kĨ thuẬt sẢn xuẤt khÁng thỂ ĐƠn dÒng · mỗi kháng thểchỉnhận diện duy...
TRANSCRIPT
KĨ THUẬT SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG
Ths. Lê Thị Hạnh
Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG.TP.HCMViện Tế Bào Gốc
Kháng nguyên-kháng thểu Kháng nguyên (antigen – Ag): một chất phản ứng với các sản
phẩm của một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
Bản chất là protein (glycoprotein/lipoprotein), polysaccharid/lipopolysaccharid, acid nucleic hoặc lipid
Kháng nguyên không phụ thuộc T (polysaccharid) và Kháng nguyên phụ thuộc T (protein)
u Kháng thể (antibody - Ab): là một protein được hệ miễn dịch sửdụng để nhận diện và trung hoà những tác nhân xâm nhiễm ngoại lại
Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó
Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody – mab): là kháng thểđược xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế bào duy nhất
Kháng thể đa dòng bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác [email protected]
Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody)
u Là kháng thể kháng môt kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào B trong điều kiện in vitro
u Là kháng thể chỉnhận diện 1 vị trí epitope duy nhất trên kháng nguyên
Fab D
omain
Fc Domain
Kháng thể đơn dòng – đa dòng
Kháng thể đa dòng -Polyclonal antibodies
Kháng thể đơn dòng -Monoclonal antibodies
ØDễ sản xuấtØTương tác kháng nguyên –
kháng thể không chuyênbiệt
ØGiới hạn số lượng (độngvất)
ØTiết kiệm thời gian
ØĐòi hỏi kĩ thuật caoØTương tác kháng
nguyên – kháng thểchuyên biệt
ØKhông giới hạn số lượng(sx trên tế bào)
ØCần nhiều thời [email protected]
Nobel y học 1984
Niels K. Jerne, George Kohler, César Milstein Hybridoma technology for production of monoclonal antibodiesGeorges J.F. Köhler, César Milstein (1975)
Niels K. Jerne and his theoriesTheory 1: Specificity is predeterminedTheory 2: Reactivity against self-antigens creates diversityTheory 3. Antibodies, [email protected]
Các bước tạo kháng thể đơn dòng
1. Chọn động vật gây nghiễm, chọn khángnguyên
2. Gây đáp ứng miễn dịch
3. Thu nhận tế bào miễn dịch và dung hợp vớitế bào myelom, tạo tế bào lai hybridoma
4. Sàng lọc, dòng hóa hybridoma
5. Thu nhận, tinh chế và kiểm tra kháng thể đơndòng
Kháng nguyên (antigen)
u Được nhận diện bởi một kháng thể mục tiêu
u Có tính gây đáp ứng miễn dịch mạnh
u Có cấu trúc càng giống với kháng nguyên tựnhiên càng tốt (Hiện nay kháng nguyên thường được tạo ra bằng kĩ thuật protein tái tổ hợp)
u Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay một phân tử protein nào đó
Chọn kháng nguyên
u Quyết định sự thành công của quy trình
u Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành
u Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (Mab gắn đặc hiệu với KN tiêm vào)
Chọn động vật gây nhiễm
u Chuột nhắt là mô hình lý tưởng do:
• Đáp ứng miễn dịch mạnh
• Thời gian ngắn tạo ra kháng thể
u 2 dòng chuột trong công nghệ sản xuấtkháng thể đơn dòng (Mab) là BALB/c vàC57BL/6
• Lai cùng dòng
• 6-8 tuần tuổi
• Chuột cái
• “sạch tuyệt đối” BALB/c C57BL/6
u Động vật thường được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch là chuột nhắt (Mouse), chuột lớn (Rat, Hamster), thỏ…
Các vịtrítiêmAg
Intramuscular (i.m.) tiêm vào cơIntraperineal (i.p.) tiêm khoang bụng
Subcutaneous (s.c.) tiêm dưới daIntradermal (i.d.) tiêm vào da
Intravenous (i.v.) tiêm tĩnh mạch
Gây đáp ứng miễn dịch
u Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài (VD: động vậtgây nhiễm là mouse thì kháng nguyên có nguồn gốctừ rat/hamster)
u Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng mộtloài với đối tượng gây đáp ứng miễn dịch (VD: tế bàolách từ mouse thì dòng myeloma là SP2/0 hoặcX63/Ag.8654, nếu là rat thì chọn dòng Y3.Ag1.2.3
u Có chất bổ trợ (tá dược - adjuvant)
• CFA (Complete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũtương dầu, xác vi khuẩn Mycobacteium
• IFA (incomplete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ tương dầu
• ALUM (aluminum hydroxide gel)[email protected]
Liều lượng sử dụng
Kháng nguyên là protein Kháng nguyên là tế bào
Ø Tiêm 10-100 µg/chuột/lầnØ Tá dược thường được dùng là
CFA
Tiêm 5x10^6 - 5x10^7 tế bào/chuột/lầnTá dược thường được dùng là ALUM
Quy trình gây đáp ứng miễn dịch ở chuột nhắt
Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm
0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c
14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c
28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c
36 Thu serum
42 Nghỉ hoặc Tiêm nhắc lại lần 3 IFA s.c
52 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v
55 Thu tế bào lách sau khi xác địnhhiệu giá Ig trong huyết thanh
Quy trình gây đáp ứng miễn dịch ởrat
Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm
0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p
21 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA i.p
42 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA i.p
52 Thu serum kiểm tra
63 Tiêm nhắc lại lần 3 IFA i.p
73 Thu serum kiểm tra
84 Tiêm nhắc lại lần 4 IFA i.p
94 Thu serum kiểm tra
98 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v
101-110
Thu tế bào lá[email protected]
Tế bào lai - hybridoma
u Được Kohler và Milsten (1975) khám phá khi nuôi cấy liên tục những tế bào tiết kháng thể
u Hybrid là lai tạo giữa tế bào lympho B và tế bào ung thư dòng tủy của cùng 1 loài – oma là khối u
u Môi trường chọn lọc HAT – hypoxanthine, aminopterin, thymidine
u HGPRT – hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase
Quá trình sinh tổng hợp nucleotid
Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường:
u Con đường De novo cần hoạt động của enzyme dihydrofolate reductase (DHFR)
u Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) đểtổng hợp purine
u Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR àtế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage
u Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine (hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage
Các phương pháp tạo tế bào lai
u Kết dính tự nhiên
u Hóa chất (PEG)
u Các yếu tố vật lý (xung điện, sóng siêu âm)
u Virus (Sendai)
u Vi tiêm
Sản xuất Mab in vitrou Hybridoma được nuôi trong môi trường phát
triển nhân tạo (bioreactor, bình Roux…)
u MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào (supenatant cell culture)
u Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp (0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy)
u Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ thống bioreactor
Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bà[email protected]
Sản xuất Mab in vivo
u Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ (ascites)
u MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid)
u Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao (1-15mg/mL nước báng)
u Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệ[email protected]
Mồi chuột bằng pristane
Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity)
Thu thập nước báng (ascites fluid)[email protected]
Pristane
u 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane
u Tách chiết từ dầu gan cá mập
u Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ởngười
u Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu bệnh tự miễn
u Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb
Tinh chế protein
u Sắc ký ái lực (affinity chromatography)
u Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)
u Lọc gel (gel filtration)
u Sắc ký cao áp
u Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid [email protected]
