sau 7 ngày của chủng vi

khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ 10%

Bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy, sau 7 ngày thí nghiệm, tỷ lệ trứng nở ở

công thức đối chứng có sự khác nhau rõ rệt so với các công thức ở các nồng

độ vi khuẩn khác nhau, nhưng ở tỷ lệ trứng ở giữa các công thức ở các nồng

độ khác nhau thì không có sự sai khác nhiều. Tỷ lệ trứng nở ở công thức đối

chứng là 92,5%, trong khi đó, ở các nồng độ vi khuẩn từ 10-30% tỷ lệ trứng

nở rất ít chỉ từ 4,2 đến 5,8%. So sánh với thử nghiệm khả năng ức chế trứng

nở của nấm Paecilomyces javanicus sau 120h, ở nồng độ 5% tỷ lệ trứng nở là

11,8%, và 3.8% ở nồng độ 20% (L. T. M. Linh và cs, 2015) [59] cho thấy vi

khuẩn có hoạt tính ức chế nở trứng tuyến trùng Meloidogyne incognita.

Bảng 3.7 và hình 3.5 cho thấy, tỷ lệ sống sót của ấu trùng giữa công

thức có vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 có sự khác nhau rất nhiều

so với đối chứng. Ở các công thức có bổ sung vi khuẩn nội sinh Bacillus

megaterium 18 ở các nồng độ từ 10-30%, tỷ lệ ấu trùng bị chết từ 72-85% và

ở nồng độ vi khuẩn B. megaterium 30% ấu trùng có hiện tượng ít hoạt động,

chuyển về trạng thái duỗi thẳng cơ thể, kiểm tra cho thấy không có hiện tượng

43

ký sinh, tỷ lệ ấu trùng chết cao, ấu trùng chết kiểu bị độc, cơ thể bị co rút. Tỷ

lệ sống sót của ấu trùng ở công thức đối chứng là 100%, lượng ấu trùng sống

sót còn nguyên.

Như vậy khi thử nghiệm ở các công thức khác nhau cho thấy có sự

phân hủy tuyến trùng Meloidogyne incognita khi bổ sung vi khuẩn B.

megaterium 18 với khả năng phân hủy trứng và ấu trùng, ở nồng độ 10-30%

tỷ lệ trứng nở còn 4,2-5,8% sau 7 ngày và chủng B. megaterium có khả năng

gây chết ấu trùng cao nhất là 85% ở nồng độ 30% sau 7 ngày.

Kết quả đạt được về khả năng phân hủy tuyến trùng Meloidogyne

incognita trong nghiên cứu này có sự tương đồng với các nghiên cứu khác về

khả năng đối kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita của các chủng vi

khuẩn thuộc chi Bacillus. Đã có nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của

các chủng thuộc chi Bacillus đến mật độ và hiệu quả diệt tuyến trùng

Meloidogyne incognita.

Kết quả nghiên cứu của Mahmoud et al. (2017) [60] cho thấy vai trò

của vi khuẩn B. pumilus trong việc hạn chế mật độ tuyến trùng Meloidogyne

incognita gây hại cây củ cải đường. Số lượng khối trứng và u sưng do tuyến

trùng Meloidogyne incognita đã giảm đến 74% và 73% khi xử lý cây cải củ

bằng B. Pumilus.

Đối với tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cây củ cải đường,

xử lý B. subtilis đã làm giảm 71% số lượng u sưng do tuyến trùng, giảm 65%

số lượng khối trứng (Mahmoud et al., 2017) [60]. Ngoài ra, B. subtilis còn

làm giảm đáng kể số lượng u sưng, giảm khả năng sinh sản cũng như mật độ

tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cây đậu xanh (Khan et al., 2007)

[55].

Trong một nghiên cứu khác, huyền phù vi khuẩn B. cereus gây chết

90,96% tuyến trùng Meloidogyne incognita trong điều kiện in vitro (Gao et

al., 2016) [61]. Với thí nghiệm trong chậu, xử lý dịch nuôi cấy vi khuẩn B.

cereus đã mang lại hiệu quả diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita lên đến

81,36% (Gao et al., 2016) [61].

44

Cơ chế của tác dụng này cũng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

và thảo luận. Ongena và Jacques (2008) [62] cho rằng các loài vi khuẩn thuộc

chi Bacillus không những có thể ức chế sự phát triển của các tác nhân gây

bệnh mà còn có khả năng xâm chiếm bộ rễ cây trồng và kích thích khả năng

miễn dịch của cây. Đây là những loài có khả năng sản sinh một lượng lớn các

phân tử có hoạt tính sinh học ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh

thực vật (Krebs et al., 1998) [63]. Ngoài ra, enzyme protease, chitinase phân

hủy chitin sản sinh bởi các chủng vi khuẩn Bacillus cũng đóng vai trò quan

trọng trong việc cân bằng mật độ tuyến trùng trong đất (Lian et al., 2007)

[64]. Cơ chế đối kháng của chủng vi khuẩn Bacillus đối với tuyến trùng ký

sinh thực vật Meloidogyne incognita cho thấy các enzyme protease,

collagenase và chitinase sản sinh bởi chủng vi khuẩn Bacillus là nguyên nhân

gây chết tuyến trùng.

3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI

CÂY CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium 18

3.3.1. Kết quả thử nghiệm trên cây thuốc lá in vitro

Sau khi lây nhiễm vi khuẩn bằng phương pháp nhân tạo, tỉ lệ ra rễ của

các công thức có lây nhiễm quan sát cao hơn so với công thức đối chứng ở tất

cả các thời điểm theo dõi:15 ngày, 30 ngày, 45 ngày và 60 ngày sau lây

nhiễm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Sinh trưởng của cây thuốc lá K326 sau lây nhiễm vi sinh vật

Thời

gian

sau lây

nhiễm

Số lá Chiều cao thân Chiều dài rễ

Đối

chứng

B.megaterium

18 Đối chứng

B.megaterium

18 Đối chứng

B.megaterium

18

0 4,8±0,4 4,8±0,4 1,08±0,19 1,04±0,10 5,6±0,31 5,6±0,28

15 4,8±0,4 5,8±0,75 1,98±0,39 2,36±1,03 6,16±0,69 7,06±1,06

30 5,2±0,4 7,2±0,75 2,78±0,60 5,82±1,32 10,16±0,67 13,22±1,52

45 7,2±0,4 8,6±1,02 3,78±0,68 7,04±1,68 12,92±1,86 17,22±2,62

60 9,4±0,8 11,4±0,8 5,66±0,52 11,98±2,37 16,08±1,38 20,5±4,01

45

(a) (b) (c)

Hình 3.6. Cây thuốc lá ở các công thức sau 15 ngày lây nhiễm

(a): Đối chứng (Không có vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18)

(b): So sánh cây thuốc lá in vitro giữa 2 công thức sau 15 ngày lây nhiễm

(c): Công thức có bổ sung vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18

(d) (f) (g)

Hình 3.7. Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây thuốc lá sau 30 ngày lây nhiễm

(d): Đối chứng (Không có vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium)

(f): So sánh cây thuốc lá invitro giữa 2 công thức sau 30 ngày lây nhiễm

(g): Công thức có bổ sung vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18

Bảng 3.8 và hình 3.6, hình 3.7 cho thấy: hầu hết sau 15, 30, 45 và 60

ngày, số liệu thu được ở lô thí nghiệm đánh giá số lá, chiều cao thân và chiều dài

46

rễ có lây nhiễm vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 cho kết quả sinh trưởng tốt

hơn cho với lô đối chứng không bổ sung. Tác động lên kích thích sinh trưởng ở

thực vật thường là do sự sản sinh ra phytohormone. Trong đó, phytohormone

phổ biến nhất là Axit indole-3-acetic acid (IAA) thuộc nhóm auxin liên quan

tới quá trình phân chia và kéo dài tế bào, giúp tăng trưởng và phát triển ở thực

vật, đặc biệt là kích thích kéo dài rễ và tăng nảy mầm ở hạt.

3.3.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 lên sinh trưởng

của cây cà phê ở giai đoạn vườn ươm

3.3.2.1. Ảnh hưởng cua vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 đến sinh trưởng

cua cây cà phê sau 1 tháng theo dõi

a. Ảnh hưởng về chiều cao và số cặp lá mới mọc trên cây cà phê

Sau khi đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh trên cây thuốc lá mô

hình, chúng tôi đã tiến hành thiết kế thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của vi

khuẩn nội sinh lên sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vườn ươm.

Mỗi thí nghiệm chọn 5 mẫu có sự sinh trưởng tương đối đồng đều nhau

để theo dõi các chỉ tiêu như chiều cao thân và số cặp lá mới mọc ra của cây cà

phê, kết quả thu được trình bày tại Bảng 3.9 và hình 3.8.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều cao và số cặp lá

của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm

Thời gian

Chiều cao thân (cm) Số lá (cặp)

ĐC TN1 TN2 ĐC TN1 TN2

0 ngày 1,3±0,1 1,29±0,1 1,29±0,1 2,2±0,1 2,2±0,1 2,2±0,1

7 ngày 1,3±0,1 1,31±0,1 1,33±0,1 2,6±0,1 2,9±0,1 3,1±0,1

14 ngày 1,3±0,1 1,29±0,2 1,36±0,1 3,2±0,1 3,4±0,2 3,4±0,1

21 ngày 1,3±0,1 1,45±0,2 1,48±0,1 3,3±0,2 3,6±0,1 3,6±0,2

28 ngày 1,5±0,2 1,96±0,1 1,84±0,1 3,5±0,2 3,76±0,3 3,80±0,2

47

Hình 3.8. Cây cà phê ở công thức ĐC, TN1 và TN2 sau 28 ngày lây nhiễm

Kết quả bảng 3.9 cho thấy:

Chiều cao thân của công thức đối chứng từ 0 đến 21 ngày là 1,3cm

không có sự thay đổi trong khi số cặp lá được tăng từ 2,2 cặp lá đến 3,3 cặp

lá. Điều này là do ở các công thức thí nghiệm đều có sự lặp lại và mỗi lần đo

là ngẫu nhiên, do vậy, kết quả đo có sự không thay đổi về số liệu ở các lần đo

khác nhau.

Trong giai đoạn đầu, ở thí nghiệm 1 và 2 lá phát triển không tốt hơn so

với công thức đối chứng. Lá ở thí nghiệm 1 và 2 có màu xanh nhạt. Tuy

nhiên, vào giai đoạn sau 14 ngày, cây ở thí nghiệm 1 và 2 khỏe mạnh hơn so

với cây ở công thức đối chứng. Lá ở các thí nghiệm 1 và 2 lá có màu xanh

nhạt và sáng bóng, cây khỏe, không thể hiện triệu chứng thiếu dinh dưỡng và

bệnh hại xuất hiện, trong khi đó, ở thí nghiệm đối chứng mặc dù lá to hơn,

dầy hơn nhưng rất cứng và thô, sần sùi, thể hiện triệu chứng thiếu dinh dưỡng

b. Ảnh hưởng về chiều dài rễ và số rễ nhánh:

Không chỉ giúp các chỉ tiêu sinh trưởng của các bộ phận trên mặt đất

gia tăng mà các chủng vi khuẩn nội sinh còn thúc đẩy bộ rễ phát triển tốt, làm

48

tăng đáng kể chiều dài rễ và số rễ nhánh của cây cà phê ở giai đoạn cây con.

Tiến hành theo dõi số rễ nhánh và chiều dài rễ chính của các cây cà phê ở các

thí nghiệm nghiên cứu; mỗi thí nghiệm chọn 5 mẫu có sự sinh trưởng tương

đối đồng đều nhau để đo các chỉ tiêu theo dõi, kết quả được trình bày ở bảng

3.10.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều dài rễ

chính và số rễ nhánh của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm

Thời gian Số rễ nhánh Chiều dài rễ chính (cm)


0 ngày 2,3±0,1 2,3±0,1 2,3±0,1 3,5±0,1 3,3±0,1 3,4±0,1

7 ngày 2,3±0,1 2,6±0,1 3,5±0,1 3,6±0,1 4,1±0,2 4,2±0,1

14 ngày 2,3±0,1 3,1±0,1 4,5±0,2 3,8±0,1 4,6±0,3 4,7±0,2

21 ngày 2,3±0,1 3,4±0,2 5,1±0,1 3,9±0,1 4,9±0,1 5,0±0,1

28 ngày 2,6±0,2 4,3±0,2 5,1±0,3 4,1±0,1 5,5±0,3 5,8±0,2

Kết quả bảng 3.10 cho thấy:

Chiều dài rễ chính ở công thức thí nghiệm 1 và 2 luôn cao hơn hơn

công thức đối chứng qua các ngày theo dõi. Chiều dài rễ chính đo được sau

28 ngày theo dõi ở công thức 1 và 2 lần lượt là 5,5 và 5,8cm còn ở công thức

đối chứng là 4,1cm.

Số rễ phụ công thức thí nghiệm 1 và 2 tăng sinh nhiều hơn so với công

thức đối chứng. Cụ thể, số rễ phụ ở công thức đối chứng hầu như không tăng

sinh trong quá trình theo dõi với số rễ là 2,3 nhưng ở các công thức thí

nghiệm 1 và 2 số rễ được tăng lần lượt từ 2,3 lên 5,1 và 4,3.

Số rễ phát triển nhanh nhất ở thời điểm từ 0 đến 7 ngày ở thí nghiệm 1

và 2 trong khi đối chứng gần như không phát triển mà chỉ bắt đầu phát triển

chậm sau 14 ngày. Điều này giúp cho cây hấp thu dinh dưỡng cũng như phát

triển khỏe nhạnh hơn trong các giai đoạn phát triển về sau.

49

3.3.2.2. Ảnh hưởng cua vi khuẩn nội sinh B. megaterium đến sinh trưởng cua cây cà

phê sau 3,6,9 tháng theo dõi.

Kết quả bảng 3.11 và hình 3.9 cho thấy:

Chiều dài thân ở công thức thí nghiệm 1 và 2 luôn cao hơn hơn công

thức đối chứng qua các tháng theo dõi.

Số cặp lá trong các công thức thí nghiệm 1 và 2 tăng sinh nhiều hơn so

với công thức đối chứng. Số cặp lá triển nhanh nhất ở thời điểm từ 6 đến 9

tháng ở thí nghiệm 1 và 2 trong khi đối chứng gần như không phát triển mà

chỉ bắt đầu phát triển chậm lại. Khi so sánh các công thức cho thấy cây hấp

thu dinh dưỡng cũng như phát triển khỏe nhạnh hơn trong các giai đoạn phát

triển về sau.

Bảng 3.11. Sinh trưởng của cây cà phê tại vườn ươm sau 3,6 và 9 tháng

Thời

gian

Chiều cao thân (cm) Số lá (cặp)


3 tháng 39,2±1,1 39,1±0,9 39,0±0,5 4,6±0,2 4,68±0,1 4,64±0,1

6 tháng 41,1±0,8 42,5±0,7 45,2±0,6 5,2±0,1 5,43±0,1 5.51±0,2

9 tháng 51,7±1,2 60,3±1,7 62.4±1,5 6,2±0,2 7,1±0,2 7.3±0,3

50

(a): Cây cà phê sau 3 tháng lây nhiễm

(b): Cây cà phê sau 6 tháng lây nhiễm

TN1 TN2 ĐC

TN2 TN1 ĐC

51

(c): Cây cà phê sau 9 tháng lây nhiễm

Hình 3.9. Cà phê tại vườn ươm sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng lây nhiễm

3.3.2.3. Ảnh hưởng cua vi khuẩn nội sinh B. Megaterium 18 đến sinh trưởng

cua cây cà phê 1,5 tuổi

Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện trên 20 cây cà phê. Các chỉ

tiêu về sinh trưởng phát triển được theo dõi ở 15 cây cà phê trong thí nghiệm

(trừ bỏ 5 cây cà phê không thu số liệu là các cây cà phê tiếp giáp giữa công

thức thí nghiệm và công thức đối chứng). Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở

bảng 3.12.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của vi khuẩn vật nội sinh tới khả năng sinh

trưởng và phát triển của cây cà phê

TT

Số

cành/cây

Chiều dài cành

số 3 (cm)

Chiều dài

cành số 5 (cm)

Số cặp

lá/cành 3

Số cặp

lá/cành 5

TN 25,86±0,9 29,42±1,1 41,3±1,0 5,3±0,2 7,6±0,3

ĐC 22,53±1,2 22,67±0,9 32,87±0,8 3,6±0,2 6,03±0,2

TN2 TN1 ĐC

52

Bảng 3.12 cho thấy:

Số cành/cây; chiều dài cành số 3 ; số lá trên cành, số cặp lá/cành của cà

phê 1,5 tuổi ở công thức thí nghiệm nhiều hơn so với công thức đối chứng.

Cụ thể:

Số cành cấp 1 có trên cây cà phê ở công thức thí nghiệm là 25,86 cành

chênh hơn 3,33 cành so với công thức đối chứng là 22,53 cành;

Chiều dài cành số 3 và cành số 5 (tính từ ngọn xuống) của các cây cà

phê ở công thức thí nghiệm đều dài hơn so với công thức đối chứng lần lượt

là 6,75 cm và 8,67 cm;

Số cặp lá/cành có trên cành số 3 và cành số 5 của các cây cà phê ở công

thức thí nghiệm nhiều hơn so với công thức đối chứng lần lượt là 1,7cm và

0,57cm.

Tóm lại, qua các thí nghiệm trên đã đánh giá được ảnh hưởng của vi

khuẩn nội sinh Bacillus megaterium lên sinh trưởng của cây cà phê ở giai

đoạn cây con và cây cà phê tái canh 1,5 tuổi. Bước đầu cho thấy sử dụng

chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở giai đoạn vườn ươm trong

nhà lưới cây cà phê sinh trưởng tốt sau 1 tháng theo dõi; đối với cây cà phê tái

canh 1,5 tuổi bước đầu ghi nhận cây sinh trưởng phát triển tốt, số cành/cây là

25,86 cành/cây, chiều dài cành số 3 là 29,42cm, chiều dài cành số 5 là

41,3cm.

53

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

- Chủng Bacillus megaterium 18 có hình thái tế bảo có khuẩn lạc lồi,

không bóng, nhầy, hơi nhăn, khả năng phân giải cơ chất là CMC và tinh bột.

Thời gian tối ưu cho sinh trưởng của chủng vi khuẩn là 30 giờ; khả năng sinh

tổng hợp chitinase với lượng enzyme sinh ra tối đa tại thời điểm 36 giờ, nuôi

ở nhiệt độ 37oC; chủng Bacillus megaterium18 sinh trưởng tối ưu ở pH 7;

nồng độ NaCl 1%. Chủng Bacillus megaterium 18 phát triển tốt nhất trong

môi trường có nguồn cacbon là saccharose và nguồn nitơ là KNO3.

- Chủng Bacillus megaterium 18 được xác định khả năng phân hủy

trứng tuyến trùng ở nồng độ 10-30%, tỷ lệ trứng bị phân hủy từ 94,2 – 96,8%;

ấu trùng nở ra cũng bị chết và phân hủy, ấu trùng chết kiểu bị co rút cơ thể, tỷ

lệ ấu trùng bị phân hủy từ 72-85% sau 7 ngày.

- Thử nghiệm lên cây thuốc lá in vitro cho thấy chủng vi khuẩn nội sinh

Bacillus megaterium 18 giúp tăng trưởng chiều cao thân và chiều dài rễ.

- Thử nghiệm ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium

lên sinh trưởng của cây cà phê ở giai đoạn cây con trong nhà lưới cho thấy

cây sinh trưởng tốt sau một tháng theo dõi.

- Kết quả đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18

đến sinh trưởng của cây cà phê tái canh 1,5 tuổi bước đầu ghi nhận trong 3

tháng cây sinh trưởng và phát triển tốt.

4.2. KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục nghiên cứu về khả năng phòng trừ bệnh hại do tuyến trùng

của các dòng vi khuẩn nội sinh khác trên cà phê.

- Tiếp tục đánh giá hiệu lực của chế phẩm vi sinh vật nội sinh này với

thời gian dài hơn để có được những kết quả toàn diện hơn, bởi những biện

pháp phòng trừ sinh học thường có tác dụng chậm nhưng kéo dài và bền vững

hơn.

54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước KHCN-TN3/11-15 (2011-2015):

Nghiên cứu phát triển và ứng dụng một số chế phẩm có nguồn gốc sinh

học trong canh tác chè, cà phê, hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững tại

Tây Nguyên.

2. Nguyễn Thị Lài và Đỗ Thị Mỹ Hiền , 2019, Thách thức trong xuất khuẩn

cà phê tại Việt Nam hiện nay, Tạp chí Công thương, Số 9: 85-89.

3. Ủy ban nhân dân tỉnh Đắk Lắk , 2013, Báo cáo Đề án tiếp tục phát triển

cà phê bền vững tỉnh Đắk Lắk đến năm 2020, tầm nhìn 2030, Đắk Lắk.

4. Trương Hồng, Đinh Thị Nhã Trúc và Nguyễn Xuân Hòa, 2013, Nghiên

cứu biện pháp kỹ thuật tổng hợp tiết kiệm chi phí đầu vào đối với cà phê

ở Tây Nguyên, Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất,

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội: 914-922.


Nghiên cứu hoàn thiện và chuyển giao công nghệ sản xuất sản phẩm sinh

học POLYFA-TN3 góp phần cải tạo đất cho vùng Tây Nguyên.


Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất phân urê và NPK nhả chậm ứng

dụng triển khai cho các cây trồng trên Tây Nguyên.

7. Báo cáo tổng kết Đề tài Khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.07B (1996-

2000): Nghiên cứu công nghệ vi sinh (vi khuẩn, nấm, virut) để sản xuất

chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật trong phòng trừ sâu hại cây trồng.

8. Cục Bảo vệ thực vật và Viện Bảo vệ thực vật, 1995, Báo cáo khoa học về

cải tiến công tác BVTV ở Việt Nam (dự án VNM.8910-030, giai đoạn

1990-1995)

55

9. Nguyễn Thị Chắt, 1999, Cà phê sâu bệnh, cỏ dại và biện pháp phòng trừ.

Nhà xuất ban Nông nghiệp.

10. Nguyễn Văn Thao, Nguyễn Thị Thu, Hà Việt Hải và cộng sự , 2010, Giới

thiệu một số sản phẩm khoa học áp dụng phục vụ sản xuất nông nghiệp.

Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam (1975 - 2010). Tiểu ban các chất có hoạt tính sinh học - 10/2010.

11. Trần Kim Loang, 2002, Nghiên cứu một số nguyên nhân gây hiện tượng

vàng lá, thối rễ trên cà phê vối (Coffea canephora pierre exfroehner) tại

Đắc Lắc và khả năng phòng trừ, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp.

12. White T, T Burns, S Lee, J Taylor, 1990, Amplification and direct

sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In:

PCRprotocols. A guide to methods and applications. Academic Press,

Inc., San Diego, Calif. 315-322

13. Nguyễn Ngọc Châu, 2003, Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ, NXB

Khoa học và Kỹ thuật.

14. Nguyễn Thu Hà, Vũ Thúy Nga, Trương Thị Tú Anh, Lương Hữu Thanh,

Đặng Thị Thu Thảo, Đào Văn Thông, 2007, Nghiên cứu phát triển chế

phẩm sinh học trừ tuyến trùng, nấm bệnh vùng rễ cà phê và hồ tiêu (Tài

liệu dẫn).

15. P.Q.Trinh , Eduardo de la Peña, Chau N. Nguyen, Hoa X. Nguyen and

Maurice Moens, 2009, Plant-parasitic nematodes associated with coffee

in Vietnam.

16. Nguyễn Tất Thắng, Đỗ Tấn Dũng và Nguyễn Văn Tuất, 2011, Nghiên

cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) hại cây

khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận và biện pháp phòng trừ. Tạp chí Khoa

học và Phát triển. 9(5): 725 – 734.

56

17. Bacon CW, White JF, 2000, Microbial endophytes. New York. Marcel

Dekker.

18. Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Mahaffee WF & Kloepper JW, 1997,

Bacterial endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol 43: 895–914.

19. Kado, C. I., 1992, “Plant pathogenic bacteria”, The prokaryotes, ed.

Balows, A., et al., Springer-Verlag, New York, 660 – 662.

20. Bacon, Charles W. and White, James F., 2000, Microbial endophytes,

Marcel Dekker, New York.

21. Verma, Subhash C., Ladha, Jagdish K. and Tripathi, Anil K., 2001,

"Evaluation of plant growth promoting and colonization ability of

endophytic diazotrophs from deep water rice", Journal of Biotechnology,

Vol. 91(2): 127- 141.

22. Bressan, Wellington and Borges, Marcela T., 2004, "Delivery methods

for introducing endophytic bacteria into maize", Biocontrol, Vol. 49(3):

315-322.

23. McInroy, J.A. and Kloepper, J.W., 1994, "Novel bacterial taxa inhabiting

internal tissue of sweet corn and cotton", in Ryder, M.H., Stephens, P.M.,

and Bowen, G.D (Editors), Improving plant productivity with rhizosphere

bacteria, CSIRO, Melbourne, Australia.

24. Oliveira, Marcelo N. V., Santos, Thiago M. A., Vale, Helson M. M.,

Delvaux, Júlio C., Cordero, Alexander P., Ferreira, Alessandra B.,

Miguel, Paulo S. B., Tótola, Marcos R., Costa, Maurício D., Moraes,

Célia A. and Borges, Arnaldo C. , 2013, "Endophytic microbial diversity

in coffee cherries of Coffea arabica from Southeastern Brazil", Canadian

journal of microbiology, Vol. 59(4): 221-230.

57

25. Ryan, Robert P., Germaine, Kieran, Franks, Ashley, Ryan, David J. and

Dowling, David N. , 2008, "Bacterial endophytes: recent developments

and applications", FEMS microbiology letters, Vol. 278(1): 1-9.

26. Compant, Stéphane, Clément, Christophe and Sessitsch, Angela, 2010,

"Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants:

Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for

utilization", Soil Biology and Biochemistry, Vol. 42(5): 669-678.

27. Lodewyckx, Cindy, Taghavi, Safieh, Porteous, Fiona, Moore, Edward R.

B., Mezgeay, Max, der Lelie, Daniel van and Vangronsveld, Jaco, 2002,

"Endophytic bacteria and their potential applications", Critical Reviews in

Plant Sciences, Vol. 21(6): 583-606.

28. Jasim, B., John Jimtha, C., Jyothis, Mathew and Radhakrishnan, E. K.

(2013), "Plant growth promoting potential of endophytic bacteria isolated

from Piper nigrum", Plant Growth Regulation, Vol. 71(1): 1-11.

29. Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần

Nguyễn Nhật Khoa và Thái Trần Phương Minh, 2013, "Phân lập các dòng vi

khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm trên cây chuối",

Tạp chí Khoa học, Trương Đại học Cần Thơ. Số 27 (Phần B): 24-31.

30. Milca, Rachel Costa Ribeiro Lins, Jssica, Martins Fontes, Nataliane,

Marques Vasconcelos, Danilo, Mamede Silva Santos, Ozias, Elias

Ferreira, Joo, Lcio de Azevedo, Janete, Magali Arajo and Glucia,

Manoella Souza Lima (2014), "Plant growth promoting potential of

endophytic bacteria isolated from cashew leaves", African Journal of

Biotechnology, Vol. 13(33): 3360-3365.

31. Rosenblueth, Mónica and Martínez-Romero, Esperanza (2006), "Bacterial

endophytes and their interactions with hosts", Molecular plant-microbe

interactions, Vol. 19(8): 827-837.

58

32. Chanway CP., 1997, Inoculation of tree roots with plant growth

promoting soil bacteria: an emerging technology for reforestation. Forest

Sci 43: 99–112.

33. Murugappan, R. M., Begum, S. Benazir and Roobia, R. Raja (2013),

"Symbiotic influence of endophytic Bacillus pumilus on growth

promotion and probiotic potential of the medicinal plant Ocimum

sanctum", Symbiosis, Vol. 60(2): 91-99.

34. Nguyễn Thu Hà , Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2009, Phân lập và

đặc tính các dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. Tạp

chí công nghệ sinh học, 7(2): 241-250.

35. Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản và cs., 2005, Phân lập tuyển chọn

chủng Bacillus cho sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng. Khoa học

Công nghệ và Phát triển nông thôn 20 năm đổi mới, Tập 1-Trồng trọt

BVTV, Bộ NN&PTNT, Nhà xuất bản Chính trị quốc gia.

36. Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2011, Phân lập và nhận diện vi

khuẩn nội sinh trong cúc xuyến chi (Wedelia Trilobata (L.) Hitche) bằng

kỹ thuật PCR. Tạp chí khoa học, trường Đại học Cần Thơ, 18a: 168-176.

37. Văn Thị Phương Như, Cao Ngọc Điệp, 2013, Phân lập và đặc tính vi

khuẩn nội sinh cây lúa (Oryza sativa L.) trồng trên đất của tỉnh Phú Yên,

Việt Nam, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2: 450-454.

38. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng, 2010, Đặc tính vi khuẩn nội sinh

phân lập trong cây Khóm trồng trên đất phèn Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang.

Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 15a: 54-63.

39. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009, Phân lập và đặc tính của vi

khuẩn nội sinh phân lập trong cây Khóm trồng trên đất phèn huyện Bến

Lức, tỉnh Long An, Việt Nam. Tuyển tập công trình nghiên cứu cua hội

59

nghị Công nghệ sinh học năm 2009 tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh ,

23-24, tháng 10 năm 2009.

40. Vega, Fernando E., Pava-Ripoll, Monica, Posada, Francisco and Buyer,

Jeffrey S. (2005), "Endophytic bacteria in Coffea arabica L", Journal of

Basic Microbiology, Vol. 45(5): 371.

41. Mekete, Tesfamariam, Hallmann, Johannes, Kiewnick, Sebastian and

Sikora, Richard (2009), "Endophytic bacteria from Ethiopian coffee

plants and their potential to antagonise Meloidogyne incognita",

Nematology, Vol. 11(1): 117- 117.

42. Miguel, Paulo Sérgio Balbino, Delvaux, Julio Cesar , de Oliveira,

Marcelo Nagem Valério , Monteiro, Larissa Cassemiro Pacheco , Freitas,

Fernanda de Souza, Costa, Maurício Dutra , Tótola, Marcos Rogério , de

Moraes, Célia Alencar and Borges, Arnaldo Chaer (2013), "Diversity of

endophytic bacteria in the fruits of Coffea canephora ", African Journal

of Microbiology Research, Vol. 7(7): 586-594

43. Silva, Harllen S. A., Tozzi, João P. L., Terrasan, César R. F. and Bettiol,

Wagner (2012), "Endophytic microorganisms from coffee tissues as plant

growth promoters and biocontrol agents of coffee leaf rust", Biological

Control, Vol. 63(1): 62.

44. Garbeva, P., van Veen, J. A. and van Elsas, J. D. (2004), "Microbial

diversity in soil: Selection of microbial populations by plant and soil type

and implications for disease suppressiveness", Annual Review of

Phytopathology, Vol. 42 (1): 243-270.

45. Berg, Gabriele and Hallmann, Johannes (2006), "Control of plant

pathogenic fungi with bacterial endophytes", in Schulz, Barbara J. E. ,

Boyle, Christine J. C., and Sieber, Thomas N., Editors, Microbial root

endophytes, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg: 53-69.

60

46. Shiomi, Humberto Franco, Silva, Harllen Sandro Alves, Melo, Itamar

Soares de, Nunes, Flávia Vieira and Bettiol, Wagner (2006),

"Bioprospecting endophytic bacteria for biological control of coffee leaf

rust", Scientia Agricola, Vol. 63(1)

47. Kloepper, Joseph W., Ryu, Choong-Min and Zhang, Shouan (2004),

"Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus

spp.", Phytopathology, Vol. 94(11): 1259-1266.

48. Sikora, R. A., Schäfer, K. and Dababat, A. A. (2007), "Modes of action

associated with microbially induced in planta suppression of plant-

parasitic nematodes", Australasian Plant Pathology, Vol. 36(2): 124-134.

49. Kloepper, Joseph W. and Ryu, Choong-Min, 2006, "Bacterial endophytes

as elicitors of induced systemic resistance", in Schulz, B., Boyle, C., and

Sieber, T. (Editors), Soil biology, microbial root endophytes,, Springer

Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg: 33-52.

50. Nguyễn Ngọc Mỹ, 2012, Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn một số

chung vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây cà phê chè (Coffea

arabica) ở Tây Nguyên, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Tây Nguyên.

51. Trương Vĩnh Thới, 2012, Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chung vi

khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây cà phê vối (Coffea canephora

Pierre var. robusta) ở Đắk Lắk, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại

học Tây Nguyên, Đắk Lắk.

52. Ngô Văn Anh, Nguyễn Anh Dũng và Trần Trung Dũng, 2017, "Phân lập,

tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây cà phê (Coffea

canephora Pierre var. robusta) có hoạt tính cố định đạm và sinh tổng hợp

Indole Acetic Acid (IAA) tại Đắk Lắk", Tạp chí Khoa học Trương Đại

học Tây Nguyên. 23: 59-64.

61

53. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh

Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty, 1976,

Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội.

54. Brijwal L, Aseesh P ADN Sushma T., 2013, An overview on

phytomedicinal approaches of Zanthoxylum armatum DC.; An important

magical medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research 7: 366-370.

55. Khan, M. R., Khan, S. M., Mohiddin, F. A. and Askary, T. H., 2007,

“Effect of certain phosphate-solubilizing bacteria on root-knot nematode

disease of mungbean”, First International Meeting on Microbial

Phosphate Solubilization, Springer Netherlands, Dordrecht: 341-346.

56. Holt, J. H., Sneath, P. H. and Krieg, N. R., 1994. Bergey’s Manual of

determinative bacteriology 9 th ed., Lippincott Williams and Wilkins,

New York, 192-194.

57. Lee S., Lee J., Jin, Y. I., Jeong J. C., Chang Y. H., Lee Y., Kim, M.,

2017, Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean

traditional soy sauce. LWT-Food Science and Technology, 79: 581-524.

58. Jungjoon Seough, Peter H. Yoon, 2012, Quasilinear theory of

anisotropy‐beta relations for proton cyclotron and parallel firehose

instabilities.

59. L.T.M. Linh, N.T. Duyen, T.Q. Phap, N.T.P. Anh, and P.V. Ty, 2015,

Biologycal control of Meloidogyne incognita on Coffee by Paecilomyces

javanicus, Vietnam Journal of Biotechnology 13: 421– 424 (in

Vietnamese).

60. Mahmoud, Mohamed Ahmed Youssef, Hassan, Abd-El-Khair and Wafaa,

Mohamed Abd El-Hameed El-Nagdi, 2017, "Management of root knot

nematode, Meloidogyne incognita infecting sugar beet as affected by

https://agupubs.onlinelibrary.wiley.com/action/doSearch?ContribAuthorStored=Seough%2C+Jungjoon

https://agupubs.onlinelibrary.wiley.com/action/doSearch?ContribAuthorStored=Yoon%2C+Peter+H

62

certain bacterial and fungal suspensions", CIGR Journal, Special issue:

293-301.

61. Gao, Huijuan, Qi, Gaofu, Yin, Rong, Zhang, Hongchun, Li, Chenggang

and Zhao, Xiuyun, 2016, "Bacillus cereus strain S2 shows high

nematicidal activity against Meloidogyne incognita by producing

sphingosine", Scientific Reports, Vol. 6: 1-11.

62. Ongena, M. and Jacques, P., 2008, "Bacillus lipopeptides: versatile weapons

for plant disease biocontrol", Trends Microbiol, Vol. 16(3): 115-125.

63. Krebs, Birgit, Höding, Birgit, Kübart, Sabine, Workie, Melkamu, Junge,

Helmut, Schmiedeknecht, G., Grosch, Rita, Bochow, Helmut and Hevesi,

Mária, 1998, "Use of Bacillus subtilis as biocontrol agent. I. Activities

and Characterization of Bacillus subtilis strains", Journal of Plant

Diseases and Protection, Vol. 105(2): 181-197.

64. Lian, L.H., Tian, B.Y., Xiong, R., Zhu, M.Z., Xu, J. and Zhang, K.Q.,

2007, "Proteases from Bacillus: a new insight into the mechanism of

action for rhizobacterial suppression of nematode populations", Letters in

Applied Microbiology, Vol. 45(3): 262-269.

ĐÁnh giÁ khẢ nĂng diỆt tuyẾn trÙng vÀ kÍch thÍch sinh

Documents