1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

______________________

NGUYỄN THỊ THU

“NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC VÀ

KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƢ CỦA PHỨC

HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 131

I–RITUXIMAB”

Chuyên ngành: Mô - phôi và tế bào học

Mã số: 62420117

(DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2016

2

Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu hạt nhân, Đà

Lạt,

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Mai Trọng Khoa

2. PGS.TS. Võ Thị Thương Lan

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . …

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia

chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Vào hồi giờ ngày tháng năm 20 ...

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu điều chế dược

chất phóng xạ gắn kháng thể đơn dòng dùng trong điều trị miễn

dịch phóng xạ đang được sự quan tâm lớn của y học. Nhiều

nghiên cứu mới vẫn đang còn trong giai đoạn thử nghiệm lâm

sàng. Việc chữa trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin đang

áp dụng hiện nay là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật. Tuy nhiên tỷ lệ

chết vẫn còn cao. Việc tìm ra phương thức điều trị hiệu quả vẫn

đang là thách thức đối với các nhà khoa học.

Cho đến nay vẫn chưa có phương pháp nào hiệu quả hơn

để điều trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin, dược chất

phóng xạ đang được sử dụng lâm sàng đã được sử dụng là

Bexxar và Zevalin, tuy nhiên, kháng thể sử dụng vẫn là kháng

thể mang bản chất chuột. Để khắc phục nhược điểm trên, kháng

thể đơn dòng thế hệ mới có bản chất humanized là rituximab ra

đời, rituximab được chọn để đánh dấu với đồng vị phóng xạ 131

I

tạo thành thuốc phóng xạ 131

I-rituximab. Với nhiều ưu điểm là

phức hợp miễn dịch 131

I-rituximab gắn đặc hiệu lên kháng

nguyên CD20 biểu hiện mật độ cao trên tế bào lympho B ung

thư, diệt tế bào ung thư bằng cơ chế tác động kép, đó là cơ chế

bức xạ ion hóa và cơ chế sinh học, tạo hiệu quả tiêu diệt tế bào

ung thư cao.

Để điều chế phức miễn dịch phóng xạ 131

I-rituximab có thể

ứng dụng lâm sàng, nâng cao hiệu quả điều trị bệnh u lympho

ác tính không Hodgkin, đề tài “Nghiên cứu điều chế, phân bố

sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn

dịch phóng xạ 131

I-rituximab” được thực hiện trong luận án này.

2

Mục tiêu của luận án: Bao gồm hai phần, thứ nhất là

nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế phức miễn dịch phóng

xạ 131

I-rituximab và các kiểm tra chất lượng. Thứ hai là nghiên

cứu đánh giá tiền lâm sàng của 131

I-rituximab bao gồm đánh giá

tính đặc hiệu của kháng thể sau khi đánh dấu với đồng vị phóng

xạ, đánh giá phân bố, đào thải và đánh giá tính an toàn trên

động vật thí nghiệm.

Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của luận án: Bao gồm

nghiên cứu đánh dấu kháng thể đơn dòng rituximab với đồng vị

phóng xạ 131

I để tạo thành dược chất phóng xạ và nghiên cứu

hoạt tính miễn dịch, tính an toàn của 131

I-rituximab cũng như

phân bố thuốc trên chuột, thỏ thí nghiệm và nghiên cứu thăm dò

liều thám thính trên người bệnh.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

Về ý nghĩa khoa học: Tạo ra sản phẩm thuốc phóng xạ nhắm

đích dùng trong điều trị ung thư lymphòao B không Hodgkin

bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ, có tác động kép trong quá

trình điều trị, vừa tiêu diệt ung thư bằng cơ chế sinh học vừa

tiêu diệt ung thư bằng bức xạ ion hóa.

Ý nghĩa thực tiễn:

- Có khả năng cạnh tranh với thuốc phóng xạ nhập ngoại.

- Khi kết hợp với đồng vị phóng xạ, dược chất phóng xạ có

tác động kép trong quá trình điều trị, vừa tiêu diệt ung thư bằng

cơ chế sinh học vừa tiêu diệt ung thư bằng bức xạ ion hóa.

- Góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu điều chế trong

nước. Ứng dụng điều trị miễn dịch phóng xạ tại các bệnh viện

trong nước.

3

- Mở ra hướng chẩn đoán và điều trị mới, có ý nghĩa thiết

thực cho bệnh nhân, nâng cao sức khỏe cho cộng đồng, giảm

chi phí nếu như đi nước ngoài điều trị, tiết kiệm cho xã hội.

Những điểm mới của luận án: Luận án đã nghiên cứu

điều chế và kiểm tra chất lượng dược chất phóng xạ 131

I-

rituximab dùng trong điều trị u lympho ác tính không Hodgkin.

Các điểm mới trong luận án là:

- Điều chế được sản phẩm 131

I-rituximab để điều trị ung thư

bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ.

- Kết hợp được phân tử kháng thể rituximab với đồng vị

phóng xạ bằng kỹ thuật đánh dấu phóng xạ dùng chất oxy hóa,

chất khử với hàm lượng tối thiểu và kỹ thuật đánh dấu phóng xạ

trong luận án đảm bảo được hoạt tính của kháng thể.

- Kỹ thuật gắn phức hợp 131

I-rituximab lên cột sắc ký ái lực

và kỹ thuật gắn với tế bào lấy từ bệnh nhân ung thư ác tính

khôg Hodgkin.

Cấu trúc của luận án: Gồm 5 phần

Mở đầu: Gồm 2 trang

Tổng quan: Gồm 15 trang. Giới thiệu về kháng thể đơn dòng và

phương pháp điều trị miễn dịch phóng xạ, giới thiệu về đồng vị

phóng xạ dùng trong chẩn đoán và điều trị hiện nay.

Phương pháp nghiên cứu: Gồm 19 trang. Trình bày các phương

pháp nghiên cứu đã được sử dụng trong luận án.

Kết quả và bàn luận: Gồm 54 trang. Trình bày các kết quả

nghiên cứu và đánh giá, bàn luận.

Kết luận và kiến nghị: Gồm 2 trang. Trình bày tóm tắt kết quả

nghiên cứu theo mục tiêu đề ra và hướng tiếp theo.

4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Ứng dụng kháng thể đơn dòng trong điều trị miễn dịch

phóng xạ

Từ khi được sản xuất, kháng thể đơn dòng đã có nhiều ứng

dụng trong các lĩnh vực như y học, chăn nuôi, công nghiệp. Đặc

biệt là trong chẩn đoán và điều trị bệnh, kháng thể đơn dòng khi

gắn với chất phóng xạ hoặc hoá chất, có thể phát hiện sớm bệnh

ung thư, phát hiện sự lan truyền ung thư, ngăn chặn và loại trừ

sự phát triển của ung thư, điều trị các ung thư ác tính. Điều trị

bằng kháng thể đơn dòng là phương pháp điều trị hiệu quả đối

với tế bào ung thư nhưng mức độc thấp nhất đối với tế bào bình

thường. Sau khi tiêm, kháng thể đi khắp nơi trong cơ thể và gắn

vào các kháng nguyên đặc hiệu trên tế bào ung thư. Dựa vào

đặc điểm đó kháng thể đơn dòng được gắn với đồng vị phóng

xạ để phát huy hiệu quả điều trị.

Rituximab được cho phép sử dụng trên người vào năm

1997, được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền, dung hợp vùng

biến đổi chuỗi nặng và nhẹ của chuột với vùng hằng định

IgG1/κ của người (Hình 1.1). Kháng thể tạo thành có khả năng

tiêu diệt các tế bào B in vitro và làm giảm lượng tế bào B trong

máu ngoại vi in vivo. Sự giảm tế bào B trong tủy xương, lách và

các hạch lympho trong đã được nghiên cứu kỹ sau nhiều năm

điều trị trên lâm sàng.

5

Hình 1.1: Cấu trúc của kháng thể rituximab

Việc sử dụng rituximab được phê chuẩn phần lớn dựa trên

các thử nghiệm đối với u lympho tế bào B không Hodgkin tái

phát nhẹ. Tỷ lệ đáp ứng trong nhóm khó chữa này là khoảng

50% khi chỉ sử dụng rituximab.

1.2. Phƣơng pháp đánh dấu kháng thể với đồng vị phóng xạ 131

I: Từ khi kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng phát triển,

người ta đã đánh dấu với các đồng vị phóng xạ như 131

I, 67

Ga, 111

In, 123

I, 99m

Tc, 90

Y … Việc chọn đồng vị phóng xạ dựa trên

những đặc điểm là thời gian bán rã phải từ 6 giờ đến 7 ngày là

thích hợp, năng lượng gamma từ 70 - 300 keV, độ giàu gamma

đơn năng trên mỗi phân rã phải cao, không có những bức xạ

đặc biệt khác, đồng vị con phải ổn định và sản phẩm ở dạng

không có chất mang. Phức của nhân phóng xạ và protein phải

ổn định hóa học invivo. Việc chọn nhân phóng xạ thích hợp cho

quá trình đánh dấu ngoài tính chất riêng của từng nhân phóng

xạ thích hợp cho chụp hình hay điều trị còn phụ thuộc vào tính

chất dược động học của phân tử kháng thể.

Đồng vị phóng xạ 131

I được dùng trong chẩn đoán vì nó có

nhiều thuận lợi là giá thành thấp, dễ sản xuất, nhưng còn nhiều

6

nhược điểm là còn tồn tại những iod tự do, liều bức xạ cao cho

bệnh nhân, thời gian bán rã dài. Năng lượng phát tia gamma

cho chụp hình của 131

I là 364 keV, các mức năng lượng cực đại

của 131

I là Emax: 0,25, 0,33, 0,47, 0,61, 0,81 MeV, Eav 192 keV.

Kháng thể gắn 131

I có thể dùng cho chẩn đoán và điều trị. Có

hai cách để gắn phóng xạ vào 131

I, đó là phương pháp thay thế

trực tiếp iot phóng xạ vào trong vị trí ortho đã hoạt hoá trên

vòng thơm, hầu hết là tyrosine, cách khác là cộng hợp phân tử

hữu cơ đã iod hoá với nhóm chức năng trên dây chuyền phản

ứng của phân tử kháng thể.

Phương pháp thay thế trực tiếp là dùng chất oxy hoá nhẹ

để bảo toàn hoạt tính miễn dịch của kháng thể, các chất oxy hóa

thường dùng là chloramin T, tetrachlorodiphenylglycouril

(iodogen) và hydrogenperoxidase (lactoperoxidase). Các vấn đề

chủ yếu liên quan đến kỹ thuật này là sự không gắn được của

tyrosine dư thừa có thể làm duỗi phân tử protein. Phân tử duỗi

ra này sẽ làm thay đổi cấu trúc toàn vẹn của protein trong môi

trường phản ứng. Ngoài ra, sự xạ phân có thể sẽ xảy ra, làm giải

phóng iod tự do và có thể sẽ tích lũy trong tuyến giáp hoặc

trong dạ dày. Tuy nhiên trong những năm gần đây, các nhà

nghiên cứu vẫn tiến hành nghiên cứu đánh dấu kháng thể với 131

I cho mục đích điều trị bệnh ngày càng nhiều.

Việc điều trị u lympho ào B không Hodgkin bằng kháng

thể đơn dòng được mở đầu bởi Gerald DeNardo, Sally

DeNardo, David trường đại học California năm 2006. Bên cạnh

đó, kháng thể đơn dòng gắn phóng xạ 131

I-rituximab đã được

thực hiện lâm sàng bởi các tác giả Sang Mao Lim và cộng sự từ

năm 2007 đến nay, hiệu quả điều trị cho thấy khả năng thành

7

công là đáng kể. Các tác giả Leahy MF, Turner JH (2011) cũng

đã có nhiều thành công sau hơn 10 năm điều trị lâm sàng dùng 131

I-rituximab.

2. PHƢƠNG PHÁP GHIÊN CỨU

Các nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Viện

Nghiên cứu hạt nhân, Bệnh viện Bạch Mai và Học viện Quân y.

Các phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị, nguyên vật liệu

đã sử dụng được trình bày như sau:

2.1. Phƣơng pháp gắn kháng thể đơn dòng rituximab với

đồng vị phóng xạ 131

I: Dùng phương pháp oxy hóa khử, đồng

vị phóng xạ 131

I bị oxi hóa tạo thành iodine-131[131

I+] và gắn

vào phân tử tyrosine tại vị trí ortho trên vòng phenol với hiệu

suất gắn cao. Kháng thể đơn dòng rituximab được khảo sát

đánh dấu với đồng vị phóng xạ 131

I. Các khảo sát hàm lượng

chloramin T, khảo sát pH, khảo sát hàm lượng kháng thể, thời

gian phản ứng. Kết quả được tính toán bằng phần mềm trên

máy quét phóng xạ Bioscan hoặc Cyclone. Hiệu suất đánh dấu

của kháng thể được tính toán bằng cách chia hoạt độ phóng xạ

tại vị trí đỉnh 131

I- rituximab cho hoạt độ tổng cộng.

2.2. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel dùng sephadex G25: Để tách

phân đoạn kháng thề đánh dấu với đồng vị phóng xạ ra khỏi

hỗn hợp phản ứng, cột sephadex PD10 pharmacia, GE

Healthcare được sử dụng. Phức hợp 131

I-rituximab được tách ra

khỏi 131

I tự do và các thành phần khác. Dung môi rửa giải là

nước muối sinh lý 0,9% hoặc đệm PBS. Vận tốc rửa giải là

30cm3/giờ. Hoạt độ phóng xạ của phức hợp và hiệu suất đánh

dấu được xác định.

2.3. Phƣơng pháp xác định độ tinh khiết hóa phóng xạ:

Dùng phương pháp điện di và các phương pháp sắc ký lớp

8

mỏng TLC, TCC, sử dụng các bản mỏng thích hợp như TLC

aluminum sheet silica gel 60 F254. TecControl Biodex 150771.

Độ tinh khiết hóa phóng xạ và hiệu suất đánh dấu được tính

toán bằng cách scan băng sắc ký trên thiết bị quét phóng xạ

Bioscan hoặc máy phóng xạ tự chụp Cyclone, tính toán bằng

phần mềm OptiQuan 5.0, phần mềm Biochrom. Thử theo Tiêu

chuẩn cơ sở DPPX-13:2010 ISO 17025.

2.4. Phƣơng pháp xác định độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ:

Bằng các phương pháp đo phổ gamma trên hệ phổ kế gamma,

thử theo Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS-DPPX-14:2010 ISO 17025).

Chấm 2 l dung dịch mẫu lên tâm giấy lọc hình tròn có đường

kính là 1,5 cm. Đo tốc độ đếm trên phổ kế gamma ORTEC®

DSPEC jrTM

(USA). Nhận diện các hạt nhân phóng xạ phát tia

gamma qua các đỉnh năng lượng ghi được trên phổ kế gamma.

Tính diện tích các đỉnh gamma trên chương trình

GammaVision 32 và phần trăm hoạt độ phóng xạ 131

I tại đỉnh

364 keV so với tổng hoạt độ. Hoạt độ phóng xạ của 131

I lớn hơn

99,90 %.

2.5. Các phƣơng pháp kiểm tra chất lƣợng sinh học: Sản

phẩm được kiểm tra độ vô khuẩn, chí nhiệt tố, kiểm tra phân bố

sinh học trên động vật. Thử nội độc tố vi khuẩn được thực hiện

trên máy Endosafe PTS100. Thử theo Tiêu chuẩn cơ sở DPPX-

15:2010 ISO 17025. Thử vô khuẩn bằng phương pháp cấy

thuốc vào các môi trường thioglicolat ủ ở nhiệt độ 30 - 350C,

môi trường soya - bean casein ủ ở nhiệt độ 20 -250C, quan sát

14 ngày liên tục, thử theo Tiêu chuẩn cơ sở DPPX-13:2010 ISO

17025. Kiểm tra tính ổn định bằng cách bảo quản ở điều kiện

40C và -20

0C. Sau các khoảng thời gian lấy sản phẩm phân tích

độ tinh khiết hoá phóng xạ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

TLC. Để làm ổn định sản phẩm trong huyết thanh người, pha

9

loãng dung dịch 131

I- rituximab đến nồng độ 100 MBq/ml, thêm

vào đó huyết thanh và ủ 370C tại các khoảng thời gian. Sản

phẩm phân tích bằng phương pháp TLC hoặc điện di, đo đếm

hoạt độ phóng xạ, tính toán phần trăm tỉ lệ giữa các phần trên

hoạt độ tổng. Phân bố sinh học trên chuột được thực hiện bằng

cách tiêm thuốc vào tĩnh mạch đuôi chuột, chia chuột thành

nhóm, 5 chuột, giết và mỗ theo các khoảng thời gian lấy các cơ

quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ, xương, phổi, tim, máu,

ruột, dạ dày, bọng đái, đuôi, cân và đo đếm phóng xạ, tính phân

bố theo liều tiêm trên gam (ID%/g).

2.6. Các nghiên cứu in vitro và in vivo

- Nuôi cấy và tăng sinh tế bào ung thư Raij: Môi trường

nuôi cấy và bảo quản tế bào là RPMI có bổ sung thêm 10%

FBS và 1% Penicillin/Streptomycin. Tế bào sau khi gieo được

nuôi trong tủ nuôi cấy tế bào, duy trì nhiệt độ ở 370C và nồng

độ CO2 là 5%. Kiểm tra tế bào và thay môi trường 2-3 lần/

tuần. Sau 1-2 tuần nuôi cấy, tế bào phát triển, khi đạt mật độ

cấy chuyền sang các chai nuôi mới. Sau thời gian nuôi cấy 8 -

10 ngày, thu hoạch tế bào và thêm đệm PBS để có nồng độ tế

bào là 107 tế bào/ml.

- Kiểm tra tính an toàn và đào thải trên động vật: Tiêm vào

tĩnh mạch tai thỏ dung dịch 131

I – rituximab với các liều từ 500

Ci đến 5000 Ci, thỏ được chia thành 6 nhóm, mỗi nhóm 5

con. Tiêm tiền liều bằng rituximab, mỗi con 100 mcg theo

đường tĩnh mạch tai. Nhóm đối chứng tiêm nước muối sinh lý

0,9%. Thỏ được gây mê bằng Thiopental và chụp hình phân bố

thuốc trên máy máy xạ hình SPECT với tốc độ 10 cm/ phút, độ

phân giải 256 x 1024 pixel tại các thời điểm sau tiêm theo các

10

khoảng thời gian. Xác định đào thải thuốc theo các thông số

đếm trên máy SPECT.

- Phương pháp gắn 131

I-rituximab với kháng nguyên CD20:

Kháng nguyên CD20 được cố định lên cột sắc ký ái lực dựa

trên ái lực của niken nitroacetic acid agarose với đuôi histag

trên phân tử kháng nguyên CD20. Sau khi gắn kháng nguyên

CD20 lên cột niken NTA agarose. Phức kháng thể 131

I-

rituximab được ủ trong đệm tris-HCl. Sau khi ủ, lấy hạt ra, rửa

với Tris-HCl nhiều lần, lần sau cùng thay bằng đệm phosphate

PBS, sau đó tách phần gắn không đặc hiệu và phần tự do, đo

hoạt độ phóng xạ và tính phần trăm hoạt tính gắn.

- Phương pháp gắn 131

I-rituximab với tế bào bạch cầu bệnh

nhân NHL: Thực nghiệm gắn 131

I-rituximab với tế bào được

tiến hành theo phương pháp Lindmo. Tách tế bào lympho với

số lượng đủ tế bào để làm ống đôi. Cho 131

I-rituximab ủ với tế

bào bạch cầu lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán là u lympho ác

tính không Hodgkin, có dấu ấn CD20 (+). Phản ứng gắn với tế

bào được thực hiện trong các ống thủy tinh trong đệm PBS 0,15

mM, pH 7 và so sánh với các ống gắn không đặc hiệu Non

Specific Binding (NSB) và các ống tổng.

- Gắn 131

I-rituximab với tế bào Raji và nguyên bào sợi: Cho

phức hợp 131

I-rituximab gắn với một lượng tế bào ung thư Raji.

Các ống gắn không đặc hiệu Non Specific Binding (NSB) và

ống gắn nguyên bào sợi được thực hiện đồng thời. Sau khi ủ, đo

hoạt độ phóng xạ của các ống ằng cách dùng hệ lọc milipore 96

lỗ, rửa 3 lần, thu màng lọc chứa tế bào, đo hoạt độ phóng xạ

trên máy đo gamma cùng với ống tổng. Tính đặc hiệu của

kháng thể được xác định dựa trên hằng số Bmax và Kd bằng

11

phương pháp phân tích Schatchard dùng phần mềm Graphpad

Prism 7,01.

* Các trang thiết bị chủ yếu đƣợc sử dụng

- Máy phóng xạ tự chụp Cyclone Plus Phosphor Scanner,

B431200, PerkinElmer, Mỹ

- Máy đo hoạt độ phóng xạ Capintec, miền đo từ 0,001-

8000mCi, Mỹ.

- Hệ phổ kế gamma đa kênh, độ phân giải tại đỉnh năng lượng

1332keV của Co-60 là 1,9keV của hãng Ortec, Mỹ.

- Máy SPECT hãng SIEMENT

- Máy sắc ký lỏng cao áp FPLC 6850A, Perkin Elmer, cột

Agilentb Zorbax GF-250

- Máy đo nhanh nội độc tố vi khuẩn Endosafe - PTSTM

Portable Test System 100, Mỹ.

- Phòng sạch vô trùng, class <10.000

- Tủ hút vô trùng, Class 100, Mỹ.

* Nguyên liệu, hoá chất chủ yếu: Đồng vị phóng xạ 131

I dạng

Na131

I sản xuất tại Viện Nghiên cứu hạt nhân, nồng độ phóng

xạ 100-200 mCi/ml. Rituximab, chai 500 mg/50ml, hãng

ROCHE. Kháng nguyên CD20 mua từ hãng fitzgerald, Mỹ. Cột

gel Sephadex G25 mua từ hãng Amersham Bioscences. Ni-

NTA Agarose R901-15, hãng invitrogen, Mỹ. Các hoá chất

chloramin T, natri metabisulphite, mua từ hãng Sigma Aldrich.

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả đánh dấu kháng thể rituximab với đồng vị

phóng xạ 131

I

- Kết quả khảo sát đánh dấu phóng xạ: Hàm lượng ChT tham

gia trong phản ứng đánh dấu trong khoảng 20 - 200 g để oxy

hóa từ 5 - 50 mCi 131

I (Hình 4.1A). Hàm lượng kháng thể là

khoảng 100 g để có thể gắn với mức tối thiểu hoạt độ phóng

12

xạ là 5 mCi (Hình 4.1B). Phản ứng đánh dấu đạt hiệu suất cao

nhất ở pH 7 - 8 (Hình 4.1C), tại pH này có thể làm cho kháng

thể ổn định trong quá trình bảo quản và điều trị trên con người.

Thời gian phản ứng đánh dấu là khoảng từ 1 đến 5 phút (Hình

4.1B), thời gian này đủ nhanh để có thể các phân tử tiếp xúc

nhau, phản ứng nhanh và người thực hiện có thể kết thúc phản

ứng. Kết quả cho phản ứng đánh dấu đạt hiệu suất cao 96% và

phương pháp đánh dấu ổn định (Hình 3.1D).

Hình 3.1: Khảo sát các điều kiện điều chế 131

I-rituximab

- Quy trình đánh dấu kháng thể với đồng vị phóng xạ: Để điều

chế 131

I-rituximab có hoạt độ riêng 6,6 Ci/g, kháng thể được

đánh dấu với 131

I trong đệm phosphat 0,5 M, pH 7,5. Cho vào

chai phản ứng theo thứ tự 100 l đệm phosphat, 300 l

rituximab (10 mg/ml), 100 l dung dịch phóng xạ Na131

I có

hoạt độ 740 MBq, thêm 50 l ChT (2 mg/ml). Lắc trộn nhẹ cho

13

phản ứng xảy ra trong 3-5 phút. Sau đó, cho 100 l SMB (4

mg/ml) vào, trộn nhẹ 30 giây. Hỗn hợp phản ứng được nạp cột

sephadex PD10 và tách, thu phân đoạn sản phẩm, đo hoạt độ

phóng xạ và bảo quản thuốc ở điều kiện lạnh.

Trong miền pH tối ưu là 7,5 - 8,5, sự oxy hoá của 131

I tạo

thành I+ dễ dàng, phản ứng gắn

131I vào phân tử kháng thể hiệu

quả hơn. Khi pH lớn hơn 8,5 hiệu suất đánh dấu giảm, có lẽ do

phản ứng không thuận nghịch tạo thành IO3- :

I2 + OH- IO

3- + I

+ H2O

Trong miền pH nhỏ hơn 6,5 hiệu suất phản ứng ít hiệu quả

hơn do sự phân ly của HOCl trong môi trường axit.

Tóm lại quy trình đánh dấu phóng xạ cho thấy chất phóng

xạ 131I gắn dễ dàng vào phân tử kháng thể bằng phương pháp

chloramin T. Hiệu suất đánh dấu cao, đạt khoảng 96%.

- Quy trình tách 131

I-rituximab: Hỗn hợp phản ứng có chứa

phức hợp miễn dịch phóng xạ 131

I-rituximab được tinh sạch qua

cột sắc ký lọc gel sephadex G25 PD10, (Hình 3.2).

Hình 3.2: Khảo sát các điều kiện điều chế 131

I-rituximab

Các thành phần 131

I-rituximab, 131

I tự do và các chất oxy

hóa, chất khử còn thừa được tách ra khỏi nhau bằng phương

pháp sắc ký lọc gel. Đệm tách là nước muối sinh lý 0.9% và

14

02468

10121416

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Hoạt

độ p

hóng x

ạ

(mC

i)

Phân đoạn 131I - rituximab (ml)

Phosphat 0,2M, pH

7,2

131I

dùng đệm PBS 0,2M, pH 7,2. Cân bằng cột tách trong vài giờ,

hút dung dịch đã đánh dấu nạp vào cột gel, chờ cho dung dịch

thấm đều vào gel, rửa giải bằng dung dịch NaCl 0,9% hoặc đệm

phosphat 0,02 M. Vận tốc xối 30 cm3/giờ. Đồ thị tách phân

đoạn sản phẩm (Hình 3.3):

Hình 3.3: Đồ thị tách 131

I-rituximab qua cột

Hiệu suất đánh dấu của 131

I-rituximab đạt từ 94-97%. Chọn

phân đoạn có hoạt độ phóng xạ chứa phức hợp 131

I-rituximab,

thu sản phẩm, lọc qua phil lọc vô trùng 0,20m và bảo quản ở

nhiệt độ 2-40C.

Độ tinh khiết hóa phóng xạ: 131

I-rituximab có độ tinh khiết hóa

phóng xạ đạt hơn 98%, TLC, 10 x 100, Bioscan. (Hình 3.4):

Hình 3.4: Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131

I-rituximab

15

Phức 131

I-rituximab nằm tại vị trí gốc, độ tinh khiết hóa

phóng xạ là 99,4%, 131

I di chuyển về vị trí ngọn là 0,6%. Độ

tinh khiết hóa phóng xạ của 131

I-rituximab được phân tích trên

hệ FPLC dùng detector UV và detector đo phóng xạ, thời gian

lưu của các phân tử kết tụ của kháng thể là 12,5 phút, phân tử

rituximab và 131

I-rituximab là 14,0 phút và 131

I là 22,2 phút.

Phân tử kháng thể đánh dấu phóng xạ 131

I-rituximab và

rituximab có thời gian lưu giống nhau, (Hình 3.5):

Hình 3.5: Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131

I-rituximab, FPLC

- Độ tinh khiết hạt nhân của 131

I-rituximab: Kết quả đo phổ

gamma 131

I-rituximab được tóm tắt trong Hình 3.6 sau:

Hình 3.6: Phổ gamma của 131

I-rituximab

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Channel

Co

un

ts

I-131

IND364 keV

284 keV637 keV

723 keV

16

Độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ của 131

I-rituximab luôn

lớn hơn 99,9%, hiện diện ở đỉnh photon có năng lượng là 364

KeV. Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng của 131

I-rituximab, Bảng 3.1:

Bảng 3.1: Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng của 131

I-rituximab

Sản phẩm, chỉ

tiêu

Chất lƣợng Phƣơng pháp

Dung dịch 131

I-

rituximab/nước

muối sinh lý

5 mCi/10ml

Dung dịch trong

suốt, không màu

Chloramin T

Hoạt độ riêng 6,6 Ci/g và

2,0 Ci/g

Hoạt độ phóng

xạ/hàm lượng KT

pH 6 - 7 Theo DĐVN IV, Phụ

lục 6.2

Hiệu suất đánh

dấu > 95,0%

Sắc ký lọc gel, TLC,

TCC, điện di

Độ tinh khiết

hóa phóng xạ > 98,0%

TCCS-DPPX 13-

2010

Độ tinh khiết hạt

nhân phóng xạ > 99,9%

TCCS-DPPX 14-

2010

Ổn định trong

huyết thanh > 95,0% Sắc ký lớp mỏng

Bảo quản -200C

và 40C

> 95,0% Sắc ký điện di

Độ vô khuẩn Đạt TCCS-DPPX 16-

2010

Nội độc tố vi

khuẩn

< 3 EU/ml

TCCS-DPPX 15-

2010, pha loãng mẫu

1:40 lần

Kết quả nghiên cứu tính ổn định của sản phẩm của 131

I-

rituximab trong huyết thanh ờ nhiệt độ 370C, (Hình 3.7):

17

Hình 3.7: Đồ thị ổn định của 131

I-rituximab trong huyết thanh

- Kết quả gắn tế bào với phức hợp 131

I-rituximab:

Tế bào Raiji và nguyên bào sợi được dùng trong thực

nghiệm gắn với phức hợp 131

I-rituximab (Hình 3.8).

Tế bào Raji khi thu hoạch Tế bào nguyên bào sợi

Hình 3.8: Hình chụp tế bào ung thư Raji và nguyên bào sợi

Kết quả gắn bão hòa của 131

I-rituximab với tế bào ung thư

Raji và kết quả tính hằng số Kd và Bmax được trình bày trong

Hình 3.9:

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Độ t

inh k

hiế

t hóa

ph

ón

g x

ạ

(%)

Thời gian (ngày)

18

Hình 3.9: Đồ thị gắn 131

I-rituximab với tế bào ung thư Raji

Trục hoành là nồng độ tăng dần của 131

I-rituximab, phần

gắn đặc hiệu amol/cell được vẽ trên trục tung là số vị trí gắn

của kháng thể trên mỗi tế bào. Kết quả được phân tích bởi

phương pháp làm khớp với hàm phi tuyến (nonlinear

regression) dùng phần mềm Graphpad Prism 7.

Phần gắn không đặc hiệu NSB được tính bởi sự cạnh tranh

với 500 g kháng thể rituximab không phóng xạ. Đồ thị đạt đến

giá trị cực đại cho thấy bão hòa. Giá trị Kd là 6,2 nmol/L, Bmax

là 1,24 amol/tế bào và từ đó số vị trí gắn của kháng thể trên tế

bào là 7 x 105. Phần gắn không đặc hiệu ít hơn 3%, phần gắn

với nguyên bào sợi nhỏ hơn 15%. Các tế bào nguyên bào sợi là

tế bào không mang dấu ấn CD20, do vậy khả năng gắn với tế

bào lành của phức hợp là ít xảy ra, tỉ lệ này một phần nói lên có

phản ứng chéo không đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên

khác trên bề mặt tế bào tuy không đáng kể. Các kết quả cho

thấy ái lực của kháng thể sau khi đánh dấu phóng xạ đảm bảo

0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5

0 . 0

0 . 5

1 . 0

1 . 5

1 3 1I - r i t u x im a b ( n M )

13

1I-

rit

ux

ima

b b

ou

nd

(a

mo

l/c

ell

)

R a j i c e l l s

F ib r o b l a s t c e l l s

N o n s p e c i f i c b in d in g

19

hoạt tính miễn dịch và số vị trí gắn trên mỗi tế bào đạt 105 phù

hợp khi so sánh với trong các nghiên cứu đã công bố.

Kết quả gắn của 131

I-rituximab với tế bào bạch cầu tách từ

máu ngoại vi bệnh nhân là 22,5 ± 9,52. Vì là bệnh lý ung thư

của tế bào lympho trong cơ thể, chủ yếu bệnh biểu hiện tại

hạch, cơ quan bạch huyết. Tế bào ung thư có thể lưu thông theo

đường bạch huyết đi vào máu ngoại vi và lưu thông trong tuần

hoàn. Tế bào lympho mang dấu ấn CD20 ở máu ngoại vi có thể

là tế bào lympho bình thường hoặc là tế bào của NHL và chúng

đều có thể gắn với kháng thể 131

I-rituximab.

Kết quả kiểm tra hoạt tính miễn dịch của phức hợp 131

I-

rituximab với kháng nguyên CD20: Đồ thị biểu diễn kết quả

gắn của 131

I-rituximab với kháng nguyên CD20 lên cột niken

agarose như trong hình 3.10:

Hình 3.10: Hoạt tính gắn 131

I-rituximab với CD20

Phản ứng gắn phức hợp 131

I-rituximab lên kháng nguyên

CD20 cho kết quả hoạt tính gắn đạt hơn 97% trong miền từ

50ng đến 10g. Số liệu cho thấy kháng thể đơn dòng rituximab

khi đánh dấu với đồng vị phóng xạ 131

I không bị mất hoạt tính.

90919293949596979899

100

10 20 30 50 100 1000 5000 10000

Phứ

c 131I-

ritu

xim

ab g

ắn

CD

20 (

%)

Hàm lượng kháng nguyên CD20 (ng)

20

Biểu đồ còn cho thấy khả năng gắn cực đại của kháng thể gắn

phóng xạ với kháng nguyên CD20 đạt đến 98%. Số liệu cho

thấy hoạt tinh miễn dịch của phức hợp đảm bảo cho sử dụng

trong điều trị.

- Kết quả kiểm tra phân bố và đào thải trên động vật:

Kết quả phân bố sinh học trên chuột: 131

I-rituximab phân

bố trong máu ngay sau khi tiêm, khoảng 10-30% liều tiêm/gam

có trong máu sau khi tiêm từ 1 ngày đến 3 ngày, phức hợp tập

trung trong thận ít hơn 10%, ít tập trung trong gan, tuyến giáp,

sai số phân bố trong gan cao. Thuốc đào thải ra khỏi máu sau

khoảng một tuần và bài tiết qua thận nhanh.

Phân bố sinh học trên thỏ: Hình SPECT cho thấy tập trung

nhiều ở khu vực lồng ngực, gan, thận và hàm mặt Hình 3.11.

Hình 3.11: Phân bố 131

I-rituximab trên thỏ thí nghiệm, SPECT

21

Kết quả chụp hình phân bố 131

I-rituximab bệnh nhân có

chẩn đoán CD20 dương tính, dạng NHL, đã điều trị hoá chất

nhiều chu kỳ và tái phát, phân bố thuốc được chụp trên máy

SPECT. Vì đặc điểm của bệnh NHL là các mô bạch huyết có

mặt ở các nơi trong cơ thể, NHL có thể xảy ra ở một node

lympho đơn, một nhóm node, hoặc một cơ quan, do đó kiểu

ung thư này có thể trải dài trên hầu hết các phần của cơ thể như

gan, tủy xương, lách.

Kết quả theo dõi đào thải thuốc trên thỏ như sau: Liều 500

và 5000 Ci Đồ thị thấy rằng trong ngày đầu tiên khoảng 30-

40% liều tiêm tập trung trong máu. Trong 3 ngày tiếp theo

thuốc đào thải dần, không quá nhanh hoặc quá chậm. Sau

khoảng 120 giờ, thuốc được đào thải hoàn toàn ra khỏi động vật

thí nghiệm, (Hình 3.12).

Hình 3.12: Đồ thị đào thải 131

I-rituximab theo liều tiêm

- Kết quả kiểm tra tính an toàn trên động vật: Kết quả đo

các chỉ số an toàn của thỏ sau khi tiêm 131

I-rituximab trong

bảng 4.3 sau: Kết quả cho thấy, số lượng hồng cầu ổn định

trong khoảng 5 T/L. Nồng độ huyết sắc tố ở thỏ dao động

0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 2 0 0

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

T i m e ( h o u r )

13

1I

-r

itu

xim

ab

ra

dio

ac

tiv

ity

(x

10

00

CP

M)

1 3 1I - r i t u x i m a b ( 5 0 0 C i )

1 3 1I - r i t u x i m a b ( 1 0 0 0 C i )

1 3 1I - r i t u x i m a b ( 1 5 0 0 C i )

1 3 1I - r i t u x i m a b ( 2 0 0 0 C i )

1 3 1I - r i t u x i m a b ( 5 0 0 0 C i )

22

quanh mức 11 g/dl ở tất cả các nhóm. Số lượng bạch cầu trong

máu ngoại vi tại thời điểm trước khi nghiên cứu đã có sự khác

biệt giữa các nhóm. Nồng độ men gan SGOT trong máu ngoại

vi thỏ ổn định trong quá trình thực nghiệm.

Bảng 3.3: Chỉ số huyết học và sinh hóa của các nhóm thỏ tại

các thời điểm nghiên cứu ( SE)

Tóm lại: Tiêm phức hợp miễn dịch phóng xạ vào thỏ với liều từ

thấp đến cao không ảnh hưởng đến sức khỏe thỏ. Kết quả phân

tích cho thấy tính an toàn của thuốc trên động vật thực nghiệm.

Hình ảnh mô bệnh học mô gan và mô thận đều cho hình

ảnh cấu trúc bình thường, (Hình 3.13). Hình ảnh mô gan (hình

A) trên tiêu bản nhuộm H.E. cho thấy các bè gan sắp xếp thành

dải, cấu trúc rõ, các tế bào gan và tế bào nội mô lót lòng các

xoang tĩnh mạch có cấu trúc bình thường; cấu trúc khoảng cửa

bình thường.

23

A B

Hình 3.13 Hình ảnh mô học tổ chức gan (A) và thận (B)

sau đợt thử nghiệm tiêm 131

I-rituximab liều 5mCi/thỏ.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận: Luận án đã thực hiện các nội dung chính đáp ứng

mục tiêu đề ra:

Xây dựng quy trình điều chế phức miễn dịch phóng xạ 131

I-

rituximab và kiểm tra chất lượng.

- Xây dựng quy trình điều chế 131

I-rituximab: 131

I-rituximab

được điều chế với các hoạt độ riêng là 6,6 Ci/g và 2 Ci/g,

hiệu suất đánh dấu đạt 94 - 97 %.

- Kiểm tra chất lượng: 131

I-rituximab đạt các tiêu chuẩn về

thuốc phóng xạ, độ tinh khiết hóa phóng xạ đạt hơn 98% và độ

tinh khiết hạt hạt nhân phóng xạ hơn 99,9%, đạt các chỉ tiêu về

độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn và ổn định.

Nghiên cứu đánh giá tiền lâm sàng của 131

I-rituximab bao

gồm đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể sau khi đánh dấu với

đồng vị phóng xạ, đánh giá phân bố, đào thải và đánh giá tính

an toàn trên động vật thí nghiệm.

- Tính đặc hiệu của 131

I-rituximab: Gắn với tế bào ung thư Raji

đạt hơn 50% tại nồng độ 5 x 106 tế bào, Kd là 6,2 nmol/L, Bmax

là 1,24 amol/tế bào, phần gắn không đặc hiệu của 131

I-rituximab

24

ít hơn 3% và gắn với nguyên bào sợi 15%. 131

I-rituximab gắn

với tế bào bạch cầu bệnh nhân ung thư NHL là 22,5%± 9,52 và

gắn với kháng nguyên CD20 là 93-98%.

- Phân bố, đào thải của 131

I-rituximab: Khoảng 10-30% liều

tiêm/gam phân bố trong máu sau tiêm đến 3 ngày, tập trung

trong thận ít hơn 10%, ít tập trung trong gan, tuyến giáp. Thuốc

đào thải ra khỏi máu sau khoảng một tuần và bài tiết qua thận

nhanh.

- Tính an toàn của 131

I-rituximab: Các chỉ số huyết học, sinh

hóa đều bình thường và các xét nghiệm vi thể tế bào không có

bất thường hay tổn thương.

Phức hợp 131

I-rituximab được nghiên cứu điều chế và đánh

giá tiền lâm sàng, đạt tiêu chuẩn chất lượng thuốc phóng xạ

dùng trong điều trị lâm sàng trong thời gian tới.

Kiến nghị: Bệnh U lympho ác tính không Hodgkin là bệnh

phức tạp trong các ung thư huyết học, vì vậy để đưa dược chất

phóng xạ 131

I-rituximab sử dụng điều trị lâm sàng, đề nghị:

- Nghiên cứu cần hoàn thiện thêm phương pháp liều lượng để

tính toán liều tiêm bao gồm liều thám thính và liều toàn thân,

tính hoạt độ phóng xạ để đưa vào điều trị lâm sàng.

- Cần thử nghiệm điều trị trên bệnh nhân phase I và phase II

lâm sàng.

- Xin cấp phép của Bộ Y Tế.

1

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Mai Trọng Khoa, Nguyễn Thị Thu, Trần Đình Hà, Võ Thị

Cẩm Hoa, Bùi Văn Cường (2013), “Nghiên cứu điều chế

kháng thể đơn dòng gắn đồng vị phóng xạ 131

I-rituximab

dùng trong điều trị u lympho ác tính không hodgkin”, Tạp

chí Y học thực hành số 1 (858), tr 60-64.

2. Mai Trọng Khoa, Nguyễn Thị Thu, Trần Đình Hà, Võ Thị

Cẩm Hoa, Dương Văn Đông. Bùi Văn Cường, Nguyễn Thị

Khánh Giang (2013) “Nghiên cứu đánh giá tính đặc hiệu của

phức miễn dịch phóng xạ 131

I-rituximab gắn trên kháng

nguyên CD20, tế bào bạch cầu bệnh nhân ung thư NHL và

tế bào Raji”, Tạp chí Y học thực hành, số 2 (859), tr 14-17.

3. Mai Trọng Khoa, Nguyễn Thị Thu, Trần Đình Hà, Võ Thị

Cẩm Hoa, Nguyễn Thị Khánh Giang, Nguyễn Lĩnh Toàn,

Hồ Anh Sơn (2013) “Nghiên cứu đánh giá tiền lâm sàng của

phức miễn dịch phóng xạ 131

I-rituximab trên động vật thí

nghiệm”, Tạp chí Y học thực hành (ISSN 1859-1663), số 3

(860), tr 30-34.

4. Nguyễn Thị Thu, Mai Trọng Khoa, Trần Đình Hà, Võ Thị

Cẩm Hoa, Dương Văn Đông Bùi Văn Cường, Nguyễn Thị

Khánh Giang (2013) “Kiểm tra chất lượng kháng thể đơn

dòng gắn đồng vị phóng xạ 131

I-rituximab dùng trong điều trị

u lympho ác tính không Hodgkin”, Tạp chí Khoa học - Đại

học Quốc gia Hà Nội, tập 29(3), tr. 51-58.

5. Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Ngọc, Nguyễn Thị Khánh

Giang, (2016), “Đánh giá khả năng gắn với tế bào ung thư

của dược chất phóng xạ 131

I-rituximab”, Tạp chí Y dược lâm

sàng 108, tập 11, tr 10-15.