nanoteknoloji bazlı ilaç taşıma sistemlerinin göze ilaç...
TRANSCRIPT
NANOTEKNOLOJİ BAZLI İLAÇ TAŞIMA SİSTEMLERİNİN
GÖZE İLAÇ UYGULAMALARINDA, TRANSKLERAL GEÇİŞ
ÜZERİNE ETKİSİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ
EVALUATION of TRANSSCLERAL PERMEABILITY
EFFECTS of NANOTECHNOLOGY BASED DRUG DELIVERY
SYSTEM in OCULAR DRUG APPLICATIONS
NAGİHAN UĞURLU
Prof.Dr.EMİR BAKİ DENKBAŞ
Tez Danışmanı
Hacettepe Üniversitesi
Lisansüstü Eğitim-Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin
Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı İçin Öngördüğü
DOKTORA TEZİ
Olarak Hazırlanmıştır.
2013
Bu tez tüm hayatım boyunca yanımda olan canım anneme ve canım babama ithaf
edilmiştir…..
i
ÖZET
NANOTEKNOLOJİ BAZLI İLAÇ TAŞIMA SİSTEMLERİNİN GÖZE İLAÇ
UYGULAMALARINDA, TRANSKLERAL GEÇİŞ ÜZERİNE ETKİSİNİN
DEĞERLENDİRİLMESİ
NAGİHAN UĞURLU
Doktora, Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı
Tez Danışmanı: Prof. Emir Baki Denkbaş
Nisan 2013, 104 sayfa
Bu tez kapsamında, kitosan nanopartiküller sentezlenerek ve bu nanopartiküllere
bevasizumab yüklenmiş ve bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin karakterizasyon
çalışmaları yapılmıştır. Atomik kuvvet mikroskobu ve zeta sizer ile yapılan ölçümlerde
bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin boyutları 80-380 nm olarak ölçülmüştür. İlaç
yükleme verimi 38±22 olarak hesaplanmıştır. Hazırlanan bevasizumab nanopartiküllerin in
vitro salım çalışmaları yapılmıştır. Yüklü nanopartiküllerin 3 haftalık izleminde, ilaç salımının
5. günden sonra artmaya başladığı ve izlem yapılan 3 hafta boyunca ilaç salımının devam
ettiği izlenmiştir. İn vivo çalışmalarda, yüklü nanopartiküller tavşan gözlerine subtenon
olarak enjekte edilmiştir. Enjeksiyon sonrası takip süresinde herhangi bir enfeksiyon veya
inflamatuar reaksiyon gelişmemiştir. İmünohistokimyasal incelemelerde yüklü
nanopartiküllerin sklera duvarında bir miktar ilerlediği gözlemlenmiştir. Bevasizumab yüklü
nanopartikül enjekte edilen deney hayvanlarından enjeksiyon sonrası 1, 3, 5 ve 7. gün alınan
örneklerde vitreus serum ve vitreus bevasizumab düzeyleri ölçülmüş ve serbest bevasizumab
enjekte edilen gözlerden alınan örnekle karşılaştırılmıştır. Yüklü nanopartikül enjekte edilen
gözlerde vitreus bevasizumab konsantrasyonunun, serbest bevasizumab enjekte edilen gözlere
oranla daha erken yükseldiği izlenmiştir.Yüklü nanopartikül enjekte edilen grupta serum
ii
bevasizumab konsantrasyonunun serbest bevasizumab enjekte edilen gruba oranla daha düşük
olduğu gözlenmiştir.
Anahtar kelimeler: Kitosan, bevasizumab, nanopartikül
iii
ABSTRACT
EVALUATION of TRANSSCLERAL PERMEABILITY EFFECTS of
NANOTECHNOLOGY BASED DRUG DELİVERY SYSTEM in OCULAR DRUG
APPLICATIONS
Dr. NAGİHAN UĞURLU
Doktor of Philosophy , Nanotechnology and Nanomedicine Department
Supervisor: Prof. Emir Baki Denkbaş
April 2013, 104 pages
Chitosan nanoparticles were synthesized and bevasizumab was loaded to this chitosan
nanoparticles in the present thesis. Characterization of bevacizumab loaded chitosan
nanoparticles were made and the size of the bevacizumab loaded chitosan nanoparticles were
measured between the range of 80-380 nm in Atomic force microscope and zeta sizer. Drug
loading capacity was measured as 38±22.In in vitro studies it was observed that amount of
drug release was increased after fifth day of injection and continued during 3 weeks. In vivo
studies of these bevacizumab loaded chitosan nanoparticle were studied. Loaded nanoparticles
were injected as subtenon injections to rabbit eyes. No infectious or inflamatory reactions
were developed during follow up period. Immunohistochemical sections showed some degree
transport of bevacizumab loaded chitosan nanoparticles transport through sclera. After
subtenon bevacizumab loaded chitosan nanoparticle injections serum and vitreus samples
were obtained from the rabbits at first, third, fifth and seventh days. The values compared to
those of rabbits that were applied free subtenon bevacizumab injection. Elevation of vitreus
bevacizumab levels were observed earlier in bevacizumab loaded chitosan nanoparticle
injected rabbits compared to free bevacizumab injected rabbits. Serum bevacizumab levels
of bevacizumab loaded chitosan nanoparticle injected rabbits were lower that those of free
bevacizumab injected rabbits.
iv
Key words:chitosan, bevacizumab, nanoparticle.
v
TEŞEKKÜR
Bu tezin hazırlanmasında bana engin bilgi ve tecrübesiyle her aşamada destek olan ve yol
gösteren hocam Emir Baki Denkbaş’a,
Tez çalışmaları sırasında tüm bilgisi ve enerjisi ile beni her zaman destekleyen Mehmet
Doğan Aşık’a,
Bilimsel çalışmalarımda fikirleri, bilgisini ve imkanlarını benimle paylaşan Mustafa Türk’e
Bilimsel çalışmalar konusunda desteğini ve yardımlarını her zaman hissettiğim hocam
Nurullah Çağıl’a,
Özgün fikirleri ile tez çalışmalarının planlanmasında yardımları olan Hasan Basri Çakmak’a
Titizliği ve özeni ile tez çalışmalarında çok büyük emeği olan Sema Tuncer’e,
Çalışmalarım süresince vermiş oldukları destekler için Murat Demirbilek’e, Cem Bayram’a,
Tamer Çırak’a,
Tezin çalışmaları boyunca samimi desteklerini benden esirgemeyen tüm Nanoteknoloji ve
Nanotıp Anabilim dalı üyelerine,
Bu tez kapsamında yapılan çalışmaları 1002 Hızlı destek projesi kapsamında verdikleri proje
ile destekleyen TÜBİTAK yetkililerin’ne,
Beni tüm yaşantım boyunca seven, destekleyen, ve iyiliğe yönlendiren sevgili annem Saadet
Orhan’a ve babam Cemal Orhan’a ve
Hayatın her aşamasında olduğu gibi tez yazma sürecinde de beni sabır ve özveriyle
destekleyen sevgili eşim Mahmut Uğurlu’ya ve ailesine
Teşekkür ederim
vi
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
Sayfa
No
ÖZ i
ABSTRACT iii
TEŞEKKÜR v
İÇİNDEKİLER vi
SİMGELER VE KISALTMALAR ix
ŞEKİLLER DİZİNİ xi
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 3
2.1. Koroid Neovasküler Membran (KNVM) 4
2.1.1. KVNM oluşumunda Anjiyogenez 5
2.1.1.1. Anjiyogenezin Gelişim Mekanizması 6
2.1.1.2 KNVM Gelişiminde VEGF-A’nın Rolü 7
2.1.2. Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF)
8
2.1.2.1. VEGF Oluşumu ve Alt Tipleri
8
2.1.2.2. VEGF Reseptörleri
9
2.1.3. KNVM Tedavisinde Anti-VEGF İlaçlar 9
2.1.3.1. Göz Hastalıklarının Tedavisinde Kullanılan Anti-VEGF Ajanlar 9
2.1.3.1.1. Bevasizumab haricinde kullanılan ilaçlar
10
2.1.3.1.2. Bevasizumab
10
2.1.3.2. KNVM Tedavisinde anti-VEGF Tedavilerin Etkinliği
11
2.1.3.3. Anti Anjiyogenik İlaçların Göze uygulanmasında geneleksel Yöntemler 12
vii
2.2. Perioküler İlaç Uygulamaları
15
2.2.1. Transskleral Bariyerler ve Özellikleri
17
2.2.1.1. Statik Bariyerler
18
2.2.1.1.1. Sklera
18
2.2.1.1.1.1. Skleranın Yapısı
18
2.2.1.1.1.2. Skleral Geçirgenlik
19
2.2.1.1.2. Bruch membran-Koroid (BK) ve RPE 19
2.2.1.1.2.1. Bruch membranın Yapısı 20
2.2.1.1.2.2. Koroidin Yapısı 20
2.2.1.1.2.2. Koroidin Yapısı 20
2.2.1.1.2.4. Bruch membran-Koroid ve RPE Geçirgenlik Çalışmaları 20
2.2.1.2. Dinamik Bariyerler
21
2.2.1.2.1. Konjuktival/Episkleral akım 21
2.2.1.2.2. Koroidal Akım
21
2.2.1.2.3. Uveoskleral Akım
22
2.2.1.2.4. Hidrostatik ve Osmotik Basınç
22
2.2.1.2.4. RPE Taşıyıcı Proteinler 22
2.2.1.3. Metabolik Bariyerler
22
2.2.2. Transskleral İlaç Geçişlerinin Etkinliği
23
2.2.2.1 Antianjiyojenik Tedavide Karşılaşılan Sorunlar 24
2.3. Gözde Nanopartiküler İlaç Taşıma Sistemlerinin Kullanılması
25
2.3.1. Nanoteknoloji Bazlı İlaç Taşıma Sistemleri
25
2.3.1.1. Kitosanın Kaynağı, Yapısı ve Fizikokimyasal Özellikleri 26
2.3.1.2. Kitosan Bazlı Taşıma istemlerinin Göze İlaç Taşınmasında
Kullanılması 27
viii
2.3.1.2.1. Kitosan Nanopartiküllerin Göze İlaç Taşınmasında Kullanılması 28
3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 30
3.1. Nanopartiküllerin Geliştirilmesi, Karakterizasyonu ve in vitro
çalışmalar 30
3.1.1. Kitosan Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu
30
3.1.2. Bevasizumabın Kitosan Nanopartiküllere Yüklenmesi
31
3.1.3. İlaç Yüklü Kitosan Nanopartiküllerin Karakterizasyonu
32
3.1.4. Salım Profillerinin Oluşturulması
32
3.1.5. Yükleme Veriminin Hesaplanması 32
3.2. Hazırlanan Nanopartiküllerle yapılan in vivo Çalışmalar
32
3.2.1. Subtenon Enjeksiyon
33
3.2.2. Enjeksiyon Sonrası Takip Muayeneleri
35
3.2.3. Örneklerin Toplanması
35
3.2.4. İmünohistokimya
36
3.2.5. ELISA Ölçümleri
36
3.2.6. Vitreusta Bulunan Bevasizumab Miktarının Hesaplanması
36
4. BULGULAR VE TARTIŞMA 37
4.1.1. İlaç Yüklü Kitosan Nanopartiküllerin Sentezi Ve Karakterizasyonu 37
4.1.2. Salım Profillerinin İncelenmesi 41
4.2.1. Enjeksiyon Sonrası Muayene Sonuçları 42
4.2.2. İmmunohistokimya Sonuçları 45
4.2.3. Eliza Sonuçları 47
SONUÇLAR 63
KAYNAKLAR 65
EK 1:APPENDİX 84
ÖZGEÇMİŞ 84
86
ix
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
YMD Yaşa Bağlı Maküla Dejeneresansı
DRP Diabetik Retinopati
VEGF Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü
FDA Federal Drug Administration
KNVM Koroidal Neovaskülar Membran
FGF Fibroblast Büyüme Faktörü
TGF α Transforming Büyüme Faktörü alfa
TGF β Transforming Büyüme Faktörü beta
HGF Hepatosit Büyüme Faktörü
CTGF Bağ Dokusu Büyüme Faktörü
IL-8 Interleukin-8
PEDF Pigment Epitel Kökenli Faktör
PDGF Platelet Kökenli Büyüme Faktörü
VEGFR Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü Reseptörü
OCT Optik Koherent Tomografi
IgG İmün globülin G
VISION VEGF Inhibition Study in Ocular Neovascularization
ANCHOR Anti-VEGF Antibody for the Treatment of Predominantly Classical CNV
in AMD
x
MARINA Minimally Classic/Occult Trial of the Anti-VEGF antibody Ranibizumab
in the treatment of neovascular AMD
FFA Fundus Florosein Anjiografi
PDT Fotodinamik Tedavi
BK Bruch Membranı-Koroid
RPE Retina Pigment Epiteli
GAG Glikozaminoglukan
ABD Amerika Birleşik Devletleri
GRAS Genel olarak Güvenli Kabul edilen
NSAI Non-steroid antiinflamatuarlar
5 FU 5 Floro urasil
TPP Tripolifosfat
AKM Atomik Kuvvet Mikroskobu
PEG Polietilen Glikol
PLGA Polilaktoglikolik Asit
NLC Nanostructured Lipid Carriers
HET-CAM Hen'in Koryoallentoik Membran Yumurta Testi
NP Nanopartikül
PLA Polilaktik Asit
xi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa No
Şekil 2.1. Gözün tabakaları 3
Şekil 2.2. KNVM’nın Göz Kesitlerinde Görünümü 5
Şekil 2.3. Anjiyogenezin Şematik Gösterimi 7
Şekil 2.4. Avastinin üç boyutlu yapısı 10
Şekil 2.5. Transskleral geçişteki tabakalar 14
Şekil 2.6. Perioküler alandan vitreus ve posterior oküler yapılara transskleral
yolla ilaç geçiş yolları
16
Şekil 2.7. Transskleral geçişteki statik bariyerler (sklera, koroid, retina
pigment epiteli)
17
Şekil 2.8. Transskleral ilaç uygulamalarında konjoktiva / episklera ve
koroiddeki temizlenme (clearance) yolları
21
Şekil 2.9. intravitreal enjeksiyonun şematik çizimi 24
Şekil 3.1. Kitosan nanopartikül üretim düzeneği 31
Şekil 3.2. Subtenon enjeksiyon uygulamasının şematik gösterilmesi 34
Şekil 3.3. A-B Tavşan gözününün enjeksiyona hazırlanması 34
Şekil 3.4. A-B Subtenon enjeksiyon uygulaması 35
Şekil 4.1. Hazırlanan kitosan partiküllerin Zeta Sizer’da hacimce boy dağılımı
grafiği
37
Şekil 4.2. Hazırlanan kitosan partiküllerin: A: AFM görüntüsü B: AFM
görüntüsünden oluşturulmuş 3 boyutlu yapısı
38
Şekil 4.3. Farklı miktarlarda Bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerden
salınan ilaç miktarının zamana göre grafiği
42
Şekil 4.4. Subtenon enjeksiyon sonrası ön segment muayene sonuçları A: 1. 43
xii
Gün B: 5. gün
Şekil 4.5. Skleranın immünohistokimyasal boyamalar;A:Kontrol grubu 1,3,5.
ve 7. gün sonuçları;B:İlaç Grubu 1,3,5. ve 7. gün sonuçları;C:İlaç
yüklü partikül grubu 1,3,5. ve 7. gün sonuçları
46
Şekil 4.6. ELISA testi ile belirlenen serumdaki bevasizumab miktarı 49
Şekil 4.7. ELISA testi ile belirlenen, vitreustaki bevasizumab miktarları 50
Şekil 4.8. Vitreusta bulunan bevasizuamb miktarının başlangıç bevasizumab
miktarına oranları
60
1
1.GİRİŞ
Gözün arka segmentinde anjiyogenezle ilişkili hastalıklar tüm dünyada geri dönüşümsüz
körlüklerin en önemli sebepleridir. İleri yaş grubunda yaşa bağlı maküla dejeneresansı
(YMD), orta yaş grubunda diabetik retinopati (DRP) ve bebek grubunda prematüre
retinopatisi, retinal ve koroidal neovaskülarizasyona sebep olarak hastalarda görmenin
ciddi oranda kaybedilmesine yolaçmaktadır. Bu hastalıkların sebep olduğu ağır görme
kayıpları, hastalarda işgücünü kaybetme, günlük aktivitelerini yerine getirememe ve
yaşam kalitesini ciddi oranda düşürme gibi istenmeyen etkilerinin yanısıra, bu hastalıkların
tedavisinde ve görme kayıplarına ikincil gelişen patolojilerin tedavilerin yüksek maliyetleri
sebebiyle sağlık harcamalarında ciddi artışlara neden olmaktadır.
Anti Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) tedavilerin gözdeki patolojik
anjiyojenez tedavilerinde kullanılması 2004 yılında başlamıştır. Önce yaşa bağlı YMD
tedavisinde yaygınlık kazanan anti-VEGF uygulamaları, elde edilen anatomik ve
fonksiyonel başarılardan sonra DRP, ven dal tıkanıklığı, üveit gibi diğer hastalıklarda da
gittikçe artan sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır. Bugün artık arka segmentteki retina ve
koroid neovaskülarizasyonla seyreden tüm hastalıklarda anti VEGF tedaviler tüm dünyada
en yaygın kullanılan seçeneklerden biridir. Ön segment neovaskülarizasyonlarında da anti
VEGF kullanımı giderek yaygınlaşmaktadır.
Bevasizumab, kolon kanseri tedavisi için Federal Drug Administration (FDA) onayı almış
ancak, göz hastalıklarının tedavisindeki etkisi de pek çok yayınla kanıtlanmış olan ve tüm
dünyada intraoküler uygulamalar için en yaygın tercih edilen anti VEGF ajandır. Off label
(ruhsatlı endikasyon dışı) olmasına rağmen, FDA onayı bulunan muadillerine karşı bu
kadar sık tercih edilmesinin sebebi fiyatının ucuz olmasıdır. Anjiyogenezle seyreden
hastalıklar kronik hastalıklar olduklarından gözdeki etkileri sürekli devam etmektedir ve bu
uygulamalar hastalığın kesin tedavisini sağlamamakta sadece belli sürelerle bulguları
düzeltmektedir. Bu nedenle uzun süreli tedaviler sözkonusudur bu da tedavi maliyetlerini
ciddi oranda arttırmaktadır.
Anti VEGF tedavilerdeki en önemli sorunu, tüm göz ilaçlarının uygulanmasında olduğu
gibi, hedef dokuda istenen terapötik ilaç dozunun sağlanmasıdır. Gözün statik ve dinamik
bariyerleri, uygulanan ilaç moleküllerinin göziçi dokulara ulaşmasını engellerler. Bu
nedenle sistemik, topikal gibi geleneksel yollarla göz içinde istenen ilaç konsantrasyolarını
sağlamak mümkün olmadığından subtenon veya intravitreal uygulamalar tercih
edilmektedir.
2
İntravitreal uygulamalarda, ilaç direk vitreus boşluğuna uygulanır. Bu uygulama ile istenen
doz kolaylıkla sağlanabilmekle birlikte, uygulamanın retina dekolmanı, katarakt, üveit,
endoftalmi gibi ciddi yan etkileri olabilmektedir. Ayrıca bu hastalıklar kronik hastalıklar
olduğundan, yaklaşık bir aylık peryotlarla bu uygulamanın tekrar edilmesi gerekmektedir.
Tedavi maliyetinin ve yan etki gelişme riskinin artmasının yanısıra, bu kadar sıklıkla
tekrarlanan enjeksiyonlar hastalar için ciddi bir zorluktur.
Trasskleral uygulamalar daha az riskli olması ve daha kolay uygulanabilmesi sebebiyle,
intravitreal enjeksiyonlara alternatif olabilecek uygulamalardır. Transskleral uygulamaların
en önemli dezavantajı intravitreal enjeksiyonlara oranla vitreusta istenen enjeksiyonların
sağlanamamasıdır. Subtenon, subkonjoktival uygulanan ilaç moleküllerinin, göz içi
dokulara ulaşması statik ve dinamik pek çok faktör tarafından engellenmektedir.
Nanopartiküler ilaç taşıma sistemleri, her alanda olduğu gibi oftalmoloji alanında de çok
yoğun olarak çalışılmaktadır. Göze uygulanan ilaçların çözünürlüğünü ve bariyerlerden
geçişini arttırmak ve ilaç konsantrayonunu daha uzun süre koruyabilmek için pek çok
nanopartiküler taşıyıcı konusunda çalışılmaktdır.
Bu tez kapsamında gözde kullanılmak üzere 80-380 nm aralığında bevasizumab yüklü
nanopartiküller sentezlenmiştir. Bu nanopartiküllerin 3 hafta boyunca in vitro salımlarını
incelenmiş ve 5. günde artan salımın izlem süresi boyunca sürdüğünü gözlenmiştir.
Hazırlanan bevasizumab yüklü nanopartiküller tavşan gözlerine subtenon olarak
uygulanmış ve tavşanlar enjeksiyon sonrası takip edilmiştir. Hiçbir hayvanın gözünde ön
kamarada reaksiyon, üveit veya enfeksiyon gelişimi izlenmemiştir. Alınan doku
örneklerinde imünohistokimyasal değerlendirmeler yapılmış nanopartiküllerin sklera
duvarında bir miktar ilerledikleri izlenmiştir. Enjeksiyondan 1, 3, 5 ve 7 gün sonra
sakrifiye edilen tavşanların gözlerinden alınan örneklerde, serum ve vitreus bevasizumab
düzeyleri ölçülmüş ve bu veriler serbest bevasizumab verilen gruptan elde edilenlerle
karşılaştırılmıştır. Bevasizumab yüklü kitosan nanopartikül enjekte edilen gözlerde vitreus
bevasizumab seviyesinin, serbest bevasizumab verilen gözler oranda daha erken yükseldiği
izlenmiştir. Başta verilen bevasizumab dozları dikkate alındığında, aynı düzeyde vitreus
ilaç dozu elde etmek için gerekli olan bevasizumab miktarının, nanopartiküle yüklü olan
grupta daha az olduğu izlenmiştir. Serum düzeylerinin yüklü nanopartikül enjekte edilen
grupta çok düşük olduğu izlenmiştir.
3
2. GENEL BİLGİLER
Göz cisimlerden yansıyan ışığı elektriksel uyarılara çevirerek optik sinir aracılığı ile beyne
ileten organdır. Göz anatomik olarak ön ve arka segmentlere ayrılmıştır. Ön segment
kornea, ön kamara, iris, arka kamara, silier cisim ve lensten oluşur. Arka segment vitreus,
retina, retina pigment epiteli ve koroidden oluşur (şekil 2.1)
Şekil 2.1. Gözün Tabakaları [1]
Ön segmentteki yapıların temel görevi ışık uyarılarını arka segmente geçirerek makülada
odaklamaktır. Arka segmentte yer alan yapıların görevi ise bu uyarıları elektriksel uyarılara
çevirmek ve beyne iletmektir. Arka segmentteki dokuların harabiyeti sıklıkla geri
dönüşümsüz körlükle sonuçlanır. Tüm dünyada körlüklerin en önemli sebebi arka
segmentteki anjiyogenez-ilişkili hastalıklardır [2-4]. Anjiyogenez ilişkili hastalıklarda en
önemli bulgu koroidal neovaskülar membran (KNVM) gelişimidir.
4
2.1.Koroid Neovasküler Membran (KNVM)
Gözdeki patolojik anjiyogenez, tüm dünyada çok ciddi görme kayıpları ile seyretmekte ve
sonuçta tedavisi mümkün olmayan körlüğe neden olmaktadır. Oküler anjiyogenezin en
önemli bulgusu KNVM gelişimidir ve tüm yaş gruplarını etkileyerek geri dönüşümsüz
görmek kaybına sebep olabilen bu patoloji, yaşlı populasyondaki görme kaybının en
önemli sebebidir [5]. KNVM, koryokapillaristen köken alan damarların bruch membranı
aşarak subretinal alanda yeni bir damar ağı yapısı oluşturmasıdır [6]. Yaşa bağlı maküla
dejenerasyonu, patolojik miyopi, oküler histoplazmozis, anjiyoid streaks, travma gibi
kırktan fazla oküler patolojide görme kaybının nedeni, KNVM gelişimidir [7].
KNVM subretinal veya subretinapigment epitel alanda gelişir ve beraberinde, bu alanda
sıvı birikimi ve kanama olabilir (şekil 2.2). Bu durum retina yüzeyinde düzensizliklere ve
kabarıklıklara yolaçar. Sonuç olarak hastada metamorfopsi olarak tanımlanan, objelerin
şekillerinde deformasyon şikayetleri gelişir. Tabloya bazen nörosensoryel RD eklenebilir
ve tüm bunların sonucunda gelişen fotoreseptör hücre hasarı tedavisi imkansız görme
kaybına yol açar [8].
5
Şekil 2.2. KNVM’nın Göz Kesitlerinde Görünümü [9]
2.1.1 KVNM oluşumunda Anjiyogenez
Koroidal neovaskülarizasyon hayvan modelleri konusunda yapılan yoğun çalışmalardan
elde edilen veriler ve cerrahi sırasında veya mostmortem olarak eksize edilen KNVM’lerin
incelenmeleri sonucunda elde edilen veriler, bu dokuların gelişimi ve etiyolojileri hakkında
önemli bilgilere ulaşılmasını sağlamıştır [10-13]. KNVM gelişiminde koryokapillaristen
gelişen damarlar, anjiyojenez yoluyla subretinal alana doğru uzanarak burada patolojik bir
membran oluştururlar [6]. Anjiyojenez, varolan kan damarlarından köken alan yeni damar
ağlarının gelişimidir. Sağlıklı bireylerde, yara iyileşmesi, saç uzaması ve menstural siklus
gibi birkaç fizyolojik anjiyogenez dışında anjiyogenezler genelde patolojik olaylara eşlik
eder. Fizyolojik anjiyogenez, anjiyogenik ve antianjiyogenik faktörlerin çok kontrollü
ekspresyonu ile dengede tutulan bir mekanizmadır [14]. Hastalık sürecinde farklı
uyaranların etkisi ile angiyogenik faktörlerin oranı artarken, antianjiyojenik faktörlerin
6
azalır ve bu dengeli mekanizma bozularak patolojik anjiyogenez süreci başlar. Solid
tümörlerden hematolojik malignitelere, inflamatuar bozukluklardan farklı göz
hastalıklarında KNVM gelişimine kadar pek çok farklı patolijinin gelişmesinde ve
yayılmasında patolojik anjiyogenez anahtar rol oynamaktadır [15,16].
Gözdeki fizyolojik angiyogenez, pozitif ve negatif uyaran faktörlerin arasındaki dinamik
denge tarafından çok sıkı bir şekilde kontrol edilen, çok basamaklı bir süreçtir [16].
Angiyogenezin pozitif uyaran faktörleri, VEGF-A, fibroblast büyüme faktörü (FGF),
anjiyopoetinler, transforming büyüme faktörü alfa, (TGF α) ve transforming büyüme
faktörü beta (TGF β), hepatosit büyüme faktörü (HGF), bağ dokusu büyüme faktörü
(CTGF) ve interleukin 8 (IL- 8) olarak sayılabilir [17,18]. Bunlar arasında VEGF-A
anjiyogenezin en önemli pozitif uyaranıdır [10,16].
Anjiyogenezin negatif düzenleyicileri incelendiğinde, thromboplastin, anjiyostatin,
endostatin ve pigment epitelyum kökenli faktör (PEDF) gibi moleküller tanımlanır. Bu
grubun içinde de anjiyogenez gelişimini en etkili şekilde önleyen PEDF’dür [18].
KNVM gelişiminde yeni damar gelişimini uyaran veya önleyen bu faktörlerin
konsantrasyonu değişir ve bu hassas denge bozulara patolojik anjiyogenez süreci başlar.
Özetle, KNVM gelişiminde pek çok farklı molekül etkili olmakla birlikte bunların
bazılarının süreçte anahtar rol oynar. Bilinen en güçlü anjiyogenik uyaranlardan biri olan
VEGF, KNVM gelişiminin en güçlü ve en önemli molekülüdür [10,16,19].
2.1.1.1. Anjiyogenezin Gelişim Mekanizması
Anjiogenez çok aşamalı ve kompleks bir süreçtir. İlk aşama varolan damarların
vasodilatasyonu ve geçirgenliklerinin artmasıdır. Bu aşamada başta VEGF-A olmak üzere
anjiyojenik uyaranlar vasküler endotel hücreleri uyararak kapiller duvarında yeralan
endotel hücrelerinin aralarında boşluklar oluşmasına neden olur. Endotel hücreler bir
tomurcuk oluşturur, bu tomurcuk yüzeyinde eksprese ettiği matriks metalloproteinazlar ve
integrinler sayesinde ekstraselüler matriksi parçalar ve ilerler. Prolifere olan endotel
hücreleri daha sonra tüp yapısını alır (şekil 2.3). Bu oluşan yeni damar ağı farklılaşan
periendotelyal hücreler ve oluşan geçici matriks tarafından desteklenir. Lümen oluşumu ve
komşu ağların anastomozu ile kapiller yumak oluşur [20].
7
Şekil 2.3:Anjiyogenezin Şematik Gösterimi [20]
2.1.1.2. KNVM Gelişiminde VEGF-A’nın Rolü
Korneal, iris, retinal ve koroidal neovaskülarizasyon hayvan modelleri konusunda yapılan
yoğun çalışmalar, neovaskülarizasyon ve vasküler permeabilite artışı gözlenen pek çok göz
hastalığında, VEGF’ün anahtar rol oynadığını göstermiştir [17,21]. Yine cerrahi olarak
eksize edilen KNMV’ların histopatolojik incelemeleri ve KNVM’lı gözlerde yapılan otopsi
çalışmaları, VEGF’ün KNVM gelişimindeki rolünü desteklemiştir [11-13]. İnsanlardan
alınan KNMV’larda ve laser uygulamaları ile oluşturulan YMD hayvan modellerinde
VEGF ekpresyonunun artmış olduğu gösterilmiştir [10]. Tüm bu çalışmalar, koroidal
neovaskülarizasyonda VEGF seviyesinin arttığını, deneysel olarak VEGF seviyesinin
arttırılmasının KNVM gelişimine neden olduğunu ve VEGF’ün etkisinin baskılanmasının
KNVM gelişimini engellediğini göstermiştir [22]. İntravitreal anti-VEGF monoklonal
antikorları maymunlarda lazer uygulamasıyla KNVM oluşturulmasını engellemiştir [10].
Tüm bu çalışmalar, insanlardaki KNVM örneklerinde ve hayvan modellerinde, KNVM
gelişiminde VEGF’ün çok önemli rolü olduğunu göstermektedir.
8
2.1.2. Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF)
Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), sentezlendiği organın gelişim evresine ve
fizyolojik fonksiyonlarına göre önemli pek çok biyolojik aktiviteye sahip, multifonksiyonel
bir moleküldür [23,24]. İlk olarak karsinoma hücre serilerinden salgılandığı keşfedilmiş ve
tümörlerde asit sıvısını arttırdığı için vasküler geçirgenlik faktörü (VPF) olarak
adlandırılmıştır [25]. Kısa süre sonra endotel hücrelerinin proliferasyonunu, migrasyonunu
uyararak endotel yaşam süresini uyardığı gösterilmiş ve VEGF’ün çok güçlü bir
anjiyojenik molekül olduğu kanıtlanmıştır [26].
2.1.2.1. VEGF Oluşumu ve Alt Tipleri
VEGF ailesi, Platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF), süpergen ailesinin bir üyesidir ve
altı büyüme hormonundan oluşmaktadır: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C VEGF-D ve viral
VEGF analoğu olan VEGF-E ve Plasental Growth Faktor (PLGF).2 VEGF hipoksik ve
inflamatuar uyaranların etkisiyle, makrofajlardan, T hücrelerinden, retina pigment
epitelyum hücrelerinden (RPE), astrositler, perisitler ve düz kas hücrelerinden salgılanır.
VEGF-A grubun en iyi bilinen ve özellikleri en iyi karakterize edilmiş elemanıdır ve
kanserden göz hastalıklarına, inflamasyondan koagulasyon bozuluklarına kadar pek çok
hastalığın patogenezinde temel rolü oynamaktadır [23,27, 28]. VEGF-B, non-anjiyojenik
tümor gelişimde etkilidir. VEGF-C ve VEGF-D’nin kanser gelişimindeki lenfanjiyogenez
ve anjiyogenezdeki rolü konusunda çok yoğun çalışmalar yapılmaktadır. PLGF, vasküler
geçirgenliği arttırır, proliferasyon, kemotaksis ve anjiyogenezde rol alarak, pek çok
patolojik durumda VEGF-A, ile sinerjistik etki gösterir [23,24,29]. VEGF-A, 46 kDa
ağırlığında homodimerik bir glikoproteindir. Literatürdeki VEGF-A’nın angiyogenezin
temel mediyatörü olduğunu kanıtlayan çok sayıda çalışma vardır [24,29,30]. İnsan VEGF-
A geni, sekiz ekzon ve yedi introndan oluşmaktadır. Ekzonların alternatif kodlanması, altı
farklı transkript oluşmasına ve altı farklı izoform üretilmesine sebep olmaktadır:VEGF121,
VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF183, VEGF189, VEGF206. Bu izoformlar,
moleküler ağırlıkları, asiditeleri ve heparine bağlanıp bağlanmamaları gibi özellikleri ile
birbirlerinden ayrılırlar. Bu izoformların daha büyük yapılı olanları matris-bağlı durumda
bulunurken kısa olanları serbest difüzyon yapabilir. VEGF165 ve VEGF121 kovalent bağlı
homodimerik proteinler olarak salgılanırlar. VEGF165, biyolojik olarak aktif olan ve
ortamda en fazla bulunan isoformdur.VEGF165 hem matris bağlı formda bulunur hem de
serbest difüze olabilir. VEGF121 asidik özelliktedir ve heparine bağlanmaz. Endotel
hücrelerinde biyolojik aktiviteye sahip olmakla birlikte, aktivitesi VEGF165’den daha
9
düşüktür. Heparin-bağlayıcı ünitesi olmadığından en kolay difüze olabilen
izoformdur.VEGF189 ve VEGF206 gibi daha büyük izoformlar, bazik özelliktedir,
heparine bağlanırlar. Bu izoformlar hücre membranından geçerek, sitoplazmaya
ulaşamadığından, ekstraselüler matrikste birikirler [24,29,31].
2.1.2.2. VEGF Reseptörleri
VEGF, tirosin kinaz ailesine ait hücre yüzey reseptörlerine bağlanarak etki gösterir.
Vasküler ve lenf damarı endotel hücrelerinin yanısıra, monositler, makrofajlar, hemopoetik
kök hücreler, epitelyum hücreleri, fibroblastlar, düz kas hücreleri gibi non endotelyal
hücrelerin yüzeylerinde de VEGF reseptörleri ve koreseptörleri bulunur. Üç tip VEGF
reseptörü vardır. VEGFR-1(flt-1), VEGFR-2 (KDR/flk-1), ve VEGFR-3 (flt-4).VEGF-A
için iki yüksek afiniteli tirosin kinaz reseptörü vardır: VEGFR-1(flt-1), VEGFR-2
(KDR/flk-1) [30,32,33,].
2.1.3. KNVM Tedavisinde Anti-VEGF Ajanlar
Kırktan fazla oküler hastalığın sonucunda gelişebilmesi ve ağır görme kayıplarına yol
açması nedeniyle, KNVM hem yaygın olarak tanı konan, hem de yaşam kalitesini ciddi
oranda düşüren önemli bir patolojidir. Bu nedenle KNVM tedavisi için günümüze dek pek
çok farklı tedavi yöntemi denenmiştir. Lazer tedavisi, cerrahi yaklaşımlar ve fotodinamik
tedavi seçenekleri KNVM yaygın olarak kullanılmakla beraber, tatmin edici sonuçlara
ulaşmak mümkün olmamıştır [11-13, 34,35].
KNVM’ın patogenezine ait verilerin elde edilmesi ile birlikte, angiyogenezin moleküler
mekanizmasını hedefleyen tedaviler gündeme gelmiştir [36]. 2004 yılındaki Oküler
Neovaskülarizasyonda Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) baskılama
çalışması, sonuçlarıyla bu alanda bir çığır açmıştır [37]. Bu çalışmada YMD bağlı KNVM
tedavisinde, VEGF’ü hedefleyen tedavilerin, anatomik ve fonksiyonel iyileşmeye sebep
olduğu sonucunu vermiştir. Daha sonra intravitreal anti-VEGF uygulamaları konusunda
yapılan pek çok prospektif ve retrospektif çalışma, tedavi edilen hastalarda, görme
seviyesinde artma, florosein anjiyografide sızıntıda azalma, optik koherent tomografi
(OCT)'de santral retina kalınlığında azalma ve ödem miktarında %90'lara varan azalma
göstermiştir [38-40].
2.1.3.1.Göz Hastalıklarının Tedavisinde Kullanılan Anti-VEGF Ajanlar
Günümüzde Amerika Birleşik Devletlerinde, göziçi kullanım için üç anti-VEGF ajanı FDA
(Federal Drug Administration) onayı almıştır: Pegaptanib sodyum (Macugen; Eyetech
10
Pharmaceuticals, Inc, New York NY), Ranibizumab (Lucentis, Genentech Inc, South San
Francisco, CA), Aflibercept (VEGF-Trab (Eylea) , Regeneron, Tarrytown, New York,
USA). Diğer bir ilaç bevasizumab, (Avastin; Genentech Inc, South San Francisco, CA)
metastatik kolorektal kanser, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri, ve metastatik meme
kanseri için FDA onayı olan ama tüm dünyada göz hastalıkları uzmanları tarafından,
KNVM tedavisinde off-label (ruhsatlı, endikasyon dışı) olarak kullanılan bir ilaçtır [41,42].
2.1.3.1.1. Bevasizumab haricinde kullanılan ilaçlar
Pegaptanib VEGF 165 izoformuna yüksek spesifisiteyle bağlanabilen diğer izoformlara
bağlanamayan bir ajandır. Pegaptanib ve Ranibizumabı, birbirlerinden ayıran en önemli
özellik, bağlanma bölgeleri ve buna bağlı olarak farklı izoformlara olan afiniteleridir.
Kimerik bir molekül olan Ranibizumab tüm tanımlanmış VEGF isoformlarına
bağlanabilen bir antikor fragmanıdır. Daha az antijenik olması için bağlanmayan kısmı
insan kökenliyken, anti-VEGF'e bağlanan yüksek afiniteli epitopu fare kökenlidir. VEGF
Trab, rekombinant kimerik VEGF füzyon proteinidir. Diğer anti VEGF ajanlardan farklı
olarak VEGF-A’nın yanısıra diğer tüm VEGF alt gruplarına ve VEGF reseptörlerine
bağlanabilen bir ilaçtır.
2.1.3.1.2.Bevasizumab
Bevasizumab, tam boyutlu, VEGF-A’nın tüm izoformlarına etki eden, humanize
monoklonal antikordur ve 149 Kd ağırlığında rekombinan bir IgG molekülüdür (şekil 2.4).
Şekil 2.5.
Şekil 2.4.Avastinin üç boyutlu yapısı [41]
Bevasizumab 6.2 PH değerinde, renksiz, berrak, sterile çözelti formudur. Orginalde
intravenöz kullanım için tasarlanmıştır ve 100 mg ve 400 mg etken madde içeren 4ml ve
11
16ml’lik (25 mg/ml) tek kullanımlık preservansız bevasizumab formları mevcuttur [41,42]
Bevasizumab VEGF-A’nın tüm izoformlarının reseptör bağlayan ünitesine bağlanabilir.
Böylece, VEGF-A’nın endotel hücre yüzeyinde yer alan reseptörü ile etkileşimini bloke
ederek endotel hücre proliferasyonu ve yeni damar oluşumuna sebep olan hücre içi sinyal
iletimini başlatmasını engeller [31].
2.1.3.2.KNVM Tedavisinde anti-VEGF Tedavilerin Etkinliği
KNVM tedavisinde anti-VEGF tedavisini değerlendiren çalışmaları incelendiğinde,
antivasküler ajanların doz, tedavi etkinliğinin değerlendirildiği çok sayıda evre 1 düzeyde
çalışma olmakla birlikte özellikle, özellikle 3 çalışmanın diğer çalışmalarda kaynak olarak
kullanıldığı izlenir. Bu üç çalışma şunlardır:
VISION = VEGF Inhibition Study in Ocular Neovascularization [37]
ANCHOR=Anti-VEGF Antibody for the Treatment of Predominantly Classical CNV in
AMD [43]
MARINA=Minimally Classic/Occult Trial of the Anti-VEGF antibody Ranibizumab in
the treatment of neovascular AMD [44]
Bu çalışmaların sonuçları kısaca değerlendirildiğinde, Vision çalışmasında, intravitreal
pegaptanib sodium uygulamasının, neovasküler YMD hastalarında, görme kaybını
yavaşlattığı, tedavi alan hastaların %70’inde 15 harften daha az görme kaybı gelişirken,
kontrol grubunda bu oranının %50 olduğu bildirilmiştir. Ayrıca intravitreal pegaptanib
sodium tedavisi alan hastaların %6’sında en az 15 harf görme artışı olurken bu oran kontrol
grubunda %2 olarak bildirilmiştir. Fundus Florosein Anjiografi (FFA)’da da, tedavi edilen
grupta hem KNVM’nin total alanda küçülme hem de sızıntı miktarında azalma izlenmiştir
[37]. MARINA ve ANCHOR çalışmalarında ise ranibizumab tedavisinin, tüm YMD
subtiplerinde görme kaybını azalttığı ve görme seviyesini arttırdığı bildirilmiştir [43,44].
ANCHOR çalışmasında ranibizumab tedavisi verteporfin fotodinamik (PDT) tedavi ile
karşılaştırılmış ve benzer sonuçlar bildirilmiştir. FFA incelemelerinde de, hem MARINA
ve hem ANCHOR çalışmasında toplam ve ortalama KNVM alanında, KNVM’den sızıntı
miktarında, seroz retina dekolmanı miktarında ve subretinal fibrosis gelişimde istatistiksel
olarak anlamlı oranda azalma bildirilmiştir.
İntravitreal bevasizumab halen tüm dünyada off-label olarak kullanılmaktdır ve etkinliğini
ve güvenilirliğini değerlendiren evre 1 çalışma yoktur. Bununla birlikte bevasizumab 2006
yılının başlarından itibaren çoğu retina uzmanı tarafında YMD tedavisinde ilk tercih olarak
kullanılmaktadır ve literatürde bevacizumab tedavisi ile ilgili çok sayıda evre 2 ve 3 yayın
12
mevcuttur[45]. Bevacizumab neovasküler AMD tedavisinde ilk olarak intravenöz
uygulama olarak denenmiş (5mg/kg) ve kısa dönemde iyi sonuçlar bildirilmiştir [46,47].
Fakat sistemik yan etkiler açısından daha güvenilir olması ve tedavi sayısının daha az
olması açısından intravitreal uygulamalar tercih edilmiştir.
İntravitreal bevasizumab uygulamasına ait ilk klinik çalışmada, AMD'ye sekonder reküren
KNVM gelişmiş ve daha önce pegaptanib, fotodinamik tedavi ve triamsinolon asetonit
tedavisi almış bir hastada, tek doz 1 mg intravitreal bevasizumab enjeksiyonu sonrası,
uygulamadan 1 hafta sonra, santral retina kalınlığında azalma ve subretinal sıvıda emilime
paralel olarak görme seviyesinde artma izlenmiştir [43]. Daha sonra intravitreal
bevasizumab uygulamaları konusundaki pek çok prospektif ve retrospektif çalışma, tedavi
edilen hastalarda, görme seviyesinde artma, florosein anjiyografide sızıntıda azalma,
OCT'de santral retina kalınlığında azalma sonuçlarını vermiştir [38-40, 48]
İlk büyük bevasizumab tedavi serilerinden birinin rapor edildiği çalışmada, subfoveal
KNVM’si olan ve 1.25 mg (0.05 ml) intravitreal bevacizumab tedavisi alan 81 göz
incelenmiştir. Bu gözlerin %80’i daha önce pegaptanip, PDT veya her ikisini de almıştır.3
ay sonra tedavi alan grupta merkezi retina kalınlığı, ortalam 340 µ’dan, 213µ’a düşmüş ve
hastaların %38.3’ünde snellen eşeline gore 2 veya daha fazla sıra artış izlenmiştir [49].
Bu çalışmaları değerlendirirken gözönünde bulundurulması gereken önemli bir nokta da
burada tedavi edilen gözlerin çoğunun daha önce tedavi edilmiş olmasıdır. AMD tanısı ile
bevasizuumab tedavisi alan 50 olgunun incelendiği bir çalışmada, daha önce herhangi bir
tedavi almamış olguların tedaviye cevabının daha once başka bir tedavi almış olgulara
oranla daha iyi olduğu sonucunu vermiştir [50].
Anti VEGF ajanların KNVM tedavisinde uygulanması ile elde edilen anatomik ve
fonksiyonel başarı, patolojik miyopi, anjioid streak, diabetik retinopati, retinal ven kök ve
retinal ven dal tıkanıklığı gibi angiogenezle seyreden pek çok hastalıkta da anti VEGF
ajanların uygulamasının kullanımına yolaçmıştır [51]. Son on yıldır giderek artan anti
VEGF uygulamaları sonucunda anti VEGF ajanlar günümüzde, ön segmentte ve arka
segmentte angiogenezle seyreden 50’den fazla göz hastalığında etkinliği gösterilmiş ve
tüm dünyada göz hekimlerinin sıklıkla uyguladığı tedavi seçenekleridir [52].
2.1.3.3. Anti Anjiyogenik İlaçların Göze uygulanmasında geneleksel Yöntemler
Göze ilaç uygulamalarda hedef, göz içinde hedef dokularda, güvenli bir uygulama yöntemi
ile istenen tedavi edici ilaç dozunun sağlanmasıdır [53]. Halen bu amaçla göz ilaçları temel
dört farklı yolla uygulanmaktadır [54-56]:
13
a-) Topikal (damla, merhem, jel formları) uygulama
b-)Peribulber (göz çevresine yapılan ) uygulamalar (subtenon, subkonjuktival gibi )
c-) İntravitreal (direk göz içine yapılan) uygulamalar
d-) Sistemik uygulamalar (ağızdan ve damar içine uygulama )
Yukarıda da ifade edildiği gibi, göze ilaç verirken hedef, istenen dokularda istenen ilaç
konsantrasyonun sağlanmasıdır ve bunun hastaya en az zarar veren, yan etkisi en az olan
yöntemle yapılabilmesidir. Maalesef bu hedef henüz tamamen yakalanamamıştır. Göz,
sahip olduğu kompleks anatomik, fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri sebebiyle tüm
yabancı cisimlere ve ilaçlara karşı çok dirençlidir, bu nedenle halen uygulanmakta olan
ilaçların oküler bariyerleri aşarak, göz içi dokularda istenen terapötik konsantrasyona
ulaşmasında çok ciddi zorluklarla karşılaşılmaktadır [57,58].
Geleneksel damla formundaki tedavilerle arka segmentte, etkin bir ilaç dozu elde etmek
mümkün değildir Damla formunda göze uygulanan ilaçlar, gözün içine giremezler, daha
damlatıldıkları andan itibaren gözün koruma mekanizmaları sayesinde hemen gözden
uzaklaştırılmaya başlarlar ve çok kısa bir sürede gözden uzaklaştırılırlar [59]. Gözün
yüzeyel hastalıklarında kullanılsalar da göz içindeki hastalıklarda hiçbir kullanım alanları
yoktur. Perioküler ilaç uygulamalarında, özellikle transsklaral ilaç uygulamalarında, ilaç
gözün içine değil de göz çevresindeki dokulara enjekte edilir, böylece gözden ilacı
uzaklaştıran mekanizmalardan bazılarının bypass edilmesi hedeflenir. Fakat burada ilaç
göz içine ulaşmak için, bazı göz tabakalarını yine kendisi aşmak zorunda olduğundan,
buralarda elimine edilir ve çok az bir kısmı gözün içine ulaşabilir (şekil 2.5). Bu nedenle
maalesef istenen tedavi edici dozun elde edilmesi zordur. Ama direk olarak göz içine iğne
yapılmadığı için bu yöntem güvenilir ve hasta için daha kabul edilebilir bir yöntemdir.
Halen uygulanmakta olmakla birlikte, istenen doz yakalanamadığından daha az tercih
edilmektedir [60-61]. Fakat paraoküler uygulamaların etkinliğini arttırmak için dünyada
yoğun çalışmalar yapılmaktadır [62-65].
Üçüncü yol olan intravitreal yolda ilaç direk olarak hastanın gözünün içine olarak
uygulanır. Halen klinik uygulamalarda en sık uygulanan yöntem bu yöntemdir. Burada
ilaç direk olarak göz içine verildiğinden istenen yüksek ilaç konsantrasyonları kolaylıkla
sağlanır fakat uygulamanın şeklinden kaynaklanan çok ciddi zorluklar ve yan etkiler
vardır[66-69].
14
Öncelikle göz içine iğne yapmak hasta için çok tedirgin edici ve rahatsızlık verici bir
uygulamadır. Bunun yanında göz içine direk enjeksiyon yapıldığında, enfeksiyon gelişimi,
katarakt, retina dekolmanı, üveit gibi çok ciddi ve göz kaybına kadar yolaçabilecek ağır
komplikasyonların gelişme riski mevcuttur. Diğer bir önemli husus da, burada tedavi
edilmeye çalışılan göz hastalıkları genelde kronik hastalıklardır. Bu nedenle uygulanan
Şekil 2.5.Transskleral geçişteki tabakalar [70]
tedavi belli periyotlarda birçok kez tekrarlanmak zorundadır. Böyle riskli uygulama
yollarının tekrarlanması da bir diğer önemli zorluktur. Tüm bu yan etkilerinden dolayı
intravitreal ilaç uygulamaları, riskli yöntemlerdir fakat istenen doz kolaylıkla elde
edilebildiğinden halen en sık tercih edilen yöntemdir.
Sistemi tedavilerin kullanımında da, gözde istenen tedavi edici dozun sağlanması için tüm
vücuda çok yüksek oranda ilaç vermek gerekmektedir bu da doğal olarak vücudun diğer
doku ve organlarında istenmeyen yan etkilerin ve toksik reaksiyonların gelişmesine sebep
olmaktadır [71-72]. Bu nedenle sistemik uygulamalar sadece nadiren kısa süreli
tedavilerde tercih edilmektedir.
15
2.2.Perioküler İlaç Uygulamaları
Gözün arka segmentine ilaç ulaştırmak için subkonjoktival, sub-tenon, peribulbar,
posterior jukstaskleral ve retrobulbar gibi pek çok farklı perioküler ilaç uygulama
yöntemleri kullanılabilir. Perioküler olarak uygulanan ilaç üç farklı yolla vitreusa ulaşabilir
(şekil 2.6). İlk yol ön kamaradan vitreusa geçiş yoludur. Bu yolla ilaç ya sklera veya siliyer
cisimden geçerek direk olarak veya konjoktivadan gözyaşı ve korneaya geçerek indirek
olarak ön kamaraya ulaşır. Ön kamaradaki ilaç daha sonra arka kamaraya ve vitreausa
geçer. İkinci yol ise ilacın konjoktival, episkleral ve koroidal damarlar aracılığı ile sistemik
dolaşıma katılmasının ardından sistemik dolaşımda dilue olduktan sonra yine kan akımı
yoluyla göze geçmesidir. Üçüncü yol olan direk yol ise ilacın sklera ve alttaki dokuları
geçerek vitreusa ulaşmasıdır. Literatürde subkonjoktival enjeksiyondan sonra farklı
yolların vitreusa geçen ilaç miktarı üzerindeki katkılarını araştıran pek çok çalışma vardır
[73,75]. Bu çalışmalar vitreusa ilaç geçişinde en etkili yolun direk geçiş olduğunu
göstermiştir. Transskleral ilaç uygulamalarında da hedef için ilacın sklera ve alttaki
dokuladan geçerek vitreusta hedeflenen ilaç konsantrasyonu sağlayacak düzeye
ulaşabilmesidir [76]. Dolayısıyla transskleral geçiş konusunda yapılan çalışmalarda
kastedilen yol sklera, koroid, retina ve vitreustan oluşan yapıların oluşturduğu direk yoldur.
16
Şekil 2.6: Perioküler alandan vitreus ve posterior oküler yapılara transskleral yolla ilaç
geçiş yolları [77]
Bunun yanında, maalesef henüz klinik olarak intravitreal uygulamalar kadar etkili bir
transskleral ilaç formu mevcut değildir [60,61]. Çünkü transskleral uygulamalarda ilacın
retinaya ulaşması için, sklera, bruch membranı-koroid, retina pigment epiteli gibi pek çok
farlı dokuyu geçmek zorunda kalmaktadır. Tüm bu katmanlardan geçiş esnasında, ilaç
sürekli olarak her bir tabakada elimine olduğundan, ilaç konsantrasyonları skleradan iç
17
katmanlara doğru hızlı bir şekilde azalmakta ve retinaya ulaşabilen ilaç konsantrasyonu,
etkinlik için gerekli dozun çok altında olmaktadır. Transskleral uygulanan ilaçlar
nöroretinaya ulaşması için, pek çok statik ve dinamik faktörleri aşmalıdır [76]. Halen
transskleral uygulamaların klinik etkinliği ve kullanım yaygınlığı intravitreal
uygulamalara oranla çok düşük olmakla birlikte, bu uygulamaların etkinliğinin arttırılması
konusunda yoğun çalışmalar devam etmektedir.
2.2.1. Transskleral Bariyerler ve Özellikleri
Bu konudaki literatür incelendiğinde, transskleral ilaç uygulamalarında, karşılaşılan
bariyerlerin üç başlık altında toplandığı görülür [77] (şekil 2.7).
2.2.1.1. Statik bariyerler
2.2.1.2. Dinamik bariyerler
2.2.1.3. Metabolik bariyerler
Şekil 2.7.Transskleral geçişteki statik bariyerler
(sklera, koroid, retina pigment epiteli) [78]
18
2.2.1.1.Statik Bariyerler
İlaç moleküllerinin transskleral olarak, retinaya difüzyonuna karşı bariyer oluşturan
dokular; sklera, bruch membranı-koroid (BK) ve retina pigment epiteli (RPE) statik
bariyerleri oluştururlar [77].
2.2.1.1.1. Sklera
Gözün beyaz kısmı olarak tanımlanabilen sklera, göz içindeki hassas tabakaları ve
hücreleri örten ve koruyan fibröz bir dokudur. Önde kornea ile arkada optik sinir dura
kılıfları ile devamlılık gösterir. Sklera, korneanın devamıdır, ikisi de kolajenden oluşmuş
dokulardır ve bu kolajenlerin diziliminin farklı olmasından dolayı kornea şeffaf bir
dokuyken sklera opaktır. Sklera korneaya oranla daha hidrate durumdadır (%65-70).
Korneanın temel fonksiyonu ışığı en yüksek oranda geçirebilmek için şeffaflık olurken,
skleranın temel fonksiyonu dış etkenlere karşı ve gözdışı kasların göz küresinde
oluşturduğu çekme kuvvetine karşı koruyuculuk sağlayabilmek için sert ve güçlü olmaktır.
2.2.1.1.1.1. Skleranın Yapısı
Sklera, glikozaminoglukan (GAG) matrikse gömülmüş kolajen liflerinden oluşmuştur ve
yapısında az miktarda fibroblast ve elastik lifler bulunur. Skleranın temel bileşeni
kolajendir, kuru ağırlığının %75’ini kolajen oluşturur. Skleranın yapısında bulunan kolajen
temel olarak tip 1 [79]. Bunun yanında skleranın yapısında Tip III, V ve tip VIII ve XII
kolajenin de yeraldığı gösterilmiştir [80-83]. Lamina kribroza ve koroidin basal
membranları ise tip IV kolajen içerirler [84]. Kolajen fibrillerin çapı oldukça heterojendir
(25-300 nm) ve çapları 500-600 nm civarında olan demetler şeklinde organize olmuşlardır.
Sklera yüzeyinde çapları 80-140 nm arasında değişen retiküler bir dizilim gösterirken içte
yeralan lifler düzensiz ramboid bir patern gösterirler [85]. Kolajen demetleri 35-75 nm ‘lik
makroperiyositelere ve 11 nm’lik mikroperiyositelere sahiptir. Santral korneadan perifere
doğru gidildikçe lif yapısı santral korneadaki lameller, tek tip düzenli bir dizilim gösteren
liflerden, sklerada değişik çaplarda dallanmış, içiçe geçmiş dizilim gösteren liflerle doğru
değişir. Skleradaki kolajen liflerin oryentasyonunda kendi içinde de bölgesel farklılıklar
vardır. Ekvator bölgesindeki liflerin çapları daha heterojendir (25-300 nm) ve bu bölgede
yeralan lifler rastgele oriyente olmuş lameller demetler şeklinde dizilmişlerdir. Skleranın
yapısında yer alan GAG’ların yapısı yeraldığı bölgeye göre farklılık gösterir. Peripepiller
sklera dermatan sülfat açısından zengindir. Ekvator bölgesi yüksek oranda hyaloronik asit
içerirken postekvatoryal bölgede kontroidin sülfat oranı fazladır. İnce miyopik skleralarda
GAG konsantrasyonu azalmıştır. Sklera boyunca difüzyon perivasküler alanlarda, jel-
19
benzeri mukopolisakkarid aköz medyada ve sklera matriks yapısında gerçekleşir.
Skleranın kalınlığı limbus bölgesinde 0.53 mm, ekvatorda 0.39 mm optik sinir
komşuluğunda ise 0.9-1 mm kadardır [86].Skleranın toplam yüzey alanı, 16.3 cm2’dir.
2.2.1.1.1.2. Skleral Geçirgenlik
Skleranın geniş yüzey alanı, intraoküler ilaç taşınması için çok önemli bir avantajdır.
Bunun yanında hidrasyon derecesinin yüksek olması, hiposelüler olması, az sayıda
proteolitik enzim içermesi ve geçirgenliğinin zamanla azalma göstermemesi gibi özellikleri
de skleraya ilaç taşınması konusunda avantaj sağlayan diğer sebeplerdir.
Skleranın geçirgenliği üzerine yapılan çalışmalar, skleranın korneaya yaklaşık bir
geçirgenliğe sahip olduğunu göstermektedir [87]. Korneal stromada olduğu gibi sklerada
da ilaç geçişi aköz ortam boyunca pasif difüzyonla olmaktadır. Skleranın yapısı %70
oranında su, proteoglikanlar ve sıkı demetler halinde kolajen liflerden oluşmaktadır.
Difüzyon yolunun, fibriller arasındaki proteoglikanların oluşturduğu jel-kıvamında aköz
ortam sıvısından olmaktadır. Dekstran, değişen ağırlıklarda polietilen glikol molekülleri,
antibiyotikler, oligonukleotidler, retinal antianjiogenik moleküller, ve lipofilik moleküller
gibi çok değişik moleküllerin skleral geçirgenliği ölçülmüştür. Skleral geçirgenliğe etki
eden pek çok önemli faktör vardır. Skleral geçirgenliğin moleküler ağırlığa bağlı olarak
değiştiği pek çok çalışma ile gösterilmiştir [87-89]. Fakat moleküler yarıçap, moleküler
ağırlıktan daha belirleyici olmaktadır, globüler yapıda olan proteinler, aynı molekül
ağırlığına sahip olmalarına rağmen, linear yapıda olan dekstranlara göre tavşan sklerasında
daha yüksek geçirgenliğe sahiptir [88].
Lipid çözünürlüğün artması hem tavşan hem de insan sklerasında geçirgenliği
azaltmaktadır [90]. Skleranın hidrasyonu, kriyoterapi uygulaması, transskleral diod lazer
cerrahi inceltme ve göz içi basıncındaki değişiklikler gibi pek çok faktörün skleral
geçirgenlik üzerine etkileri araştırılmıştır Skleranın hidrasyonunun ve skleranın cerrahi
olarak inceltilmesinin skleral geçirgenliği arttırdığı bildirilirken kriyoterapi uygulaması ve
transskleral diod lazer uygulamalarının skleranın geçirgenliğinde herhangi bir değişikliğe
yol açmadığı gösterilmiştir [74,86].
2.2.1.1.2. Bruch membran-Koroid (BK) ve RPE
Bruch membranı ve koroid dokularını birbirinden ayırmak zor olduğundan, iki tabakanın
geçirgenlik çalışmaları birlikte yapılmaktadır [91].
20
2.2.1.1.2.1. Bruch membranın Yapısı
Bruch membran 7 µ kalınlığında, koryokapillarisi RPE’den ayıran ince bir zardır. Bruch
membranı beş tabakadan oluşur:
RPE basal membranı
İç gevşek kolajen alan
Esnek liflerin oluşturduğu orta tabaka
Dış gevşek kolajen alan
Koryokapillaris endotelinin basal membranı
2.2.1.1.2.2. Koroidin Yapısı
Sklera ve retina arasında yeralan damar ve pigment açısından zengin dokudur.
2.2.1.1.2.3. RPE’nin Yapısı
RPE, bruch membanı ile retina arasında bulunan, nöroekdodermal kökenli, tek katlı,
altıgen şekilli, küboidal hücre tabakasıdır. RPE hücreleri alçak ve yaklaşık 16 µm çaplı
hücrelerdir. Komşu hücrelerin dış yüzeyleri ile yakın temastadırlar ve apikal kısma yakın
olan sıkı bağlantı yapıları (zonula okludans) ile birbirine tutunmuşlardır. Bu sıkı bağlantı
yapıları dış retinal kan-oküler bariyeri oluşturur.
2.2.1.1.2.4. Bruch membran-Koroid ve RPE Geçirgenlik Çalışmaları
Bruch membranı ve koroid dokularını birbirinden ayırmak zor olduğundan, iki tabakanın
geçirgenlik çalışmaları birlikte yapılmaktadır [91]. RPE ise kolayca ayrılabildiği için bu
tabakanın geçirgenlik çalışmaları bağımsız olarak yapılabilmektedir. Bir çalışmada floresen
işaretli pigment epitel kökenli faktörün (50 kDa) RPE geçirgenliğini ölçmek için kültüre
edilmiş maymun RPE hücreleri kullanılmıştır. Sıkı kavşakların (tight jnx) varlığına rağmen
protein kültüre edilmiş RPE hücrelerinden geçiş göstermiştir [92]. Hidrofilik
karboksiflorosein ve FITC-dextranla yapılan BK kompleks ve RPE geçirgenlik
çalışmalarında geçirgenliğin molekül yarı çapındaki artışla orantılı olarak azaldığı
gösterilmiştir [93]. Köpeklerde yapılan bir çalışmada BK kompleksinin 150 kDa
büyüklüğündeki moleküllere geçirgen olduğu gösterilmiştir [94]. Lipofilik özelliğin
artması BK kompleksinde geçirgenliği azaltırken, RPE’inde arttırmaktadır.
RPE’ine doğru pasif transportla geçen moleküller dışarı (retina koroid) ve içeri (koroid
RPE) doğru aynı geçirgenliği gösterirken, aktif transportla geçen moleküller iki yönde
farklı geçirgenlik gösterirler.
21
2.2.1.2. Dinamik Bariyerler
Sadece in vivo çalışmalarda değerlendirilebilen, ex-vivo çalışmalarda değerlendirilemeyen
konjuktival/episkleral akım, koroidal akım, uveoskleral akım, RPE transport proteinleri,
hidrostatik ve onkotik basınç, metabolik bariyerler ve organik iyon pompaları dinamik
bariyerleri oluşturur.
2.2.1.2.1. Konjuktival/Episkleral akım
Subkonjoktival akım, perioküler alana enjekte edilen ilacın uzaklaştırılmasında önemli rol
oynar (şekil 2.8). Yapılan çalışmalarda subkonjoktival alana enjekte edilen maddelerin
servikal lenf nodunda izlendiği bildirilmiştir. Tavşanlarda subtenon enjeksiyon öncesi
koroidal an akımı ve lenfatiklerinin inhibe edilmesi için konjoktival pencere
uygulamasının, tavşanlarda ilacın vitreusa geçişini arttırdığı gösterilmiştir [95].
Şekil 2.8. Transskleral ilaç uygulamalarında konjoktiva/episklera ve koroiddeki
temizlenme (clearance) yolları [96]
2.2.1.2.2. Koroidal Akım
Koroiddeki hızlı kan akımı sebebiyle koroidal akım transskleral geçişte ilaç moleküllerinin
uzaklaştırılmasında çok etkili olarak düşünülse de, yapılan çalışmalar bu beklentiyi
22
desteklememiştir. Transskleral uygulama öncesi koroide kriyo uygulaması ile koryoretinal
skar oluşturularak koroid akımın önlenmesi, transskleral geçiş miktarında bir artışa sebep
olmamıştır. Bu nedenle bu çalışmalar koroidal akımın transskleral geçiş üzerinde belirgin
bir etkisinin olmayabileceğini göstermektedir.
2.2.1.2.3. Uveoskleral Akım
Uveoskleral yol direk ve invaziv olmayan bir yöntemle değerlendirilemediğinden, bu
yolun ilaç eliminasyonundaki etkisi çok net olarak açıklanamamıştır. Uveoskleral yol
insanlarda tüm aköz drenajına katkısı %4 ile 60% arasında değişmektedir [96].Uveoskleral
yolun aköz drenajındaki rolünün değişken olması, onun transskleral geçişte de
beklenenden daha yüksek rol oynadığının göstergesi olabilir.
2.2.1.2.4. Hidrostatik ve Osmotik Basınç
Koroid zengin vaskülarizasyona sahip, protein içeriği yüksek bir yapıdır. Tavşanlarlarda
koroid basıncı 12-14 mm olarak ölçülmüştür [97]. Koroid sistemik basınca yakın bir
osmotik basınca sahipken vitreus basıncı sistemik basınçtan çok düşüktür (0’a yakındır).
Koroid ve vitreus arasındaki bu basınç farkı koroidden vitreusa doğru sıvı alışına neden
olur.
2.2.1.2.4. RPE Taşıyıcı Proteinler
RPE iyonların ve moleküllerin subretinal alana geçişini düzenlemekle görevlidir. RPE
üzerinde, iyon taşıyıcılar, aminoasit taşıyıcılar ve ilaç pompaları gibi pek çok taşıyıcı
protein eksprese edilir. Taşıyıcı proteinler ilaçları koroide taşıdıklarından, transskleral
geçişi azaltabilirler. Bu konuda yeterli çalışma olmamakla birlikte, transskleral geçişte
RPE’de ilaç düzeyinin düşük olması, taşıyıcı proteinlerin bariyer görevi gördüğü tezini
desteklemektedir.
2.2.1.3. Metabolik Bariyerler
Göz insan vücudunun atmosfere açık olan parçasıdır. Bu nedenle koruma mekanizması
olarak göz, oküler yapılara zararlı olabilecek yabancı cisimleri parçalayabilecek koruma
mekanizmalarına sahiptir. Pek çok göz dokusunda ilaç metabolize eden enzimler
bulunmakla birlikte bu mekanizmaların en yoğun olduğu yapılar silier cisim ve RPE’dir.
Bu dokularda yüksek oranda koruyucu enzim bulunmasının sebebi bu dokuların sistemik
dolaşımla gelen zararlı maddelerin parçalanmasında rol almalarıdır. Transskleral geçişte de
RPE’deki metabolik enzimler ilaçların parçalanmasında ve geçişin azalmasında rol
oynayabilir.
23
2.2.2. Transskleral İlaç Geçişlerinin Etkinliği
Subtenon enjeksiyonların intravitreal uygulamaya oranla iki önemli avantajı
1-Uygulama sırasında göziçine girilmediği için düşük komplikasyon riskine sahip olması
2- Uygulanın daha az invaziv olması nedeniyle hasta uyumunun daha yüksek olması ve
tedavinin tekrar edilebilirliğinin fazla olması olarak özetlenebilir.
Halen, klinik olarak intravitreal uygulamalar kadar etkili bir transskleral ilaç formu
mevcut değildir [61,62]. Çünkü transskleral uygulamalarda ilacın retinaya ulaşması için,
yukarıda anlatıldığı pek çok farklı bariyeri geçmek zorunda kalmaktadır. Tüm bu
bariyerlerden geçiş esnasında, ilaç sürekli olarak her bir tabakada elimine olduğundan, ilaç
konsantrasyonları skleradan iç katmanlara doğru hızlı bir şekilde azalmakta ve retinaya
ulaşabilen ilaç konsantrasyonu, etkinlik için gerekli dozun çok altında olmaktadır. Bu
nedenle transskleral ilaç uygulamaları güvenilir ve etkin bir yöntem olmasına rağmen,
günümüzde yaygın olarak sadece steroid tedavileri için yaygın olarak tercih edilmektedir
[98-101], intraoküler tümörlerin tedavisinde kullanılan kemoterapötik ajanların
uygulanmasında da etkili olduğunu bildiren çalışmalar vardır [102-104]. Halen subtenon
uygulamaların klinik etkinliği ve kullanım yaygınlığı intravitreal uygulamalara oranla çok
düşük olmakla birlikte, ilaç taşıma sistemleri konusunda yapılan pek çok çalışma ile
transskleral geçişin etkinliği arttırılmaya çalışılmaktadır. Nanopartiküler ilaç taşıma
sistemlerinin kullanılması diğer alanlarda olduğu gibi bu alanda da pek çok farklılığı ve
üstünlüğü beraberinde getirmiştir [105].
Nanoteknoloji bazlı ilaç taşıma sistemlerin kullanılması, ilaç moleküllerinin büyüklük,
yük, yüzey özellikleri gibi parametrelerinin modifiye edilebilmesini sağlayarak ve istenen
özellikleri taşıyan ilaç taşıyıcı sistemlerin sentezlenmesini imkan vermektedir [106]. Bu
veriler ışığında, nanoteknolojik yöntemlerle hazırlanan ve istenen özelliklere göre
modifiye edilen ilaç taşıma sistemlerinin kullanılması ile transskleral uygulamalarda,
etkin tedavi dozunun yakalanmasını son zamanlarda üzerinde çok çalışılan önemli bir
konudur.
24
2.2.2.1. Antianjiyojenik Tedavide Karşılaşılan Sorunlar
Şekil 2.9.İntravitreal enjeksiyonun şematik çizimi[107]
İntravitreal uygulanan anti VEGF tedavilerinin en önemli komplikasyonu, endoftalmi,
retina dekolmanı, üveit ve katarakt gelişimidir. İntravitreal anti VEGF uygulaması sonrası
retina dekolmanı, endoftalmi gibi lokal komplikasyonların gelişme riski, herhangi bir
intravitreal uygulama sonrası lokal komplikasyon gelişme riski ile aynıdır. Burada
komplikasyon gelişiminde esas etken uygulama yoludur [66-69] (şekil 2.9). Kanser
tedavilerinde intravenöz bevasizumab uygulamalarından sonra, hipertansiyon, artmış
tromboemboli riski, gastrointestinal perforasyon, miyokard enfarktüsü ve ölüm gibi
komplikasyonlar gelişmiştir. İntravitreal uygulamalardan sonra da serum bevasizumab
düzeyleri yükseleceğinden, kanser tedavisinde izlenene benzer yan etkilerin gelişme riski
vardır. Literatürde intravitreal enjeksiyon sonrasında gelişen pek çok sistemik bevasizumab
yan etkisi bildirilmiştir [107-108].Özetle intravitreal anti-VEGF tedavilerinde retina
dekolmanı, endoftalmi, katarakt ve üveit gibi ciddi komplikasyonlar gelişme riski olmakla
birlikte bu risk, uygulamanın şekline bağlıdır. Ayrıca bu uygulamanın, tekrarlanmasının
gerekmesi de hem komplikasyon riskini arttırmakta hem de hasta uyumunu düşürmektedir.
Bu nedenle, intravitreal uygulamanın getirdiği bu yan etkileri azaltmak amacıyla, diğer
lokal oküler ilaç uygulama yöntemleri gündeme gelmektedir. Bunlar arasında en yaygın
25
olarak kullanılan peribulber uygulamalardır. Peribulber uygulamaların etkinliğini arttırmk
için pek çok farklı yöntem geliştirilmeye çalışılmaktadır [65]. Bunlar arasında üzerinde en
fazla çalışılan sistemlerden biri de nanopartiküler sistemlerin kullanılmasıdır.
2.2.3. Gözde Nanopartiküler İlaç Taşıma Sistemlerinin Kullanılması
Nanoteknoloji 0.1-100 nm boyutlarındaki bilim ve teknoloji uygulamaları olarak
tanımlanabilir [109]. Nanotıp, hastalıkların önlenmesi, tanısı, tedavisi ve insan sağlığının
korunması için moleküler düzeydeki bilginin ve moleküler düzeydeki cihazların
kullanılması olarak tanımlanabilir [110]. Nanoteknoloji uygulamaları elektronik, fizik
kimya, bilgisayar bilimleri gibi pek çok bilim dalında olduğu gibi tıp ve eczacılık alanında
da pek çok özgün uygulamanın gelişmesine ve çözümü mümkün olmayan konulara yeni
çözümler üretilmesine sebep olmuşlardır. Tıp ve eczacılık alanında nanoteknoloji
uygulamalarının en sıklıkla tercih edildiği konulardan biri nanoteknoloji bazlı ilaç taşıma
sistemlerinin geliştirilmesidir [111].
2.2.3.1. Nanoteknoloji Bazlı İlaç Taşıma Sistemleri
İlaç taşıma sistemlerinin geliştirilmesinde hedef, taşınan ilacın etkin ve güvenilir bir
şekilde hedeflenen dokuya ulaştırılmasıdır. Başarılı bir ilaç taşıma sisteminin hedefi şu üç
konuda etkin çözümler üretmektir:
Etken maddeyi kontrollü bir şekilde salarak terapötik konsantrasyonu uzun süre
korumak
Organa veya dokuya özel hatta hastalığa özel hedeflendirimiş tedavi modaliteleri
geliştirmek
Ulaşılması güç olan organ ve dokulara ilaç taşınmasını sağlamak için yeni ve
kullanılabilir uygulama yolları geliştirmek.
Bu hedeflerin sağlayabilecek özellikte ilaç taşıma sistemlerinin geliştirilebilmesi için çok
farklı teknolojiler kullnılmaktadır [112]. Nanoteknoloji bazlı ilaç taşıma sistemlerin
kullanılması da özellikle son iki dekadda istenilen özelliklerde ilaç taşıma sistemlerinin
geliştirilmesinde yaygın olarak tercih edilen yöntemlerden biridir [109-111].
Nanopartiküller boyutları, 1 ile 1000 nm arasında değişen polimerik parçacıklardır. Bu
parçacıklar nanokabuklar ve nanoküreler olmak üzere iki grupta toplanabilir.
Nanokabuklar merkezde bir boşluk ve çevrede onu saran polimerik bir membrandan
oluşan küçük kapsüllerdir. Nanoküreler ise yoğun solid polimerik ağdan oluşan küçük
monolitik kürelerdir. İlaç nanoküreler matriksine yüklenebileceği gibi yüzeyine de
26
bağlanabilir. Nanopartiküller son iki dekatta kornea epiteli gibi dokularda ilaç
biyoyararlanımını arttırmak ve hedefleme yapmak için üzerinde en fazla çalışılan nano
sistemlerdir.
Göz kendine has anatomik, biyokimyasal, fizyolojik özellikleri nedeniyle yabancı
moleküllere ve ilaç uygulamalarına karşı çok korunaklıdır. İç ve dış retinal bariyerler
sebebiyle retina ve vitreus sistemik dolaşımdan ayrılmışlardır. Göze uygulanan
moleküllerde temel hedefler hem bariyerlerin etkin biçimde aşılırken, ilaçların göz
dokularında çözünürlüğünün arttırılmasıdır [113,110 ].
Nanopartiküler ilaç taşıma sistemlerinin oftalmik ilaçlarda kullanılmasının en önemli
avantajları şöyle özetlenebilir [114].
1-İlaçların kontrollü bir şekilde uygulanmasının sağlanması
2-İlaç parçalanmasının en az düzeye indirilmesi
3-İstenmeyen zararlı yan etkilerin önlenmesi
4-İlaç biyoyararlanımının arttırılması
5-Hedeflenen alanda ilaç birikiminin arttırılması
6-İlaç geçirgenliğinin arttırılması
Nanopartiküllerin glokom [115,116] oküler enfeksiyonlar [117,118], oküler inflamasyonlar
[119]ve oküler imün aracılı hastalıklar [120] gibi pek çok farklı göz hastalığında topikal
veya lokal enjekte edilebilir sistemler olarak kullanılmaları konusunda çok yoğun
araştırmalar yapılmaktadır. İlaç uygulamalarında başarıyı etkileyen faktörler ilaç yükleme
kapasitesi, ilaç salım hızı ve kullanılan polimerin biyouyumluluğudur. Göze ilaç
taşınmasında kullanılan nanopartiküler ilaç sistemlerinin başarısında en önemli
faktörlerden biri polimer seçimidir. Günümüzde polimetilmetakrilat, polialkilsiyanoakrilat,
polikaprolaktone, albümin, jelatin, polilaktik asit, kitosan ve Eudgarid gibi pek çok sentetik
ve doğal biyouyumlu polimer göze ilaç taşınmasında kullanılmaktadır.
Kitosan sahip olduğu bioparçalanabilirlik, biyouyumluluk ve stabilite gibi özellikleri
sebebiyle göz ilaç taşınmasında yaygın olarak tercih edilen bir materyaldir [121-123] .
2.2.3.1.1.Kitosanın Kaynağı, Yapısı ve Fizikokimyasal Özellikleri
Kitosan, değişik derecelerde deasitile ve depolimerize edimiş deasetile kitinlere verilen
genel addır [124]. Kitin kabuklu deniz hayvanlarının dış kabuklarında, böceklerin üst
derilerinde ve pek çok mantarın hücre duvarında bulunan doğal bir biyopolimerdir [125].
27
Kitosan glukozamin ve asetilglukozamin ünitelerinin her ikisine de sahip bir
heteropalimerdir [121,122].Kitosan, polikatyonik, biyouyumlu ve biyobozunur olmasının
yanısıra, mukoadhesive ve geçirgenlik arttırıcı özelliklere sahip olması dolayısıyla
mukozal yolla ilaç uygulamalarında en sık tercih edilen polimerlerden biridir [126-129]
.Yüksek molekül ağırlığına (yaklaşık 1400 Kd) sahip kitosan düksek molekül ağırlığına
(500-800 Kd) sahip kitosanlara oranla daha iyi mukoadhesiv özellik gösterir. Bununla
birlikte, görece olarak düşük molekül ağırlıklı kitosanların glutamat tuzları da iyi
mukoadhesiv özelliğe sahiptir (25 – 50 kDa) [130]. Kitosan hem psödoplastik hem de
elastik reolojik özelliklere sahiptir [131]. Kitosan biyouyumlu yapısı sebebiyle alerjik
reaksiyonlara sebep olmaz. İnsan vücudunda, tamamen emilebilen zararsız amino gruplara
parçalanır. İyonize radyasyon, buhar, sıcak uygulaması ve kimyasal yöntemler gibi pek çok
farklı yöntemle sterilize edilebilir olması kitosanın klinik uygulamaları açısından önemli
bir avantaj sağlamaktadır [132].
Kitosan Amerika Birleşik Devletleri’nde (ABD) Genel olarak Güvenli Kabul edilen
(GRAS) maddeler sınıfında kabul edilmektedir. Japonya, İtalya ve Finlandiya’da da gıda
katkı maddesi olarak kabul edilmektedir [121,133, 134].
2.2.3.1.2.Kitosan Bazlı Taşıma istemlerinin Göze İlaç Taşınmasında Kullanılması
Kitosan sahip olduğu farklı ve özgün biyolojik özellikler, sebebiyle tüm dünyada
farmasötik formulasyonların hazırlanmasında sıklıkla tercih edilen bir polimerdir [135-
137]. Kitosan geçirgenlik arttırıcı özelliğe sahip ve düşük toksisite riski taşıyan
mukoadhesif ve biyobozunur bir polimerdir. Tüm bu seçkin biyofarmasötik özellikleri
kitosanın sadece parenteral ilaç taşınmasında için değil oküler ilaç taşınması da dahil
olmak üzere transmukozal yolla ilaç taşınmasında da taşıyıcı molekül olarak sıklıkla tercih
edilmesine sebep olmaktadır [138-140].
Kitosanın göze ilaç taşınmasında yaygın olarak kullanılmasına sebep olan özellikleri
incelendiğinde, kitosanın mukoadhesif karakteri ilk göze çarpan özelliktir. İlk olarak ex
vivo çalışmalarla gösterilen bu özellik ilacın yüzeylere daha iyi yapışmasını sağlamakta ve
uygulama bölgesinde kalış süresini uzatmaktadır[121,141]. Diğer bir önemli özellikte
kitosanın epitel hücreleri arasındaki sıkı kavşakları açabilmesinden veya parasellüler
yollardan absorbe olabilmesinden kaynaklanan geçirgenlik arttırıcı özelliğidir. Bu özellik
kitosan yüklü etken maddenin hedef dokulara ulaştırılmasında rol oynamaktadır [142,143].
28
Kitosanın psodoplastisitesi ve elastisitesi de hem uygulama alanında kalış süresini uzatarak
hem de epitel yüzeylerini harabiyetten koruyarak, uygulanan ilacın etkinliğinin
arttırılmasında önemli rol oynar [144]. Göz dokularının kitosana karşı yüksek toleransı pek
çok çalışma ile kanıtlanmış olan bir diğer önemli özelliktir [145,121]. Kesin mekanizması
henüz açıklanamamış olmakla birlikte kitosanın antibakterial etkisi olduğu gösterilmiştir
ve bu özellik te kitosanın göze ilaç taşınmasında etkin olmasına katkıda bulunan bir başka
önemli özelliktir [146,121].
Günümüzde kitosanın farklı formülasyonlarının göze ilaç taşınmasında kullanımı
konusunda çok sayıda çalışma yapılmaktadır. Göze ilaç taşınmasında en sık tercih edilen
kitosan formülasyonları solüsyonlar [147], jeller [148], lipozomlar [149], emülsiyonlar
[150], nanoemülsiyonlar[151], mikro ve nanopartiküller[152,153] olarak özetlenebilir.
2.2.3.1.2.1.Kitosan Nanopartiküllerin Göze İlaç Taşınmasında Kullanılması
Kitosan nanopartiküller, ilaç taşıma sistemi olarak giderek artan sıklıkla tercih edilmeye
başlanan formülasyonlardır. Kitosan nanopartiküllerin diğer alanlarda olduğu gibi göze
ilaç uygulamalarında da yaygın olarak kullanılmalarına sebep bazı özellikleri şöyle
özetlenebilir:
Hazırlanmaları için çok ileri teknoloji gerektirmemeleri
Homojen partikül popülasyonu elde edilebilmesi ve partiküllerin büyüklüğünün ve
yüzey yüklerinin kolayca modifiye edilebilmesi
Peptitler, proteinler ve nükleik asitler gibi çok farklı etken maddelerle
etkileşebilmesi
Poloksamerler, glukomannan, siklodekstrinler, hiyaloronik asit, aljinat gibi diğer
moleküllerle nanomatriks yapısında kolayca birleşerek hibrit nanopartiküller
oluşturabilmeleri.
Kitosanın farmasötik formu, göze ilaç taşınmasındaki etkinliğini belirlemede önemlidir.
Yapılan çalışmalar kitosan çözeltisinin ve kitosan nanopartiküllerin göze uygulandığında,
29
mukoza ile etkileşiminin farklı olduğunu göstermiştir. Elde edilen sonuçlar
değerlendirildiğinde, nanopartikül formunun çözelti formuna oranla uygulama sonrası
kornea ve konjoktiva gibi göz dokularında daha uzun süre kaldığını göstermiştir. Bunun
yanında nanopartiküler formdaki kitosanın göze uygulama sonrası, oküler epiteli geçişinde
paraselüler ve transselüler yolları kullandığını da göstermiştir.
Konu ile ilgili geniş literatür bilgisi incelendiğinde, kitosan nanopartiküllerin göze ilaç
taşınmasında etkin ve güvenilir taşıma sistemi oldukları ve bu nedenle antibiyotiklerden
NSAI’lara, siklosporinden 5 FU’e kadar pek çok farklı ilacın göz dokularına taşınmasında
yaygın olarak tercih edildiği görülmektedir [153-156] .
30
3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR
Yapılan çalışmada öncelikle kitosan nanopartiküller hazırlanıp bevasizumab yüklenmiş ve
hazırlanan bu nanopartiküllerin karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonrasında ise in vitro
salım profili oluşturulan partiküller, in vivo ’da tavşan gözlerine uygulanarak salım
profilleri gözlemlenmiştir. Bu aşamada, tavşanlara göz muayenesi yapılarak tedavi süreci
takip edilmiştir.
3.1. Nanopartiküllerin Geliştirilmesi, Karakterizasyonu ve In vitro çalışmalar
Etken madde yüklü kitosan nanopartiküllerin ön segment hastalıklarında kullanım
konusunda literatürde pek çok çalışma vardır [110,121,135]. Bu çalışmalarda kitosan
nanopartiküllerin ön segment hastalıklarında etkinliği ve güvenilirliği kanıtlanmış
olduğundan sunulan çalışmada, subtenon uygulama amaçlı hazırlacak bevasizumab yüklü
nanopartiküllerin hazırlanmasında taşıyıcı madde olarak kitosan tercih edilmiştir.
3.1.1. Kitosan Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu
Kitosan nanopartiküllerin hazırlanması geniş literatüre sahip birçok yöntemle
yapılabilmektedir. Bu çalışmada iyonik jelasyon yöntemi tercih edilmiştir (şekil 3.1).
Kitosan polimeri ve sodyum tripolifosfat (TPP) tuzunun 3 e 1 oranında karıştırılmasıyla
elde edilen nanopartiküller için, asetik asit içerisinde %0,5’lik kitosan çözeltisi
hazırlanmıştır. Benzer şekilde %0,5’lik sulu TPP çözeltisi hazırlandıktan sonra, kitosan
çözeltisinin pH’sı 4,5 e ayarlanmıştır. pH ayarlamaları için çözeltiye 0,1 M NaOH ve HCl
eklemeleri yapılmıştır. Daha sonra manyetik karıştırıcı üzerinde 2 ml TPP damla damla 6
ml kitosan çözeltisine eklenmiştir. 1 saat süreyle karıştırıcıda homojenize olması beklenen
partiküller daha sonra 12000 rpm’de 3 kere sentirüjlenerek yıkanmıştır.
31
Şekil 3.1.Kitosan nanopartikül üretim düzeneği
3.1.2. Bevasizumabın Kitosan Nanopartiküllere Yüklenmesi
Kitosan nanopartiküllerin hazırlanması kısmında anlatıldığı gibi hazırlanan partiküllerin
yıkama basamağına gelindikten sonra 12000 rpm’de 15 dk kadar santrifüj edilerek MES(2-
(N-morpholino) ethanesulfonic acid) tampon çözeltisiyle yıkanmıştır. 3.yıkamanın sonunda
süpernatant atılarak üzerine kitosanın miktarına eş miktarda EDAC içeren 5ml solüsyon
eklenmiş ve rotatorda yarım saat döndürülmüştür. Sonra tekrar santrifüjlenerek süpernatant
atılmış ve 2 kez daha MES ile yıkama yapılıp EDAC uzaklaştırılmıştır. Son olarak da ilaç
(bevacizumab-0,5 ml) pellet üzerine eklenmiş ve vortekslenip rotatora konulmıştur.
Hazırlanan partikül ve ilaç etkileşmesi için 24 saat boyunca rotatorda dönmeye
bırakılmıştır. İlaç yüklenen partiküller 24 saat sonunda santrifüjlenerek 3 kez distile suyla
yıkanmıştır. Yıkamalardan alınan örnekler Zeta- Sizer’in (Nano-ZS Malvern, USA) 280 A
IgG ölçüm yazılımı ile incelenerek, yüklenmeyen ilaç miktarları bulunmuştur. Toplam
sisteme eklenen ilaç miktarından yüklenmeyen kısım çıkarılarak, yüklenen ilaç miktarı
hesaplanmıştır. Toplam sisteme eklenen ilaç ile yüklenen ilaç oranlanarak, yükleme verimi
teorik olarak hesaplanmıştır.
% 0.5’lik kitosan
Çözeltisi (% 0.1 Asetik Asit’te)
% 0.3 TPP çözeltisi
NaOH ilavesi
(pH: 4.5’e ayarlama)
Hacimce 3/1
(Kitosan/TPP) TPP
damlatılması
Santrifüjleme
ve yıkama
Kitosan Nanopartiküller
32
3.1.3. İlaç Yüklü Kitosan Nanopartiküllerin Karakterizasyonu
Hazırlanan bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin morfolojik değerlendirilmeleri
zeta sizer ve Atomik Kuvvet Mikroskobuyla (AKM, Nano Magnetics Instruments, Turkey)
değerlendirilmiştir. Zeta sizer ile yapılan çalışmalarda hazırlanan kitosan nanopartiküller
ve/veya bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküller deiyonize su ile yaklaşık 2 ml’lik
çözeltiler halinde seyreltilmiş ve zeta sizer cihazının PS küvetine yerleştirilerek ölçümler
gerçekleştirilmiştir. Kitosan nanopartiküllerin AKM incelemelerinde de yaklaşık 10 ml
hacmindeki kitosan nanopartikül içeren örnekler alınmış ve mika örnek plakası üzerine
damlatılarak AFM görüntüleri alınmıştır.
3.1.4. Salım Profillerinin Oluşturulması
Hazırlanan ilaç yüklü kitosan nanopartiküller 2,5 ml pH 7,4 PBS çözeltisinde dağıtılarak in
vitro salım deneyleri başlatılmıştır. 15 ml’lik falkon tüplere alınan 2.5 ml çözelti oda
sıcaklığında rotatora yerleştirilerek 100 rpm hızında dönmeye bırakılmıştır. Daha sonra
örnek alabilmek için tüpler 12000 rpm’de sentrifüjlenerek ilaç yüklü partiküllerin dibe
çökmesi sağlanmış, üst kısımda serbest ilaç molekülleri kalmıştır. Üst kısımdan 100 ml
örnek alınarak yerine 100 µl PBS eklenmiştir. Aynı işlem boş nanopartiküllerle aynı sırada
tekrarlanmış, çöktürülen nanopartiküllerin üst kısımlarından örnek alınarak 100 µl PBS ile
tazelenmiştir. Alınan örneklerden, salınan ilaç miktarı serbestilaç kullanılarak hazırlanan
kalibrasyon grafiği yardımıyla belirlenmiştir.
3.1.5.Yükleme Veriminin Hesaplanması
Yükleme veriminin hesaplanması için ilk olarak yükleme için seçilen 12.5 mg
bevasizumab nanodropta ölçülmüştür. Yükleme işlemleri 3.2.1’de anlatıldığı gibi
yapılmıştır. Yıkama aşamasında yüklenmeyen ilaç miktarının belirlenmesi için her yıkama
aşamasında süpernatanttan 100 µl ’lik örnekler alınarak nanodropta ölçülmüştür. 1., 2. ve
3. yıkamada atılan toplam ilaç miktarını hesaplamak için, toplam hacim ve elde edilen
konsantrasyon miktarları çarpıldı ve elde edilen miktar başlangıç dozu olan 12.5 mg’dan
çıkarılarak yükleme verimi hesaplanmıştır.
3.2. Hazırlanan Nanopartiküllerle yapılan In Vivo Çalışmalar
Sunulan çalışma kapsamında yapılan tüm in vivo çalışmalar için Sağlık Bakanlığı Refik
Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Deney Hayvanları Etik Kurulu’ndan 05/11/2010
tarih ve 46 karar sayılı Etik Kurul onayı alınmıştır. Sunulan çalışmada 36 tane 2-3 aylık, 2-
3 kg ağırlığında Yeni Zelanda tipi tavşan kullanılmıştır. Tavşanlar üç gruba ayrılmıştır. Bu
33
gruplar, ilaç içermeyen nanopartiküllerin enjekte edildiği kontrol grubu (n=12), serbest
bevasizumabın enjekte edildiği ilaç grubu (n=12) ve bevasizumab yüklü nanopartiküllerin
enjekte edildiği ilaçlı nanopartikül grubu (n=12) olarak ayrılmıştır. Enjeksiyonun yapıldığı
günden 1, 3, 5 ve 7 gün sonra sakrifiye edilen tavşanların vitreus sıvısından ve kanlarından
örnekler alınarak test edilmiş ve bir salım profili çıkarılmıştır Ayrıca sklera dokusu
üzerinde yapılan immunohistokimyasal çalışmalarla salım profilinin ilaç üzerinden
gözlemlenmesi hedeflenmiştir.
3.2.1. Subtenon Enjeksiyon
Subtenon enjeksiyonlar aseptik şartlarda ve genel anestezi altında yapılmıştır. Genel
anestezi intramusküler olarak uygulanan 20 mg/kg ketamine and 2 mg/kg xylazine ile
sağlanmıştır. Tüm enjeksiyonlar aseptik koşullarda hazırlanmıştır. Enjeksiyon öncesi
tavşanların gözüne %4 oksibuprokain ile topikal anestezi uygulanmış ve gözler birer damla
tropicamide ile dilate edilmiştir. Enjeksiyondan önce ve hemen sonra topikal antibiyotik
(exocin) uygulanmıştır. Enjeksiyondan önce tüm gözlere 2 dakika boyunca %5’lik povidon
iodi uygulanmıştır. Enjeksiyon öncesi basal ön segment incelemeleri ve enjeksiyondan
sonra takip süresince yapılan kontrol muayeneleri taşınabilir el biyomikroskobu (Optotek
Hawk Eye Dijital biomikroskop) ile yapılmıştır. Enjeksiyonlar tavşanların sağ gözüne
uygulanmış ve enjeksiyon esnasında kapakları açık tutmak için bleferosto kullanılmıştır
(Şekil 3.2, 3.3.A,B). Subtenon enjeksiyon esnasında, topikal anestezi uygulanmış gözde,
üst rektus üzerindeki konjoktiva penset yardımıyla kaldırılmıştır (Şekil 3.4.A), 30 gauche
iğne ile bu alanda konjoktivadan girilmiş ve enjekte edilecek materyal üst temporal
kadranda limbustan 5-6 mm uzaklıktaki subtenon alana enjekte edilmiştir (Şekil 3.4.B).
Her üç gruba da 0,5 ml enjeksiyon uygulanmıştır. İlaç grubu için içerisinde 12,5 mg ilaç
içeren enjeksiyon, ilaçlı partikül grubunda ise 12,5 mg ilaç’ın %38 verimle yüklenmiş
olduğu 30 mg kitosan nanopartikül ve kontrol grubunda ise 30 mg kitosan nanopartikül
verilmiştir. Enjeksiyondan sonra iğne geri çekilerek konjoktivadaki açıklıktan herhangi bir
ilaç sızıntısı olmadığı izlenmiştir.
34
Şekil 3.2:subtenon enjeksiyon uygulamasının şematik gösterilmesi [157]
A
B
Şekil 3.3. A-B. Tavşan gözlerinin enjeksiyona hazırlanması
35
A
Şekil 3.4.A-B. Subtenon enjeksiyon uygulaması
3.2.2. Enjeksiyon Sonrası Takip Muayeneleri
Enjeksiyondan sonra takip süresince her gün hayvanların detaylı ön segment muayeneleri
taşınabilir el mikroskobu ile yapılmış ve görüntüler kaydedilmiştir. Ön segment
muayenesinin amacı, konjoktival hiperemi, kemozis, subkonjoktival kanama ve ön
kamaradaki inflamatuar reksiyonun varlığını, sıklığını ve şiddetini belirlemektir.
3.2.3. Örneklerin Toplanması
Deney hayvanları 1, 3, 5 ve 7. günlerde ketamin (35mg/kg)/ksilazin (5mg/kg) verilerek
anestezi altında intra kardiyak kan alınarak sakrifiye edilmişlerdir. Göz alınması
işleminde, konjoktiva 360 derece diseke edildikten sonra rektus kasları kas forsepsi
yardımıyla ekarte edildikten sonra skleraya yapıştıkları yerden kesilmiştir. Orbita
serbestleştirildikten sonra nazikçe öne çekilerek künt uçlu göz alma makası ile temporal
taraftan globun arkasına ucu kapalı olarak girilmiştir. Optik sinir kapalı makas ucu ile
hissedildikten sonra makasın ucu açılarak optik sinir çok kısa güdük kalmayacak şekilde
36
kesilmiştir. Göz küresi çevre bağ dokudan serbestleştirilerek çıkarılarak gözküresinin
alınması tamamlanmıştır. Göz küresinin alınmasından sonra hemen sıvı azot içerisine
alınan gözler ve serumu ayrıştırılmış kanlar daha sonra – 80 dereceye kaldırılarak eliza ve
immünohistokimya çalışmaları için saklanmışlardır.
3.2.4. İmmunohistokimya
Vitreus çıkarma işlemi esnasında çözülmeye bırakılan göz küreleri, doku bloklarının
üzerine yerleştirilerek doku sabitleyici ortam içerisinde dondurulmuştur. 30 μm ‘lik kesitler
alınan doku önceden soğutulmuş aseton içerisinde fikse edilmiştir. Alınan kesitler
kurutulduktan sonra, 1 saat süreyle 1:100 oranında seyreltilmiş yine Matriks biotek
laboratuarlarından alınan VEGF’e bağlanması için geliştirilmiş rekombinant insan IgG1
antikoruna spesifik FITC işaretli antikorla boyanmıştır. 1 saat sonunda 3 kere PBS ile
yıkanan dokular flüoresan mikroskop altında incelenmiştir.
3.2.5. ELISA Ölçümleri
ELISA çalışması için Shikari Q-Beva kiti kullanılmıştır. Serum örnekleri ön hazırlığa tabi
tutulmadan 1:100 oranında seyreltilerek çalışılmıştır. Vitreus örnekleri içinse, öncesinde -
80 derece donmuş göz örnekleri çözülmeden kesilerek, donmuş vitreus çıkartılmış,
sonrasında ise çözülerek 1 saat süreyle 6000 rpm’de santrifüjlenmiştir. Santrifüj sonrasında
üstte kalan berrak kısım başka bir tübe alınarak tekrar sentrifüjlenmiş, böylece çeşitli doku
parçaları ve vitreus içerisinde kırıcılık sağlayan diğer elementlerden uzaklaştırılmıştır.
Süperantan alınarak 1:100 oranında seyretilerek ELISA çalışması yapılmıştır.
3.2.6. Vitreusta Bulunan Bevasizumab Miktarının Hesaplanması
Bu hesaplamanın amacı ölçüm yapılan anlarda, vitreusta bulunan bevasizumab miktarının
başlangıçtaki bevasizumab miktarına oranını belirleyemektir. Bu amaçla her bir ölçüm
anında vitreusta bulunan bevasizumab miktarı, eliza ölçümlerinden elde edilen
konsantrasyonun, ortalama tavşan vitreus hacmi olan 1.5 ile çarpımı ile elde edilmiştir. Bu
değer daha sonra başlangıçta uygulanan bevasizumab mikarına bölünmüştür. Serbest
bevasizumab uygulanan gözlerde elde edilen değer 12.5 mg’a bölünmüştür. Bevasizumab
yüklü kitosan nanopartikül enjekte edilen olgularda ise başlangıçta alınan bevasizumab
düzeyleri 12.5 mg olmakla birlikte, ilaç yükleme verimi %38 oranında olduğundan,
nanopartiküllere yüklenebilen miktar hesaplandığında;
Nanopartiküle yüklü bevasizumab miktarı =Başlangıçtaki ilaç miktarı×İlaç yükleme verimi
4.75= 12.5×3.8 olarak hesaplanacağından bu olgularda başlangıç bevasizumab dozu 4.75
mg alınmış ve vitreusta ölçülen bevasizumab miktarı bu değere bölünmüştür.
37
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
Bu çalışmada kitosan nanopartiküller hazırlanmış ve bu kitosan nanopartikülere
bevasizumab yüklenmiştir. Bu nanopartiküller karakterize edilmiş ve nanopartiküllerin in
vitro ilaç salım çalışmaları yapılmıştır. In vivo uygulamalarda, üç grup tavşana subtenon
bölgeye boş nanopartikül, serbest bevasizumab ve bevasizumab yüklü nanopartikül
uygulanmıştır. Enjeksiyondan sonra gözler takip edilmiş ve toksisite ve inflamatuar cevap
gelişip gelişmediği izlenmiştir. Enjeksiyondan sonra 1, 3, 5 ve 7. günlerde hayvanların feda
edilmesinden sonra göz küreleri alınmış, vitreusta ve serumda eliza yöntemi ile
bevasizumab düzeyleri tayin edilmiş ve imünohistokimyasal incelemeler yapılmıştır.
Sonuçta serbest bevasizumab enjekte edilen olgularla, bevasizumab yüklü nanopartikül
enjekte edilen olgulardan elde edilen serum ve vitreus bevasizumab konsantrasyonu
karşılaştırılarak, nanopartiküle yüklü ilacın transskleral geçiş ve kontrollü salım üzerindeki
etkileri araştırılmıştır. Göz dokularından alınan örneklerde imünohistokimyasal incelemeler
yapılmıştır.
4.1.1. İlaç Yüklü Kitosan Nanopartiküllerin Sentezi Ve Karakterizasyonu
Bu çalışma kapsamında edilen kitosan nanopartiküllerin boyutları zeta-sizer ile yapılan
ölçümlerde 120-380 nm aralığındadır (Şekil 4.1). Buna karşın AFM ile alınan görüntülerde
boyutlar 80-150 nm aralığında görülmektedir (Şekil 4.2.A, B). Partiküllerde çıplak gözle
ve ve ya sonrasında yapılan Zeta sizer ve AFM ölçümlerde agregasyon görülmemiştir.
ya sonrasında yapılan Zeta sizer ve AFM ölçümlerde agregasyon görülmemiştir.
Şekil 4.1: Hazırlanan kitosan partiküllerin Zeta Sizer’da hacimce boy dağılımı grafiği.
Çizelge 1: Hazırlanan kitosan partikülle 1
38
Şekil 4.2. Hazırlanan kitosan partiküllerin A: AFM görüntüsü, B: AFM görüntüsünden
oluşturulmuş 3 boyutlu yapısı
İlaçların, biyolojik bariyerleri geçişteki etkinliğini arttırmak ve kontrollü salım sağlayarak
hedef konsantrasyonu daha uzun süre koruyabilmek amacıyla nanopartiküler taşıma
sistemlerin kullanılması giderek yaygınlaşan bir uygulama olmakla birlikte literatürde
bevasizumab yüklü nanopartiküllerin çalışıldığı sınırlı sayıda çalışma vardır.
Leung karaciğer tümörlerinde manyetik resonans görüntülenmesinde VEGF
ekspresyonunun hedeflemek için anti-VEGF PLA-PEG-PLL-DTPA-Gd anti-VEGF PLA-
39
PEG-PLL-FITC ve nanopartiküller sentezlemiştir. Bu nanopartiküllerin boyutlarını
sırasıyla 85.8 ± 7.2 nm ve 85.2 ± 5.8 nm olarak bildirmiştir. Araştırmacı, her iki
nanopartikülün de DTPA-Gd’ye oranla karaciğer, kalp ve kas tümörlerinin
görüntülenmesinde tümörden alınan sinyal yoğunluğunu arttırdığını bildirmiştir [158].
Yapılan literatür taramalarında bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin göze ilaç
taşınması ile ilgili hiçbir çalışma bulunmazken, bevasizumabın başka taşıyıcılara
yüklenmesi ile oluşturulmuş nanopartiküllerin arka segmente ilaç taşınması ile ilgili çok
sınırlı sayıda literatür bulunmuştur. Bu çalışmalardan biri Pan ve ark [ PAN 2011].
tarafından gerçekleştirilmiş ve bu çalışmada PEG ile modifiye edilmiş bevasizumab ve
bevasizumab yüklü PLGA nanopartikülleri olmak üzere bevasizumabın iki farklı
formulasyonunu üretilmiş ve bevasizumab yüklü PLGA nanopartiküllerin büyüklüğünü
ortalama 819 nm olarak bildirilmiştir. Bu iki formulasyonun intravitreal enjeksiyon sonrası
sıçan gözünde deneysel KNVM modelinde etkilerini inceleyen araştırmacılar, PEG-
bevasizumab ve bevasizumab-PLGA konjugasyonunun başarılı kombinasyonlar olduğunu
ve bu şekilde hazırlanan bevasizumabın anjiyojenik etkinliğini koruduğu sonucunu
bildirmişlerdir.
Abrishami ve ark [159] intravitreal bevasizumab uygulamasından sonra ilacın vitreusta
kalış süresini uzatmak amacıyla lipozom kaplı bevasizumab nanopartikülleri
hazırlamışlardır. Araştırmacılar, bir grup tavşana intravitreal serbet bevasizumab bir grup
tavşana lipozoma yüklü bevasizumab enjekte etmişler ve vitreusta elde edilen bevasizuamb
konsantrasyonun zamana göre değişimini incelemişlerdir. 6 haftalık izlem süreci sonunda
lipozoma yüklü bevasizumab enjekte edilen gözlerde, serbest bevasizumab enjekte edilen
gözlere oranla hem maksimum vitreus bevasizumab düzeyleri (sırasıyla 246 µg/mL, 163
µg/mL), hem de 42 gün boyunca elde edilen tüm vitreus bevasizumab düzeyleri anlamlı
olarak daha yüksek bulunmuştur.
Li ve ark [160], yaşa bağlı maküla dejenerasansında kullanılan bevasizumabın etkinlik
süresini uzatmak amacıyla bevasizumab yüklü PLGA nanopartikülleri hazırlamışlar ve
karakterize etmişlerdir. Araştırmacılar, nanopartikül sentezinde kullanılan farklı
yöntemlerin ve ilaç/polimer oranının, oluşan partiküllerin şeklini ve salım profilini
etkilediğini bildirmişler ve sentezledikleri 0.2-1.0 µ boyutlarındaki bevasizumab yüklü
PLGA nanopartiküllerin in vitro ortamda 90 gün boyunca kontrollü salım sağladığını
bildirmişlerdir.
Hao ve ark [161] da yaşa bağlı maküla dejenerasansının tedavisinde transskleral yolla
uygulamak amacıyla 230 nm büyüklüğünde bevasizumab yüklü PLGA nanopartikülleri
40
sentezlemişler ve in vitro ortamda nanopartikülden salınan bevasizumabın yapısını ve
aktivitesini koruduğunu bildirmişlerdir.
Steroidler, nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar ve antibiyotikler oftalmolojide en sık
kullanılan ilaçlardandır. Bevasizumabtan farklı olarak oftalmoloji alanında uygulanan bu
ilaç gruplarının nanopartiküler formlarının geliştirilmesi konusunda literatürde çok fazla
sayıda çalışma bulmak mümkündür. İlaç taşıyıcı sistem olarak lipozomlar, niazomlar,
dendrimerler olmak üzere çok farklı ilaç taşıma sistemleri kullanılmaktadır.
Arajuo ve ark [162] oküler anjiogenik tedavilerde kullanılmak üzere triamsinolon yüklü
NLC (nanostructured lipid carriers) hazırlamışlardır. Araştırmacılar parçacıkların ortalama
büyüklüğünün 200 nm’nin (100-300) altında olduğunu ve partiküllerin in vitro
çalışmalarda herhangi bir oküler toksisite göstermediğini bildirmişlerdir.
Badawi ve ark [163], indometazinin kornea üzerinde kalış süresini arttırmak ve oküler
bioyararlanımını arttırmak için indometazin yüklü nanopartikül ve nanoemülsiyon
formunda iki kitosan taşıyıcı sistem oluşturmuşlardır. Araştırmacılar nanopartikülün
boyutlarını 280 nm olarak bildirirken, nanoemülsiyondaki parçacık boyutlarının 220-690
nm arasında değiştiğini ve her iki nanotaşıyıcı formunun da korneaya uygulama sonrası
aköz sıvısında elde edilen indometazin konsantrasyonunun serbest indometazine göre
yüksek olduğunu bildirmişlerdir.
Gupta ve ark [164] korneal geçirgenliği arttırmak, korneal kalış süresini uzatmak ve oküler
bioyararlanımını arttırmak için sparfloxasin (yeni nesil hidrofobik florokinon antibiyotik)
yüklü PLGA nanopartikülleri hazırlamışlardır. Araştırmacılar 180-190 nm boyutlarındaki
partiküllerin HET-CAM testi sonunda göz dokuları için hiçbir irritan özellik taşımadığını
izlediklerini bildirmişlerdir.
Nanopartiküler sistemlerde kullanılan hemen hemen tüm taşıyıcı sistemler oküler kullanım
amaçlı hazırlanan nanopartiküllerin hazırlanmasında da kullanılmaktadır. Literatürde farklı
özelliklere sahip nanopartiküler taşıyıcı sistemlerin oküler kullanım açısından farklı olup
olmadığını değerlendiren pek çok çalışma vardır.
Li ark [160], bevasizuamab yüklü PLGA nanopartikülerin hazırlanmasında kullanılan
ilaç/polimer oranının değiştirilerek, salım profilinin modifiye edilebileceğini
bildirmişlerdir.
Badawi ve ark [163] nanoemülsiyon ve nanopartikül formlarında hazırladıkları
indometazin yüklü nanotaşıyıcıların her ikisinin de serbest indometazin uygulamasına göre
indometazinin prekorneal kalış süresini uzattığını ve daha yüksek aköz indometazin
seviyesi sağladığını bildirmekle birlikte, in vivo çalışmalarda ve histolojik incelemelerde
41
nanoemülsiyon uygulanan tavşanlarda nanopartikül uygulanan tavşanlara göre, kimyasal
korneal yanığın daha etkin bir şekilde iyileştiğinin izlendiğini bildirmişlerdir.
Araujo ve ark [162] yüksek ve düşük viskositelere sahip flurbiprofen yüklü PLGA
nanosferleri hazırlamışlar ve polimer vizkositesindeki farklılığın nanosferin fizikokimyasal
özellikleri ve oküler tolerans üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Araştırmacılar,
parçacığın stabilitesinin veya oküler toleransın polimer viskositesinden etkilenmediğini
bildirirken, ilaç salım profilinin ise polimer viskositesinden etkilendiğini, yüksek
viskositeli PLGA ile hazırlanan formulasyonun ilaç salım hızının daha yavaş olduğunu
rapor etmişlerdir.
4.1.2. Salım Profillerinin İncelenmesi
Kitosan yüklü nanopartiküllerin ilaç salımları deneysel çalışmalar bölümünde belirtildiği
gibi 3 hafta süreyle takip edilmiştir (şekil 4.3). İki farklı yükleme miktarı arasında salım
profillerinde büyük bir benzerlik olmakla birlikte, salınan ilaç miktarları arasındaki oran
yükleme miktarları arasındaki orandan fazla olduğu izlenmiştir. İn vitro salım grafiği
değerlendirildiğinde 12.5 mg bevasizumab yüklü nanopartiküllerden ilk 5 gün anlamlı
düzeyde bir salım izlenmezken, 5. günde salınan bevasizumabın arttığı ve bir hafta
boyunca bir plato çizerek yüksek oranda bevasizumab salındığı, daha sonra ise izlem
yapılan üç hafta bounca salımın sabit bir oranda devam ettiği izlenmiştir. 25 mg
bevasizumab yüklü nanopartiküllerden ilk 7 gün anlamlı düzeyde bir salım izlenmezken,
salımın 7. gün civarlarında pik yaptığı ve 12. gün sonunda ise bu pikin düştüğü, izlem
yapılan 3 hafta süresinde de yüksek oranda bevasizumab salımının devam ettiği izlenmiştir.
Biodegradable partiküllerden ilaç salımı yüzeye adsorbe olmuş ilacın desorbsiyonu,
dezentegrasyonu, matriksten difüzyonu, polimer duvarından difüzyonu, merkeze
hapsolmuş ilacın ise yüzey ve kütlenin degradasyonu veya difüzyon veya degrdasyon
proseslerinin kombinasyonu olacak şekilde pek çok farklı mekanizma ile olabilir.
Hoa ve arkadaşlarının çalışmasında [161], bevasizumab PLGA nanopartiküllere % 45
oranında bir verimle yüklenebilirken, salım profilleri incelendiğinde nanopartiküllerden 4
hafta boyunca bevasizumab salımı olduğu bildirilmiştir.
Li ve ark’nın [160] çalışmasında ise PLGA nanopartiküllere bevasizumab yükleme verimi
%95.4 olarak bildirilirken, nanopartiküllerden 90 gün boyunca bevasizumab salımı tespit
edildiği bildirilmiş. Araştırmacılar, bildirdikleri sonuçların bevasizumab/PLGA oranının
%1.6 olarak hazırlandığında elde edilen sonuçlar olduğunu bildirirken, bevasizumab/PLGA
oranının %13 oranın arttırıldığında, bazı sferik partiküllerin varlığına rağmen genelde
partiküllerin sferik şeklini kaybettiklerini bildirmişlerdir. Araştırmacılar,
42
bevasizumab/PLGA oranını %1.6 olarak hazırladıkları nanopartiküllerin in vitro salım
profili değerlendirildiğinde ilk 55 gün 0.5 mg bevasizumabın rölatif olarak dengeli bir
düzeyde salındığını, bu zamandan izlem yapılan 91. günün sonuna kadar ise anlamlı bir
salım yapılmadığını bildirken bevasizumab/PLGA oranının %13 oranında seçildiği
nanopartiküllerin ise işlem yapılan 91 gün boyunca 1.9 mg bevasizumabı dengeli bir
şekilde saldığını ifade etmişlerdir.
Abrishami ve ark [159] çalışmasında ise, etken madde yüklü nanolipozomlar hazırlanırken
bevasizumab %45.5 oranında bir verimle lipozomlara yüklenmiş ve in vivo ortamda
vitreusta 42 gün boyunca vitreus düzeyi izlenebilmiştir.
Şekil 4.3. Farklı miktarlarda Bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerden salınan ilaç
miktarının zamana göre grafiği.
4.2.1.Enjeksiyon Sonrası Muayene Sonuçları
Subtenon enjeksiyon sonrası göz muayeneleri sonucunda, enjeksiyon yerinde hafif
kemozis ve konjoktival hemoraji dışında herhangi bir bulgu izlenmemiştir. Hiçbir tavşanda
üveit, ön kamara reaksiyonu ve inflamatuar bir cevap gelişmemiştir. Enjeksiyona bağlı
herhangi bir komplikasyon izlenmemiştir (şekil 4.4.A-B).
43
Şekil 4.4.Subtenon enjeksiyon sonrası ön segment muayene sonuçları; A:1. gün, B:5. Gün
Bevasizumabın arka segment hastalıklarının tedavisinde farklı dozlarda etkinliğini
karşılaştıran kontrollü in vitro çalışmalar yoktur. Halen kullanımda yaygın olarak
kullanılan doz intravitreal 1.25 mg dozdur. Literatürde intravitreal 1.25 mg ile 3 mg
arasındaki dozların in vivo etkinliklerinin karşılaştırılması konusunda yapılan çalışmalar
bu dozlar arasında etkinlik açısından fark olmadığını göstermiştir. Arka segment
hastalıklarının tedavisinde subkonjoktival veya subtenon bevasizumab uygulamaları
kullanılmamakla birlikte, ön segmentte anjiogenezle seyreden hastalıkların tedavisinde
subkonjoktival bevasizumab uygulamaları giderek daha sıklıkla uygulanmaktadır [52].
Sunulan çalışma kapsamında, klinikte uygulanan formların dışında özgün bir uygulama
yöntemi olarak subtenon uygulanan ilaç transskleral geçişin değerlenirilmesi ve vitreusta
hedef dozun sağlanması amaçları ile kullanıldığından rutinde kullanılan dozlardan daha
yüksek dozlar (12.5 mg) kullanılmıştır. Bu doz klinikte yaygın olarak kullanılan doz
olmamakla birlikte, yüksek doz bevasizumab uygulamasının göz dokularında güvenle
uygulanabileceği konusunda literatürde pek çok in vitro ve in vivo çalışma vardır.
Yoeurek ve ark [165], in vitro ortamda insan keratinosit, keratinosit ve korneal endotel
hücre kültürlerinde 5 mg/ml konsantrasyonunda bevasizumab uygulamasının güvenle
uygulanabileceğini bildirmişlerdir.
Kernt ve ark da [166], in vitro ortamda RPE, optik sinir başı astrositleri, insan trabeküler
ağ hücreleri ve kornea hücre kültürlerinde, rutinde kullanılan bevasizumab dozlarının 0.1,
1 ve 10 katını (25 µg/ml, 250 µg/ml, and 2,500 µg/ml) hücre toksisitesi açısından
değerlendirmişler, 10 katı dozların sadece RPE hücrelerine toksik etki gösterdiğini, diğer
hücre kültrürlerine herhangi bir toksik etki göstermediğini bildirmişlerdir.
Thaler ve ark [167], uygulama öncesi retinal gangliyon hücre hasarı oluşturulmuş farelerde
B A
44
ve normal farelerde, normal ve yüksek doz intravitreal VEGF inhibitörü (bevasizumab,
ranibizumab ve pegaptanip), uygulamasının toksisite incelemesini yapmışlardır. Normal
doz bevasizumab (0.2µl hacimde 25mg/ml) ve yüksek doz bevasizumab (0.2µl hacimde
125 mg/ml) uygulanan farelerde, ne normal grupta ne de uygulama öncesi retinal
gangliyon hücre hasarı oluşturulmuş grupta herhangi bir toksisite izlenmediğini
bildirmişlerdir.
Hoffart ve ark [168], farklı dozlarda subkonjoktival bevasizumab ugulamalarının alkali
yanık sonrası gelişen korneal neovaskülerizasyonunda etkinliğini araştırmışlardır.
Araştırmacılar, kimyasal yanık sonrası korneal neovaskülarizasyon oluşturdukları farelerde
subkonjoktival olarak farklı dozlarla sadece bevasizumab 2.5 mg/gün, 3.75 mg/gün, 5.0
mg/gün, sadece steroid (4 mg/gün deksametazon fosfat) veya steroid bevasiumab
kombinasyonunu (4 mg/gün deksametazon fosfat ve 5.0 mg/gün bevasizumab)
uygulamışlar ve bu uygulamayı 7 gün boyunca her gün tekrarlamışlardır. Sonuç olarak en
yüksek etkinliğin 5mg/gün bevasizumab tedavisini monoterapi olarak veya steroidle elde
edildiğini bildirmişler ve bu tedavilerle herhangi bir toksisite gelişmediğini rapor
etmişlerdir.
Sakurai ve ark [169] intravitreal uygulanan yüksek doz bevasizumabın etkilerini
değerlendirdikleri çalışmada bir grup maymuna 6.25 mg diğer gruba da 12.5 mg
intravitreal bevasizumab uygulamışlar ve uygulamadan sonra 28 gün boyunca takip
etmişlerdir. Enjeksiyon sonrası takip süresinde olguları fundus muayenesi, görüntüleme
yöntemleri ve elektrofizyolojik testlerle toksisite açısından inceleyen araştırmacılar,
hayvanların feda edilmesinden sonra da alınan göz dokularında histolojik incelemeler
yapmışlardır. Araştırmacılar tüm bu testlerin sonucunda yüksek doz intravitreal
bevasizumab uygulamasının göz dokularında geri dönüşümsüz herhangi bir toksisiteye yol
açmadığı göstermişlerdir .
Bevasizumab yüklü kitosan nanopartikül konusunda literatürde herhangi bir çalışma
olmamakla birlikte bevasizumabın yukarıda ifade edildiği gibi diğer taşıyıcılarla
oluşturulmuş nanopartiküllerinin intravitreal uygulamaları konusunda çalışmalar vardır. Bu
uygulamalar gözatıldığında, Abrishami ve ark [159], bevasizumab yüklü nanolipozomları
tavşan gözlerine intravitreal enjeksiyon sonrası 42 günlük takip süresinde herhangi bir
komplikasyon izlemediklerini bildirmişlerdir.
Pan ve ark [170] da sıçan gözünde deneysel KNVM modelinde intravitreal uygulanan
bevasizumab yüklü PLGA nanopartiküllerin etkilerini değerlendirdikleri çalışmada,
enjeksiyondan sonraki 8 haftalık takip süresince herhangibir komplikasyon
45
bildirmemişlerdir.
Kitosan oküler ilaçların üretiminde sıklıkla kullanılan bir taşıyıcıdır [123,140]. Kitosan
sıklıkla ön segment tedavisinde kullanılan ilaç moleküllerinin hazırlanmasında kullanılan
bir moleküldür ve subkonjuktival ve subtenon uygulanan kitosan moleküllerinin
güvenilirliği konusunda pek çok çalışma vardır.
Nagarval ve ark [171] oküler kullanım için, 5 florourasil yüklü kitosan kaplı kitosan-
sodyum alginat nanopartikülleri hazırlamışlar ve karakterize etmişlerdir. Araştırmacılar in
vitro, ex-vivo ve in vivo çalışmalar sonucu hazırlanan nanopartikülün hem anterior hem de
posterior segmente ilaç uygulanması için etkin ve güvenilir bir sistem olduğunu
bildirmişlerdir.
Etken madde yüklü kitosan nanopartiküllerin anterior segment hastalıklarının tedavisinde
topikal veya subkonjoktival uygulamaları sıklıkla kullanılmakla birlikte kitosanın veya
kitosan nanopartiküllerin posterior segment hastalıkları için intravitreal veya subtenon
uygulamaları konusunda literatürde sınırlı sayıda literatür vardır. Bu çalışmalardan biri
Jin ve ark [172] tarafından yapılmıştır. Bu çalışmada nanopartikül aracılı plazminojen
krinkle 5 (K5-NP) uygulamasının koroid neovaskülarizasyon ve retinal inflamasyon
üzerindeki etkilerini araştırmak için, sıçan koroid neovasküler membran modelinde
intravitreal K5 ekspresyon plazmidi içeren PLGA:kitosan nanopartikülleri uygulanmıştır.
Araştırmacılar uygulamadan 2 hafta sonra retinada yoğun bir K5 ekspresyonu bildirirken
ve K5-NP’nin KNVM üzerinde uzun süreli inhibitör etki sağladığını göstermişlerdir.
Yang ve ark [173] ise kitosanın intravitreal tamponad materyali olarak kullanmak için
uygun bir madde olup olmadığını araştırmak için planladıkları çalışmada, intravitreal
kitosan uyguladıkları tavşanları 30 gün inflamatuar reaksiyon açısından takip etmişler ve
takip süresinde ön ve arka segment muayenelerini ve göziçi basıncı değişimlerini
incelemişlerdir. Araştırmacılar tavşanların feda edilmesinden sonra alınan göz dokularında
da kornea, lens, silier cisim ve retinadaki morfolojik değişiklikleri ve aköz ve vitreus
sıvılarında inflamatuar markerları incemişler ve inflamatuar markerlarda anlamlı düzeyde
olmayan bir yükseklik dışında anormal bir sonuç izlememişlerdir. Araştırmacılar bu
verilere dayanarak kitosanın intravitreal tamponad ajanı olarak güvenle kullanılabileceğini
bildirmişlerdir.
4.2.2. İmunohistokimya Sonuçları
Göz dokusundan alınan kesitler, imunohistokimyasal boyamalar sonrası floresan
mikroskop altında incelendiğinde kontrol grubunda hemen hemen hiç ışıma
gözlemlenmemiştir (Şekil 4.5.A1-A4). Buna benzer şekilde ilaç grubunun 1.ve 3. gününde
46
anlamlı bir ışıma gözlemlenmemiştir, ancak 5. günde bir miktar ışıma ortaya çıkıp 7. günde
ortadan kaybolmuştur (Şekil 4.5.B1-B4). Buna karşın, ilaçlı nanopartikül grubu tüm
günlerde çeşitli miktarlarda ve skleranın çeşitli pozisyonlarında ışıma vermiştir(Şekil
4.5.C1-C4). Özellikle 3. günde skleranın orta kısımlarında agrege olmuş bir grup
partikülün bulunduğu bir alan gözlemlenmiştir (Şekil 4.5.C2 ). .
A1 A2 A3 A4
C
B1 B2 B3 B4
C1 C2 C3 C4
Şekil 4.5. Skleranın immünohistokimyasal boyamaları: A) Kontrol grubu A1:1., A2:3.,
A3:5. ve A4:7. gün sonuçları, B) İlaç grubu B1:1., B2:3., B3:5. ve B4:7. gün sonuçları, C)
İlaç yüklü nanopartikül grubu C1:1., C2:3., C3:5. ve C4:7. gün sonuçları
Daha sonraki günlerde ise benzer bir yapı gözlenmemiş, partiküllerin dağıldıkları ve
giderek miktarlarının azaldıkları ortaya konmuştur (Şekil 4.5.C3,C4 ). Skleral kesitlerde
ilaçlı partikül grubunda 3. gün incelemelerinde elde edilen bu görüntüde, partiküllerden
alınan ışımanın, bant şeklinde, skleranın yapısı ile uyumlu bir ışıma olduğu izlenmektedir
47
[85]. Bu kesitlerde izlenen ışımada, serbest ilaç verilen grupta elde edilen homojen
ışımanın aksine, ilaç moleküllerinin grup halinde kümelenmiş olduğu da görülmektedir. Bu
veriler, bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin sklerada bir miktar ilerleme
kaydettikleri şeklinde yorumlanmıştır.
Literatürde nanopartiküllerin transskleral geçişlerini inceleyen çalışmalara bakıldığında
farklı sonuçlar bildirildiği görülür.
Amrite ve ark [174] 20 nm ve 200 nm boyutlarında modifiye karboksile polisteren ve
bodipy yüklü flousfer nanopartiküllerin perioküler enjeksiyonu sonrası sistemik ve oküler
dokulardaki konsantrasyonlarını incelemişlerdir. Araştırmacılar, 20 nm boyutlarındaki
parçacıkların sklera boyunca ilerlediklerini fakat sklera-BK-RPE hattını geçemediklerini,
200 nm boyutlarındaki parçacıkların ise sklerayı geçemediklerini bildirmişlerdir.
Amrite ve ark’nın [175] bir başka çalışmasında da, 20 nm, 200 nm ve 2 mikron
boyutlarında flourosein işaretli polisterene nano-mikropartiküllerin subkonjoktival
enjeksiyon sonrası göz dokularında dağılımını incelemişlerdir. Araştırmacılar partiküllerin
büyüklüğe bağlı bir temizlenme eğrisine sahip olduğunu, 20 nm’lik küçük
nanopartiküllerin 200 nm ve 2 mikronluk partiküllere oranda çok daha hızlı temizlendiğini,
2 ay sonra enjeksiyondan perioküler dokularda 20 nm boyutlarındaki partiküllerin hiç
gözlemlenmediğini, 200 nm’lik partiküllerin ise gözlemlenebildiğini bildirmişlerdir.
Bourges ve ark.’nın [176] çalışmasında ise boyutları ortalama 140±20 nm olan Rh yüklü
PLA-PMMA-co-MA nanopartikülleri ile boyutları 310±40 nm olan Nr PLA-PVA
nanopartiküllerin oluşan 5 µgr’lık karışımın sıçan gözünde intravitreal enjeksiyon sonrası
farmakokinetiğini araştırmışlardır. Araştırmacılar, farklı yük ve büyüklükteki
nanopartiküllerin vitreustan retina tabakalarına doğru ilerlediğini ve RPE hücrelerinde
biriktiğini göstermişlerdir.
Bejjani ve ark (177) da Rhodamine-6G yüklü PLA nanopartiküllerin RPE’ne direk gen
transferi için kullanımına uygun olup olmadığın araştırdıkları çalışmada, 140±20nm
boyutlarındaki nanopartiküllerin intravitreal enjeksiyon sonrası RPE hücrelerini transfekte
ettiğini göstermiş, bunun da nanopartiküllerin vitreustan bu dokulara doğru hareketinin
göstergesi olarak yorumlamışlardır.
Suen ve ark [178] in vitro çalışmalarında, 130 nm triamsinolon asetonid yüklü folat-PEG-
PCL nanopartiküllerin RPE hücreleri tarafından reseptör tarafından endosite edilerek hücre
içine alındığını göstermişlerdir. Araştırmacılar, nanopartikülden 4 hafa boyunca ilaç salımı
olduğunu göstermiş ve RPE hedefli tedaviler için folat-PEG-PCL nanopartiküllerin iyi bir
aday olduğunu savunmuşlardır.
48
Literatürde etken maddenin nanopartiküllere yüklenmesinin transkleral geçiş üzerine
etkisini değerlendiren çalışmalar incelendiğinde, bu çalışmalarda kriter olarak ya ilacın
hastalık üzerindeki tedavi edici etkisini veya serbest ilacın vitreustaki dozunun dikkate
alındığı görülmektedir. Literatürde bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin
transskleral geçişini inceleyen başka çalışma olmamakla birlikte farklı etken maddelerin,
farklı taşıyıcı sistemlerle taşınmasının transskleral geçişte etkisini değerlendiren sınırlı
sayıda sayıda çalışma bulunmaktadır.
Kang ve ark [179] retinoblastom tedavisi için yüksek ve düşük dozda uygulanan
subkonjuktival karboplatin yüklü dendrimerik nanopartiküllerin etkinliğini
değerlendirdikleri çalışmalarında, tek doz uygulanan subkonjuktival karboplatinin yüklü
dendrimerik nanopartiküllerin her iki dozda da etkin ve güvenilir bir tedavi sağladığını
göstermişlerdir. Araştırmacılar ayrıca yüksek doz yüklü nanopartikül uygulanan farelerde,
diğer gözdeki tümör büyüklüğünde de anlamlı azalma olduğunu bildirmişlerdir.
Shome ve ark [180], karboplatin nanomoleküllerinin nanopartikülere yüklü formunun
transskleral geçişin değerlendirdikleri çalışmada, subkonjoktival uygulanan serbest
karboplatin ile nanopartiküle yüklü karboplatinin transskleral geçiş sonrası intravitreal
karboplatin düzeyini karşılaştırmışlardır. Araştırmacılar nanopartiküle yüklü karboplatin
uygulanan gözlerde, vitreusta karboplatin düzeyinin daha erken yükselmeye başladığını ve
bir hafta sonunda, nanopartiküle yüklü karboplatin uygulanan gözlerde vitreusta elde
edilen karboplatin seviyesinin, serbest karboplatin elde edilen gözlere oranla anlamlı
olarak yüksek olduğunu bildirmişlerdir.
Kim ve ark [181] in vitro ortamda kadavradan alınan insan sklerasında serbest doxorubisin
ve vinkristinin skleradan geçişini, PLGA ve liposomal taşıyıcılara yüklenmiş doxorubisinin
geçirgenliği ile karşılaştırmışlardır. Araştırmacılar, serbest doksorubsinin sklera dokusuna
nanopartiküle yüklü doksorubisine oranla daha fazla oranda tutunduğunu ifade etmişlerdir.
Araştırmacılar, floresen mikroskopi görüntülerinde de serbest doksorubisin uygulanan
olgularda sklerada izlenen yaygın florosan görüntünün aksine nanopartiküle yüklü
doksorubisin uygulanan olgularda, kümeleşmiş florosein tutulumları izlediklerini
bildirmişlerdir.
Bu çalışma kapsamında hazırlanan bevasizumab yüklü nanopartiküller gözü arka
segmentindeki hastalıkların tedavisinde kullanılmak için tasarlanmış olmasına rağmen
maalesef ülkemiz koşullarında hayvanlarda herhangi bir arka segment hastalık modelini
oluşturacak araştırma merkezi bulunmadığından, transskleral geçiş etkinliği literatürdeki
verilere dayanarak vitreustaki serbest bevasizumab moleküllerinin düzeyine göre
49
değerlendirilmiştir.
4.2.3. ELISA Sonuçları
Yapılan çalışma sonrasında, enjeksiyonu takip eden 1., 3., 5. ve 7. günlerde alınan kan ve
vitreus örneklerinde bevasizumab miktarı ölçülmüştür. Yapılan ölçümler sonucunda kontrol
grubu olan ilaç yüklenmemiş kitosan nanopartikül minimal ve sabit bir oranda absorbans
vermiştir. İlaç yüklenmiş nanopartikülde ise artışlar ve azalışlar mevcuttur. In vivo salım
profili in vitro çalışmalarla uyumludur.
Vitreusta ölçülen bevasizumab düzeylerinin zamana göre değişimi, şekil 4.6’da, eliza
ölçümleri sonucu vitreusta belirlenen bevasizumab miktarının başlangıçtaki bevasizumab
miktarına oranını gösteren vitreusta bulunan bevasizummab miktarı ise şekil 4.7’de
verilmiştir. Serumda ölçülen bevasizumab düzeylerinin zamana göre değişimi ise şekil
4.8’de verilmiştir.
Şekil.4.6.ELISA testi ile belirlenen, vitreustaki bevasizumab miktarları
50
Şekil 4.7.Vitreusta bulunan bevasizuamb miktarının başlangıç bevasizumab miktarına
oranları
12.5 mg subtenon serbest bevasizumab enjekte edilen olgularda intravitreal bevasizumab
düzeylerinin zamana göre değişimi incelendiğinde, bevasizumab seviyesinin, ilk üç günde
yavaş bir artış gösterdiği, daha sonraki iki günde ise bu artışın hızlandığı, beşinci günden
sonraysa vitreustaki bevasizumab düzeyinin hızla azaldığı izlenmektedir. Bu grupta,
enjeksiyondan 1 gün sonra vitreustaki bevasizumab konsantrasyonu 8 µg/ml olarak
ölçülürken, vitreustaki bevasizumab düzeyinin zirve değeri olan 21µg/ml düzeyine
enjeksiyondan 5 gün sonra ulaşıldığı izlenmiş, enjeksiyondan 7 gün sonra ise vitreustaki
bevasizumab düzeyinin 4 µg/ml düzeyine düştüğü izlenmiştir (şekil 4.6). İlaç yükleme
verimi %38 ± 22 olarak hesaplandığından, yüklü nanopartikül enjekte edilen grupta,
enjekte edilen ilaç miktarı (4.75 mg), serbest ilaç enjekte edilen gruba oranla, daha düşük
olmuştur. Yüklü nanopartikül enjekte edilen grupta, vitreustaki intravitreal bevasizumab
düzeylerinin zamana göre değişimi incelendiğinde, bevasizumab seviyesinin, ilk üç günde
hızlı bir artış gösterdiği, daha sonraki dört gün ise ilaç düzeylerinin düşmeye başladığı
izlenmektedir. Vitreus bevasizumab düzeyi enjeksiyondan 1 gün sonra 11µ/ml düzeyine
ulaşırken, enjeksiyondan 3 gün sonra, vitreustaki zirve değeri olan 18 µ/ml değerine
ulaşmış ve daha sonraki 4 gün yavaş yavaş azalarak, enjeksiyondan sonra 7. Günde 6 µ/ml
51
düzeyinde ölçülmüştür (şekil 4.6).
Transskleral yol, güvenilir ve etkin bir yöntem olmakla birlikte, günümüzde yaygın olarak
sadece steroid tedavileri için yaygın olarak tercih edilmektedir [98-101], intraoküler
tümörlerin tedavisinde kullanılan kemoterapötik ajanların uygulanmasında da etkili
olduğunu bildiren çalışmalar vardır [102-104]. Klinik pratikte anti VEGF ajanlar
transskleral olarak uygulanmamaktadır. Literatürde bevasizumb ve ranibizumab gibi anti
VEGF ajanların transskleral geçişimi inceleyen sınırlı sayıda çalışma vardır.
Wen ve ark [182], insan sklerasının bevasizumab ve ranibizumab için transskleral geçişteki
bariyer fonksiyonlarını değerlendirmek ve makromoleküllerin moleküler yapılarının insan
sklerasından geçiş üzerindeki etkilerini incelemek için, bevasizumab, ranibizumab,
florosein izosiyanat (FITC) işaretli sığır serum albümini (FITC-BSA), FITC-işaretli ficol
(FITC-ficoll) ve FITC-işaretli dekstran (FITC-dekstran) moleküllerinin in vitro ortamda
insan sklerasından geçişlerini incelemişlerdir. Araştırmacılar bevasizumab, ranibizumab,
(FITC-BSA) moleküllerinin daha düşük transskleral geçirgenliğe ve daha uzun transport
gecikme süresine sahip olduğunu bildirmişler ve bu durumun moleküler yapılarındaki
farklılıklardan kaynaklandığını bildirmişlerdir. Dekstranların lineer ve esnek bir yapıya
sahip olmaları sebebiyle, skleral porlardan daha kolaylıkla geçebildiklerini savunan
araştırmacılar bevasizumab ve ranibizumab moleküllerinin ise katı ve sert bir yapıda
olmalarından dolayı geçiş süresince şekillerini kolaylıkla değiştiremediklerini ve bunun
sonucu olarak daha büyük çapa sahip olan dekstranların daha küçük çapa sahip olan
proteinlerden daha yüksek geçirgenliğe sahip olduğunu bildirmişlerdir. Molekülün
yapısının ve yükünün transskleral geçişte etkili faktörler olduğunu vurgulayan
araştırmacılar ayrıca transskleral geçiş sonunda bevasizumab ve ranibizumabın yapısının
stabil kaldığını ve ilacın aktivitesini sürdürdüğünü bildirmişlerdir.
Chopra ve ark [183] iyontoforesisin yüklü makromoleküllerin transskleral geçişi
üzerindeki etkilerini araştırdıkları çalışmada, sığır serum albümini (BSA), polistrene
sulfonik asit (PSA) ve bevasizumab moleküllerinin in vitro ortamda kadavradan elde
edilen insan sklerasında pasif geçişi, anodal iyontoferesis ve katodal iyontoforesis altında
geçişlerini ölçmüşlerdir. Her üç molekülün de transskleral geçişinin, hem anodal hem de
katodal iyontoforesis ile arttığını gözlemleyen araştırmacılar, bevasizumabın anodal
iyontoforesis uygulaması ile elde edilen transskleral geçişinin, pasif transskleral geçişi ve
katodal iyontoforesisis ile transskleral geçişine oranla da anlamlı oranda yüksek olduğunu
gözlemlemişlerdir.
Pescina ve ark [184] da, iyontoforesisin bevasizumabın transskleral geçişi üzerindeki
52
etklerini araştırdıkları çalışmada, FITC işaretli bevasizumab moleküllerinin iontoforesis
uygulaması altında transskleral geçişini incelemişler ve anodal iyontoforesisin FITC
işaretli bevasizumab moleküllerinin skleradan geçişini anlamlı olarak arttırdığını
bildirmişlerdir.
Heiduscha ve ark [185] ise intravitreal enjekte edilen bevasizumab moleküllerinin retina
tabakalarındaki penetrasyonunu inceledikleri çalışmalarında, intravitreal bevasizumab ve
125I işaretli bevasizumab verdikleri maymun gözlerinden alınan kesitlerde, bevasizumab
moleküllerinin retinaya penetre olduğunu belirterek RPE, koroid ve fotoreseptör dış
segmentlerinde bevasizumab moleküllerinin görüntülemişlerdir. Bevasizumabın
fotoreseptör dış segmentlerine muhtemelen vitreustan direk olarak gitmiş olduğunu
savunan araştırmacılar, bunun yanında, hızla sistemik dolaşıma geçen bevasizumab
moleküllerinin, bruch membranını geçerek RPE’ne ve oradan fotoreseptör dış
segmentlerine ulaşmış olma ihtimalinin de tamamen dışlanamayacağını ifade etmişlerdir.
Birinci yolun daha muhtemel olduğunu savunan araştırmacılar, bu görüş destekleyen kesin
bir delil olmamasına rağmen, kesitlerin incelenmesi sonucunda bruch membran veya RPE
tabakasında harabiyete dair herhangi bir bulgunun izlenmemiş olmasını ve enjeksiyondan 7
sonra dahi retinanın tüm tabakalarında radyoaktivitenin izlenmesini, birinci görüşü
destekleyen bulgular olarak ifade etmişlerdir.
Shahar ve ark [186] da intravitreal 2.5 mg bevasizumab enjeksiyonu yaptıkları tavşanlarda
bevasizumabın retinal penetrasyonunu ve güvenilirliğini araştırmışlardır. Araştırmacılar
enjeksiyondan 1 gün sonra tüm retinal tabakalarda bevasizumab moleküllerini izlediklerini
bildirirken bu bulgunun klinik sonuçlarla da uyumlu olduğunu vurgulamışlardır.
Araştırmada elde edilen elektrofizyolojik testlerin sonuçları da bevasizumabın retina için
toksik olmadığını göstermiştir.
Mordendi ve ark [187] , maymunlarda yaptıkları çalışmada intravitreal uyguladıkları 125I
işaretli tam uzunlukta insan ruMab HER2 antikorunun retina tabakalarına geçişini
incelemişlerdir. Araştırmacılar enjeksiyondan 1 saat sonra ve 1, 3, 7 ve 14 gün sonra
sakrifiye ettikleri olguların göz dokularında mikrootoradyografik olarak uygulanan
antikorun retina tabakalarını dağılımını incelemişler ve hiçbir değerlendirme periyodunda,
antikorun retina tabakalarına geçişinin izlenmediğinin bildirmişlerdir.
Shahar ve ark [186] sonuçlardaki bu farklılığın sebeplerini açıklarken, her iki çalışmada
kullanılan antikorun yapısının farklı olmasının, retinal geçişin değerlendirilmesinde
kullanılan tetkiklerin farklı olmasının ve her iki çalışmada uygulanan antikor dozlarının
farklı olmasının, farklı sonuçlar elde edilmesine sebep olabileceğini savunmuşlardır.
53
Olsen ve ark [188] mikrokanül yardımıyla suprakoroidal alana uygulanan bevasizumabın
farmakokinetiğini ve doku dağılımını incemek amacıyla yaptıkları çalışmada, domuz
gözlerinde bir gruba intravitreal bevasizumab, bir gruba da suprakoroidal alana mikrakanül
yardımıyla viskoelastik madde içinde bevasizumab enjekte etmişlerdir. Araştırmacılar,
intravitreal alana enjekte edilen bevasizumabın, çoğunlukla iç retinal tabakalara geçtiğini,
suprakoroidal alana enjekte edilen bevasizumabın ise bruch membranı, RPE ve
fotoreseptör dış segmentlerinde lokalize olduğunu gözlemlemişlerdir. Bunun yanında
araştırmacılar, intravitreal bevasizumabın aynı dozdaki suprakoroidal bevasizumaba oranla
daha uzun süreli bir farmakolojik profil gösterdiğini fakat suprakoroid alana enjekte edilen
bevasizumabın, serumda hızlı bir zirve değerine ulaştıktan sonra hızla gözden
temizlendiğini ve göz dokularındaki konsantrasyonunun hızla düştüğünü ifade etmişlerdir.
Literatürde bevasizumab yüklü nanopartiküllerin subtenon uygulama sonrası
farmakokinetiğini araştıran herhangi bir çalışma bulunmazken, subtenon uygulanan serbest
bevasizumabın in vivo ortamda transskleral geçişi konusunda bilgi veren yalnızca tek bir
çalışma vardır. Bu çalışmada Nomoto ve ark [189] tavşan gözlerine topikal,
subkonjoktival ve intravitreal yolla enjekte edilen bevasizumabın farmakokinetiğini
aratırmak amacıyla, enjeksiyonundan sonra 12 hafta boyunca serumdan ve göziçi
sıvılarından alınan örneklerde bevasizumab seviyesini ölçmüşlerdir. Araştırmacılar, 1.25
mg/0.05ml subkonjoktival bevasizumab enjeksiyondan iki hafta sonra vitreustaki
bevasizumab konsantrasyonun 11.1±1.0 ng/ml, serumda ise 3733.1±174.9 ng/ml olarak
bildirmişlerdir. Bu çalışma, subtenon alan uygulanan bevasizumabın farmakokinetiğini
incelemesi bakımından sunulan çalışmaya benzemekle birlikte, sunulan çalışmadan iki
yönüyle farklıdır. İlk olarak Nomoto ve ark. 1.25 mg bevasizumab enjeksiyonu
yapmışlardır ve sunulan çalışmaya oranla daha uzun süreli sonuçlar vermişlerdir.
Sunulan çalışma kapsamında elde edilen sonuçlar Nomoto ve ark’nın sonuçları ile
karşılaştırıldığında, bildirilen serum bevasizumab düzeylerinin birbirine oldukça yakın
olduğu, bildirilen vitreus bevasizumab düzeyleri arasında ise farklılık olduğu
izlenmektedir. Transskleral geçiş kompleks bir süreçtir ve bu süreçte pek çok farklı statik,
dinamik ve metabolik bariyerler ilacın eliminasyonunda rol alır [190]. Bu sebeple
transskleral olarak uygulanan ilacın başlangıç dozundaki farklılıklar, ilacın vitreustaki
konsantrasyonuna direk olarak yansımayabilir.
Robinson ve ark. literatürde, transskleral geçiş konusunda sıklıkla refere edilen
çalışmalarında 6 grup tavşana farklı dozlarda ve farklı skleral hazırlıkları takiben subtenon
triamsinolon asetonid uygulamışlar ve transskleral geçiş üzerinde etkili olan statik ve
54
dinamik faktörleri araştırmışlardır. Araştırmacılar 10 mg subtenon triamsinolon
enjeksiyonundan 3 saat sonra vitreusta ölçülebilir düzeyde bir ilaç konsantrasyonu elde
edemezken, 20 mg subtenon triamsinolon enjeksiyonundan 3 saat sonra vitreusta
16.56±16.4 µg/ml ilaç konsantrasyonu elde etmişlerdir [190]. Araştırmacılar 10 mg
triamsinolon asetonid uygulamasında, ilacın subtenon bölgedeki yıkanma (clearance) hızı
aşılamazken 20 mg triamsinolon uygulamasında bu hızın aşıldığı ve vitreusta 16.56±16.4
µg/ml ilaç konsantrasyonu elde edildiği yorumunu yapmışlardır. Robinson ve ark daha
önce triamsinolon asetonitin farmakokinetik modelini inceledikleri çalışmanın verilerine
atıfta bulunarak [191]10 mg triamsinolon asetonid-depo formunun 8 µg/saat, 20 mg
triamsinolon asetonid-depo formunun 13 µg/saat olduğu göz önüne alındığında,
triamsinolon asetonitin subtenon bölgeden temizlenme hızının 8 ile 13 µg/l arasında
olduğunu bildirmişlerdir.
Shahar ve ark [186] yaptıkları çalışma kapsamında intravitreal uygulanan bevasizumab
moleküllerinin retina tabakalarına geçişini göstermelerine rağmen, Mordenti ve ark’nın
[187] çalışmasında uygulanan tüm uzunlukta antikorun retinal tabakalara geçişinin
gösterilememesinin sebeplerinin açıklarken, uygulanan miktarın arttırılmasının geçişi
arttıran sebeplerden bir olabileceğinin savunmuşlardır. Araştırmacılar iki çalışmada
uygulanan dozlar arasında yaklaşık 100 katı fark olmasına dikkati çekerek (sırası ile
25µg/2.5mg), uygulanın dozun arttırılmasının, geçiş esnasındaki bariyerlerin aşılmasında
etkin olabileceği sonucuna varmışlardır.
Transskleral geçiş konusunda yapılmış çalışmalar incelendiğinde, benzer sonuçların
bildirildiği izlenmektedir. Inaue ve ark [192] subtenon bölgeye 5 mg veya daha az
trimsinolon asetonid depo formu enjekte ettiklerinde, enjeksiyondan 5.5 gün sonra
olguların çoğunda vitreusta ölçülebilir düzeyde bir ilaç konsantrasyonu elde edemezken,
Thomas ve ark [193] ise 40 mg depo subtenon triamsinolon enjeksiyonundan 4 hafta sonra
bile sonra vitreusta ölçülebilir düzeyde ilaç konsantrasyonu elde ettiklerinin
bildirmişlerdir. Depo kortikosteroid kullanılan hayvan çalışmalarında [194] vitreus ilaç
düzeyinin subkonjoktival veya subtenon enjeksiyondan 24-72 saat sonra en yüksek olduğu,
daha sonra 1-2 hafta içinde hızla düşerek ölçülemeyecek düzeye düştüğü bildirilmektedir.
Buradaki hızlı düşüşün sebebini araştırmacılar, deponun zamanla küçülmesi sebebiyle
salınan ilaç miktarının azalarak, temizlenme (clearance) için eşik değer olan düzeyin altına
inmesi ve böylece temizlenme mekanizmalarını aşamaması olarak yorumlamışlardır [190].
Nanopartiküle yüklü bevasizumab enjekte edilen olgularda vitreusta elde edilen
bevasizumab düzeyleri incelendiğinde, maksimum vitreus bevasizumab düzeyinin
55
enjeksiyondan 3 gün sonra 18 µg/ml olarak elde edildiği ve enjeksiyondan 7 gün sonra
dahi vitreusta 6 µg/ml düzeyini koruduğu izlenmektedir (şekil 4.6). İki grup arasında
vitreustaki maksimum ilaç düzeyleri karşılaştırıldığında serbest bevasizumab enjekte
edilen olgularda maksimum bevasizumab konsantrasyonu, bevasizumab yüklü
nanopartikül enjekte edilen olgulara oranla daha yüksek görünmekle birlikte (sırasıyla 21
µg/ml/18 µg/ml ) bu fark başlangıçtaki bevasizumab miktarlarından kaynaklanmaktadır.
Yukarıda da özetlendiği gibi her iki gruba da 12.5 mg bevasizumab verilmekle birlikte
ikinci grupta bevasizımab kitosan nanopartiküle yüklendiğinden ve yaklaşık %38 oranında
bir verimle yükleme sağlanabildiğinde, bu grupta verilen gerçek bevasizumab miktarı diğer
gruba oranla üçte bir oranındadır yani bu gruba yaklaşık 4.75 mg düzeyinde bevasizumab
enjeksyonu yapılmıştır. Öte yandan, yüzdece vitreusta bulunan bevasizumab miktarlarları
incelendiğinde, vitreusta bulunan bevasizumab miktarının başlangıç bevasizumaba
oranının nanopartiküle yüklü bevasizumab enjeksiyonu yapılan olgularda serbest
bevasizumab enjekte edilen olgulara oranla daha yüksek olduğu izlenmektedir.
Enjeksiyondan sonra örnek alınan tüm günler için bu durum geçerlidir (şekil 4.7).
Bu veriler imunohistokimyasal incelemelerle birlikte değerledirildiğinde, nanopartiküle
yüklemenin, bevasizumabın hem transskleral geçişini kolaylaştırdığı hem de kontrollü
salımı sağlayarak, vitreusta daha uzun süre daha yüksek konsantrasyonu sağladığı
görülmektedir. Özetle hedeflenen intravitreal konsantrasyona ulaşmak için nanopartiküle
yüklü ilaç uygulamasında daha az ilaç uygulamak gerekmektedir.
Bevasizumab tüm dünyada 50’nin üzerinde göz hastalığının tedavisinde çok yaygın olarak
kullanılan bir ilaç olmasına rağmen göz hastalıkları için kullanımında FDA onayı
olmadığından halen endikasyon dışı (off-label) olarak bir ilaçtır bu nedenle hayvan veya
insan gözlerinde bevasizumab farmakokinetiğini araştıran çok sınırlı sayıda yayın vardır.
Gerek insan gerekse hayvan gözlerinde bevasizumab farmakokinetiğini inceleyen bu az
sayıda çalışma incelendiğinde de bildirilen veriler arasında ciddi farklılıklar olduğu
izlenmektedir [189,190,195-197] .
Zhu ve arkadaşları [196], koroid neovasküler membran tanısı ile intravitreal bevasizumab
tedavisi yapılan 11 hastanın gözünden aldıkları vitreus örneklerinde bevasizumab
farmakokinetiğini araştırmışlar ve bevasizumabın vitreusta iki kompartmanlı bir model
izlediğini ve yarılanma ömrünün başlangıç ve terminal yarılanma ömürleri olarak sırasıyla
0.5 ve 6.7 gün olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmacılar ilk fazın hızlı bir dağılım fazı
olduğunu ikinci fazın ise eliminasyon fazı olduğunu ve bu fazdaki bevasizumab yıkımının
birinci derece kinetiğine sahip olduğunu bildirmişlerdir.
56
Csaky ve ark[198] ise 18 olguda 1.25 mg intravitreal bevasizumab enjeksiyonu sonrasında
elde edilen bevasizumab konsantrasyonunun 80-170 µg/ml arasında değiştiğini
bildirmişlerdir. Araştırmacılar bevasizumabın vitreusta yarılanma ömrünün insanda 10 gün
olduğunu ve birinci derece kinetiğine sahip olduğu bildirmişlerdir . Zhu ve ark. ilk fazda
vitreus boşluğunda çok hızlı bir bevasizumab dağılımı olduğundan intravitreal
bevasizumab dozunda çok hızlı bir düşüş olduğunu, bu nedenle bu fazda çok sık örneklem
yapılmazsa, bu fazın atlanarak yanlışlıkla yıkımın tek fazlı modele sahipmiş gibi
algılanabileceğini de bildirmişlerdir.
Bakri ve ark [195] tavşanlarda intravitreal bevasizumabın dağılımını ve farmakokinetiğini
incelemişler ve bevasizumabın vitreusta 400 µ/ml’lik zirve konsantrasyonuna 1. günde
ulaştığını ve yarılanma ömrünün 4.32 gün olduğunu, 8. günde intravitreal bevasizumab
dozunun yaklaşık 100 µ/ml düzeylerinde olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmacılar
intravitreal uygulamadan sonra bevasizumab düzeylerinin serumda 8 günde zirve yaptığını
(3.3 µg/ml) ve 6.86 günlük bir yarılanma ömrüne sahip olduğunu bildirmişlerdir.
Sinapis ve ark [197] da yine tavşanlarda intravitreal bevasizumabın dağılımını ve
farmakokinetiğini incelemişler ve bevasizumabın vitreusta enjeksiyondan 1 gün sonra 406
µg/ml’lik zirve konsantrasyonuna ulaştığını ve yarılanma ömrünün 6.61 gün olduğunu
bildirmişlerdir. Araştırmacılar serum bevasizumab düzeylerinin intravitreal enjeksiyondan
8 gün sonra zirve değeri olan 0.413 μg/mL düzetine ulaştığını ve 5.87 günlük bir yarılanma
ömrüne sahip olduğunu bildirmişlerdir.
Nomoto ve ark [189] ise tavşanlarda topikal, subkonjoktival ve intravitreal uygulama
sonrası bevasizumabın farmakokinetiğini araştırmışlar ve intravitreal uygulama sonrasında
bevasizumabın vitreusta yarılanma ömrünün yaklaşık 6 gün olduğunu bildirmişlerdir.
Araştırmacılar ilk bir hafta sonunda subkonjoktival enjeksiyon uygulanan gözlerde
intravitreal bevasizumab konsantrasyonun 11.1 +1.0 ng/ml, intravitreal bevasizumab
uygulanan gözlerde ise 59,730.8 ng/ml olarak bildirmişlerdir.
Bu sonuç farklılığının temel sebepleri oküler anatominin farklılığı ve bevasizumab düzeyi
ölçüm yöntemlerinin farklılıkları olabilir. Konu ile ilgili literatürde yeralan bazı
çalışmalarda insan, bazı çalışmalarda ise tavşan gözleri kullanılmıştır. Fakat sonuçlar
incelendiğinde insan gözlerinde yapılan çalışmaların ve tavşan gözlerinde yapılan
çalışmaların kendi aralarında da farklılık gösterdiği izlenmektedir ki bu durumun
bevasizumab düzeyini belirlemede kullanılan yöntemlerin farklılığından kaynaklandığı
ifade edilmektedir.
Bakri ve ark sadece serbest bevasizumabı tanıyan bir yöntem kullanırken, Nomoto ve ark.
57
tavşan bevasizumabın hem hafif hem ağır zincirine bağlanabilme özelliği olan tavşan anti-
human IgG kullandıklarından, hem VEGF’ e bağlı bevasizumab düzeyini hem de serbest
bevasizumab düzeyini ölçmüşlerdir.
Sunulan çalışmada, intravitreal enjeksiyon yapılmadığından, vitreusta sabit bir başlangıç
dozu bulunmamaktaydı, vitreustaki bevasizumab dozu doz transskleral geçişle zamanla
artmaktaydı. Bu nedenle bevasizumabın yarı ömrünü hesaplama imkanı olmamıştır. Bunun
yanında vitreusta ölçülen bevasizumab düzeylerinin zamana göre değişimi incelendiğinde
serbest bevasizuamb verilen olgularda, maksimum bevasizumab dozunun (21µg/ml) 2 gün
içinde hızla azalarak 4µg/ml düzeyine düştüğü, nanopartiküle yüklü bevasizumab enjekte
edilen olgularda da benzer şekilde maksimum bevasizumab düzeyinin (6 µg/ml) hızla
azaldığı izlenmektedir (şekil 4.6). Yukarıda ifade edildiği gibi, transskleral geçiş süresince
bu sürede vitreusta sadece bevasizumab temizlenmesi (clearance) değil aynı zamanda
transskleral yolla gelen bevasizumab da olduğundan, bu sonuçlar direk olarak vitreustaki
bevasizumab yarıömrünü vermemekle birlikte bevasizumab yıkım hızı hakkında bir fikir
vermektedir. Bu sonuçlar değerlendirildiğinde, her iki gruptaki olgularda da bevasizumabın
literatürdeki verilere oranla çok daha hızlı bir şekilde yıkıldığı izlenmektedir. Bu farklılığın
sebebinin vitreustaki bevasizumab düzeylerinin farklı olmasından kaynaklandığı
düşünülmektedir.
Bakri ve ark’nın çalışmasında 1.25 mg intravitreal bevasizumab enjeksiyonu sonrasında
bevasizumab yarı ömrü hesaplanmıştır ve bu çalışmada vitreusta elde edilen düzey 400
µg/ml, yarılanma ömrü 4.32 gündür. Synapis ve ark. çalışmasında da vitreusta elde edilen
bevasizumab düzeyi 406 µg/ml, yarılanma ömrü 6.61 gün olarak bildirilmiştir. Sunulan
çalışmada elde edilen maksimum bevasizumab düzeyleri iki grup için 21 µg/ml ve 18
µg/ml dir. Açıkça görülebildiği gibi Bakri ve Synapis’in çalışmaları ile sunulan çalışmada
elde edilen vitreus bevasizumab düzeyleri arasında ciddi fark bulunmaktadır. Literatürde
farklı dozlarda intravitreal bevasizuamb enjeksiyonu sonrası bevasizumab
farmakokinetiğini inceleyen bir çalışma bulunmamakla birlikte farklı dozlarda intravitreal
bevasizumab enjeksiyonu sonrası ön kamaradaki bevasizumab farmakokinetiğini inceleyen
bir çalışma vardır. Meyer ve ark [199], diabetik maküler ödem, KNVM ve ven tal
tıkanıklığı tanısı almış 29 olguya intravitreal bevasizumab tedavisi uygulamışlardır.
Olguların 13 tanesine 1.5 mg, 16 tanesine de 3.0 mg bevasizumab uygulayan araştırmacılar
enjeksiyondan sonraki takip süresinde (1-60 gün) olgulardan ön kamaradan aköz sıvısı
alarak bevasizumabın intraoküler farmakokinetiğini araştırmışlardır. 1.5 mg bevasizumab
enjekte edilen olgularda maksimum aköz bevasizumab konsantrasyonu 14.86 µg/ml olarak
58
ölçülürken, 3.0 mg bevasizumab enjekte edilen olgularda maksimum aköz bevasizumab
konsantrasyonu 27.74 µg/ml olarak ölçülmüştür. Bu olgularda bevasizumabın aközde
yarılanma ömürleri incelendiğinde 1.5 mg bevasizumab enjekte edilen olgularda yarılanma
ömrü 7.85 gün olarak belirlenirken, 3.0 mg bevasizumab enjekte edilen olgularda
yarılanma ömrü 11.69 gün olarak belirlenmiştir. Buradan da anlaşılacağı gibi
bevasizumabın göz içi sıvılarında yarılanma ömrü, başlangıçtaki maksimum bevasizumab
konsantrasyonuyla ilişkili olarak değişmektedir [199]. Sunulan çalışmada da her iki
gruptaki maksimum intravitreal bevasizumab düzeyleri (21µg/ml,18 µg/ml) hem Bakri’nin
çalışmasındaki (400 µg/ml), hem de Synopis’in çalışmasındaki (406 µg/ml) düzeylerle
karşılaştırıldığında çok düşük düzeylerde olduğundan, bu kadar hızlı bir şekilde vitreustan
temizlenmeleri normaldir. Sonuç olarak bu çalışma kapsamında elde edilen bulgular
literatürdeki verilerle uyumludur.
Steroidler, antibiyotikler, antineoplastikler, NSAI ajanlar ve bevasizumab tüm dünyada
göz hastalıklarının tedavisinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte, göz hastalıklarının
tedavisi için FDA onayları olmadığından off-label (ruhsatlı endikasyon dışı) olarak
kullanılmaktadır. Bu ilaçların, üretim ve geliştirme aşamasında göz hastalıklarına yönelik
kullanım planlanmadığından, doza bağlı kontrollü in vitro ve in vivo etkinlik ve
güvenilirlik çalışmaları yapılmamıştır bu nedenle bu ilaçların kullanımı, genelde
piyasadaki formulasyonun toksik olmayan en yüksek dozu olarak tercih edilmektedir.
Uygulama esnasında elde edilen ampirik ve anekdodal veriler, resmiyet kazanmadan
aktarılmakta ve klinik uygulamaları yönlendirmekte ve bazen bu veriler klinik çalışmalarla
detaylı olarak incelenmektedir [200].
Literatürde bevasizumabın iris, koroid ve retinal neovaskülarizasyonların tedavisi için
gereken etkin terapötik konsantrasyonu konusunda kesin bir bilgi bulunmamaktadır. In
vitro çalışmalar, endotel proliferasyonunun maksimum düzeyde inhibisyonu için gerekli
bevasizumab dozunun 2.6 ile 1 molar arasında olduğunu göstermiştir. Bevasizumabın
maximum yarım inhibitör konsantrasyonu (IC50) 22ng/ml’dir ve VEGF-indüklenmiş
endotel hücre çoğalması, migrasyon ve hiperpermeabilite dahil tüm VEGF aktivitelerini
tamamen bloke eden bevasizumab dozu da 500 ng/ml’dir [201].
Arka segment hastalıklarındaki gerekli etkin tedavi dozu tam olarak bilinmemekle birlikte,
literatürde arka segment hastalıklarının tedavisi için bevasizumab uygulanmış olgulardan
elde edilen vitreus örneklerinden ölçülen değerleri bildiren çalışmalar vardır. Zhu ve
ark’nın [196] çalışmasında KNVM tedavisi için bevasizumab tedavisi uygulanan gözlerden
alınan vitreus örneklerinde, intravitreal bevasizumab konsantrasyonu 165 µg/ml olarak
59
ölçülmüştür.
Klettner ve Roider [202] in vitro ortamda, VEGF nötralizasyonu için çok az miktarlarda
bevasizumab ve ranibizumabın yeterli olduğunu göstermişlerdir. Araştırmacılar, in vitro
ortamda bevasizumabın 1 µg/mL konsantrasyonda VEGF ekspresyonunu inhibe ettiğini
bildirirken, bu değerin eşik değer olduğunu, 975 ng/mL konsantrasyondaki bevasizumabın
VEGF neutralizasyonunda etkisini kaybettiğini bildirmişlerdir. Thomas, intravenöz
mikrodoz (1.25-2.5mg) bevasizumab uygulanan 37 hastanın 11’inde tam iyileşme, 11’inde
ise parsiyel iyileşme izlediklerini, 15 hastada ise herhangi bir cevap alamadıklarını
bildirmiş ve mikrodoz bevasizumab tedavisinin seçilmiş hastalarda ve göziçi enjeksiyonu
reddeden hastalarda tercih edilebileceğini savunmuştur [203].
Avery ve ark [204], proliferatif diabetik retinopati tanısı olan 32 olgunun 45 gözüne 6.2 µg
ile 1.2 mg arasında değişen dozlarda intravitreal bevasizumab enjeksiyonu uygulamış ve
elde edilen anatomik ve görsel başarıyı değerlendirmiştir. Araştırmcılar 6.2 µg intravitreal
bevasizumab uygulanan olguda dahi belirgin bir biyolojik etki elde edildiğini
bildirmişlerdir.
Buna ek olarak, enjeksiyon sonrası, literatürde diğer gözde vitreus bevasizumab
konsantrasyonlarının, enjeksiyon yapılan göze oranla çok düşük olarak bildirilmekle
birlikte [189,195,197] enjeksiyon yapılmayan gözde de bevasizumaba bağlı etkilerin
geliştiğini bildiren çalışmalar vardır [205-208].
Charbel Issa ve ark [205] tip 2 idiyopatik maküler telenjiyektazi tanısı ile intravitreal
bevasizumab tedavisi uyguladıkları 5 olgunun 18 aylık takibini değerlendirdikleri
çalışmada, intravitreal enjeksiyon uygulanmayan gözlerdeki lezyonlarda da düzelme
izlendiğini bildirmişlerdir.
Mennel ve ark [206] yaş tip AMD tanısı olan bir olguda 4 ay boyunca 5 kez intravitreal
bevasizumab enjeksiyonu uygulaması yaptıklarını ve bu sürede tedavi uygulanmayan
gözde retina pigment epitel yırtığı geliştiğini rapor etmişlerdir.
1.25 mg intravitreal bevasizumab enjeksiyonu sonrasında tavşanlarda enjeksiyon
yapılmayan gözlerde ölçülen en yüksek bevasizumab konsantrasyonları Bakri ve ark
çalışmasında 11.17 ng/ml, Nomoto ve ark çalışmasında 6.7 ng/mL, Synopis’in
çalışmasında ise 0.335ng/ml olarak bildirilmiştir.
Bevasizumab uygulamalarında, başlangıçta elde edilen yüksek maksimum düzeyler,
terapotik etkinin sağlanmasından çok, geleneksel yöntemlerle uygulanan serbest ilaç
moleküllerinin vitreusta kalış süresini uzatmaktır [201].
Saati ve ark. tavşan retinal koroid neovaskülarizasyon modelinde tek doz bevasizumabın
60
intravitreal enjeksiyon olarak uygulanması ile aynı miktarın küçük dozlara bölünerek
tekrarlayan enjeksiyonlar şeklinde uygulanması sonucunda elde edilen cevabı
karşılaştırmışlardır. Araştırmacılar, gruplar arasında gerek retina kalınlığı, gerekse VEGF
tarafından indüklenmiş vasküler değişiklikler açısından herhangi bir fark bulmadıklarını,
VEGF tarafından indüklenmiş vasküler değişikliklerin tedavisinde tekrarlayan küçük doz
uygulamasının, toplam dozun bir defada uygulanması kadar etkin olduğunu göstermişlerdir
[209].
Yukarıda ifade edilen belirsizliğin giderilebilmesi için yapılan çalışmaların hastalık modeli
oluşturulmuş hayvanlarda tekrarlanması konuya çözüm getirecektir.
Şekil.4.8.ELISA testi ile belirlenen serumdaki bevasizumab miktarı.
Serbest bevasizumab uygulanan oldularda serum bevasizumab düzeyi enjeksiyondan 3 gün
sonra 13 µg/ml, 7 gün sonra ise 8 µg/ml olarak ölçülürken, nanopartiküle yüklü
bevasizumab uygulanan gözlede elde edilen serum bevasizumab düzeyi enjeksiyondan 3
gün sonra 3 µg/ml, 7 gün sonra ise 2 µg/ml olarak ölçülmüştür. Bevasizumabın serumdaki
maksimum seviyeleri incelendiğinde ise serbest bevasizumab enjekte edilen olgularda
maksimum konsantrasyonun 5. günde 15 µg/ml düzeyinde izlenirken bevasizumab yüklü
nanopartikül enjekte edilen olgularda ise serumdaki maksimum bevasizumab düzeyi 5.
günde 7 µg/ml düzeyinde izlenmiştir (şekil 4.8). Yukarıda da ifade edildiği gibi serbest
61
bevasizumab uygulanan olgularda verilen toplam bevasizumab konsantrasyonu
nanopartiküle yüklü bevasizumab verilen olgulara göre üç kat daha fazladır. Bu fark göz
önüne alındığında, serum düzeyleri arasındaki fark, başlangıç ilaç dozlarından
kaynaklanmaktadır, serum düzeyleri arasında iki grup arasında daha yüksek bir fark
izlenmemiştir.
Bakri ve ark çalışmasında 1.25 mg intravitreal bevasizumab enjeksiyonu sonrasında
serumda ölçülen maksimum bevasizumab düzeyi enjeksiyondan 8 gün sonra elde edilen
3.3 µg/ml olarak bildirilirken bevasizumabın serumda yarı ömrü 6.86 gün olarak
bildirilmiştir. Synopis’in çalışmasında ise maksimum serum bevasizumab konsantrasyonu
yine enjeksiyondan 8 gün sonra elde edilen 0.413 µg/ml olurken, bevasizumabın serumda
yarı ömrü 5.87 gün olarak bildirilmiştir.
Nomoto ve ark çalışmasında[189] 1.25 mg subkonjoktival bevasizumab enjeksiyonundan 1
hafta sonra serumda ölçülen maksimum bevasizumab düzeyi 3733.1 ng/mL olarak
ölçülürken, bevasizumabın vitreustaki yarılanma ömrü 1.75 hafta olarak ölçülmüştür.
Subkonjoktival ve intravitreal uygulanan bevasizumabın sistemik dolaşıma katılma
özellikleri benzerdir [189].Sunulan çalışma kapsamında elde edilen serum bevasizumab
düzeyleri literatürdeki çalışmalarla karşılaştırıldığında, çalışma kapsamında kullanılan
yüksek dozlar dikkate alındığında elde edilen sonuçların literatürle uyumlu olduğu
görülmektedir.
Burada önemli olan sonuç, nanopartiküle yüklenmiş bevasizumab enjeksiyonu sonrasında,
vitreusta hedeflenen terapötik bevasizumab dozunun sağlanması için serbest bevasizumaba
oranla çok daha az ilaç kullanılacaktır dolayısıyla seruma geçen ilaç dozu da daha düşük
olcaktır. Böylece bevasizumabın istenmeyen sistemik yan etkilerinin gelişme riski
azaltılacaktır.
Literatürde intravitreal enjeksiyon sonrasında gelişen pek çok sistemik bevasizumab yan
etkisi bildirilmiştir [107-108]. Bu yan etkiler hipertansiyon, tromboembolik olay ve ölüm
gibi bevasizumabın sistemik olarak kullanıldığı kanser tedavisinde kullanımında
görülenlere benzer yan etkilerdir. Nanopartiküle yüklü bevasizumab kullanımı ile
hedeflenen dozun daha az sistemik ilaç düzeyi ile sağlanabilmesi yan etki sıklığının
azalması açısından da önemli bir bulgudur.
Tavşan modeli, göze uygulanan ilaçların farmakokinetik incelemelerinin çalışılması için
uygun bir modeldir [190].Tavşan sklerası insan sklerasına oranla daha incedir koroidal
akım daha yüksektir [210].Tavşan modelinin insan modelinden diğer farkları da, tavşan
retinasının insan retinasından daha az vasküler olması [211] hacim dağılımının insan
62
modelinden farklı olması ve lensin insan lensine oranla daha büyük olmasıdır. Bu
farklılıklar insan gözü ile karşılaştırıldığında farmakokinetik değişikliklere neden olabilir.
İnsanlarda vitreus hacmi ortalama 4.5 ml iken tavşanlarda 1.5 ml kadardır. Serum hacmi de
insanlarda tavşanladan çok daha fazla olduğundan, sistemik dolaşımdaki konsantrasyon
insanlarda daha düşüktür. Tüm bu farklılıklarına rağmen göziçinde kullanılan ilaçların
farmakokinetiğinin değerlendirilmesinde tavşan modeli literatürde en sıkılıkla tercih edilen
modellerden biridir [190]. Bu çalışma kapsamında elde edilen sonuçlar direk olarak
insanlar için kullanılamasa da, insan uygulamalarının geliştirilmesi konusunda çok önemli
katkılar sağlayacaktır.
63
SONUÇLAR
Sunulan tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde:
1. 80-380 nm aralığında kitosan nanopartiküller sentezlenmiş ve bu nanopartiküllere
bevasizumab yüklenmiştir. İlaç yükleme verimi %38±22 olarak hesaplanmıştır.
Sentezlenen bu nanopartiküllerin AFM ve zeta sizer ölçümleri alınarak
karakterizasyonları yapılmıştır.
2. Sentezlenen bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin in vitro salım çalışmaları
yapılmıştır. Sentezlenen nanopartiküllerden ilaç yükleme dozuna bağlı olarak farklı
salım profilleri elde edilmiştir. 12.5 mg bevasizumab yüklenen kitosan
nanopartiküllerden ilk beş günde anlamlı oranda ilaç salımı olmazken, beşinci
günden itibaren bir hafta süre ile yüksek miktarda ilaç salımı gerçekleşmiş ve bu
salım azalmakla birlikte izlem yapılan 3 hafta boyunca sürmüştür.
3. Enjeksiyon sonrası yapılan kontrol muayenelerinde hiçbir gözde inflamatuar veya
alerjik bir reaksiyon gelişmemiştir.
4. Göz dokularından alınan örneklerin imünohistokmyasal incelemelerinde,
bevasizumab yüklü kitosan nanopartikül verilen olgulardan özellikle enjeksiyondan
3 gün sonra alınan kesitlerde, skleranın yapısı ile uyumlu, bant şeklinde ışımalar
izlenmiş ve bu ışımalar nanopartiküllerin sklerada bir miktar ilerlediklerinin
göstergesi olarak yorumlanmıştır.
5. Eliza ölçümlerinde subtenon serbest bevasizumab enjekte edilen olgularda
enjeksiyondan 1 gün sonra vitreustaki bevasizumab konsantrasyonu 8 µg/ml olarak
ölçülürken, vitreustaki bevasizumab düzeyinin zirve değeri olan 21µg/ml düzeyine
enjeksiyondan 5 gün sonra ulaşıldığı izlenmiş, enjeksiyondan 7 gün sonra ise
vitreustaki bevasizumab düzeyinin 4 µg/ml düzeyine düştüğü izlenmiştir.
6. Nanopartiküle yüklü bevasizumab enjekte edilen olgularda vitreusta elde edilen
bevasizumab düzeyleri incelendiğinde, maksimum vitreus bevasizumab düzeyinin
enjeksiyondan 3 gün sonra 18 µg/ml olarak elde edildiği ve enjeksiyondan 7 gün
sonra dahi vitreusta 6 µg/ml düzeyini koruduğu izlenmektedir.
7. Yüzdece vitreusta bulunan bevasizumab miktarlarları incelendiğinde, vitreusta
bulunan bevasizumab miktarının başlangıçta uygulanan bevasizumab miktarına
oranının nanopartiküle yüklü bevasizumab enjeksiyonu yapılan olgularda serbest
bevasizumab enjekte edilen olgulara oranla daha yüksek olduğu izlenmektedir.
64
Enjeksiyondan sonra örnek alınan tüm günler için bu durumun geçerli olduğu tespit
edilmiştir.
8. Serbest bevasizumab uygulanan oldularda serum bevasizumab düzeyi
enjeksiyondan 3 gün sonra 13 µg/ml, 7 gün sonra ise 8 µg/ml olarak ölçülürken,
maksimum serum bevasizumab konsantrasyonun 5. günde 15 µg/ml düzeyinde
izlenmiştir.
9. Nanopartiküle yüklü bevasizumab uygulanan gözlede elde edilen serum
bevasizumab düzeyleri enjeksiyondan 3 gün sonra 3 µg/ml, 7 gün sonra ise 2 µg/ml
olarak ölçülürken serumdaki maksimum bevasizumab düzeyi 5. günde 7 µg/ml
düzeyinde izlenmiştir.
10. Elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde sentezlenen nanopartiküllerin subtenon
uygulama için güzenilir olduğu ve herhangi bir reaksiyona sebep olamdığı
izlenmektedir. İmunuhistokimyasal incelemeler ve vitreus ve serum bevasizumab
düzeyleri incelendiğinde sentezlenen bevasizumab yüklü kitosan nanopartiküllerin
transskleral geçişe katkıda bulunduğu ve ilacın vitreusta kalım süresini arttırdığı
görülmektedir. Bu veriler ışığında, bavasizumab yüklü kitosan nanopartiküller, arka
segment hastalıklarının tedavisinde daha az invaziv bir yolla terapötik
konsantrasyonu sağlayabilme konusunda umut verici olarak bulunmuştur.
Elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde sentezlenen nanopartiküllerin subtenon
uygulama için güzenilir olduğu ve herhangi bir reaksiyona sebep olamadığı izlenmektedir.
İmunuhistokimyasal incelemeler ve vitreus ve serum bevasizumab düzeyleri
incelendiğinde elde edilen bevasizumab yüklü nanopartiküllerin transskleral geçişe katkıda
bulunduğu ve ilacın vitreusta kalım süresini arttırdığı görülmektedir. Bu konuda yeni
çalışmaların özellikle hastalık oluştulmuş hayvan gözlerinde de yapılması konunun daha
geliştirilmesine fayda sağlayacaktır.
65
KAYNAKLAR
1. Eye Institute Of The Laurentians. Gözün Tabakaları,
Http:/Iwww.İnstitutdeloeil.com (Mart, 2013)
2. Bird A., Age-Related Macular Disease, British Journal of Ophthalmology, 80, 2–3,
1996.
3. Ciulla, T.A., Amador, A.G., Zinman, B., Diabetic Retinopathy And Diabetic
Macular Edema: Pathophysiology, Screening, And Novel Therapies, Diabetes
Care, 26, 2653–2664, 2003.
4. Cugati, S., Wang, J.J., Rochtchina, E., Mitchell, P., Ten-Year Incidence of Retinal
Vein Occlusion In an Older Population: The Blue Mountains Eye Study, Archives of
Ophthalmology, 124, 726-732, 2006.
5. Chakravarthy, U,, Augood, C., Bentham, G.C., Et Al. Cigarette Smoking and Age-
Related Macular Degeneration In The EUREYE Study, Ophthalmology , 114, 1157-
1163, 2007.
6. Campochiaro, P.A., Soloway, P., Ryan, S.J., Miller, J.W., The Pathogenesis of
Choroidal Neovascularization in Patients with Age-Related Macular Degeneration,
Molecular Vision, 5, 34, 1999.
7. Green, W.R., Wilson, D.J., Choroidal Neovascularization. Ophthalmology, 93,
1169–1176, 1986.
8. Ryan, J.S., Retina, 2. Cilt, 4. Baskı, Saunders, 2005.
9. Vision And Eye Health, KNVM’nın Göz Kesitlerinde Görünümü,
Http://Www.Vision-And-Eye-Health.Com/Macular-Degeneration-Types.Html
(Mart 2013)
10. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J.M., Campochiaro, P.A., VEGF Is Majör
Stimulator in Model Of Choroidal Neovascularization, Investigative
Ophthalmology & Visual Science, 41, 3158–3164, 2000.
11. Green, W.R., Enger, C., Age-Related Macular Degeneration Histopathologic
Studies, Ophthalmology, 100, 1519–1535, 1993.
12. Grossniklaus, H.E., Hutchinson, A.K., Capone, A. J., Clinicopathologic Features of
Surgically-Excised Choroidal Neovascular Membranes, Ophthalmology, 101,1099–
1111, 1994.
66
13. Grossniklaus, H.E., Green, W.R., For The Submacular Surgery Trials Research
Group, Histopathologic and Ultrastructural Findings Of Surgically-Excised
Choroidal Neovascularization, Archives of Ophthalmology, 116, 745–749, 1998.
14. Folkman, J., Clinical Applications Of Research On Angiogenesis, The New
England Journal of Medicine, 333,1757–1763, 1999.
15. Ohno-Matsui, K., Morita, I., Tombran-Tink, J., Novel Mechanism For Age-
Related Macular Degeneration: An Equilibrium Shift Between the Angiogenesis
Factors VEGF And PEDF, Journal of Cellular Physiology, 189, 323–333, 2001.
16. Martin, G., Schlunck, G., Hansen, L.L., Agostini, H.T., Differential Expression of
Angioregulatory Factors In Normal And CNV-Derived Human Retinal Pigment
Epithelium, Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology,
242:321–326, 2004.
17. Qazi, Y., Maddula, S., Ambati, B.K.J., Mediators of Ocular Angiogenesis,
Genetics, 88, 495–515, 2009.
18. Tong, J.P., Yao, Y.F., Contribution of VEGF And PEDF to Choroidal Angiogenesis:
A Need For Balanced Expressions, Clinical Biochemistry , 39, 267-276, 2006.
19. Gao, G., Li, Y., Zhang, D., Unbalanced Expression of VEGF and PEDF in
Ischemia-Induced Retinal Neovascularization, FEBS Letters, 489,270–276, 2001.
20. Witmer, A.N., Vrensen, G.F., Van Noorden, C.J., Schlingemann, R.O., Vascular
Endothelial Growth Factors And Angiogenesis in Eye Disease, Progress in Retinal
and Eye Research, 22, 1-29, 2003.
21. Tawara, A., Kubota, T., Hata, Y., Neovascularization in The Anterior Segment of
the Rabbit Eye by Experimental Anterior Ischemia, Graefe's Archive for Clinical
and Experimental Ophthalmology, 240, 144–153, 2002.
22. Krzystolik, M.G., Afshari, M.A., Adamis, A.P., Prevention Of Experimental
Choroidal Neovascularization With intravitreal Anti-Vascular Endothelial Growth
Factor Antibody Fragment, Archives of Ophthalmology, 120, 338–346, 2002.
23. Ferrara N, Davis-Smyth T. The Biology Of Vascular Endothelial Growth Factor,
Endocrine Reviews, 18:4–25, 1997.
24. Leung, D.W., Cachianes, G., Kuang, W.J., Vascular Endothelial Growth Factor is a
Secreted Angiogenic Mitogen, Science, 246,1306–1309,1989
25. Senger, D.R., Galli, S.J., Dvorak, A.M., Perruzzi ,C.A., Tumor Cells Secrete a
Vascular Permeability Factor That Promotes Accumulation Of Ascites Fluid,
Science, 25, 219, 983-985, 1983.
67
26. Ferrara, N., Henzel, W.J., Pituitary Follicular Cells Secrete A Novel Heparin-
Binding Growth Factor Specific For Vascular Endothelial Cells. Biochemical and
Biophysical Research Communications 1989. Commun, 31;425, 540-547, 2012.
27. Carmeliet, P., Jain, R.K., Angiogenesis in Cancer and other Diseases, Nature, 407,
249–257, 2000.
28. Eriksson, U., Alitalo, K., Structure, Expression And Receptor-Binding Properties
Of Novel Vascular Endothelial Growth Factors, Current Topics in Microbiology
and Immunology, 237,41–57, 1999
29. Breen, E.C., VEGF in Biological Control, Journal of Cellular Biochemistry, 102,
1358-1367, 2007.
30. Ferrara, N., Gerber, H.P., Lecouter, J., The Biology of VEGF and Its Receptors,
Nature Medicine, 9, 669–676, 2003.
31. Ferrara, N., Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science And Clinical
Progress, Endocrine Reviews, 25,581–611, 2004.
32. Rahimi, N., Vascular Endothelial Growth Factor Receptors: Molecular Mechanisms
of Activation and Therapeutic Potentials, Experimental Eye Research, 83, 1005-
1016, 2006.
33. Robinson, C.J., Stringer, S.E., The Splice Variants Of Vascular Endothelial Growth
Factor (VEGF) And Their Receptors, Journal of Cell Science, 114, 853-865, 2001.
34. Macular Photocoagulation Study Group. Argon Laser Photocoagulation For
Idiopathic Neovascularization: Results Of A Randomized Clinical Trial, Archives
of Ophthalmology, 101:1358-1361, 1983.
35. Treatment Of Age-Related Macular Degeneration Using Photodynamic Therapy
(TAP) Study Group. Photodynamic Therapy of Subfoveal Choroidal
Neovascularization in Agerelated Macular Degeneration With Verteporfin: One-
Year Results Of 2 Randomized Clinical Trials. TAP Report 1, Archives of
Ophthalmology, 117,1329–1345, 1999.
36. Bhisitkul, R.B.,Vascular Endothelial Growth Factor Biology: Clinical Implications
for Ocular Treatments, British Journal of Ophthalmology, 90, 1542–1547, 2006.
37. Gragoudas, E.S., Adamis, A.P., Cunningham E.T., VEGF Inhibition Study in Ocular
Neovascularization Clinical Trial Group, Pegaptanib For Neovascular Age-Related
Macular Degeneration, The New England Journal of Medicine, 351, 2805–2816,
2004.
68
38. Bashshur, Z.F., Haddad, Z.A., Schakal, A., Intravitreal Bevacizumab For Treatment
Of Neovascular Age-Related Macular Degeneration: A One-Year Prospective
Study, American Journal of Ophthalmology, 145, 249–256, 2008.
39. Weigert, G., Michels, S., Sacu, S., Intravitreal Bevacizumab (Avastin) Therapy
Versus Photodynamic Therapy Plus İntravitreal Triamcinolone For Neovascular
Age-Related Macular Degeneration: 6-Month Results Of A Prospective,
Randomised, Controlled Clinical Study, British Journal of Ophthalmology, 92,
356–360, 2008.
40. Mekjavic, P.J., Kraut, A., Urbancic, M., Lenassi, E., Hawlina, M., Efficacy Of 12-
Month Treatment Of Neovascular Age-Related Macular Degeneration With
İntravitreal Bevacizumab Based On Individually Determined Injection Strategies
after three Consecutive Monthly Injections, Acta Ophthalmologica, 89, 647-653,
2011.
41. Avastinin Üç Boyutlu Yapısı. [Http://Www.Avastin.Net/Vegf-And-Moa/Avastin-
Vegf-A], (Mart 2013).
42. Ferrara, N., Hillan, K.J., Nowotny, W., Bevacizumab, Avastin A Humanized Anti-
VEGF Monoclonal Antibody For Cancer Therapy, Biochemical and Biophysical
Research Communications, 333, 328-335, 2005.
43. Brown, D.M., Kaiser, P.K., Michels, M., Soubrane, G., ANCHOR Study Group.
Ranibizumab Versus Verteporfin For Neovascular Age-Related Macular
Degeneration, The New England Journal of Medicine, 5, 355, 1432-1444, 2006 .
44. Rosenfeld,P.J., Brown D.M., Heier J.S., Ranibizumab For Neovascular Age-Related
Macular Degeneration, The New England Journal of Medicine, 355,1419–1431,
2006.
45. Mittra R.A., Pollack J.S., Preferences and Trends Survey. Poster Presented At: 24th
Annual ASRS Meeting And The 6th Annual EVRS Meeting, September 9–13,
2006, Cannes, France.
46. Michels, P.J. Rosenfeld And C.A., Systemic Bevacizumab (Avastin) Therapy For
Neovascular Age-Related Macular Degeneration: Twelveweek Results Of An
Uncontrolled Open-Label Clinical Study, Ophthalmology , 112, 1035–1047, 2005.
47. Moshfeghi A.A., Rosenfeld P.J. And Puliafito C.A. Et Al., Systemic Bevacizumab
(Avastin) Therapy For Neovascular Age-Related Macular Degeneration: Twenty-
Four-Week Results of an Uncontrolled Open-Label Clinical Study, Ophthalmology
113, 2002–2011, 2006.
69
48. Pitlick, J.M., Vecera, K.F., Barnes, K.N., Reski, J.W., Forinash, A.B.,Bevacizumab
For The Treatment Of Neovascular Age-Related Macular Degeneration, The
Annals of Pharmacotherapy, 46, 290-296, 2012.
49. Spaide, R.F., Laud, K., Fine, H.F., Intravitreal Bevacizumab Treatment Of
Choroidal Neovascularization Secondary To Age-Related Macular Degeneration,
Retina, 26, 383–390, 2006.
50. Yoganathan, P., Deramo, V.A., Lai, J.C., Visual İmprovement Following
İntravitreal Bevacizumab (Avastin) in Exudative Age-Related Macular
Degeneration, Retina, 26,994–998, 2006.
51. Gunther, J.B., Altaweel, M.M., Bevacizumab (Avastin) for The Treatment of Ocular
Disease, Survey of Ophthalmology , 54, 372-400, 2009.
52. Hosseini, H., Nowroozzadeh, M.H., Salouti ,R., Nejabat, M., Anti-VEGF Therapy
With Bevacizumab For Anterior Segment Eye Disease, Cornea, 31, 322-334, 2012.
53. Del Amo, E.M., Urtti, A., Current And Future Ophthalmic Drug Delivery Systems.
A Shift To The Posterior Segment, Drug Discovery Today, 13,135–143, 2008.
54. Geroski D.H., Edelhauser H.F., Drug Delivery For Posterior Segment Eye Disease,
Investigative Ophthalmology & Visual Science, 41, 961–964, 2000.
55. Hughes P.M., Olejnik O., Chang-Lin J.E.,Topical And Systemic Drug Delivery To
The Posterior Segments, Advanced Drug Delivery Reviews , 57, 2010–2032, 2005.
56. Raghava S., Hammond M., Kompella U.B.,Periocular Routes For Retinal Drug
Delivery, Expert Opinion on Drug Delivery, 1, 99–114, 2004.
57. Urtti, A., Challenges And Obstacles Of Ocular Pharmacokinetics And Drug
Delivery, Advanced Drug Delivery Reviews, 58, 1131–1135, 2006.
58. Nagarwal, R.C., Kant, S., Singh, P.N., Maiti, P., Pandit, J.K., Polymeric
Nanoparticulate System: A Potential Approach For Ocular Drug Delivery, Journal
of Controlled Release, 21;136, 2-13, 2009.
59. Lang, J.C., Ocular Drug Delivery: Conventional Ocular Formulations, Advanced
Drug Delivery Reviews, 16, 39–43, 1995.
60. Bonini-Filho M.A., Jorge R., Barbosa J.C., Intravitreal injection Versus Sub-
Tenon’s infusion of Triamcinolone Acetonide for Refractory Diabetic Macular
Edema: A Randomized Clinical Trial, Investigative Ophthalmology & Visual
Science, 46, 3845–3849, 2005.
61. Cardillo J.A., Melo L.A Jr, Costa RA, Skaf M, Belfort R Jr, Souza-Filho AA, Farah
ME, Kuppermann BD: Comparison of Intravitreal Versus Posterior Sub-Tenon’s
70
Capsule Injection of Triamcinolone Acetonide for Diffuse Diabetic Macular
Edema, Ophthalmology, 112: 1557–1563, 2005.
62. Das, S., Preeti, K., Suresh, K., Drug Delivery To Eye: Special Reference To
Nanoparticles, International Journal of Drug Delivery, 2, 12-21, 2010.
63. Yasukawa, T., Ogura, Y., Tabata, Y., Drug Delivery Systems For Vitreoretinal
Diseases, Progress in Retinal and Eye Research, 23, 253-281, 2004.
64. Zhang, K., Zhang, L., Weinreb, Rn., Ophthalmic Drug Discovery: Novel Targets
And Mechanisms For Retinal Diseases And Glaucoma, Nature Reviews Drug
Discovery, 15,11, 541-559, 2012 .
65. Lee, Ss., Robinson, Mr., Novel Drug Delivery Systems For Retinal Diseases,
Ophthalmic Research, 41, 124-135, 2009.
66. Kralinger, M.T., Kieselbach, G.F., Voigt, M., Experimental Model for Proliferative
Vitreoretinopathy by Intravitreal Dispase: Limited By Zonulolysis And Cataract.
Ophthalmologica, 220, 211–216, 2006.
67. Ozkiris, A., Erkilic, K.,Complications Of Intravitreal Injection Of Triamcinolone
Acetonide, Canadian Journal of Ophthalmology, 40, 63–68, 2005.
68. Nelson, M.L., Tennant, M.T., Sivalingam, A., Regillo, C.D., Belmont JB, Martidis
A: Infectious And Presumed Noninfectious Endophthalmitis After intravitreal
Triamcinolone Acetonide injection, Retina, 23, 686–691, 2003.
69. Roth, D.B., Chieh, J., Spirn, M.J., Noninfectious Endophthalmitis Associated With
Intravitreal Triamcinolone injection, Archives of Ophthalmology , 121, 1279–1282,
2003.
70. Transskleral Geçişteki Tabakalar:Http://Www.Stlukeseye.Com/Popups/Sclera.Htm
(Mart 2013)
71. Raviola, G., The Stractural Basis Of The Blod-Ocular Barriers, Experimental Eye
Research 25, 27, 1977.
72. Chastain Je. General Considerations In Ocular Drug Delivery. In: Mitra AK, Editor.
Ophthalmic Drug Delivery Systems. New York: Marcel Dekker, Inc.; 2003. P. 59–
107.
73. Ayasomayajua S.P., Kompella U.B., Retinal Delivery Of Celecoxib is Several-Fold
Higher Following Subconjunctival Administration Compared to Systemic
Administration, Pharmaceutical Research , 21, 1797–1804, 2004.
71
74. Lee T.W.Y., Robinson J.R., Drug Delivery To The Posterior Segment Of The Eye:
Some Insights on The Penetration Pathways after Subconjunctival Injection,
Journal of ocular pharmacology and therapeutics, 17, 565–572, 2001.
75. Tsuji, Tamai I., Sasaki K., Intraocular Penetration Kinetics of Prednisolone after
Subconjunctival Injection In Rabbits, Ophthalmic Research, 20, 31–43, 1988.
76. Ranta V.P., Urtti A., Transscleral Drug Delivery To The Posterior Eye: Prospects of
Pharmacokinetic Modeling, Advanced Drug Delivery Reviews, 58, 1164–81, 2006.
77. Eljarrat-Binstock E, Pe'er J, Domb AJ. New Techniques For Drug Delivery To The
Posterior Eye Segment, Archives of Pharmacologial Research, 27,4, 530-43, 2010.
78. Transskleral Geçişteki Statik Bariyerler (Sklera, Koroid, Retina Pigment Epiteli)
Http://Www.Scienceofamd.Org/Learn (Mart 2013)
79. Keeley, F.W., Morin, J.D., Vesely, S., Characterization of Collagen From Normal
Human Sclera, Experimental Eye Research, 39, 533–42, (1984).
80. Shuttleworth, C.A., Type Vııı Collagen, The International Journal of Biochemistry
& Cell Biology, 29, 1145–8, 1997.
81. Kimura, S., Kobayashi, M., Nakamura, M., Immunoelectron Microscopic
Localization Of Decorin in Aged Human Corneal And Scleral Stroma, Journal of
Electron Microscopy, 44, 445–459, 1995.
82. Wessel H., Anderson, S., Fite, D., Type Xıı Collagen Contributes To Diversities İn
Human Corneal And Limbal Extracellular Matrices, Investigative Ophthalmology
& Visual Science, 38, 2408–2422, 1997.
83. White, J., Werkmeister, J.A., Ramshaw, J.A., Organization Of Fibrillar Collagen İn
The Human And Bovine Cornea: Collagen Types V And III, Connective Tissue
Research, 36, 165–174. 1997.
84. Marshall G.E., Konstas, A.G., Lee, W.R., Collagens in The Aged Human Macular
Sclera, Current Eye Research, 12, 143–153, 1993.
85. Thale, A., Tillmann, B., Rochels, R., Scanning Electronmicroscopic Studies of The
Collagen Architecture Of The Human Sclera Normal And Pathological Findings.
Ophthalmologica, 210, 137–141, 1996.
86. Olsen T.W., Edelhauser H.F., Lim J.I., Geroski D.H., Human Scleral Permeability:
Effects Of Age, Cryotherapy, Transscleral Diode Laser, And Surgical Thinning,
Investigative Ophthalmology & Visual Science, 36, 1893–903, 1995.
72
87. Prausnitz M.R., Noonan J.S, Permeability Of Cornea, Sclera, and Conjunctiva: A
Literatüre Analysis For Drug Delivery To The Eye, Journal of Pharmaceutical
Sciences , 87, 1479–88, 1998 .
88. Ambati J., Canakis C.S., Miller J.W., Gragoudas E.S., Edwards A., Weissgold D.J.,
Kim I., Delori F.C., Adamis A.P., Diffusion of High Molecular Weight Compounds
Through Sclera, Investigative Ophthalmology & Visual Science , 41, 1181–1185,
2000.
89. Boubriak O.A., Urban J.P., Akhtar S., The Effect Of Hydration and Matrix
Composition on Solute Diffusion in Rabbit sclera, Experimental Eye Research , 71,
503–14, 2000.
90. Cruysberg L.P., Nuijts R.M., Geroski D.H., Koole L.H., Hendrikse F., Edelhauser
H.F., In Vitro Human Scleral Permeability Of Fluorescein, Dexamethasone-
Fluorescein, Methotrexate- Fluorescein And Rhodamine 6G And The Use Of A
Coated Coil As A New Drug Delivery System, Journal of ocular pharmacology
and therapeutics, 18, 559– 569, 2002.
91. Moore D.J., Hussain A.A., Marshall J. Age-Related Variation in the Hydraulic
Conductivity of Bruch’s Membrane, Investigative Ophthalmology & Visual
Science, 36, 1290–1297, 1995.
92. Amaral J., Fariss R.N., Campos M.M., Robison W.G.., Kim H., Lutz R., Becerra
S.P., Transscleral- Rpe Permeability Of Pedf And Ovalbumin Proteins: Implications
for Subconjunctival Protein Delivery, Investigative Ophthalmology & Visual
Science, 46, 4383–4892, 2005.
93. Pitkänen L., Ranta V.P., Moilanen H., Urtti A., Permeability of Retinal Pigment
Epithelium: Effects of Permeant Molecular Weight And Lipophilicity, Investigative
Ophthalmology & Visual Science, 46, 641–646, 2005.
94. Lyda W., Eriksen N., Krishna N., Studies Of Bruch’s Membrane; Flow And
Permeability Studies in A Bruch’s Membrane-Choroid Preparation, American
Journal of Ophthalmology , 44, 362– 369, 369–70, 1957.
95. Robinson M.R., Lee S.S., Kim H., Kim S., Lutz R.J., Galban C., Bungay P.M.,
Yuan P., Wang N.S., Kim J., Csaky K.G., A Rabbit Model For Assessing The
Ocular Barriers To The Transscleral Delivery of Triamcinolone Acetonide,
Experimental Eye Research , 82, 479-487, 2006.
73
96. Kim, S.H., Lutz, R.J., Wang, N.S., Robinson, M.R., Transport Barriers in
Transscleral Drug Delivery For Retinal Diseases, Ophthalmic Research, 39, 244-
54, 2007.
97. Bill, A., A Method To Determine Osmotically Effective Albumin And
Gammaglobulin Concentrations in Tissue Fluids, its Application To Uvea And A
Note On Effects Of Capillary ‘Leaks’ On Tissue Fluid Dynamics, Acta Physiologica
Scandinavica , 73, 511–522, 1968.
98. Cellini, M., Pazzaglia, A., Zamparini, E., Intravitreal Vs. Subtenon Triamcinolone
Acetonide for the Treatment of Diabetic Cystoid Macular Edema, BMC
Ophthalmology , 17, 8, 5, 2008.
99. Choudhry, S., Ghosh, S., Intravitreal And Posterior Subtenon Triamcinolone
Acetonide in Idiopathic Bilateral Uveitic Macular Oedema, Clinical &
Experimental Ophthalmology, 35, 713-718, 2007.
100. Qi, H., Bi, S., Wei, S., Cui, H., Intravitreal Versus Subtenon Triamcinolone
Acetonide Injection for Diabetic Macular Edema: A Systematic Review And Meta-
Analysis, Current Eye Research, 37, 12, 1136-1147, 2012.
101. Shen, L., You, Y., Sun, .S, Chen, Y., Intraocular and Systemic Pharmacokinetics of
Triamcinolone Acetonide after a Single 40-Mg Posterior Subtenon Application,
Ophthalmology, 117, 2365-2371, 2010.
102. Van, Quill K., Dioguardi, P., Tong, C., Gilbert, J., , Subconjunctival Carboplatin in
Fibrin Sealant in The Treatment Of Transgenic Murine Retinoblastoma,
Ophthalmology, 112,1151–1158, 2005.
103. Murray, T., Cicciarelli, N., O'brien, J., Subconjunctival Carboplatin Therapy And
Cryotherapy in The Treatment Of Transgenic Murine Retinoblastoma, Archives of
Ophthalmology, 115,1286–1290, 1997.
104. Simpson, A., Gilbert ,J., Rudnick, D., Geroski, D., Transscleral Diffusion of
Carboplatin: An In vitro And in Vivo Study, Archives of Ophthalmology, 120,
1069–1074, 2002.
105. Bamrungsap, S., Zhao, Z., Chen, T., Wang, L., Li, C., Nanotechnology in
Therapeutics: A Focus on Nanoparticles as a Drug Delivery System,
Nanomedicine, 8, 1253-1271, 2012.
106. Petkar, K., Chavhan, S., Agatonovik-Kustrin, S., Sawant, K.,Nanostructured
Materials in Drug and Gene Delivery: A Review Of The State Of The Art, Critical
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems , 28, 101-164, 2011.
74
107. İntravitreal enjeksiyonun şematik çizimi http://jirehdesign.com/eye-
illustrations/eye-surgery-illustrations/suvr0018.html (Mart 2013)
108. Fung, A.E., Rosenfeld, P.J., Reichel, E., The International Intravitreal Bevacizumab
Safety Survey: Using The internet To Assess Drug Safety Worldwide, British
Journal of Ophthalmology , 90, 1344–9, 2006.
109. Sahoo, S.K. And Labhasetwar, V., Nanotech Approaches To Drug Delivery and
Imaging, Drug Discovery Today 8, 1112–1120, 2003.
110. Diebold, Y, Calonge, M.,Applications Of Nanoparticles in Ophthalmology,
Progress in Retinal and Eye Research, 29, 596-609, 2010.
111. Sahoo, S.K., Dilnawaz, F., Krishnakumar, S., Nanotechnology in Ocular Drug
Delivery, Drug Discovery Today, 144e151, 2008.
112. Yih, T.C., Al-Fandi, M., Engineered Nanoparticles As Precise Drug Delivery
Systems, Journal of Cellular Biochemistry, 97, 1184–1190, 2006.
113. Sultana, Y., Maurya, D.P., Iqbal, Z., Aqil, M., Nanotechnology in Ocular Delivery:
Current And Future Directions, Drugs Today, 47, 441-455, 2011.
114. Zarbin, M.A., Montemagno, C., Leary, J.F., Ritch, R., Nanotechnology in
Ophthalmology, Canadian Journal of Ophthalmology, 45, 457-476, 2010.
115. Diepold, R.W., Kreuter, J., Himber, J., Gurny, R., Lee, V.H.L., Robinson, J.R.,
Comparison of Different Models for the testing of Pilocarpine Eyedrops Using
Conventional Eyedrops as a Novel Depot Formulation (Nanoparticles), Graefes
Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 227,188–193, 1989.
116. Gurny, R., Boye, T., Ibrahim, H., Ocular Therapy With Nanoparticulate Systems
For Controlled Drug Delivery, Journal of Controlled Release, 2, 353–361, 1985.
117. Losa S., Calvo, P., Castro, E., Vilajato, J.L., Alonso M.J., Improvement Of Ocular
Penetration of Amikacin Sulfate by Associatioto Poly(Butylcyanoacrylate)
Nanoparticles, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 43,548–552, 1991.
118. Merodio, M., Irache, J.M., Valamanesh, F., Mirshahi, M., Ocular Disposition And
Tolerance Of Ganciclovir-Loaded Albumin Nanoparticles After Intravitreal
Injection in Rats, Biomaterials, 23, 1587–1594, 2002.
119. Bucolo, C., Maltese, A., Maugeri, F., Busa, B., Puglisi, G., Pignatello, R., Eudragit
Rl100 Nanoparticle System for the Ophthalmic Delivery Of Cloricromene, Journal
of Pharmacy and Pharmacology, 56, 841–846, 2004.
75
120. Calvo P., Alonso M.J., Vila-Jato J.L., Robinson J.R., Improved Ocular
Bioavailability Of Indomethacin by Novel Ocular Drug Carriers, Journal of
Pharmacy and Pharmacology, 48,1147–1152, 1996.
121. Baldrick, P., The Safety of Chitosan as A Pharmaceutical Excipient, Regulatory
toxicology and pharmacology, 56, 290-299, 2010.
122. Hu, Y-L., Qi, W., Han, F., Toxicity Evaluation Of Biodegradable Chitosan
Nanoparticles Using A Zebrafish Embryo Model, International Journal of
Nanomedicine, 6, 3351-3359, 2011.
123. De La Fuente, M., Raviña, M., Paolicelli, P., Sanchez, A., Chitosan-Based
Nanostructures: A Delivery Platform for Ocular Therapeutics, Advanced Drug
Delivery Reviews, 62, 100-117, 2010.
124. Raymond, C.R., Paul, J.S., Marian, E.Q.. Chitosan. In: Rowe Rc, Sheskey Pj,
Quinn Me, Editors, Pharmaceutical Excipients, Rps Publishing; Usa: 2009. P. 159-
161
125. Guibal, E., Heterogeneous Catalysis on Chitosan-Based Materials: A Review.
Progress Polymer Science, 30, 71-109, 2005.
126. Araujo, J., Gonzalez, E., Egea, M., Nanomedicines For Ocular NSAIDs: Safety on
Drug Delivery, Nanomedicine & Nanotechnology, 5, 394-401, 2009.
127. Yenilmez, E., Basaran, E., Yazan, Y., Release Characteristics of Vitamin E
Incorporated Chitosan Microspheres and In Vitro–In Vivo Evaluation for Topical
Application, Carbohydate Polymers, 84,807-811,2011.
128. Gong, K., Darr, J., Rehman, I. Supercritical Fluid Assisted Impregnation Of
indomethacin into Chitosan Thermosets For Controlled Release Applications,
International Journal of Pharmaceutics, 315, 93-98, 2006.
129. De, Campos A., Sanchez ,A., Alonso, M. Chitosan Nanoparticles: A New Vehicle
For The İmprovement Of The Delivery Of Drugs To The Ocular Surface.
Application To Cyclosporin A, International Journal of Pharmaceutics, 224, 159-
168, 2001.
130. Dodane, V., Vilivalam, V. Pharmaceutical Applications of Chitosan. Pstt 6,:246-
253, 1998.
131. Agnihotri, S., Mallikarjuna, N., Aminabhavi, T. Recent Advances On Chitosan-
Based Micro- And Nanoparticles in Drug Delivery, Journal of Controlled Release,
100, 5-28, 2004.
76
132. Ludwig, A., The Use Of Mucoadhesive Polymers in Ocular Drug Delivery.
Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 1595-1639, 2005.
133. FDA GRAS Claim Notification Of Chitosan. Available From:
Http://Www.Accessdata.Fda.Gov/Scripts/Fcn/Gras_Notices/Grn000073.Pdf (Mart
2013)
134. FDA Chitosan GRAS Notice. Available From:
Http://Www.Accessdata.Fda.Gov/Scripts/Fcn/Gras_Notices/GRN000397.Pdf (Mart
2013)
135. Alonso, M.J., Sánchez, A., The potential of chitosan in ocular drug delivery,
Journal of Pharmacy and Pharmacology, 55,1451-1463, 2003.
136. Başaran, E., Yazan, Y., Ocular Application Of Chitosan, Expert Opinion On Drug
Delivery, 9, 6, 701-712, 2012.
137. Pahuja, P., Arora, S., Pawar, P., Ocular Drug Delivery System: A Reference To
Natural Polymers, Expert Opinion On Drug Delivery, 9, 837-861, 2012.
138. 137-Wang, J., Zeng, Z., Xiao, R., Recent Advances Of Chitosan Nanoparticles as
Drug Carriers, Internationa Journal of Nanomedicine, 6,765-774, 2011.
139. Paolicelli, P., De La Fuente, M., Sánchez, A., Chitosan Nanoparticles For Drug
Delivery To The Eye, Expert Opinion On Drug Delivery, 6, 239-253, 2009.
140. Badawi, A., El-Laithy, H., El Qidra, R., El Mofty, H., El Dally, M., Chitosan Based
Nanocarriers For Indomethacin Ocular Delivery, Archives of Pharmacologial
Research, 31, 8, 1040-1049, 2008.
141. Wadhwa, S., Paliwal, R., Paliwal, S., Vyas, S., Chitosan And its Role in Ocular
Therapeutics, Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 9, 1639-1647, 2009.
142. Berger, J., Reist, M., Mayer, J., Structure and Interactions in Covalently And
Ionically Crosslinked Chitosan Hydrogels For Biomedical Applications, European
Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 57,19-34, 2004.
143. Zhang, J., Wang, S., Topical Use Of Coenzyme Q10-Loaded Liposomes Coated
With Trimethyl Chitosan: Tolerance, Precorneal Retention And Anti-Cataract
Effect, International Journal of Pharmaceutics, 372, 66-75, 2009.
144. Diebold, Y., Jarrin, M., Saez, V., Ocular Drug Delivery By Liposome–Chitosan
Nanoparticle Complexes (Lcs-Np), Biomaterials, 28,1553-1564, 2007.
145. Rodrigues, L., Leite, H., Yoshida, M., In Vitro Release and Characterization of
Chitosan Films as Dexamethasone Carrier, International Journal of Pharmaceutics,
368,1-6, 2006.
77
146. Contreras-Ruiz, L., De La Fuente, M., García-Vázquez, C., Ocular Tolerance To A
Topical Formulation Of Hyaluronic Acid And Chitosan-Based Nanoparticles,
Cornea, 29, 550-558, 2010.
147. Friedman, A., Phan, J., Schairer, D., Antimicrobial And Anti-Inflammatory Activity
Of Chitosan-Alginate Nanoparticles: A Targeted Therapy For Cutaneous Pathogens,
Journal of Investigative Dermatology, doi: 10.1038/jid.2012.399, 2012.
148. Di Colo, G., Zambito, Y., Burgalassi, S., Effect Of Chitosan And Of N-
Carboxymethylchitosan on Intraocular Penetration of Topically Applied Ofloxacin,
International Journal of Pharmaceutics, 273, 37-44, 2004.
149. Gratieri, T., Gelfuso, G., Rocha, E., A Poloxamer/Chitosan In Situ Forming Gel
With Prolonged Retention Time For Ocular Delivery, European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics,75,186-193, 2010.
150. Li, N., Zhuang, C., Wang, M., Liposome Coated With Low Molecular Weight
Chitosan And its Potential Use in Ocular Drug Delivery, International Journal of
Pharmaceutics, 379, 131-138, 2009.
151. Tamilvanan, S., Benita, S. The Potential Of Lipid Emulsion For Ocular Delivery Of
Lipophilic Drugs, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 58,
357-356 2004.
152. Hagigit T, Abdulrazik M, Orucov F, Topical And intravitreous Administration Of
Cationic Nanoemulsions to Deliver Antisense Oligonucleotides Directed Towards
Vegf Kdr Receptors To The Eye, Journal of Controlled Release, 145, 297-305,
2010.
153. Mahmoud Aa, El-Feky Gs, Kamel R, Chitosan/Sulfobutylether–Cyclodextrin
Nanoparticles as A Potential Approach For Ocular Drug Delivery. International
Journal of Pharmaceutics, 413, 229-236, 2011
154. Akhter, S., Talegaonkar, S., Khan, Zı., Jain, Gk., Khar, R ., Ahmad, F.J.Assessment
Of Ocular Pharmacokinetics and Safety Of Ganciclovir Loaded Nanoformulations.
Journal of Biomedical Nanotechnology, 7, 144-145, 2011.
155. Nagarwal, R.C., Kumar. R., Pandit, J.K., Chitosan Coated Sodium Alginate-
Chitosan Nanoparticles Loaded With 5-FU For Ocular Delivery: In Vitro
Characterization And in Vivo Study in Rabbit Eye, European Journal Of
Pharmaceutical Sciences, 20, 47, 678-85, 2012 .
156. De Campos Am, Sánchez A, Alonso Mj. Chitosan Nanoparticles: A New Vehicle
For The improvement Of The Delivery Of Drugs To The Ocular Surface.
78
Application To Cyclosporin A, International Journal of Pharmaceutics, 224, 159-
168, 2001.
157. Sahoo, S.K., Parveen, S., Panda, J.J., The Present And Future of Nanotechnology in
Human Health Care. Nanomedicine, 3, 20e31, 2007.
158. Vision and Health Care :Subtenon enjeksiyon uygulamasının şematik gösterilmesi
www.vision-and-eye-health.com (Mart 2013).
159. Leung K., Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Polylactic Acid-Polyethylene
Glycol-Poly-L-Lys/Gadolinium-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid
Nanoparticles, Molecular Imaging And Contrast Agent Database (MICAD)
[Internet], Bethesda (MD): National Center For Biotechnology Information (US);
2004-2013.
160. Abrishami, M., Zarei-Ghanavati, S., Soroush, D., Rouhbakhsh, M., Preparation,
Characterization, And In Vivo Evaluation Of Nanoliposomes-Encapsulated
Bevacizumab (Avastin) For intravitreal Administration, Retina, 29, 699-703, 2009.
161. Li, F., Hurley, B., Liu, Y., Leonard, B., Griffith, M., Controlled Release Of
Bevacizumab Through Nanospheres For Extended Treatment Of Age-Related
Macular Degeneration, Open Ophthalmology Journal, 6, 54-58, 2012 .
162. Hao, Y., Patel, A., Liu, W., Krishna, R., Ppreparation and Characterization Of
Bevacizumab (Avastin) Nanoparticles For The Treatment Of Age Related Macular
Degeneration. American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS) Annual
Meeting And Exposition, Los Angeles, California, U.S.A. 2009.
Http://Www.Aapsj.Org/Abstracts/AM_2009/AAPS2009-002539.PDF .
163. Araújo J., Vega E., Lopes C., Egea M.A., Effect Of Polymer Viscosity On
Physicochemical Properties And Ocular Tolerance Of FB-Loaded PLGA
Nanosphere, Colloids Surface B: Biointerfaces, 1, 72, 48-56, 2009.
164. Badawi, A.A., El-Laithy, H.M., El Qidra, R.K., Chitosan Based Nanocarriers For
Indomethacin Ocular Delivery, Pharmaceutical Research, 31, 1040-1049, 2008.
165. Gupta, H., Aqil, M., Khar, R.K., Ali, A., Sparfloxacin-Loaded PLGA Nanoparticles
For Sustained Ocular Drug Delivery, Nanomedicine, 6, 324-333, 2010.
166. Yoeruek, E., Spitzer, M.S., Tatar, O., Safety Profile of Bevacizumab on Cultured
Human Corneal Cells, Cornea 26, 8, 977-982, 2007.
167. Kernt, M., Welge-Lüssen, U., Y.A., Neubauer, A.S., Kampik, A., Bevacizumab is
Not Toxic To Human Anterior- And Posterior-Segment Cultured Cells,
Ophthalmologe, 104, 11, 965-971, 2007 .
79
168. Thaler, S., Fiedorowicz, M., Choragiewicz, T.J., Toxicity Testing Of The VEGF
Inhibitors Bevacizumab, Ranibizumab And Pegaptanib in Rats Both with And
without Prior Retinal Ganglion Cell Damage, Acta Ophthalmologica Scandinavya,
88, E170-6, 2010.
169. Hoffart, L., Matonti, F., Conrath, J., Inhibition of Corneal Neovascularization after
Alkali Burn: Comparison of Different Doses of Bevacizumab in Monotherapy or
Associated With Dexamethasone, Clinical and Experiment Ophthalmology, 38, 4,
346-352, 2010.
170. Sakurai, K., Akiyama, H., Shimoda, Y.,.Effect Of Intravitreal Injection Of High-
Dose Bevacizumab in Monkey Eyes, Investigative Ophthalmology & Visual
Science, 50, 4905-4916, 2009.
171. Pan, C.K., Durairaj, C., Kompella, U.B., Agwu, O., Oliver, S.C., Comparison Of
Long-Acting Bevacizumab Formulations in The Treatment of Choroidal
Neovascularization in a Rat Model, Journal of ocular pharmacology and
therapeutics 2011 27, 3, 219-224, 2011.
172. Nagarwal, R.C., Kumar R, Pandit JK. Chitosan Coated Sodium Alginate-Chitosan
Nanoparticles Loaded With 5-FU For Ocular Delivery: In Vitro Characterization
And in Vivo Study in Rabbit Eye, European Journal of Pharmaceutical Sciences,
20, 47, 678-685, 2012 .
173. Jin, J., Zhou, K.K., Park, K., Hu, Y., Xu, X. Anti-Inflammatory And Antiangiogenic
Effects Of Nanoparticle-Mediated Delivery Of A Natural Angiogenic inhibitor,
Investigative Ophthalmology & Visual Science, 5, 52, 6230-62377, 2011 .
174. Yang, H., Wang, R., Gu, Q., Zhang, X. Feasibility Study Of Chitosan As
Intravitreous Tamponade Material, Graefe's Archive for Clinical and Experimental
Ophthalmology, 246, 8, 1097-1105, 2008.
175. Amrite, A.C., Edelhauser, H.F., Singh, S.R., Kompella, U.B., Effect Of Circulation
on The Disposition and Ocular Tissue Distribution of 20 Nm Nanoparticles after
Periocular Administration, Molecular Vision,14, 150-60, 2008.
176. Amrite, A.C., Kompella, U.B.,Size-Dependent Disposition of Nanoparticles and
Microparticles Following Subconjunctival Administration, Journal of Pharmacy
and Pharmacology, 57, 1555-1563, 2005.
177. Bourges, J.L., Gautier, S.E., Delie, F., Bejjani, R.A., Ocular drug delivery targeting
the retina and retinal pigment epithelium using polylactide nanoparticles,
Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44,3562-3569, 2003.
80
178. Bejjani, R.A., Benezra, D., CoheN, H., Rieger, J.,Nanoparticles For Gene Delivery
To Retinal Pigment Epithelial Cells, Molecular Vision, 11, 124-132, 2005.
179. Suen, W.L., Chau, Y., Specific Uptake Of Folate-Decorated Triamcinolone-
Encapsulating Nanoparticles By Retinal Pigment Epithelium Cells Enhances And
Prolongs Antiangiogenic Activity, Journal of Controlled Release, 10, 167, 21-28,
2013.
180. Kang, S.J., Durairaj, C, Kompella, UB, O'Brien, JM, Grossniklaus, HE.
Subconjunctival Nanoparticle Carboplatin in The Treatment Of Murine
Retinoblastoma, Archives of Ophthalmology, 127:1043-1047, 2009.
181. Shome, D., Poddar, N., Sharma, V., Sheorey, U., Does A Nanomolecule Of
Carboplatin Injected Periocularly Help in Attaining Higher intravitreal
Concentrations? Investigative Ophthalmology & Visual Science, 50, 5896-5900,
2009.
182. Kim, E.S., Durairaj, C., Kadam, R.S,. Human Scleral Diffusion Of Anticancer
Drugs From Solution And Nanoparticle Formulation, Pharmacologial Research,
26, 1155-1561, 2009.
183. Wen, H., Hao, J., Li, S.K. Characterization Of Human Sclera Barrier Properties For
Transscleral Delivery Of Bevacizumab And Ranibizumab, Journal of
Pharmaceutical Science, 102, 3, 892-903, 2011 .
184. Chopra, P., Hao, J., Li, S.K.,Iontophoretic Transport Of Charged Macromolecules
Across Human Sclera, International Journal of Pharmaceutics, 388, 107–113,
2010.
185. Pescina, S., Ferrari, G., Govoni, P., Macaluso, C., In-Vitro Permeation Of
Bevacizumab Through Human Sclera: Effect Of Iontophoresis Application, Journal
of Pharmacy and Pharmacology, 62, 1189–1194, 2010.
186. Heiduschka, P., Fietz, H., Hofmeister, S., Schultheiss, S., Tübingen Bevacizumab
Study Group. Penetration Of Bevacizumab Through The Retina After Intravitreal
Injection in The Monkey, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 48,
2814-2823, 2007.
187. Shahar, J., Avery, R.L., Heilweil, G., Barak, A., Electrophysiologic And Retinal
Penetration Studies Following Intravitreal Injection Of Bevacizumab (Avastin),
Retina, 26, 3, 262-269, 2006.
188. Mordenti, J., Cuthbertson, R.A., Ferrar,a N., Comparisons Of The intraocular
Tissue Distribution, Pharmacokinetics, And Safety Of 125-Labeled Full Length and
81
Fab Antibodies in Rhesus Monkeys Following Intravitreal Administration,
Toxicologic Pathology, 27, 536–544, 1999.
189. Olsen, T.W., Feng, X., Wabner, K., Csaky, K., Pharmacokinetics of Pars Plana
Intravitreal Injections Versus Microcannula Suprachoroidal Injections Of
Bevacizumab in A Porcine Model, Investigative Ophthalmology & Visual Science,
1; 52, 7, 4749-4756, 2011.
190. Nomoto, H., Shiraga, F., Kuno, N., Pharmacokinetics Of Bevacizumab After
Topical, Sub Conjunctival, and Intravitreal Administration in Rabbits, Investigative
Ophthalmology & Visual Science, 50,4807–4813, 2009.
191. Robinson, M.R, Lee, S.S., Kim, H., Kim, S., Lutz, R.J., Galban, C., Bungay,
P.M.,.A Rabbit Model For Assessing The Ocular Barriers To The Transscleral
Delivery of Triamcinolone Acetonide, Experimental Eye Research, 82, 3, 479-487,
2006.
192. Robinson, M.R., Kim, H., Gravlin, L., Tansey, G., Grimes, G., Potti, G., Yuan, P.,
Csaky, K.G., Preclinical evaluation of a triamcinolone acetonide preservative-free
(TAC-PF) formulation for intravitreal injection, Investigative Ophthalmology &
Visual Science, 45. [ARVO E-Abstract 5058], 2004.
193. Inoue, M., Takeda, K., Morita, K., Yamada, M.,Concentrations of Triamcinolone
Acetonide in Human Eyes after Intravitreal or Subtenon Injection, American
Journal of Ophthalmology, 138, 1046–1048, 2004.
194. Thomas, E., Hainsworth D.P. Intravitreal Concentration of Subtenon’s Injected
Triamcinolone Acetonide, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 46.
[ARVO E-Abstract 5394], 2005.
195. Hyndiuk, R.A., Radioactive Depot-Corticosteroid Penetration into Monkey Ocular
Tissue. II. Subconjunctival Administration, Archives of Ophthalmology, 82, 259–
263, 1969.
196. Bakri, S.J., Snyder, M.R., Reid, J.M., Pulido, J.S., Singh, R.J., Pharmacokinetics of
Intravitreal Bevacizumab (Avastin), Ophthalmology, 114, 855–859, 2007.
197. ZHU, Q.I., Focke, Z, Sigrid, F.H., Vitreous Levels Of Bevacizumab And Vascular
Endothelial Growth Factor-A in Patients with Choroidal Neovascularization,
Ophthalmology, 115, 1750–5, 2008.
198. Sinapis, C.I., Routsias, J.G., Sinapis, A.I., Sinapis., D.I., Agrogiannis, G.D.
Pharmacokinetics Of intravitreal Bevacizumab (Avastin®) in Rabbits, Clinical
Ophthalmology, 5,697-704, 2011.
82
199. Csaky K.G., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2007;48:ARVO E-
Abstract 4936), 2007.
200. Meyer, C.H., Krohne, T.U., Holz, F.G.Intraocular Pharmacokinetics after a Single
intravitreal injection Of 1.5 Mg Versus 3.0 Mg Of Bevacizumab in Humans, Retina,
31, 1877-1884, 2011 .
201. Rodrigues, E.B., Farah, M.E., Maia, M., Penh,a F.M., Therapeutic Monoclonal
Antibodies in Ophthalmology, Progress in Retinal and Eye Research, 28, 117-144,
2009.
202. Klettner, A., Roider J.Comparison of Bevacizumab, Ranibizumab, and Pegaptanib
in Vitro: Efficiency And Possible Additional Pathways, Investigative
Ophthalmology & Visual Science, 49, 10, 4523-4527, 2008.
203. Thomas, E.L. Microdose Intravenous Bevacizumab For Treating Retinal Vascular
Disease (Abstract). Presented At The 7th International Symposium On Ocular
Pharmacology and Therapeutics, A-32, 2008.
204. Avery, R.L., Pearlman, J., Pieramici, D.J., Rabena, M.D., Intravitreal Bevacizumab
(Avastin) in The Treatment of Proliferative Diabetic Retinopathy, Ophthalmology,
113,10, 1695.E1-15, 2006.
205. Charbel Issa, P., Finger, R.P., Holz, F.G., Scholl, H.P. Eighteen-Month Follow-Up
Of intravitreal Bevacizumab in Type 2 Idiopathic Macular Telangiectasia, British
Journal of Ophthalmology, 92, 941–945, 2008.
206. Mennel, S., Callizo, J., Schmidt, J.C., Meyer, C.H. Acute Retinal Pigment
Epithelial Tear in The Untreated Fellow Eye Following Repeated Bevacizumab
(Avastin) Injections, Acta Ophthalmologica Scandinavya, 85,689–691, 2007.
207. Yoon, Y.H., Kim, J.G., Chung, H., Lee, S.Y. Rapid Progression Of Subclinical Age-
Related Macular Degeneration in The Untreated Fellow Eye After intravitreal
Bevacizumab, Acta Ophthalmologica, Published Online, 2008.
208. Sawada, O., Kawamura, H., Kakinoki, M., Ohji, M. Vascular Endothelial Growth
Factor in Fellow Eyes Of Eyes injected with intravitreal Bevacizumab, Graefe's
Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 2008;246:1379–1381,
2008.
209. Saati, S., Agrawal, R.N., Louie, S., Chader, G.J., Humayun, M.S., Effect Of
Multiple injections Of Small Divided Doses vs Single injection Of intravitreal
Bevacizumab On Retinal Neovascular Model in Rabbits, Graefe's Archive for
Clinical and Experimental Ophthalmology, 248, 457-466, 2010.
83
210. Alm A., Bill, A., 1973. Ocular And Optic Nerve Flow At Normal And Bincreased
Intraocular Pressures in Monkeys (Macaca Irus); A Study With Radioactively
Labelled Microspheres including Flow Determinations in Brain and some other
Tissues, Experimental Eye Research, 15, 15–29, 1973.
211. Prince J.H., Diesem, C.D., Eglitis, I., Ruskell, G.L., Anatomy And Histology of The
Eye And Orbit in Domestic Animals, 268, Charles C. Thomas, Springfield, 1960.
84
EK 1:APANDIX
Kontrol Grubu
İlaç Grubu
Nanopartikül Grubu
Gün 1 0,172 0,207 0,291
0,173 0,199 0,196
0,173 0,202
Gün 3 0,173 0,301 0,344
0,171 0,254 0,557
0,211 0,132
Gün 5 0,139 0,435 0,321
0,141 0,23 0,106
0,549 0,226
Gün 7 0,087 0,08 0,218
0,089 0,097 0,122
0,156 0,111
Vitreus örnekleri için Eliza absorbans sonuçları
Kontrol Grubu
İlaç Grubu
Nanopartikül Grubu
Gün 1 0,173 0,139 0,118
0,153 0,098 0,171
0,128 0,224
Gün 3 0,082 0,321 0,074
0,058 0,209 0,072
0,124 0,142
Gün 5 0,069 0,215 0,137
0,057 0,284 0,216
0,218 0,079
Gün 7 0,093 0,238 0,068
0,057 0,129 0,107
0,11 0,079
Serum örnekleri için Eliza absorbans sonuçları
85
ELİSA standart kalibrasyon grafiği (Y=Absorbans X=konsantrasyon)
86
ÖZGEÇMİŞ
Kimlik Bilgileri
Adı Soyadı: Nagihan Uğurlu (12-10-1974)
Doğum Yeri: Hayrabolu, Tekirdağ
Medeni Hali: Evli, üç çocuk annesi
e-posta:[email protected]
Adresi:48. Cadde, 1474. Sokak, 3/10, pembeköşk apr. Çukurambar Ankara
Eğitim
Lise: Bursa IH Kız Lisesi, 1992
Lisans: Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, 1999
Yüksek Lisans: Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, 1999
Tıpta Uzmanlık Eğitimi: Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Göz Hastalıkları
bölümü, 2004.
Yabancı Dil ve Düzeyi
İngilizce, iyi derecede
İş deneyimi
Araştırma Görevlisi: Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi (2000-2004)
Uzman Doktor: Kelkit Devlet Hastanesi (2004-2004)
Başasistan: Ankara Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi Göz Kliniği (2004-2008)
Uzman Doktor: Özel Yeni Hayat Göz Merkezi (2004-2008)
Başasistan: Ankara Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi Göz Kliniği (2010-2013)
Deneyim Alanları
Uvea, Medikal retina.
Tezden Üretilmiş Projeler ve Bütçesi:
Etken madde yüklü nanopartiküllerin subtenon enjeksiyon sonrası Güvenlik ve
Etkinliğinin Değerlendirilmesi, 111S292 No’lu Tübitak 1002 Hızlı Destek Projesi,
Bütçesi:23.880 YTL.
87
Tezden Üretilmiş Serbest bildiri:
“Bevasizumab Loaded Chitosan Nanoparticles for Ocular Uses”
Nagihan Uğurlu, Sema Tuncer, Mehmet Doğan Aşık, Mustafa Türk, Emir Baki Denkbaş
VIII. Türkiye Nanobilim ve Nanoteknoloji Konferansı, [A1-Nanoparticles] [OP-027],
Ankara, 2012.