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Mykotoxine: Zwischen Acker, EU-Recht und Endverbraucher
Welche Rolle spielt die Probenvorbereitung?Dr. Marc von Essen - Dezember 2017
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Was macht LCTech?
LCTech GmbH
• Wir unterstützen Kunden mit innovativen Produkten und Lösungen für die Probenvorbereitung zur Analytik in den Bereichen Lebensmittel-, Futtermittel- und Umweltanalytik.
• Wir unterstützen darüber hinaus SPE-Anwendungen in pharmazeutischen und forensischen Laboratorien.
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Unsere Mission
LCTech GmbH
JE REINER DER EXTRAKT
–
UMSO BESSER DAS ERGEBNIS
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Schimmelpilze = Mykotoxineein ubiquitäres Problem!?
Nicht gänzlich zu verhindern, aber einzudämmen.
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EU-Recht
Endverbraucher„Acker“ / Erzeuger
Verordnungen z.B. 1881/2006Empfehlungen z.B. 2012/154/EU…(z.B. Oeohlinger et al.)
Intramatrix-Variation(z.B. Stadler et al.)
“Die Dosismacht das Gift”
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Mykotoxin-Matrices
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
• Aflatoxine: Nüsse, Getreide, Feigen, Gewürze, Trockenfrüchte, Futtermittel
• Deoxynivalenol: Getreide• Fumonisine: Getreide, Mais • Ochratoxin A: Getreide, Trauben,
Rosinen, Kaffee, Wein, Bier, Süßholz, Gewürze, Futtermittel
• Patulin: Apfelsaft, Apfelmus, -püree, Obst • Zearalenon: Getreide, Mais• T-2/HT-2: Getreide, Hafer• Ergotalkaloide: Getreide, Gräser
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Geregelte Mykotoxine (EU)
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
• Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und M1(Σ / E)• Deoxynivalenol (DON) (E)• Fumonisine B1und B2 (Σ) • Ochratoxin A (E)• Patulin (E)• Zearalenon (E)
Σ = SummenparameterE = Einzelparameter
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100% Sicherheit
Wunschtraum zwischen Verbraucherschutz/Juristerei
und chemischer Analytik
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Probenahme und Hintergrund der Untersuchung
• Eigenkontrolle der Wirtschaft
• Amtliche Lebensmittelkontrolle
• Kontrollen bei akuten Problemen
Hürden im Laboralltag
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Kreuzfahrtschiffskapitänstaschenuhrenstellknopf
• Kreuzfahrtschiff 100.000 t
• 1 ppm Kapitän an Bord? 100 kg
• 1 ppb mit Taschenuhr? 100 g• Mykotoxine und Pestizide
• 1 ppt mit Stellknopf? 100 mg• Dioxin-Anwendungen
• Mykotoxine in Babynahrung
• 1 ppq mit Verchromung? 100 µg• Dioxin- und teilweise Mykotoxin-Anwendungen
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
AIDAsol – 71.100 t
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Regelungen entsprechend der MHmV (EU 1881/2006)
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
• Art und Weise, Menge der Probennahme
• Analytik (Homogenisierung Messung)
• Ergebnisbewertung nach• Zulässiger Höchstmenge (µg/kg,
mg/kg, ppb oder ppm)
• Art des Lebens- bzw. Futtermittels
• Diätverordnung
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100% repräsentative Probe?
Es können nur (qualifizierte) Stichproben analysiert werden –
Ein Spiel der Wahrscheinlichkeiten!
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Analytik von Mykotoxinen
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
Folgende Teilbereiche werden durchlaufen:
• Probennahme• Homogenisierung• Extraktion• Aufreinigung• Derivatisierung • Detektion• Auswertung mit Bewertung
Fehlerp
oten
tial
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Extraktion
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
• Typischerweise fest-flüssig
• Organische Lösungsmittel + Wasser• Methanol / Wasser (80 - 70 / 20 - 30)• Acetonitril / Wasser (80 - 70 / 20 - 30)• Ethylacetat
Alle Angaben v / v
• Matrixspezifisch Salze, Puffer, Tenside
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Aufreinigung
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
• Normalerweise Chromatographie über Immunoaffinitätsäulen (IAC), z. B. LCTech, VICAM, r-biopharm,RomerLabs
•Anmerkung: Immunoaffinitätssäulen sind Einweg-Säulen
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„Dilute and shoot“ vs. OTAclean
IAC ergibt Sinn
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0-5
50
100
150
200
250
300
Roggen (halbe einwaage) 10ppb nachher (AO)Emission
2 - 171128-FW-ROGGEN_BUTTERKEKS VK UND BUCHWEIZEN AO #100EmissionmV
min21
1 - Ota - 4,586
EM:465 nm
-5,0
10,0
20,0 Roggen (halbe einwaage) 10ppb nachher (AO)EmissionmV
1
1 - Ota - 4,586
EM:465 nm
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0-5,0
10,0
20,0 2 - 171128-FW-ROGGEN_BUTTERKEKS VK UND BUCHWEIZEN AO #100EmissionmV
min
2
EM:465 nm
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Derivatisierung
• Eine Derivatisierung vor der Messung ist abhängig von der Detektion und der gewünschten Empfindlichkeit.
• Typischerweise wird sie vor einer Fluoreszenz-Detektion verwendet.• Aflatoxine B1, B2, G1, G2, M1 (Pickering / Iod; UVE / Wasser; Cobra-Zelle / Brom)
• Ochratoxin A (NaOH oder NH3)
• Fumonisine B1, B2, B3 (OPA, Thiof.) (Pickering)
• Deoxynivalenol (NaOH, Hantzsch‘-R.)
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
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Detektion
• Fluoreszenz-Detektion (FLD)• Empfindlich• Derzeit meistverwendet
• Gesetzl. Verfahren basieren auf HPLC mit UV-Detektion• Einfach, aber relativ unempfindlich
• LC-MS/MS• Kostspielig• Sehr empfindlich• Vielseitig
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
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FREESTYLE ThermELUTE™ - ppt statt ppb
• Vom Rohextrakt zum Chromatogramm ohne manuellen Zwischenschritt:• Probenbearbeitung Tag, Nacht und sogar am Wochenende
• Bemerkenswerte Sensitivität im unteren ppt-Bereich
• Sehr gute Wiederfindungsraten
• Reproduzierbare Ergebnisse
• Kombination mit den SMART Immunoaffinitätssäulen• Miniaturisierung des Prozesses
• Hoher Probendurchsatz von bis zu 500 Proben/Woche
• Reduzierung der Proben- und Lösungsmittelmenge
Vollautomatisierte Mykotoxinanalytik
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FREESTYLE ThermELUTE™ - ppt statt ppb
• Robotiksystem FREESTYLE• Ausgestattet mit SPE- und ThermELUTE™ Modul
• Kombiniert mit HPLC-System
• Funktionsweise ThermELUTE™ Modul• Thermische Denaturierung bricht Toxin-Antikörper-Bindung
• Großvolumige wässrige Elution mit quantitativer Überführung direkt in die HPLC-Probenschleife
• Analyse der Probe in HPLC-System
Vollautomatisierte Mykotoxinanalytik
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Zusammenfassung
• Global weiter ansteigender Analysenbedarf für Mykotoxine im Bereich der Lebens- und Futtermittelanalytik
• Probenahme birgt höchstes Fehlerpotential, lässt sich jedoch nicht mittelfristig nicht global verbessern
• Analytik muss zuverlässig, möglichst schnell und kostengünstig durchführbar sein
• Automatisierte Probenaufbereitung mit SMART-Säulen bietet kostengünstig hohen Durchsatz bei höchster Zuverlässigkeit
Grundlagen der Mykotoxinanalytik
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