nghiÊn cỨu biỂu hiỆn gen mÃ hÏa chẤt hoẠt hÏa...

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

--------------------------------------------

HOÀNG PHÚ HIỆP

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI

TRONG VI KHUẨN Echerichia coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

--------------------------------------------

HOÀNG PHÚ HIỆP

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI

TRONG VI KHUẨN Echerichia coli

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số : 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. LÊ THỊ THU HIỀN

Thái Nguyên - 2008

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

Bảng viết tắt ............................................................................................................. 1

Danh mục các hình ................................................................................................... 2

Mở đầu .................................................................................................................... 3

Chương 1: Tổng quan tài liệu ............................................................................... 5

1.1. Bệnh tim mạch ............................................................................................. 5

1.2. Chất hoạt hóa plasminogen.......................................................................... 5

1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người ......................................................... 9

1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm

tan máu đông ............................................................................................. 12

1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô

người ......................................................................................................... 14

1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................... 18

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................ 19

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 19

2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 19

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 20

2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 20

2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose .................................................................. 20

2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide ................................................... 21

2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain

Reaction - PCR) ........................................................................................ 22

2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ............................................................ 23

2.2.5. Ghép nối DNA .......................................................................................... 23

2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng

phương pháp sốc nhiệt .............................................................................. 24

2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli ............................................................ 24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli ............................................. 24

2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid ...................................................... 25

2.2.8. Xác định trình tự gen ................................................................................ 26

2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli ................................................... 27

Chương 3: Kết quả và thảo luận ........................................................................... 28

3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA................................. 28

3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR ............................... 28

3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và

pET21a(+) ..................................................................................................... 30

3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme

hạn chế .......................................................................................................... 30

3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế ..................... 31

3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và

pET21a(+) ..................................................................................................... 32

3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA ................. 32

3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương

pháp sốc nhiệt ................................................................................................ 32

3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá

h-tPA ............................................................................................................. 33

3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA ............................... 37

3.2. Biểu hiện gen ............................................................................................... 43

3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp ........................................................... 43

3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE ................. 43

Kết luận và đề nghị ................................................................................................ 47

Tài liệu tham khảo ................................................................................................. 48

Phụ lục ..................................................................................................................... 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn

BẢNG VIẾT TẮT

Amp Ampicillin kb Kilo base

Bp Cặp bazơ (Base pair) LB Luria – Bertani

CIAP Calf Intestinal Alkaline

Phosphatase P

Vùng serine protease (Serine

protease)

ddNTP Dideoxynucleoside

triphosphate PA

Chất hoạt hóa plasmingen

(Plasminogen activator)

DNA Deoxyribonucleic acid PAI

Chất ức chế chất hoạt hóa

plasminogen (Plasminogen

activator inhibitor)

dNTP Deoxynucleoside

triphosphate PCR

Phản ứng dây chuyền

polymerase (Polymerase Chain

Reaction)

E. coli Escherichia coli rDNA DNA tái tổ hợp (Recombinant

DNA)

EDTA Ethylene Diamine Tetra-

acetic Acid RNA Ribonucleic acid

EGF

Vùng nhân tố sinh trưởng

biểu bì (Epidermal growth

factor region) RNase Ribonuclease

EtBr Ethidium bromide scuPA

Chất hoạt hóa urokinase sợi đơn

(single chain urokinase - type

plasminogen activator)

F Vùng “ngón tay” (Finger) SDS Sodium Dodecyl Sulphate

GST Glutathione S-transferase SK Streptokiase

h- tPA

Chất hoạt hóa plasminogen

mô người (Human tissue

plasminogen activator) TAE Tris-acetate- EDTA

IPTG Isopropyl b-D thiogalactoside tPA

Chất hoạt hóa plasminogen mô

(Tissue - type plasminogen

activator)

K1 Vùng Kringle 1 uPA

Chất hoạt hóa urokinase

(Urokinase - type plasminogen

activator)

K2 Vùng Kringle 2 v/p Vòng/ phút


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc của tPA và uPA 7

1.2 Các vùng của tPA 10

1.3 Cấu trúc h-tPA 11

1.4 Quá trình phân hủy huyết khối 13

1.5 Con đường phân giải tơ máu (Fibrin) 13

2.1 Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1 19

3.1 Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA 30

3.2

Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện

bằng enzyme hạn chế 32

3.3

Chọn dòng pGEX6p1

mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA) 34

3.4

Chọn dòng pET21a(+)

mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA) 35

3.5

Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA

bằng enzyme hạn chế 36

3.6

Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA

bằng kỹ thuật PCR 37

3.7

So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h-

tPA và pET21a(+)/h-tPA với NM_000930 42

3.8 Kiểm tra kiểm tra protein h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA p3 44

3.9 Kiểm tra protein h-tPA trong pET21a(+)/h-tPA p1 45

Formatted: Font: Bold







Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt






MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử

và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh

xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc

trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980,

là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972.

Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp

dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học

và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ

và bảo vệ sức khỏe con người [44]. Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược

phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc

mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã

nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả

năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu”. Một trong những protein đó, chất hoạt

hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã

được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y

dược. DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được

phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng

(Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành... và sản xuất

dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39].

Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang

bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa

plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh

học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất

phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã

hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”.


2. Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector

và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein

h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp.

- Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli.

4. Những điểm mới của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm

tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược

phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở

nước ta.


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh tim mạch

Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim

và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu

ngoại biên và tăng huyết áp. Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong

trên thế giới. Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu

người và dự đoán sẽ có khoảng 25 triệu người bị bệnh tim mạch tử vong vào năm

2020. Bệnh tim mạch cũng được dự đoán sẽ là nguyên nhân lớn nhất gây tàn phế

cho người vào năm 2020. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1

người chết vì bệnh tim mạch. Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và

mỗi 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ. Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp

với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch [60].

Một trong những nguyên nhân sinh lý quan trọng dẫn tới các bệnh tim mạch

là do thành mạch bị tổn thương, dẫn tới hình thành huyết khối bên trong mạch máu.

Do vậy, điều trị huyết khối là một trong những phương pháp hiệu quả giúp làm

giảm nguy cơ tử vong và các biến chứng ở các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, đặc

biệt là ở các bệnh nhân đột quỵ và nghẽn mạch máu.

Trong phác đồ điều trị huyết khối và bệnh tim mạch, chất hoạt hóa

plasminogen (plasminogen activator, PA) đóng vai trò quan trọng và được xem là

thuốc điều trị có hiệu quả cao. Chất hoạt hóa plasmminogen có vai trò biến đổi

plasminogen thành plasmin- là chất phân hủy huyết khối (thrombolytic). Plasmin

sau đó sẽ hòa tan dần fibrin và fibrinogen từ đó làm tan huyết khối. Bằng công nghệ

gen, các PA đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất nhằm tạo ra thuốc đặc hiệu

trong điều trị huyết khối và bệnh tim mạch. Tuy nhiên, do quy trình sản xuất phức

tạp nên giá thành của sản phẩm này khá cao.

1.2. Chất hoạt hóa plasminogen

Chất hoạt hóa plasminogen có tác dụng quan trọng trong quá trình làm tan

khối máu đông. Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzyme duy nhất chuyển chất


xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động - plasmin. Vì đặc tính

này, một vài loại plasminogen khác nhau đã được sử dụng nhằm điều trị các chứng

bệnh tim mạch. Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính. Một nhóm là chất

hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA). Chất

này có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu. Bởi vậy

chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen

trong pha lỏng của huyết thanh. Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô

(tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất

hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu. Loại thứ ba là streptokinase (SK). SK hoạt hóa

plasminogen bằng cơ chế trực tiếp. Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu

(fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng

một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47].

Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại

dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type

plasminogen activator - scuPA) không hoạt động. Chất hoạt hóa plasminogen

urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng

54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18]. Chúng có

hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và

chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động

sinh lý trong máu [30]. Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi

plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên.

Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm

uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin. Chất hoạt hóa

plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin.

Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin. Trong huyết

tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml. Giá trị cao nhất thường được

tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9].


Gen mã hóa tPA và protein này đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới

nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y- dược [31], [40]. Những nghiên cứu gần

đây cho thấy tPA còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh [49], [56]. Ở

người và các động vật khác, tPA đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hủy

fibrin [53], [54]. Đối với các trường hợp mắc bệnh huyết khối, sau khi tPA được

đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình

thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy ở những vùng khác trong cơ

thể, tuy nhiên hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [21].

Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminogen ngoại sinh có khối lượng

47kDa. Hiện nay, Streptokinase được thu chủ yếu từ nuôi cấy vi khuẩn Streptococci

B-hemolytic. Streptokinase có chức năng tương tự với plasminogen ở người. Chức

năng chính là phụ thêm vào thay đổi cấu trúc trong phân tử plasminogen, làm trung

tâm hoạt động của phân tử plasminogen này hoạt động để hoạt hóa phân tử

plasminogen thứ hai bằng cách cắt phân tử plasminogen thứ hai tại vị trí Agr560-

Hình 1.1. Cấu trúc của tPA và uPA [9]


Val561. Tiếp theo, plasminogen trong hỗn hợp Streptokinase- plasminogen sẽ được

chuyển thành plasmin, cuối cùng, hỗn hợp tách nhau hình thành dạng Streptokinase

và plasmin tự do. Cả hai loại của hỗn hợp Streptokinase đều ảnh hưởng ngang nhau

tới sự hoạt hóa của plasminogen:

Streptokinase + plasminogen → Streptokinase-plasminogen

Streptokinase- plasminogen + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin

Streptokinase- plasmin + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin

Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminigen không đặc hiệu. Việc dùng

Streptokinase dẫn tới tình trạng phân hủy hệ thống. Một tác dụng không mong

muốn của việc dùng Streptokinase là gây cảm ứng việc đáp ứng của chất trợ đông

thông qua việc tăng giải phóng thrombin. Mặc dù đáp ứng trợ đông xảy ra với tất cả

các thuốc tan huyết khối, nhưng các số liệu in vitro cho thấy tác dụng này lớn nhất

với Streptokinase.

Tương ứng với các nhóm hoạt hóa plasminogen, hiện nay trên thị trường có 5

loại thuốc tan huyết khối được phép lưu hành: Alteplase tương ứng với chất hoạt hóa

plasminogen mô, có nguồn gốc từ DNA tái tổ hợp do hãng Genentech sản xuất [8];

Streptase tương ứng với streptokinase có nguồn gốc từ cầu khuẩn tan máu beta được sản

xuất bởi hãng Aventis Pharma; Urokinase biết đến với tên là Abbokinase được sản

xuất bởi hãng ImaRx Therapeutics, urokinase có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận

người; phức chất hoạt hóa Streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và

Tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hóa hóa plasminogen mô người gắn với fibrin

và làm biến đổi plasminogen thành plasmin. Tất cả các dạng thuốc này được dùng để

điều trị nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch.

Tuy nhiên, tùy từng trường hợp, các loại thuốc khác nhau được sử dụng để điều trị

một cách hiệu quả và ít tốn kém nhất. Ví dụ, Streptase là thuốc rẻ nhất nhưng chỉ

được dùng cho những trường hợp đặc biệt vì nhiều lý do như thiếu tính đặc hiệu với

sợi huyết, hiệu quả thấp, thời gian dùng thuốc kéo dài... Còn Alteplase được sử

dụng nhiều hơn trong điều trị nghẽn động mạch phổi lớn.


1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời

Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động

nội sinh của plasminogen trong máu. Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế

bào thành mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải

thoát một cách nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào

thành mạch máu [39]. Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết

khối về phương diện lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng

nhồi máu cơ tim [9], [27], [46]. Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA

hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen.

Ở người, gen mã hóa h-tPA là một gen đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên

nhiễm sắc thể số 8 [20]. Ở chuột, gen này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị

trí 24p22. Cấu trúc và chức năng của gen mã hóa cho h-tPA được xác định bằng kết

hợp nhân bản invitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập

được các dòng từ thư viện gen người. Những dòng này được xác định bằng bản đồ

enzyme hạn chế, lai Southern blot và giải trình tự DNA [13], [23]. Kết quả xác định

và phân tích trình tự gen cho thấy, gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen có chiều

dài 36.594bp, bao gồm 32.720bp từ vị trí khởi đầu đến vị trí đuôi polyadenyl, có

thêm khoảng 353 và 344 bp của hai đầu 5’ và 3’, mười ba intron xen giữa mười bốn

exon, kích thước trung bình của các exon là 914bp, trong khi của intron từ 111 đến

14.257bp [20], [37 ], [41].

Thành phần base và tần suất dinucleotide trong mRNA của gen như sau:

A:26,4%; C:23,6%; G:25,3% và T:24,8% và trong trình tự ngược: A:24,8%;

C:26,3%; G:22,1% và T:26,9%. Trình tự cặp nucleotide như sau: AA(7,5%),

AC(5,2%), AG(8,1%), AT(5,6%), CA(7,7%), CC(6,8%), CG(1,9%), CT(7,3%),

GA(6,8%), GC(5,8%), GG(7,6%), GT(5,1%), TA(4,3%), TC(5,8%), TG(7,7%) và

TT(6,9%) [20].

Các kết quả phân tích cho thấy cấu trúc protein h-tPA bao gồm 5 vùng thuộc

hai chuỗi: chuỗi nặng của h-tPA (hay còn gọi chuỗi A, có khối lượng 39.000 kDa)

được xác định ở đầu amino, còn chuỗi nhẹ (hay còn gọi chuỗi B, khối lượng 33.000


kDa) ở đầu carboxyl. Trong đó, chuỗi nặng chứa ba vùng: vùng “ngón tay” (F -

vùng finger ) gồm 47 amino acid từ vị trí acid amin thứ 4 - 50, người ta cũng thấy

cấu trúc tương tự trong fibronectin; vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (epidermal

growth factor region - EGF) từ amino acid có vị trí 51 - 87; vùng thứ ba bao gồm

hai cấu trúc kringle, vùng kringle 1 (K1 - kringle one region) từ amino acid 88 -

176, vùng kringle 2 (K2 - kingle two region) từ vị trí amino acid 177 đến 262. Các

cấu trúc đó cũng được tìm thấy trong prothrombin, plasminogen, urokinase và nhân

tố XII [14], [19], [20], [23], [38], [45], [52]. Chuỗi nhẹ của h-tPA, chứa vị trí tâm

hoạt động (gồm năm exon được ngăn cách bởi bốn intron), vùng serine protease (P -

serine protease domain) có vị trí từ amino acid 267 đến 527 và tương đồng với

chuỗi xúc tác của enzyme phân hủy protein serine khác [38], [45].

Các vùng này có thể nằm kế tiếp nhau hoặc được ngăn cách với nhau bởi các

vùng nối ngắn. Các vùng này góp phần tạo nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả

phân tử. Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu. Hoạt tính này

thể hiện tính đặc hiệu cao của h-tPA trong quá trình phân giải các khối máu đông giàu

tơ máu. Vùng EGF thể hiện hoạt tính gắn h-tPA với bề mặt tế bào, chức năng này được

Hình1.2. Các vùng của tPA

Formatted: Font: 13 pt


bảo thủ trong rất nhiều protein tPA ở động vật có vú. Vùng EGF chứa 6 cysteine, đây

là thành phần tạo nên cầu disulfide trong domain. Vùng kringle trong protease serine

rất quan trọng trong mối tương tác protein-protein trong quá trình hoạt hóa

plasminogen và phân giải tơ máu, hoặc quá trình chuyển đổi prothrombin-thrombin.

Vùng kringle 2 của h-tPA cũng liên quan chặt chẽ với quá trình gắn tơ máu và có khả

năng kích thích hoạt tính h-tPA đối với fibrin nên có vai trò quan trọng trong sự kết

hợp giữa h-tPA và tơ máu [16], [55]. Vùng kringle 1 không được xem như có liên quan

đến trong đặc tính kết hợp với tơ máu của h-tPA mặc dù trình tự amino acid của kringle

1 và kringle 2 có tính tương đồng cao [52]. Vùng P đảm nhiệm chức năng phân cắt

plasminogen bằng enzyme để tạo ra plasmin [37].

Protein h-tPA được tổng hợp và tồn tại trong tế bào màng trong mạch dưới

dạng chuỗi polypeptide sợi đơn, tuy nhiên h-tPA trưởng thành là một sợi đơn

glycoprotein có 530 amino acid; 32 amino acid trình tự đầu sẽ được cắt khỏi h-tPA

Hình 1.3. Cấu trúc h-tPA [38]


trước khi h-tPA được đưa ra bên ngoài tế bào. Plasmin, kallikrein huyết tương, hoặc

nhân tố Xa hoạt hóa h-tPA bằng cách cắt h-tPA ở vị trí Arg 275- Ile 276 thành hai

sợi (A và B), hai sợi này liên kết với nhau bởi cầu disulfide [15], [20], [28], [34],

[45], [52].

Trong tự nhiên, h-tPA tồn tại ở dạng sợi đơn. Dạng hai sợi đã quan sát được

trong nuôi cấy tế bào ung thư tế bào hắc tố ở người. Nghiên cứu cho thấy h-tPA

dạng một sợi hoạt động có hiệu quả hơn dạng hai sợi. Điện di trên SDS (sodium

dodecyl sulfate) cho thấy, h-tPA dạng một sợi được chuyển thành dạng hai sợi trong

quá trình phân giải huyết khối [45]. Theo Berg, khi bị glycosyl hóa ở vị trí Asn- 184

sẽ gây ức chế trung gian đối với plasmin để chuyển h-tPA từ phân tử dạng sợi đơn

sang dạng sợi đôi, và khi glycosyl hóa ở vị trí Asn- 117 và/hoặc Asn- 448 sẽ làm

giảm kích thích hoạt hóa của h-tPA kết hợp với tơ máu và hoạt động phân giải

huyết khối [11].

1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu

đông

Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó hạn chế quá trình mất máu của cơ

thể. Khi thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che

phủ bởi huyết khối chứa tiểu cầu và sợi huyết. Cơ chế đông máu được bảo thủ khá bền

vững trong tiến hóa; ở lớp thú, hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần: tế bào (tiểu

cầu) và protein (các yếu tố đông máu). Phản ứng đông máu được kích hoạt ngay sau

chấn thương làm tổn hại đến nội mạc mạch máu. Tiểu cầu lập tức tạo nút chặn cầm máu

tại vết thương; đây chính là quá trình cầm máu ban đầu. Quá trình cầm máu thứ phát diễn

ra đồng thời; các yếu tố đông máu trong huyết tương đáp ứng trong một chuỗi phản ứng

để tạo các sợi huyết có vai trò củng cố nút chặn tiểu cầu.


Thành phần quan trọng nhất trong hệ thống phân giải tơ máu là glycoprotein

plasminogen, là chất do gan sinh ra và có mặt trong huyết tương và có mặt hầu hết ở

ngoài thành mạch. Plasminogen là dạng tiền enzyme (zymogen), là chất có vùng dễ

phân chia, dưới tác dụng của chất hoạt hóa plasminogen sẽ được chuyển đổi thành

dạng hoạt động và là dạng phân giải protein, plasmin. Mục tiêu đầu tiên của plasmin

là tơ máu, nhưng plasmin có thể làm giảm một vài thành phần của hỗn hợp ngoài

thành mạch và chuyển một số tiền hormone và tiền cytokine thành dạng hoạt động

của chúng. Plasmin thường liên quan đến sự di căn của bệnh ung thư. Sự phát sinh

của plasmin xảy ra trước tiên trên bề mặt tơ máu, thường có điểm kết hợp cho

plasminogen và yếu tố cơ bản hoạt hóa của nó trong máu, tPA [59].

Quá trình làm giảm

và phân hủy tơ máu sẽ

được cân bằng trong quá

trình sửa chữa thành mạch

máu bị tổn thương. Tế bào

thành mạch máu bị tổn

thương sẽ giải phóng chất

hoạt hoá plasminogen

(tPA, uPA), hoạt hóa hệ

Hình 1.4. Quá trình phân hủy huyết khối [9]

Hình1.5. Con đƣờng phân giải tơ máu (Fibrin) [58]


thống phân giải tơ máu. Chất hoạt hóa plasminogen cắt plasminogen tạo thành

plasmin, là chất phân hủy huyết khối.

Nguyên tắc phân hủy tơ máu: bản thân quá trình phân hủy tơ máu được điều

hòa bởi các chất ức chế chất hoạt hoá plasminogen (plasminogen activator

inhibitors - PAIs) và chất ức chế plasmin (α2-antiplasmin), đây là những chất làm

chậm quá trình phân giải tơ máu. PAI-1, một chất quan trọng của PAI, làm cho tPA

và uPA không hoạt động và được giải thoát khỏi tế bào thành mạch và hoạt hóa tiểu

cầu. Chất ức chế tiền plasmin là α2-antiplasmin, rất nhanh giải phóng plasmin tự do

không hoạt hóa thoát khỏi huyết khối. Một vài α2- antiplasmin thường liên kết với

nhân tố XIIIa với tơ máu trong quá trình hình thành cục máu đông, nó có thể ngăn

ngừa quá mức plasmin hoạt động trong cục máu. Cả tPA và uPA đều nhanh chóng

được phân hủy bởi thận, một bộ phận của ngăn ngừa phân hủy huyết khối quá mức.

1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời

Như đã trình bày, chất hoạt hóa plasminogen mô người đã được thương mại

hóa với tên gọi là Alteplase do hãng Genentech sản xuất. Đây là thuốc làm tan

huyết khối đặc hiệu (nghĩa là chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với tơ

máu) [43], [44]. Dược phẩm này đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration - FDA) công nhận như là một dạng

thuốc chữa bệnh đột quỵ vào năm 1996. Về phương diện lâm sàng, h-tPA được xem

là thuốc tan huyết khối đặc hiệu (chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn

với tơ máu) và được lựa chọn để điều trị nhồi máu cơ tim, tắc mạch phổi, đột quỵ,

tắc động mạch ngoại biên và các bệnh khác liên quan đến tan huyết khối [36], [40].

Trong những năm từ cuối 1990 đến đầu năm 2000, tỷ lệ bệnh nhân bị đột quỵ được

điều trị bằng h-tPA chỉ chiếm 2%. Khoảng 9 năm trở lại đây, tỷ lệ bệnh nhân mắc

bệnh tim mạch và bị đột quỵ được điều trị bằng h-tPA tăng lên đáng kể, chiếm

khoảng 10- 20%.

Thuốc này có ưu điểm là không có tác dụng phụ, không gây chảy máu hệ

thống và hiện đang thuộc loại có doanh thu rất cao trên thị trường. Từ năm 1998

đến năm 2003, doanh thu mỗi năm đạt khoảng 200 triệu USD. Dự kiến, tới năm

2010 doanh thu đạt được lên tới 600 USD [22], [58].


Trong những nghiên cứu ứng dụng đầu tiên về h-tPA, các tế bào u nuôi cấy

được sử dụng làm nguồn sản sinh h-tPA cho các mục đích trị bệnh [26]. Tuy nhiên,

các ứng dụng lâm sàng đòi hỏi quy trình sản xuất protein thích hợp với sản lượng và

độ tinh sạch cao. Vì vậy, nghiên cứu tạo h-tPA tái tổ hợp sử dụng các tế bào động

vật có vú cũng được triển khai. Các tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc

(Chinese hamster ovary - CHO) đã được chuyển gen h-tPA để tổng hợp protein h-

tPA tái tổ hợp [17]. Các sản phẩm DNA tái tổ hợp tạo ra từ hệ thống lên men môi

trường nuôi cấy tế bào động vật có vú cũng được thu nhận và làm sạch. Những nỗ

lực xây dựng quy trình đơn giản tạo h-tPA tái tổ hợp hiệu quả với giá thành hạ từ vi

sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn, và cụ thể hơn là từ E. coli, rất được quan tâm

nghiên cứu [23], [40].

Vi khuẩn E. coli: Gen mã hóa h-tPA đã được nghiên cứu và biểu hiện trên vi

khuẩn E. coli từ những năm 1983 [23], [40]. Trong nghiên cứu của Pennica và đồng

tác giả (đtg), lượng h-tPA thu được chỉ đạt khoảng 50- 80 µg/l dịch nuôi, tương

đương với 1500- 2400 phân tử h-tPA có hoạt tính/ tế bào [40]. Đến năm 1998, sau khi

tinh sạch, hàm lượng protein h-tPA thu được vào khoảng 180 µg/l dịch nuôi [42].

Gần đây, Zhu và đtg đã biểu hiện thành công protein h-tPA trong vi khuẩn E. coli với

hàm lượng protein h-tPA chiếm 30% tổng số protein của vi khuẩn [57].

Nấm men: Để khắc phục những nhược điểm của vi khuẩn nói chung và E.

coli nói riêng, người ta cũng có thể dùng hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân

chuẩn bậc thấp làm vật chủ tách dòng, như nấm men (ví dụ, Saccharomyces

cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) hay tảo. Ưu điểm của nấm

men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống

như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá

đơn giản, không sản sinh nội độc tố và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy

mô lớn. S. cerevisiae là nấm men được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các

protein tái tổ hợp. Hiện nay, nấm P. pastoris cũng được sử dụng rộng rãi, hơn 120

protein tái tổ hợp đã được biểu hiện ở tế bào chủ này trong đó rất nhiều gen có

nguồn gốc từ người và động vật.


Chất hoạt hóa plasminogen mô người là một trong những protein động vật

được tổng hợp trên nấm Aspergillus nidulans [51], S. cerevisiae [35] và Aspergillus

niger. Đối với nấm A. niger, hàm lượng h-tPA được tổng hợp khoảng 0,07mg/g

sinh khối và tăng lên 1,9mg khi bổ sung peptone. Chất hoạt hóa plasminogen mô

người được tạo ra trong A. niger bị cắt thành dạng hai sợi có trọng lượng phân tử

giống với dạng h-tPA hai sợi của khối u người, dạng hai sợi này thường xuất hiện

sau 16h nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, thông thường chỉ dưới 1% sản phẩm h-tPA tạo

ra trong A. niger có hoạt tính, và dạng h-tPA hoạt hoá không bị mất khỏi dịch trong

suốt quá trình nuôi cấy. Dạng h-tPA hoạt hoá không xuất hiện bề mặt trong giai

đoạn tĩnh của bể nuôi cấy, có thể do quá trình tổng hợp không đúng hoặc do quá

trình phân hủy protein đã xảy ra ở vùng phân hủy protein của protein h-tPA.

Tế bào động vật có vú: Do yêu cầu đa số các sản phẩm protein tái tổ hợp

cần sự biến đổi về cấu trúc nên các tế bào prokaryote không đáp ứng được. Các tế

bào eukaryote bậc thấp như nấm men hay tế bào côn trùng cũng không đáp ứng

được đối với các quá trình biến đổi tương tự ở động vật có vú như phân giải protein,

liên kết các tiểu đơn vị hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như glycosylation,

methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc

phosphoryl hóa các gốc amino acid, cho nên hệ thống tế bào động vật có vú như tế

bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese hamster ovary - CHO) và tế bào thận

chuột chưa trưởng thành (baby hamster kidney - BHK) thường được lựa chọn để

sản xuất các protein trị liệu cho người. Khoảng 60% protein tái tổ hợp dùng làm

dược phẩm được sản xuất từ các hệ thống tế bào vật chủ này.

Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào động vật làm tế bào chủ có một số nhược điểm

như: Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật, vì

thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong

một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn. Các tế bào động vật được bao

bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường

thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ.

Trong khi đó nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách

đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền.


Do vậy giá thành sản xuất các sản phẩm sử dụng các hệ thống này khá cao. Sự lựa

chọn hệ thống biểu hiện trên có thể ảnh hưởng đến đặc tính, chất lượng và giá thành

của sản phẩm cuối cùng [12].

Động - thực vật biến đổi gen: Hiện nay, động vật và thực vật biến đổi

gen cũng được đưa vào ứng dụng để sản xuất các protein trị liệu [24], [25],

[32], [50]. Động vật biến đổi gen được thiết kế sao cho có thể tiết protein vào

các dịch thể dễ thu nhận như sữa (bò, cừu, dê...). Người ta đã tính toán và thấy

rằng sử dụng các động vật biến đổi gen để tổng hợp các protein trị liệu tái tổ

hợp sẽ có thể rẻ hơn bốn đến năm lần so với sử dụng các tế bào động vật có vú

nuôi cấy. Bên cạnh đó, thực vật, đặc biệt là ngô, cũng đã được nghiên cứu về

khả năng sản xuất các protein tái tổ hợp. Từ năm 1990, protein tái tổ hợp được

sản xuất từ cây thuốc lá và khoai tây chuyển gen để phục vụ cho y- dược đã bắt

đầu được thương mại hóa. Mười lăm năm tiếp theo, các loại DNA tái tổ hợp

được chuyển vào thực vật để thu nhận protein chữa bệnh như kháng sinh, sản

phẩm máu, cytokine, hormone sinh trưởng, enzyme tái tổ hợp, vaccine người và

động vật… [33]. Thực vật có nhiều ưu điểm hơn so với động vật trong việc tạo

ra các protein tái tổ hợp. Giống như nấm men, thực vật có khả năng tự thực

hiện nhiều khâu để tạo ra các protein phức tạp với chi phí cho trồng trọt khá

thấp. Sử dụng thực vật biến đổi gen không phát sinh các tranh cãi về đạo đức,

cũng như có thể tránh được các nguy cơ liên quan đến các virus, động vật, các

chất độc vi khuẩn. Tuy nhiên, hệ thống biểu hiện là thực vật biến đổi gen vẫn

còn một vài hạn chế. Thứ nhất, sản lượng protein tái tổ hợp do hệ thống biểu

hiện này sinh ra còn tương đối thấp. Thứ hai, tác dụng trị liệu của cùng một sản

phẩm protein có nguồn gốc thực vật và động vật là khác nhau. Ví dụ, nhiều

protein của người thường bị glycosyl hóa, nghĩa là sau khi được tạo ra, các

protein thường được gắn thêm một số gốc đường đặc trưng để giúp chúng kiểm

soát hoạt động chức năng một cách bình thường. Các nhà nghiên cứu đã thao

tác để vượt qua được hàng rào này bằng cách tạo ra các thực vật biến đổi gen

có thể tiến hành quá trình glycosyl hóa protein. Các thực vật biến đổi gen này

mang các gen của người mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình gắn các phân


tử đường vào protein. Một nhóm nghiên cứu ở Hà Lan đã tiến hành biến đổi vật

chất di truyền của một cây thuốc lá và sau đó lai cây thuốc lá biến đổi gen này

với một cây được thiết kế để sinh ra một loại kháng thể của chuột. Kết quả là

kháng thể này cũng có dạng glycosyl hóa, rất giống với kháng thể sinh ra bởi

chuột hơn bất kỳ kháng thể thực vật nào được sinh ra trước đó. Có thể thấy rõ

rằng, khoa học hiện đại có vai trò rất to lớn trong việc hoàn thiện các hệ thống

biểu hiện protein tái tổ hợp.

1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu gen/ protein có giá trị sử dụng trong y dược,

tiến tới biểu hiện sản xuất protein tái tổ hợp là rất cần thiết và mới được tiếp cận

nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây. Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành

phân lập, xác định trình tự một số gen từ các nguồn sinh vật khác nhau, trong đó có

cả gen người để nghiên cứu ứng dụng sản xuất dược phẩm công nghệ sinh học.

Trong đó, Viện Công nghệ sinh học đã thành công trong nghiên cứu tổng hợp

Trihobakin, protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật có khả năng ức chế các dòng tế

bào ung thư cũng như thành công trong việc tinh chế protein bất hoạt ribosome

(RIP) phân lập từ cây mướp đắng [2], [3]. Cũng tại Viện Công nghệ sinh học, gen

mã hóa interleukin-2 của người, tác nhân điều biến miễn dịch, được sử dụng trong

điều trị ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng đã được tách dòng và biểu hiện

[5], [6]; iterleukin-2 của người rh-LL2MM bị đột biến cũng được biểu hiện thành

công [4]. Ngoài ra, các nhà khoa học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại

học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh cũng đã triểu khai tạo dòng biểu hiện mini-

proinsulin của người trong E. coli [7]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu tạo vaccine tái

tổ hợp cũng được quan tâm nghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm [1]. Tuy nhiên,

cho đến nay chưa có một công bố nào về nghiên cứu sản xuất h-tPA tái tổ hợp ở

nước ta, vì vậy đề tài này sẽ làm tiền đề cho quá trình nghiên cứu và sản xuất chất

hoạt hóa plasminogen tái tổ hợp.


CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Vật liệu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vật liệu ban đầu là cDNA mã hóa

h-tPA đã được chọn dòng trong vector pUC18 (pUC18/ h-tPA) trong nghiên cứu

trước đây [10].

Vector biểu hiện gồm hai loại: pET21a(+) được mua từ Hãng Novagen (Mỹ)

và pGEX6p1 được mua từ Hãng Pharmacia.

Bản đồ hai vector được trình bày trong hình 2.1:

Hình 2.1. Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1

Chủng E.coli DH5α được mua từ Hãng Invitrogen (Mỹ) và chủng E.coli

BL21(DE3) pLysS Competent Cells từ Hãng Promega (Mỹ).


2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ nhiều hãng khác

nhau. Danh sách các hóa chất cần thiết, các dung dịch sử dụng và trình tự mồi được

trình bày tương ứng ở các Bảng 1, 3 và 4 trong phần Phụ lục.

2.1.3. Các thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Gen và phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng khác nhau. Các thiết bị

thường sử dụng được liệt kê ở Bảng 2 phần Phụ lục.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose

Mục đích: Điện di giúp phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau,

từ đó xác định được sự có mặt các đoạn DNA quan tâm.

Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên đặc tính tích điện của

hầu hết các phân tử. Các phân tử ở dạng ion khác nhau về mức độ ion hóa, kích

thước phân tử có thể tách riêng biệt theo khả năng di động trong trường điện từ về

hai cực âm (-) và dương (+). Các phân tử DNA có khối lượng và điện tích khác nhau

được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện

trường có điện thế và cường độ thích hợp.

Hóa chất điện di: agarose 0,8- 1,5% (phụ thuộc vào kích thước phân tử

DNA. Ở đây, chúng tôi sử dụng agarose nồng độ 0,8% bởi nồng độ này phù hợp với

kích thước của đoạn gen), dung dịch đệm TAE 1X.

Quy trình điện di:

- Chuẩn bị gel agarose: hòa tan 0,8 gram agarose vào 100ml dung dịch TAE

1X, đun sôi cho dung dịch tan hoàn toàn. Để nhiệt độ xuống khoảng 50- 60oC, đổ

dung dịch agarose vào khay gel điện di có cài sẵn lược thích hợp. Sau 30- 60 phút,

khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra và đặt vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách

mặt gel từ 1- 2 mm [48].


- Mẫu DNA được trộn với 3- 5l đệm tra mẫu và được tra vào các giếng trên

gel. Chạy điện di với hiệu điện thế 100V, 60- 80mA trong khoảng 30 phút.

- Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm 5 phút trong dung dịch EtBr nồng

độ 0,5g/ml, sau đó rửa sạch bằng nước.

- Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio- Rad với tia UV có bước sóng 320nm.

2.2.2. Điện di protein trên gel polyacyamide

Nguyên tắc: Các tiểu phần protein được xác định dựa vào tốc độ di chuyển

khác nhau của các tiểu phần protein trong trường điện. Ở một số điều kiện nhất

định, protein ở dạng ion và có mức độ ion hóa khác nhau, nên có thể tách riêng biệt

chúng theo khả năng di động trong trường điện từ về hai cực âm (-) và dương (+).

Kết quả nhận được phổ các vạch protein khác nhau. Phương pháp điện di là một

phương pháp nghiên cứu sinh hóa thông dụng và rất tiện lợi. Phương pháp điện di

protein thường được tiến hành trên chất mang ở dạng gel là lưới polymer. Lưới

polymer làm chậm tốc độ di chuyển các phân tử protein theo khối lượng, kích

thước, độ mang điện của chúng.

Phương pháp điện di protein trên gen polyacrylamit có chứa SDS được tiến

hành theo phương pháp của Laemmli [29]. Thành phần gel được trình bày ở Bảng

11 phần Phụ lục. Quy trình điện di như sau:

- Pha mẫu với Protein Sample Buffer 4X và biến tính mẫu ở 95oC trong 5

phút. Dùng 10 l mẫu tra vào từng giếng và tiến hành điện di trên gel

polyacrylamide 10% gồm gel cô 4% và gen tách 10%.

- Đổ dung dịch chạy (Running buffer) SDS- Page 1x và chạy điện di: Chạy

ở hiệu điện thế 110V trong 2- 3 giờ. Theo dõi đến khi thấy màu dung dịch đệm mẫu

bắt đầu thoát ra ngoài dung dịch đệm chạy thì kết thúc.

- Bản gel được nhuộm trong dung dịch nhuộm (Comasive Brilliant Blue

R250) trong khoảng từ 30 phút đến 1 giờ.

- Tẩy gel bằng cách ngâm bản gel đã nhuộm vào dung dịch tẩy (acid acetic

7%, metanol 20%) đến khi bản gel màu trắng thì kết thúc quá trình tẩy. Thời gian

tẩy khoảng 30 phút. Sau đó gel được bảo quản và chụp ảnh.


2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction-

PCR)

Phương pháp PCR nhằm mục đích khuyếch đại in vitro một đoạn DNA khi

biết trình tự hai đầu. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là nhờ sự xúc tác của enzyme

DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in

vitro trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu [48].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi là Cặp 1: h-tPA-NdeI

F2, h-tPA-XhoI R3; Cặp 2: h-tPA-BamHI F2, h-tPA-XhoI R4.

Các thành phần của PCR: đoạn DNA khuôn (cDNA mã hóa h-tPA được tạo

dòng trong vector pUC18), hai cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15- 30 nucleotide, bốn

loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), DNA polymerase.

PCR bao gồm các giai đoạn:

– Giai đoạn biến tính: DNA được biến tính ở nhiệt độ khoảng 94oC- 95

oC trong thời

gian một vài phút, khi đó các liên kết hydro bị đứt và sợi DNA dạng sợi kép thành

hai sợi đơn;

– Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 40oC- 65

oC trong khoảng 30 giây đến 1 phút,

hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ bắt cặp với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở

hai đầu đoạn DNA cần nhân. Nhiệt độ của bước gắn mồi tùy thuộc vào từng loại

mồi cụ thể, được tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi;

– Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ phản ứng được nâng lên 70oC- 80

oC (trung bình

khoảng 720C) trong khoảng thời gian thích hợp (tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần

tổng hợp), enzyme Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp DNA diễn ra;

Quy trình phản ứng được thực hiện trên máy PCR GeneAmp

PCR System

9700 với thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 5 phần Phụ lục, chu trình

nhiệt phản ứng như sau:

Chu trình nhiệt trên máy GenAmp

PCR System 9700 như sau:

94oC 94

oC 60

oC 72

oC 72

oC 4

oC

3’ 30’’ 30’’ 1’30’’ x30ck 10’


Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose

0,8%, sau đó được tinh sạch DNA theo kit Wizard SV Gel and Clean-Up System.

2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế

Nguyên tắc: Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết

các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt

cả hai sợi của phân tử DNA. Enzyme hạn chế cắt DNA hình thành hai dạng đầu: tạo

đầu bằng và tạo đầu dính.

Đối với sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành cắt bằng hai cặp enzyme

BamHI/XhoI và NdeI/XhoI. Vector pET21a(+) được xử lý bằng NdeI/XhoI và

pGEX6p1 được cắt bằng BamHI/XhoI. Thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng

6 phần Phụ lục. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích

hợp (thường ở 370C, 2 giờ). Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 0,8%;

Sau khi cắt bằng enzyme hạn chế, các vector được xử lý với phosphatase để

loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’ nhằm giảm quá trình nối lại của vector. Thành

phần phản ứng được trình bày ở Bảng 7 phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong

1h sau đó tiếp tục ủ ở 75oC trong 15 phút để loại CIP [48].

2.2.5. Ghép nối DNA

Nguyên tắc: Đoạn cDNA và vector được xử lý bằng cùng một loại enzyme

hạn chế tạo đầu bổ sung, các đầu này có trình tự bắt cặp với nhau. Dưới tác dụng của

enzyme T4 DNA ligase, đoạn DNA quan tâm sẽ được gắn vào vector. Thành phần

phản ứng ghép nối được trình bày ở Bảng 8 Phần Phụ lục.

Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ 14- 24 giờ, ở 16oC. Sản phẩm phản ứng

được biến nạp vào E. coli và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung Ampicillin

(Amp), nồng độ 50µg/ml [48].


2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng

pháp sốc nhiệt

Tùy từng mục đích khác nhau mà chúng tôi chuẩn bị các chủng vi khuẩn

khác nhau. Chủng tế bào dùng tạo dòng là vi khuẩn E. coli chủng DH5α. Để biểu

hiện, chúng tôi sử dụng vi khuẩn E. coli chủng BL21. Quy trình chuẩn bị và biến

nạp đối với hai chủng là tương tự nhau [48].

2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli

- Chủng vi khuẩn lấy từ ống giữ chủng được cấy ria trên môi trường LB đặc và

nuôi qua đêm ở 37oC; Ngày hôm sau lấy 1 khuẩn lạc rời từ đĩa cấy ria, nuôi lắc

200vòng/phút (v/p) ở 37oC trong môi trường LB lỏng từ 1- 2h; Ngày tiếp theo cấy

trải dịch nuôi ra đĩa chứa môi trường LB đặc. Nuôi qua đêm ở 37oC;

- Chọn 1 khuẩn lạc từ đĩa, cấy chuyển vào 1,5 ml môi trường LB lỏng, nuôi

qua đêm ở 37oC;

- Cấy chuyển 200l dịch nuôi sang 30 ml LB lỏng. Nuôi lắc trong 3h ở 37oC;

- Chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm. Giữ lạnh trên đá trong 10 phút;

- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút, ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; sau đó bổ sung 15 ml

dung dịch CaCl2 0,1M. Làm tan hết tủa tế bào trong dung dịch CaCl2. Ủ trên đá

trong 40 phút;

- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; bổ sung 1,5 ml dung

dịch CaCl2 0,1 M. Ly tâm nhẹ để hòa tan tủa tế bào vào dung dịch CaCl2;

- Chia ra các ống eppendorf và bổ sung 20 l glycerol 100%. Búng nhẹ để trộn

đều các thành phần với nhau (thao tác trong box). Giữ tế bào khả biến ở -80oC [48].

2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli

- Tế bào khả biến E. coli được giữ trên đá khoảng 30 phút, sau đó bổ sung 5l

của sản phẩm ghép nối vào ống tế bào khả biến (khoảng 100l). Giữ trong đá

khoảng 15 phút;


- Sốc nhiệt ở 42oC trong 70 giây, sau đó chuyển ngay sang bình đá và giữ

trong đá 5 phút;

- Bổ sung 300l môi trường LB lỏng;

- Nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1giờ;

- Cấy trải hết dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Amp

(50g/ml), nuôi ở 37oC qua đêm [48].

2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid

Nguyên tắc: Tách chiết plasmid dựa trên hai nguyên ngắc cơ bản là DNA

nhiễm sắc thể của E. coli có kích thước lớn hơn rất nhiều so với DNA plasmid; do

trọng lượng, kích thước khác nhau giữa các dạng DNA E. coli mà hầu hết DNA

plasmid tách ra dưới dạng vòng đóng [48].

Hóa chất tách chiết DNA plasmid gồm: Sol I, Sol II, Sol III, dung dịch loại

protein (hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol = 24:1), dung dịch TE 0,01M, pH 8,0.

Quy trình tách chiết DNA plasmid của E. coli

- Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào E. coli trong 1,7ml môi trường LB (có kháng

sinh Amp nồng độ 50g/ml) ở 370C, 200 v/p; Ngày hôm sau, ly tâm dịch nuôi cấy

trên ở 6.000 v/p, 7 phút; loại bỏ dịch;

- Hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 150l dung dịch I để lạnh, voltex làm tan cặn

tế bào, sau đó giữ trong đá 5 phút;

- Bổ sung 150l dung dịch II, đảo đầu ống Eppendorf nhẹ nhàng và giữ trên đá

10 phút;

- Thêm 150l dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3 – 5 phút;

- Thêm 500 l dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ thể tích 24:1).

Đảo đều hỗn hợp;

- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Chiết và chuyển pha lỏng ở phía trên

sang một ống eppendorf mới; Thêm 50 l CH3COONa 3 M (pH 5,2) và 1 ml cồn

100 %. Đảo đều và giữ lạnh ở -200C trong 3 giờ;

- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC để thu tủa DNA;


- Rửa cặn bằng 0,2ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút, làm khô và

hoà cặn trong 40l TE 0,01M, giữ ở -20oC; Sau đó đổ bỏ cồn. Làm khô tủa bằng

máy SpeedVac trong 5 phút;

- Hòa tan tủa DNA trong 50 l nước chứa RNase (0,01 mg/ml). Bảo quản

DNA ở -20oC; Kiểm tra DNA bằng gel agarose 0,8 %.

Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm tra

bằng enzyme hạn chế và PCR kiểm tra. Thành phần cắt kiểm tra được nêu ở Bảng 9

phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 2h. Thành phần và chu trình nhiệt của

phản ứng PCR kiểm tra giống với quá trình nhân gen. Sản phẩm cắt và PCR kiểm

tra được điện di trên gel agarose 0,8%.

2.2.8. Xác định trình tự gen

Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM

3100 Genetic Analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye

Terminator v3.1 Cycle

Sequencing.

Thành phần hỗn hợp sử dụng trong xác định trình tự DNA bao gồm cả

dNTPs và ddNTPs, là các nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh

quang khác nhau. Mồi đọc trình tự đối với vector pET21a(+) là cặp mồi T7, đối với

vector pGEX6p1 là cặp mồi PEXF/PEXR. Phản ứng gắn các nucleotide đánh dấu

vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn được tiến hành trên máy PCR. Quá trình tổng

hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP được lắp vào, kết quả là tạo

ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide. Sau đó sản phẩm

PCR được điện di trên gel có độ phân giải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn

hơn kém nhau một nucleotide [48].

Thành phần PCR xác định trình tự được trình bày ở Bảng 10 phần Phụ lục.

Chu trình nhiệt trên máy GenAmp

PCR System 9700 như sau:

96oC 96

oC 50

oC 60°C 4

oC

1’ 10’’ 5’’ x25ck 4’ ∞

- Tiếp đó, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp tủa cồn/EDTA:


- Bổ sung 4l EDTA 125mM có pH 8,0 và 60l cồn 100%. Đảo nhẹ hỗn hợp

và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại

bỏ cồn.

- Rửa tủa bằng 60l cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút và làm khô.

- Bổ sung 10l Hi–DiTM

Formamide và biến tính ở 95oC trong 5 phút. Các

mẫu được cho vào các giếng của khay đựng mẫu. Điện di trong ống vi mao quản 80

cm x 50 m chứa POP- 4TM

.

Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM

3100 Data Collection

v2.0, Seqscape v2.5 và BioEdit v7.0.5.

2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli

Sau khi plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa h-tPA được biến nạp thành

công vào tế bào biểu hiện E.coli chủng BL21, protein tái tổ hợp được tiến hành biểu

hiện và kiểm tra theo các bước sau:

- Chọn một khuẩn lạc (E. coli BL21) nuôi lắc ở 200 v/p trong 5ml LB lỏng có

bổ sung Amp (100g/ml) ở 37oC qua đêm;

- Ngày tiếp theo, hút 2ml dịch vi khuẩn trên vào 100 ml LB lỏng có bổ sung Amp

(100g/ml). Tiếp tục nuôi lắc ở 200 v/p ở 37oC đến OD600= 0,6- 0,8;

- Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG nồng độ 1mM. (Tỷ lệ 100 l IPTG cho

100ml dịch nuôi). Để tế bào tiếp tục sinh trưởng trong 3h;

Kiểm tra biểu hiện: hút 1ml dung dịch nuôi cấy sang ống eppendoft mới. Ly

tâm thu tế bào và bổ sung 100 µl loading dye. Voltex phá tế bào, biến tính protein

trong 5 phút ở 95oC;

- Dùng 10l mẫu để điện di SDS-PAGE cùng với thang chuẩn protein và mẫu

đối chứng âm là dịch phá màng của E.coli BL21 và dịch phá màng E.coli BL21chứa

vector rỗng được cảm ứng IPTG;

- Phần dịch nuôi cấy còn lại được ly tâm thu tế bào. Giữ tế bào ở -20oC chờ

bước tinh chế protein.


Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA

3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hoá h-tPA bằng kỹ thuật PCR

Gen mã hóa h-tPA sử dụng trong nghiên cứu đã được tạo dòng trong vector

pUC18. Để kiểm tra cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự

cDNA mã hóa h-tPA trong vector pUC18 sử dụng cặp mồi M13, sau đó trình tự này

được phân tích và so sánh với trình tự NM000930 trên Ngân hàng Gen Quốc Tế. Kết

quả phân tích và so sánh cho thấy, trình tự cDNA trong vector pUC18 có độ tương

đồng tới 99% với trình tự so sánh, các điểm đột biến giữa h-tPA với trình tự

NM000930 không làm thay đổi trình tự acid amin. Trình tự bao gồm đầy đủ các thành

phần cần thiết cho biểu hiện gen như mã mở đầu, mã kết thúc, đúng khung đọc...

Sau khi xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR

với hai cặp mồi đặc hiệu và khuôn là vector pUC18 tái tổ hợp để tạo dòng cDNA

này trong vector biểu. Hai cặp mồi đã được chúng tôi thiết kế mang các trình tự

nhận biết của enzyme hạn chế để sử dụng cho các quá trình ghép nối gen và kiểm

tra sản phẩm. Việc thiết kế thêm trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế vào mồi

tuân theo một số nguyên tắc như trình tự nhận biết chỉ có một vị trí trong vùng gắn

đa vị của vector và không có mặt trong gen cần tạo dòng; số nucleotide phía ngoài

trình tự nhận biết từ 3- 6 nucleotide nhằm bảo vệ các trình tự này và giúp các

enzyme cắt tốt hơn. Trong nghiên cứu này, đối với vector pGEX6p1 chúng tôi sử

dụng hai enzyme là BamHI và XhoI, vì chúng có mặt trong vùng cắt gắn đa vị của

vector biểu hiện pGEX6p1; đối với vector pET21a(+), chúng tôi đã sử dụng hai

enzyme NdeI và XhoI. Các enzyme này đều không có điểm cắt trên cDNA mã hoá

h-tPA. Trình tự hai cặp mồi như sau:

Cặp 1:

htPA-NdeI F2: 5’-GTG AAG CAC ATA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G-3’

htPA-XhoI R3: 5’-GTG GTG CTC GAG CGG TCG CAT GTT GTC-3’


Cặp 2:

htPA-BamHI F2: 5’-ATT CCG TGG ATC CAC CAT GGA TGC AAT GAG G-3’

htPA-XhoI R4: 5’-GTG GTG CTC GAG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’

Kỹ thuật PCR là phương pháp được sử dụng nhằm nhân một đoạn DNA nằm

giữa hai vùng đã biết trình tự. Hai đoạn oligonucleotide được sử dụng như mồi cho

một loạt phản ứng tổng hợp được xúc tác bởi enzyme DNA polymerase. Các đoạn

oligonucleotide có trình tự khác nhau và bổ sung cho trình tự nằm ở hai đầu của

trình tự DNA mẫu được nhân lên. DNA mẫu bị biến tính bởi nhiệt độ trong sự có

mặt của hai đoạn oligonucleotide và bốn loại dNTPs. Hỗn hợp phản ứng sau đó

được hạ xuống tới nhiệt độ cho phép mồi oligonucleotide bám vào trình tự đích, tiếp

theo mồi được kéo dài bởi DNA polymerase. Số chu kỳ được nhắc lại nhiều lần từ

25 đến 35 chu kỳ. Bởi vì sản phẩm của một vòng của quá trình nhân là mẫu cho quá

trình tiếp theo, mỗi chu kỳ cho hai sản phẩm DNA nên số lượng sản phẩm là phản

ứng mũ một đoạn đôi DNA được xác định bởi đầu cuối 5’ của đoạn mồi

oligonucleotide và chiều dài được xác định bởi khoảng cách giữa hai mồi. Hai cặp

mồi này có thể được thiết kế theo yêu cầu của nghiên cứu. Việc nhân gen bằng PCR

từ vector dễ hơn so với nhân gen từ hệ gen nên thường thu được lượng sản phẩm

lớn, đặc hiệu do số điểm bám của mồi trên vector tái tổ hợp ít, tỷ lệ bám mồi cao...

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành phản ứng nhân cDNA mã

hóa h-tPA. Thành phần và chu trình nhiệt được trình bày ở phần 2.2.3. Sản phẩm

PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di được thể

hiện ở hình 3.1.


Hình 3.1. Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA

M: Marker 1kb

1: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 1

2: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 2

Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử

khoảng 1,7kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết. Băng

chính đều sáng, đậm, rõ nét và sẽ được tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành

ghép nối gen.

3.1.2. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+)

3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hoá h-tPA bằng enzyme

hạn chế

Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi đã tiến hành chiết và làm sạch

sản phẩm qua cột theo kit Wizard® SV Gel and Clean- Up System. Hệ thống này

dựa trên khả năng kết hợp của DNA với màng silica trong sự có mặt của hỗn hợp

muối, hệ thống màng có thể kết hợp với 40µg DNA và cho phép thu hồi sản phẩm

PCR trong 15 phút. Quá trình tinh sạch này giúp loại bỏ khỏi sản phẩm PCR các

thành phần không mong muốn như các đoạn DNA vệ tinh, các NTPs... Sau khi tinh

sạch, hai mẫu sản phẩm PCR được xử lý bằng hai cặp enzyme hạn chế tương ứng là

Formatted: Font: 13 pt, Do not check spellingor grammar


NdeI/XhoI và BamHI/XhoI. Thành phần và quá trình xử lý được trình bày ở mục

2.2.4. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.

3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế

Sau khi nghiên cứu tài liệu và điều kiện vật chất phòng thí nghiệm, chúng tôi đã

tiến hành biểu hiện protein h-tPA trên vi khuẩn E. coli chủng BL21 với hai vector biểu

hiện là pET21a(+) và pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA. Vector pET21a(+) là vector

mạnh để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Gen đích được tạo dòng

trong plasmid pET21a(+) được điều khiển bởi tín hiệu dịch mã tốt của phage T7, biểu

hiện dưới sự tổng hợp của T7 RNA polymerase trong tế bào chủ. Vector pET21a(+) là

vector mang trình tự T7 ở đầu N và trình tự đuôi His ở đầu C. Vector này mang chỉ thị

chọn lọc là gen kháng kháng sinh (kháng Amp và Kanamycin). Vùng tạo dòng/ biểu hiện

được điều khiển bởi T7 polymerase. Trình tự này được xác định, giải trình tự khi sử dụng

mồi đầu T7. Hệ thống biểu hiện này được cảm ứng bởi IPTG hoặc lactose trong quá trình

nuôi cấy.

Vector pGEX6p1 điều khiển tổng hợp protein ngoại lại bởi promoter tac,

promoter này được cảm ứng bởi isopropyl b-D thiogalactoside (IPTG). Vector pGEX6p1

được thiết kết gồm có một gen lacIq, sản phẩm gen lacIq là protein ức chế kết hợp với

vùng operator trên promoter tac, làm ngăn cản quá trình biểu hiện cho tới khi cảm ứng

bởi IPTG, qua đó điều khiển quá trình biểu hiện của gen được thêm vào. Đầu 3’ vùng đa

nối có chứa đoạn gen mã hoá Glutathione S- Transferase - GST, đây là một protein giúp

quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp dễ hơn. Ngoài ra, vector pGEX6p1 có một số ưu

điểm như: mức độ biểu hiện cao, điều kiện tinh sạch protein đơn giản, ảnh hưởng của

kháng nguyên và chức năng của protein là nhỏ nhất.

Quá trình cắt mở vòng hai vector cũng sử dụng hai cặp enzyme là NdeI/XhoI và

BamHI/XhoI tương tự như đối với sản phẩm PCR. Thành phần và quá trình xử lý đối với

vector pET21a(+) và pGEX6p1 được trình bày ở phần 2.2.4. Sau khi cắt với enzyme,

vector được xử lý với phosphatase để loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’, làm giảm quá

trình tự nối của vector. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.


Hình 3.2. Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện

bằng enzyme hạn chế

Kết quả điện di trên hình 3.2 cho thấy sản phẩm cắt tương đối sạch và đủ

điều kiện tiến hành phản ứng ghép nối.

3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và

pET21a(+)

Chúng tôi đã tiến hành ghép nối cDNA mã hóa h-tPA với các vector

pET21a(+) và pGEX6p1 tạo các vector tái tổ hợp mang gen mã hoá h-tPA. Do cả

sản phẩm PCR và vector đều đã được xử lý bằng hai enzyme tương ứng nên dưới

tác dụng của enzyme T4 ligase, sản phẩm PCR và vector có thể nối lại với nhau tạo

vector tái tổ hợp. Thành phần và phản ứng ghép nối giữa vector và sản phẩm PCR

đã trình bày ở phần 2.2.5. Phản ứng ghép nối được tiến hành ở 16oC, qua đêm.

3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA

3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phƣơng pháp

sốc nhiệt

Sản phẩm lai giữa vector và sản phẩm PCR được biến nạp vào tế bào E. coli

chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt trong 70 giây ở 42oC. Các tế bào này sau

đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ ml) ở 37°C qua

M: Marker 1kb

1: Vector pGEX6p1/BamHI+XhoI

2: Vector pET21a(+)/NdeI+XhoI

3: cDNA h-tPA/NdeI+XhoI

4: cDNA h-tPA/BamHI+XhoI



đêm. Kết quả, chúng tôi đã thu được rất nhiều khuẩn lạc, là các dòng tế bào vi khuẩn

khác nhau. Do trong môi trường có chất kháng sinh nên chỉ có những khuẩn lạc nào

mang vector mới mọc được, các dòng tế bào vi khuẩn này gồm 2 loại tế bào khác

nhau: tế bào mang vector nhưng không mang đoạn chèn và tế bào mang vector và

đoạn chèn. Vì vậy để xác định dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp, chúng tôi đã

tiến hành sàng lọc thông qua tách chiết plasmid, xử lý bằng enzyme hạn chế, PCR

và xác định trình tự.

3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA

Tách chiết DNA plasmid

Plasmid được tách chiết nhằm xác định vector nào mang đoạn chèn và vector

nào không mang đoạn chèn. Phương pháp tách plasmid được trình bày ở mục 2.2.7.

Để tách chiết DNA plasmid, một số khuẩn lạc được nuôi cấy trong môi trường LB

lỏng có bổ sung Amp ở 37oC từ 12- 14h. Phương pháp tách chiết plasmid gồm 3 bước

chính: thu nhận và phân giải tế bào, làm sạch plasmid và kết tủa DNA. Dung dịch I (sol I)

có tác dụng rửa sạch tế bào, dung dịch II (sol II) có chứa SDS và NaOH có tác dụng phá

màng tế bào và ức chế hoạt động của nuclease, không cho chúng phân giải DNA do Mg2+

(một nhân tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease) bị liên kết với EDTA, khi cho tiếp

dung dịch III (sol III) có chứa axetate và axetic acid thì pH môi trường chuyển thành acid

yếu gần với điểm đẳng điện của DNA, vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và dễ

dàng tách được nhờ ly tâm. Do trong tế bào vi khuẩn có chứa hai dạng DNA là DNA

nhiễm sắc thể và DNA plasmid nên việc tách và tinh sạch DNA plasmid là rất quan trọng,

DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dụng dịch I, II, III.

Do DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn và liên kết chặt chẽ với protein nên

khoảng thời gian ngắn giữa các lần thêm dung dịch không kịp thoát ra ngoài.

DNA plasmid thu được sau khi tách chiết từ tế bào vi khuẩn thường tồn tại ở

3 dạng: dạng siêu xoắn được tạo ra do liên kết hydro giữa một số phần của phân tử

DNA plasmid hay do lực hút tĩnh điện giữa các phần của phân tử với nhau, dạng

vòng mở do bị đứt gãy một mạch đơn của chuỗi DNA mạch kép và dạng mạch


thẳng khi cả hai mạch DNA dều bị đứt gãy. Dạng siêu xoắn có cấu trúc không gian

gọn nên khi điện di chúng thường chạy nhanh nhất, tiếp đến là mạch thẳng và cuối

cùng là mạch vòng. DNA sau đó được hoà tan trong dung dịch RNase 0,01mg/ml

nhằm loại bỏ RNA và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Theo lý thuyết khi một DNA plasmid mang gen ngoại lai, chúng sẽ có kích

thước bằng tổng kích thước của plasmid và kích thước của gen ngoại lai. Do vậy

trong điện di đồ, chúng sẽ chạy chậm hơn (thấp hơn) so với đối chứng âm (các

plasmid chưa mở vòng), dựa vào đó chúng ta có thể kết luận sơ bộ được những

plasmid này có kích thước lớn hơn và có thể chúng mang gen ngoại lai.

Hình 3.3. Chọn dòng pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA)



ĐC: Đối chứng âm

1- 7: DNA plasmid của các dòng pGEX6p1

Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các đường chạy đều xuất hiện 2 băng chạy

trước rõ nét hơn, điều đó chứng tỏ lượng DNA plasmid của chúng tôi thu được tồn

tại ở dạng siêu xoắn nhiều hơn dạng thẳng. Hình 3.3 cho thấy, đối với các dòng

mang vector pGEX6p1, dòng 1 và 3 (ký hiệu pGEX/htPA p1 và pGEX/htPA p3) là

hai dòng có kích thước lớn hơn các dòng khác và lớn hơn so với đối chứng âm; do

vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA.

Đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có thể mang

cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).

Formatted: Centered


Hình 3.4. Chọn dòng pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA)

ĐC: Đối chứng âm (vector pET21a(+) không mang h-tPA)

1- 5: DNA plasmid của các dòng pET21a(+)

Tương tự, đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có kích

thước lớn hơn các dòng khác và đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang

cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).


Formatted: Space After: 0 pt


Để chứng minh chính xác xem đoạn xen vào plasmid có phải là đoạn gen mã

hoá h- tPA hay không, chúng tôi đã tiếp tục kiểm tra bằng enzyme hạn chế, tiến

hành PCR và giải trình tự.

Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng xử lý

enzyme hạn chế

Hai cặp enzyme NdeI/XhoI và BamHI/XhoI đã được sử dụng để tạo đầu bổ

sung cho vector và đoạn chèn nên để kiểm tra, chúng tôi cũng sử dụng hai cặp

enzyme này nhằm kiểm tra các dòng được chọn có mang đoạn chèn hay không.

Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm xử lý enzyme của plasmid tái tổ hợp bao gồm

hai đoạn gen, một đoạn có kích thước tương ứng với vector gốc (vector mở vòng)

và một đoạn có kích thước tương ứng với đoạn chèn (cDNA mã hóa h-tPA). Thành

phần và quy trình phản ứng được tiến hành như trình bày ở mục 2.2.4. Các sản

phẩm xử lý enzyme được điện di trên gel agarose 0,8%.

Hình 3.5. Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA

bằng enzyme hạn chế

Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, sau khi xử lý các vector tái tổ hợp bằng hai

cặp enzyme tương ứng, chúng tôi thu được hai băng có kích thước khác nhau; đối

M: Marker 1kb

1: pGEX/htPA p1

2: pGEX/htPA p3

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt


Formatted: Space After: 0 pt


với vector pGEX6p1, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 5kb

(tương ứng với kích thước của vector pGEX6p1 khi xử lý bằng hai enzyme BamHI/

XhoI) và một băng có kích thước 1,7kb (tương ứng với kích thước cDNA mã hoá h-

tPA). Đối với vector pET21a(+), chúng tôi cũng thu được một băng có kích thước

khoảng 5,5kb (tương ứng với kích thước vector pET21a(+)) và một băng có kích

thước khoảng 1,7kb (tương ứng với kích thước cDNA mã hoá h-tPA). Như vậy,

chúng tôi sơ bộ kết luận là đã chọn được một số dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn

gen phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR h-tPA.

Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR

Để khẳng định lại các dòng plasmid tái tổ hợp đã được chọn có mang đúng

đoạn gen mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR với việc sử dụng các plasmid

được chọn làm khuôn để nhân đoạn h-tPA với các cặp mồi đặc hiệu. DNA mẫu để

chạy PCR là pGEX/htPA p3 và pET/htPA p1. Kết quả kiểm tra các vector tái tổ hợp

bằng kỹ thuật PCR được trình bày trên hình 3.6.

Hình 3.6. Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA

bằng kỹ thuật PCR

M: Marker 1kb

1: PCR sử dụng khuôn là pET/htPA p1

2: PCR sử dụng khuôn là pGEX/htPA p3



Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của các dòng mang kiểm tra này

đều xuất hiện băng với kích thước khoảng 1,7 kb, đúng với kích thước cDNA mã

hóa cho h-tPA. Như vậy, các dòng được chọn làm khuôn trong thí nghiệm PCR đều

có mang cDNA mã hóa h-tPA. Các dòng này đã được chúng tôi tinh sạch phục vụ

cho xác định trình tự.

3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hoá h-tPA

Mặc dù đã được xác định trình tự trong vector tạo dòng pUC18, tuy nhiên,

khi nhân lại cDNA này bằng enzyme Taq DNA polymerase có khả năng phát sinh

các điểm đột biến. Vì vậy, sau khi chọn được các dòng mang cDNA mã hoá h-tPA,

trước khi tiến hành biểu hiện, chúng tôi đã tinh sạch và một lần nữa xác định trình

tự cả hai chiều đoạn cDNA bằng hai cặp mồi: cặp mồi T7 đối với vector pET21a(+)

và cặp mồi PEXF/PEXR đối với vector pGEX6p1 trên máy xác định trình tự tự

động. Trình tự DNA sau đó được xử lý trên các phần mềm: BioEdit, Sequencing

analysis 7.0. Sau khi sử lý số liệu, chúng tôi đã thu được đoạn gen có kích thước

khoảng 1700bp. Phổ trình tự của các dòng plasmid đều rõ ràng, không có tín hiệu

nhiễu. Kết quả phân tích và so sánh với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen

Quốc tế như sau:

10 20 30 40 50 60

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt

MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 tcgcccagccaggaaatccatgcccgattcagaagaggagccagatcttaccaagtgatc

SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerTyrGlnValIle

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 tgcagagatgaaaaaacgcagatgatataccagcaacatcagtcatggctgcgccctgtg

CysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgProVal


pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


190 200 210 220 230 240

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ctcagaagcaaccgggtggaatattgctggtgcaacagtggcagggcacagtgccactca

LeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSer

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 gtgcctgtcaaaagttgcagcgagccaaggtgtttcaacgggggcacctgccagcaggcc

ValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGlnAla

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


310 320 330 340 350 360

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ctgtacttctcagatttcgtgtgccagtgccccgaaggatttgctgggaagtgctgtgaa

LeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCysGlu

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


370 380 390 400 410 420

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 atagataccagggccacgtgctacgaggaccagggcatcagctacaggggcacgtggagc

IleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSer

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


430 440 450 460 470 480

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 acagcggagagtggcgccgagtgcaccaactggaacagcagcgcgttggcccagaagccc

ThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysPro

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


490 500 510 520 530 540

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 tacagcgggcggaggccagacgccatcaggctgggcctggggaaccacaactactgcaga

TyrSerGlyArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCysArg

pET21a(+) ....................T.......................................


pGEX6p1 ....................T.......................................



550 560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 aacccagatcgagactcaaagccctggtgctacgtctttaaggcggggaagtacagctca

AsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSerSer

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


610 620 630 640 650 660

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 gagttctgcagcacccctgcctgctctgagggaaacagtgactgctactttgggaatggg

GluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGly

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


670 680 690 700 710 720

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 tcagcctaccgtggcacgcacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaat

SerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


730 740 750 760 770 780

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 tccatgatcctgataggcaaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggc

SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGly

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


790 800 810 820 830 840

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ctgggcaaacataattactgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtg

LeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisVal

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


850 860 870 880 890 900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ctgaagaaccgcaggctgacgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggc

LeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGly

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................



910 920 930 940 950 960

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ctgagacagtacagccagcctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcc

LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


970 980 990 1000 1010 1020

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 tcccacccctggcaggctgccatctttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttc

SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPhe

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1030 1040 1050 1060 1070 1080

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ctgtgcgggggcatactcatcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccag

LeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGln

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1090 1100 1110 1120 1130 1140

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 gagaggtttccgccccaccacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccct

GluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValPro

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1150 1160 1170 1180 1190 1200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ggcgaggaggagcagaaatttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgat

GlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1210 1220 1230 1240 1250 1260

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 gacacttacgacaatgacattgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcc

AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAla

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1270 1280 1290 1300 1310 1320

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 caggagagcagcgtggtccgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggac

GlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAsp


pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1330 1340 1350 1360 1370 1380

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 tggacggagtgtgagctctccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcg

TrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSer

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1390 1400 1410 1420 1430 1440

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 gagcggctgaaggaggctcatgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacat

GluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1450 1460 1470 1480 1490 1500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ttacttaacagaacagtcaccgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcggg

LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGly

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1510 1520 1530 1540 1550 1560

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 ccccaggcaaacttgcacgacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctg

ProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeu

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1570 1580 1590 1600 1610 1620

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 aacgatggccgcatgactttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaag

AsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLys

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................


1630 1640 1650 1660 1670 1680

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

NM_000930 gatgtcccgggtgtgtacaccaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatg

AspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet

pET21a(+) ............................................................


pGEX6p1 ............................................................



....|....

NM_000930 cgaccgtga

ArgProEnd

pET21a(+) ......---

ArgPro

pGEX6p1 .........

ArgProEnd

Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA và

pET21a(+)/h-tPA với NM_000930

Từ kết quả so sánh trên, chúng tôi nhận thấy trình tự cDNA mã hóa h-tPA

được tạo dòng trong hai vector biểu hiện hoàn toàn không thay đổi so với trình tự

cDNA đã xác định được trong vector tạo dòng pUC18. So với NM_000930, trình tự

cDNA của chúng tôi không có sự thay đổi nào đáng kể, chỉ có một sai khác nằm ở

vị trí 499 của cDNA mã hóa h-tPA. Ở trình tự NM_000930, vị trí 499 nucleotitde

này là C được thay thế bằng nucleotide T trong trình tự chúng tôi đang nghiên cứu

biểu hiện. Tuy nhiên trình tự này không làm thay đổi trình tự acid amin, vì vậy

không ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng của protein. Ở vector pET21a(+), không

có trình tự kết thúc do chúng tôi thiết kế mồi PCR nhằm gắn đuôi His vào giúp quá

trình tinh sạch protein h-tPA sau này được dễ hơn.

3.2. Biểu hiện gen

3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp

Trong nghiên cứu này, sau khi thu được các dòng plasmid mang gen cDNA

mã hoá h-tPA, để biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi đã tiến hành biến nạp

hai vector tái tổ hợp (pET21a(+) và pGEX6p1) mang gen mã hoá h-tPA vào tế bào

vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) plysS. Các dòng tế bào này sau đó được cấy

chuyển và tiếp tục nuôi lắc 200 v/p trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp ở

37oC cho tới khi OD= 0,6 thì tiến hành cảm ứng IPTG 0,1mM. Đối với vector biểu

hiện pGEX6p1, theo tính toán lý thuyết, protein h-tPA tái tổ hợp có khối lượng

phân tử khoảng 95kDa (bằng tổng khối lượng của protein h-tPA (70 kDa) và đoạn

GST (26,4 kDa)); còn đối với vector biểu hiện pET21a(+), khối lượng phân tử

protein tái tổ hợp thu được khoảng 72kDa.


Sau mỗi giờ từ khi cảm ứng IPTG chúng tôi đã tiến hành thu 1ml dịch tế bào

nhằm kiểm tra độ biểu hiện của tế bào. Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi thu được dịch

tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến

hành điện di protein trên gel polyacrylamide 10%.

3.2.2. Kiểm tra protein bằng phƣơng pháp điện di trên SDS-PAGE

Đối với vector biểu hiện pGEX6p1 mang h-tPA, kết quả phân tích SDS-

PAGE cho thấy các mẫu thí nghiệm đã xuất hiện một băng protein mới có kích

thước khoảng 95kDa so với các mẫu đối chứng. Đây rất có thể là dạng protein dung

hợp giữa h-tPA (72kDa) với đuôi GST (26,4kDa) của vector pGEX6p1.

Mẫu đối chứng âm chúng tôi sử dụng là dịch phá màng của tế bào BL21 có

chứa vector pGEX6p1 gốc (giếng 5) và dịch phá màng của E.coli BL21 không

mang vector (giếng 7) có cảm ứng IPTG. Các mẫu đối chứng âm này cũng xuất

hiện băng nhưng kích thước nhỏ và không rõ nét. Có thể ở những mẫu này, tế bào

chủ có tổng hợp một số protein có cùng kích thước nhưng hàm lượng thấp. Ở giếng

5 xuất hiện băng đậm có kích thước 26,4kDa, đây là băng GST đã được tổng hợp

tuy nhiên do plasmid không mang gen cDNA mã hóa h-tPA nên trong quá trình

tổng hợp protein, h-tPA không được tổng hợp.


Hình 3.8. Điện di kiểm tra protein h-tPA trong pGEX/h-tPA p3

M: Marker

1, 2, 3, 4: Mẫu thu được sau 0h, 1h, 2h, 3h cảm ứng IPTG

5: Dòng tế bào mang vector pGEX6p1

6: Mẫu thu được sau 3h cảm ứng IPTG

7: Dòng tế bào không mang vector

Để xác định được thời điểm tại đó lượng protein được tổng hợp là cao nhất,

chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trong 3h sau khi cảm ứng. Sau khoảng thời gian

0h, 1h, 2h, 3h chúng tôi đã tiến hành thu mẫu. Kết quả cho thấy kích thước và độ



đậm của băng này tăng theo thời gian sau khi cảm ứng IPTG và đậm nhất tại thời

điểm 3h sau cảm ứng.

Kết quả này cho thấy dòng tế bào E.coli BL21 có mang plasmid pGEX6p1

tái tổ hợp có khả năng tổng hợp protein dung hợp GST-htPA. Tuy nhiên hàm lượng

protein tái tổ hợp còn thấp so với tổng lượng protein được tổng hợp.

Song song với thí nghiệm biểu hiện h-tPA trong vector pGEX6p1, chúng tôi

cũng tiến hành biểu hiện protein h-tPA trong vector pET21a(+) trên tế bào chủ

E.coli BL21.

Sau khi thu được dịch protein, chúng tôi đã điện di trên gel polyacrylamide

10% với thang protein chuẩn và các đối chứng âm. Các đối chứng âm ở đây cũng là

dịch phá màng tế bào E. coli BL21 không mang vector và có mang vector

pET21a(+) đều được cảm ứng IPTG.


Hình 3.9. Điện di protein h-tPA trong pET21/h-tPA p1

M: Marker

1: Dòng tế bào BL21

2: Dòng tế bào BL21 mang vector pET21a(+) gốc

3, 4, 5, 6: Mẫu thu được sau 0h, 1h, 2h, 3h cảm ứng IPTG

Sau khi thu được dịch protein, chúng tôi đã điện di trên gel polyacrylamide

10% với thang protein chuẩn và các đối chứng âm. Các đối chứng âm ở đây cũng là



dịch phá màng tế bào E. coli BL21 không mang vector và có mang vector

pET21a(+) đều được cảm ứng IPTG.

Kết quả điện di cho thấy không có sự khác biệt nhiều về số lượng và độ đậm

nhạt băng giữa các dòng E.coli BL21 mang vector pET21a(+)/h-tPAvới các đối

chứng âm (giếng 1 và giếng 2).

Ở vị trí 72kDa có xuất hiện băng nhưng giữa các mẫu điện di là giống nhau.

Nếu h-tPA không được biểu hiện thì băng 72kDa này là protein có cùng khối lượng

của tế bào E.coli được tổng hợp. Nếu gen h-tPA được tổng hợp thì hàm lượng

protein được tổng hợp là rất thấp so với tổng lượng protein của tế bào chủ.

Để có những kết luận chính xác về quá trình biểu hiện của cDNA mã hóa h-

tPA, cần có những nghiên cứu khác như: lai Western Blot, hay kỹ thuật Elisa...

nhằm khẳng định protein h-tPA được tổng hợp. Mặt khác, các điều kiện thí nghiệm

khác cũng cần được nghiên cứu tối ưu để quá trình biểu hiện cho lượng protein h-

tPA là lớn nhất và tiến tới ứng dụng quy trình biểu hiện.

Cũng cần nhấn mạnh rằng, mặc dù hệ thống biểu hiện gen của sinh vật bậc

cao trên đối tượng vi khuẩn E. coli bên cạnh nhiều ưu điểm như: môi trường nuôi

cấy rẻ; dễ điều khiển quá trình biểu hiện; hàm lượng protein thu được lớn (đến 30%

tổng protein tế bào).... còn tồn tại một vài nhược điểm. Đây là một quá trình phức

tạp và khó thực hiện do hệ thống này chỉ biểu hiện tốt đối với protein có kích thước

nhỏ hơn 80 acid amin, đối với các protein có kích thước lớn thì hệ thống biểu hiện

E.coli có thể tổng hợp được protein nhưng protein này có thể không cuộn xoắn; bộ

ba mã hóa ở E.coli có sự khác biệt nhiều với bộ ba mã hóa ở sinh vật bậc cao; các

quá trình cải biến sau dịch mã thường không có; khả năng biểu hiện một protein

đơn lẻ không tốt..... Đối với h-tPA, đã có nhiều công trình công bố biểu hiện được

trên E. coli nhưng hàm lượng protein thu được chưa cao. Vì vậy, việc nghiên cứu

biểu hiện trên các đối tượng khác như nấm men, tế bào côn trùng, tế bào động vật

cũng được quan tâm ở nhiều phòng thí nghiệm.


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

1. Đã tạo được hai vector biểu hiện pGEX6p1 và pET21a(+) mang cDNA mã

hóa h-tPA có kích thước khoảng 1,7kb.

2. Đã xác định trình tự nucleotide của cDNA mã hóa h-tPA. So sánh trình tự

nucleotide của cDNA mã hóa h-tPA với trình tự gen trên Ngân hàng Gen

Quốc tế, mã số NM_000930 cho thấy độ tương đồng đạt 99%. So với

NM_000930, trình tự cDNA nghiên cứu không có sự thay đổi nào đáng kể,

chỉ có một sai khác nằm ở vị trí 499 của cDNA mã hóa h-tPA. Ở trình tự

NM_000930, vị trí 499 nucleotitde này là C được thay thế bằng nucleotide T.

Tuy nhiên, sự khác biệt này không làm thay đổi trình tự acid amin, vì vậy

không ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng của protein.

3. Đã tiến hành biểu hiện cDNA mã hóa h-tPA trên hai vector pGEX6p1 và

pET21a(+) và thu được protein h-tPA khi biểu hiện trong vector pGEX6p1.

Đề nghị

- Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa h-tPA trong vector

pET21a(+) trên vi khuẩn E.coli chủng BL21.

- Tối ưu hoá quá trình biểu hiện đối với cDNA mã hóa h-tPA trong

pGEX6p1 nhằm thu được hàm lượng protein lớn nhất.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), “Nghiên cứu và phát triển sản xuất

vaccine ăn được trong thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 133- 142.

2. Nguyễn Đình Cường, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Lương Thị Thu

Hường, Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nông

Văn Hải (2003), “Biểu hiện gen mã hóa protein bất hoạt ribosome của cây

mướp đắng ở vi khuẩn Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,

1(4), tr. 451- 460.

3. Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả

năng ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ

hợp”, Y học Việt Nam, 284(5), tr. 26- 30.

4. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải

(2005), “Biểu hiện gen interleukin- 2 của người rh-LL2LL bị đột biến tại

các điểm glycosyl hóa và gốc cysteine 125 trong Escherichia coli”, Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 149- 154.

5. Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng

Quốc Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu hiện và xác định interleukin- 2 của

người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 143- 148.

6. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã

hóa interleukin- 2 của người”, Y học Việt Nam, 310(5), tr. 26- 30.

7. Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng

và biểu hiện mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia coli”,

Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 155- 160.

8. Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thúy, Nguyễn Hữu Lộc (1992), “Thuốc, biệt dược và

cách sử dụng”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.


Tiếng Anh

9. Axelsson F. (1995), “Plasminogen”, Product monograph.

10. Becker C., Nong V.H., Bäumlein H., Le T.X., Farouk A., Will H., Bassüner

R. (1993), “Synthesis and accumulation of human tissue-type plasminogen

activator (h-tPA) in transgenic tobaco seeds”, Seed storage compounds 35,

pp. 326- 331.

11. Berg D.T., Burck P.J., Grinnell B.W. (1993), “Kringle glycosylation in a

modified human tissue plasminogen activator improves functional

properties”, Blood 81(5), pp. 1312- 1322.

12. Bhopale G.M., Nanda R.K. (2005), “Recombinant DNA expression products

for human therapeutic use”, Curr. Scie. 89(4), pp. 614- 622.

13. Booyse F.M., Scheinbuks J., Lin P.H., Traylor M., Bruce R. (1988), “Isolation

and interrelationships of the multiple molecular tissue-type and urokinase-

type plasminogen activator forms produced by cultured human umbilical

vein endothelial cells”, J. Biol. Chem. 263(29), pp. 15129- 15138.

14. Bulleid N.J., Bassel- Duby R.S., Freedman R.B., Sambrook J.F., Gething

M.H. (1992), “Cell-free synthesis of enzymically active tissue-type

plasminogen activator”, Biochem. J. 286, pp. 275- 280.

15. Burck P.J., Berg D.H., Warrick M.W., Berg D.T., Walls J.D., Jaskunas S.R.,

Crisel R.M., Weigel B., Vlahos C.J., McClure D.B., Grinnell B.W. (1990),

“Characterization of a modified human tissue plasminogen activator

comprising a kringle-2 and a protease domain”, J. Biol. Chem. 265(9), pp.

5170- 5177.

16. Carlie V.C., Veerman H., Pannekoek H. (1989), “Identification of the

domains of tissue-type plasminogen activator involved in the augmented

binding to fibrin after limited digestion with plasmin”, J. Biol. Chem.

264(21), pp. 12604- 12610.

17. Cartwright T. (1992), “Production of t-PA from animal cell culture”, Animal.

Cell Biotechnol. 5, pp. 218- 245.

18. Castellio F.J. (1983), “Plasminogen activator”, BioScience 33(11), pp. 647- 650.


19. Collen D., Lunen R. (2004), “Tissue- type plasminogen activator: a historical

perspective and personal account”, J. Thromb. Haemost 2, pp. 541- 546.

20. Degeng S.J.F., Rajput B., Reich E. (1986), “The human tissue plasminogen

activator gene”, J. Biol. Chem. 261(15), pp. 6972- 6985.

21. Demaerschalk B.M., Yip T.R. (2005), “Economic benefit of increasing

utilization of intravenous tissue plasminogen activator for acute ischemic

stroke in the United States”, Stroke 36, pp. 2500- 2503.

22. Demain A.L. (2005), “The Biopharmaceutical revolution”, TeknoScienze 22(11).

23. Edlund T., Ny T., Ranby M., Hedon L., Palms G., Holmgren E., Josephson

S. (1983), “Isolation of cDNA sequences coding for a part of human tissue

plasminogen activator”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, pp. 349- 352.

24. Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. (2003), “The production of

recombinant pharmaceutical proteins in plants”, Nat. Rev. Genet. 4, pp.

794- 805.

25. Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Twyman R.M. (2004),

“Plant- based production of biopharmaceuticals”, Curr. Opin. Plant Biol. 7,

pp. 152- 158.

26. Griffiths J.B., Electricwala A. (1987), “Production of tissue plasminogen

activators from animal cells”, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 34, pp. 147- 166.

27. Hoffman J.R. (2005), “Tissue plasminogen activator (tPA) for acute

ischaemic stroke: Why so much has been made of so little”, Med. J. Aust.

179(7), pp. 333-334.

28. Kalyan K.S., Lee S.G., Wilhelm J., Fu K.F., Hum W.T., Rappaport R.,

Hartzell R.W., Urbano C., Hung P.P. (1988), “Structure-function analysis

with tissue-type plasminogen activator”, Biochem. J. 263 (8), pp. 3971-3378.

29. Laemmli U.K. (1970), “Cleavage of Structural Proteins during the Assembly

of the Head of Bacteriophage T4”, Nature 22, pp. 680- 685.

30. Leonardi A., Brun P., Sartori M.T., Cortivo R., DeDominicis C., Saggiorato

G., Abatangelo G., Secchi A.G. (2005), “Urokinase plasminogen activator,


uPa receptor, and its inhibitor in Vernal keratoconjunctivitis”, Invest.

Ophthalmol. Vis. Sci. 46, pp. 1364- 1370.

31. Li Z.L., An J. (2002), “Cloning and identification of human tissue - type

plasminogen activator gene”, Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao 22(1), pp. 22- 24.

32. Ma J.K.C., Drake P.M.W., Christou P. (2003), “The production of

recombinant pharmaceutical protein in plant”, Nature 4, pp. 794- 805.

33. Ma J.K.C., Barros E., Bock R., Christou P., Dale P.J., Dix P.J., Fischer R.,

Irwin J., Mahoney R., Pezzotti M., Schillberg S., Sparrow P., Stoger E.,

Twyman R. M. (2005), “Molecular farming for new drugs and vaccines”,

EMBO rep. 6(7), pp. 593- 599.

34. Markland W., Pollock D., Livingston D.J., (1989), “Structure - function

analysis of tissue-type plasminogen activator by linker-insertion, point and

deletion mutagenesis”, Protein Eng. 3(2), pp. 117- 125.

35. Martegani E., Forlani N., Mauri I., Porro D., Schleuning W.D., Alberghina

L. (1992), “Expression of high levels of human tissue plasminogen

activator in yeast under the control of an inducible GAL promoter”, Appl.

Microbiol. Biotechnol. 37, pp. 601- 608.

36. Meschia J.F., Miller D.A., Brott T.G. (2002), “Thrombolytic treatment of

acute ischemic stroke”, Mayo Clin. Proc. 77, pp. 254- 551.

37. Novokhatny V.V., Inghams K.C., Medved L.V. (1991), “Domain structure

and domain-domain interactions of recombinant tissue plasminogen

activator”, J. Biol. Chem. 266(20), pp. 12994- 13002.

38. Ny T., Elgh F., Lund B. (1984), “The structure of the human tissue-type

plasminogen activator gene: Correlation of intron and exon structures to

functional and structural domains”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(17), pp.

5355- 5359.

39. Otter M., Kuiper J., Bos R., Rijken D.C., Berkel J.C.V. (1992), “Characterization

of the interaction both in vitro and in vivo oftissue-type plasminogen activator

(t-PA) with rat liver cell”, Biochem. J. 284, pp. 545- 550.


40. Pennica D., Holmes W.S., Kohr W.J., Harkins R.N., Vehar G.A., Ward C.A.,

Bennett W.F., Yelverton E., Seeburg P.H., Heyneker H.L., Goeddel D.V.

(1983), “Cloning and expression of human tissue-type plasminogen

activator cDNA in E. coli”, Nature 301, pp. 214- 221.

41. Petersen T.E., Martzen M.R., Ichinose A., Davie E.W. (1990),

“Characterization of the gene for human plasminogen, a key proenzyme in

the fibrinolytic system”, J. Biol. Chem. 265(11), pp. 6104- 6111.

42. Qui J., Swartz J.R., Georgiou G. (1998), “Expression of active human tissue-

type plasminogen activator in Escherichia coli”, Appl. Envir. Microbiol. 64

(12), pp. 4891- 4896.

43. Reichert J.M. (2002), “Therapeutic monoclonal antibodies: trends in

development and approval in the US”, Curr. Opin. Mol. Ther. 4(2), pp.

110- 118.

44. Reichert J.M., Paquette C. (2003), “Therapeutic recombinant proteins: trends

in US approvals 1982- 2002”, Curr. Opin. Mol. Ther. 5(2), pp. 139- 147.

45. Rijken D.C. (1988), “Relationships between structure and function of tissue-

type plasminogen activator”, Klin. Wochenschr. 66(12), pp. 33- 39.

46. Rouf S.A., Moo- Young M., Chisti Y. (1996), “Tissue- type plasminogen

activator: Characteristics, applications and production technology”,

Biotechnol. Adv. 14(3), pp. 239- 266.

47. Salonen E.M., Saksela O., Vatio T., Vaheri A., Nielsen L.S., Zeuthen J.

(1985), “Plasminogen and tissue-type plasminogen activator bind to

immobilized fibronectin”, J. Biol. Chem. 260(22), pp. 12302- 12307.

48. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (2001), “Molecular Cloning: A

laboratory manual”. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor.

49. Siren V., Peltonen J., Vaheri A. (2006), “Plasminogen activators and their

inhibitor gene expression in cutaneous NF1- related neurofibromas”, Arch.

Dermatol. Res. 297(9), pp. 421- 424.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Rijken%20DC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Rouf%20SA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Moo-Young%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Chisti%20Y%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.springerlink.com/content/l50h406q2567/?p=d9b2d043d1854b6093985879df9019a4&pi=0


50. Twyman R.M., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Fisher R. (2003),

“Molecular farming in plants: host systems and expression technology”,

Trends Biotechnol. 21, pp. 570- 578.

51. Upshall A., Kumar A.A., Bailey M.C., Parker M.D., Favreau M.A., Lewison

K.P., Joseph M.L., Maraganore J.M., McKnight G.L. (1987), “Secretion of

active human tissue plasminogen activator from the filamentous fungus

Aspergillus nidulans”, Bio. Technol. 5, pp. 1301- 1304.

52. Van Zoneveld A.J., Veerman H., MacDonald M.E., Mourik J.A., Pannekoek

H. (1986), “Structure and function of human tissue plasminogen - type

plasminogen activator”, J. Cell Biol. 32, pp. 169- 178.

53. Verstraete M., Collen D. (1986), “Pharmacology of thrombolytic drugs”, J.

Am. Coll. Cardiol. 8, pp. 33- 40.

54. Verstraete M. (2000), “Third-generation thrombolytic drugs”, Am. J. Med.

109, pp. 52- 58.

55. Wilhelm O.G., Jaskunas S.R., Vlahos C.J., Bang N.U. (1990), “Functional

properties of the recombinant Kringle-2 domain of tissue plasminogen activator

produced in Escherichia coli”, J. Biol. Chem. 265(24), pp. 14606- 14611.

56. Yepes M., Lawrence D.A. (2004), “Tissue-type plasminogen activator and

neuroserpin: a well-balanced act in the nervous system?”, Trends

Cardiovasc Med. 14(5), pp. 173- 179.

57. Zhu M.C., Zhan Z., Wang Y.J., Liu C.G., Shi Y., Cai Q. (2005), “Expression

and activity of tissue- type plasminogen activator mutant reteplase with

deletion of PAI-1 binding sites”, Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 21

(5), pp. 565- 569.

Website

58. http://www.i-s-b.org

59. http://www.merck.com

60. http://thuocbietduoc.com.vn

http://www.i-s-b.org/business/rec_sales.htm

http://www.merck.com/

http://thuocbietduoc.com.vn/


PHỤ LỤC

Bảng 1. Hóa chất sử dụng

Hóa chất Hãng sản xuất

Các loại enzyme hạn chế MBI Fermentas (Mỹ)

Taq DNA polymerase MBI Fermentas (Mỹ)

T4 ligase MBI Fermentas (Mỹ)

Thang DNA chuẩn, protein chuẩn MBI Fermentas (Mỹ)

dNTP MBI Fermentas (Mỹ)

Kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Promega (Mỹ)

Agarose Gibco (Mỹ)

Phenol Merck (Đức)

Chloroform Merck (Đức)

Isoamylalcohol Merck (Đức)

Tris acetic acid Merck (Đức)

EDTA Merck (Đức)

Ampicillin Serva (Đức)

LB US Biological (Mỹ)

BigDye® Terminator Applied Biosciences (Mỹ)

Cồn Merck (Đức)

Bảng 2. Thiết bị sử dụng

Thiết bị Hãng sản xuất

Máy ly tâm 5415R Eppendorf (Đức)

Máy PCR 9700 Applied Biosystems (Mỹ)

Máy điện di Mupid- 2Plus (Nhật)

Máy soi DNA Bio- Rad (Mỹ)

Máy hút chân không Speed Vac Savant (Mỹ)

Máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Applied Biosystems (Mỹ)

Máy chuẩn pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ)


Bảng 3. Dung dịch cần pha

Dung dịch Hóa chất Nồng độ

Đệm chạy điện đi DNA

TAE 1X

Tris-acetate

EDTA

40mM

1mM

Đệm tra mẫu DNA

(Loading buffer)

Bromophenol blue

Xylene cyanol FF

Sucrose trong H2O

0,25%

0,25%

40%

Đệm chạy điện di protein

(1X Tris- Glycine pH 8,3)

Tris base

Glycine

SDS

H2O

3 g

14,4 g

1 g

1 l

Đệm tra mẫu protein

(Protein sample buffer 4X)

Tris- HCl pH= 6,8

Glycerol

SDS

DTT

Bromophenol Blue

0,5M

60%

20%

1M

0,2%

Dung dịch nhuộm protein

(Comasive Brilliant Blue

R250)

Comasive R250

Metanol

Acid acetic

H2O

0,3 g

120 ml

30 ml

150 ml

Dung dịch tẩy gel protein

Acid acetic 7%

Metanol 20%

H2O

35 ml

100 ml

365 ml

Dung dịch I (Sol I)

(Khử trùng, giữ 4oC)

Tris- HCl, pH 8,0

EDTA, pH 8,0

Glucose

25mM

10mM

50mM

Dung dịch II (Sol II)

(Pha mới trước khi sử dụng)

NaOH

SDS

0,2N

1%

Dung dịch III (Sol III)

(Khử trùng, giữ 4oC)

CH3COOK, pH 5,5

CH3COOH

3,0M

11,5%

Dung dịch TE 0,01M, pH 8,0 Tris- HCl, pH 8,0

EDTA, pH 8,0

0,1mM

0,01mM


Bảng 4. Các cặp mồi sử dụng

Mồi Trình tự mồi

T7 promoter 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’

T7 terminator 5’-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3’

M13 forward 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’

M13 reverse 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’

Bảng 5. Thành phần PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA

Thành phần

Nồng độ Thể tích (l)

H2O

- 14,25

Buffer PCR 10X 2,5

MgCl2 25mM 2,5

dNTP 10mM 2,5

Primer F(Mồi xuôi) 10pmol/ul 1,0

Primer R(Mồi ngược) 10pmol/ul 1,0

DNA 6g/ml 1,0

Taq DNA polymerase 5u/l 0,25

Tổng thể tích: 25,0


Bảng 6. Thành phần phản ứng xử lý DNA bằng enzyme hạn chế

Thành phần Nồng độ Thể tích (l)

Buffer Tango 10X 1

BamHI (NdeI) 10u/µl 0,5

XhoI 10u/µl 0,5

DNA 1 µg/µl 2

H2O - 6

Tổng thể tích 10

Bảng 7. Thành phần phản ứng loại phosphate ở vector

Thành phần Nồng độ Thể tích

(µl)

Buffer for CIAP 10X 2,0

CIAP 1u/µl 1,5

Vector (đã xử lý bằng

enzyme hạn chế) 1µg/µl 15,0

H2O - 1,5


Bảng 8. Thành phần phản ứng ghép nối DNA vào vector

Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

T4 Buffer 10X 1,0

Vector 10ng/µl 2

Sản phẩm PCR 10ng/µl 5

T4 ligase 5u/µl 1,0

Tổng thể tích 10,0


Bảng 9. Thành phần PCR xác định trình tự

Thành phần Nồng độ Thể tích (l)

Big Dye - 3

Mồi 0,01 µg/µl 1,275

Buffer 2,5X 3

DNA plasmid 10ng/µl 3

H2O - 4,725


Bảng 10. Thành phần gel polyacrylamide

Thành phần Nồng độ Gel cô 4%

(Stacking gel)

Gel tách 10%

(Separating gel)

Tris- HCl, pH=6,8 0,5M 0,75 ml -

Tris- HCl, pH= 8,8 1,5M - 2,25 ml

SDS 10% 30 l 90 l

Acrylamide 30% 0,4 ml 3,02 ml

H2O - 1,8 ml 3,55 ml

APS 10% 15 l 45 l

TEMED - 3 l 4,5 l

Tổng thể tích 3 ml 9 ml

nghiÊn cỨu biỂu hiỆn gen mÃ hÏa chẤt hoẠt hÏa...

Documents