1

SKKY:n ja sairaalakemistit ry:n koulutuspäivä HelsinginMessukeskus 24.3.2011

Terho Lehtimäki, Professori, ylilääkäriterho.lehtimaki@uta.fi

Kliinisen kemian yksikköPSHP Laboratoriokeskus ja Tampereen yliopisto Lääketieteen

laitos

METABONOMIIKKA, LIPIDIT JALIPOPROTEIINIT JA NIIDEN

MERKITYS ATEROSKLEROOSISSA

Luennon sisältö

• Taustaa• Liporoteiinit, lipidit ja apoliporoteiinit• Metabolomiikka ja lipidomiikka uutena välineenä

lipidi­ ja lipoproteiinianalytiikassa• Liporoteiinien ja lipidien merkitys ateroskleroosin

ja sydän ja verisuonitautien kehittymisessä

Sydän­ ja verisuonitautikuolleisuusmaailmanlaajuisesti: Taustaa

Lähde: Maailman terveysjärjestö WHO. The atlas of heart disease and stroke. Www­osoite: http://www.who.int/cardiovascular_diseases/resources/atlas/en/print.html. Ladattu 7.2.2006.

Korkea verenpaine 5 %

Aivohalvaus33 %

Muut14 % Sepelvaltimo­

tauti43 %

Reumaattiset 2 %Tulehdukselliset 2 %

Yhteensä:16,7 miljoonaa

kuolemantapausta(2002)

• Sepelvaltimotauti aiheuttaavuosittain noin 15.000kuolemaa Suomessa.

• Sitä sairastaa noin 300.000(180.000 kela) suomalaista.

• Aivoverenkierohäiriöihinsairastuu maassammevuosittain 13.000­14.000 jakuolee 5000­6000 henkilöä

• 600.000 syö statiineja

Sydän­ ja verisuonitautikuolleisuusSuomessa: Taustaa

Mitä liporoteiinit ovat?• Lipoproteiinit

ovat pallomaisiaproteiini­lipidikomplekseja

• Hydrofobisetlipidit ytimessä

• Hydrofiilisetkuoressa(kolesteroli,fosfolipidit)

Apolipoproteiineja

Fosfolipidejä

Triglyseridejä jakolesteroliestereitä

Kolesteroli

Mitä liporoteiinit tekevät?Toimivat rasvaliukoistenaineiden kuljettajina erikudosten välillä ja sisältävät

– energia aineenvaihdunnansubstraatteja (TG)

– keskeisiä solujen osia (PL, C)– eikosanoidisynteesin esiasteita– lipidiliukoisia vitamiineja– kolesteroli on sappihappojen, D­

vitamiinin ja hormonien esiaste

Apolipo­

proteiineja

Fosfolipidejä

Triglyseridejäjakolesteroli­

estereitä

Kolesteroli

HO

Cholesterol

HO OH

OŠOH

O

Bile acidscholate

HOVitamin D

2

TiheysLiikkuvuus

Elektroforeesi

FFA

UltrasentrifugaatioLipoproteiinien pääluokat

Lipoproteiinientärkeimmät lipidit

Triglyseridit

Fosfolipidit

Kolesteroli/Kolesteroliesterit

Tärkeät lipoproteiinien aineenvaihdunnansäätelijät ­ apolipoproteiinit

• Apo B­100 (maksa)– Rakenneproteiini VLDL synteesissä; LDL­reseptorin

ligandi.– Korreloi voimakkaasti LDL:n kanssa ja on

sepelvaltimotudin (ST) ja ST kuolleisuuden riskitekijä• Apo B­48 (ohutsuoli)

– Rakenneproteiini kylomikroni synteesissä; syntyyapo B­100 mRNA:sta spesifisen editoinnin jälkeen.

• Apo E (maksa, makrofagit, aivot)– ApoE reseptorin (LRP1) ligandi (on IDL, VLDL, HDL,

kylomikroni remnantit); osllistuu solujen sisäisenkolesterolin mobilisointiin. E2, E3, E4 alamuotoja.

Tärkeät lipoproteiinien aineenvaihdunnansäätelijät ­ apolipoproteiinit

•Apo C­I (maksa)–Lesitiinikolesteroliasyylitransferaasin (LCAT)

aktivaattori•Apo C­II (maksa)

–LPL aktivaattori•Apo C­III (maksa)

–LPL inhibiittori

Tärkeät lipoproteiinien aineenvaihdunnansäätelijät ­ apolipoproteiinit

• Apo A­I (maksa, ohutsuoli)– Rakenneproteiini; Lesitiinikolesteroliasyylitransferaasin

(LCAT) aktivaattori– Kemiallisia ominaisuuksia jotka kiinnittävät sen tiukasti eri

lipideihin, esim. fosfolipideihin ja kolesteroliin, mikä selittääsen kykyä kerätä kolesterolia soluilta.

– Korreloi voimakkaasti HDL:n kanssa ja suojaasepelvaltimotaudilta (ST) ja ST kuolleisuudelta

• Apo A­II (maksa)– Rakenneproteiini; estää maksalipaasia; toimii osana HDL:n

sitoutumisessa• Apo A­IV (ohutsuoli)

– Lesitiinikolesteroliasyylitransferaasin aktivaattori– Moduloi lipoproteiinilipaasia (LPL)

3

Lipoproteiinienaineenvaihdunta

A. Ravintoperäisen rasvojenkuljetus suolesta,vaputtaminen kudoksiin jakulkeutuminen maksaan

B.     Maksassa syntetisoituvienrasvojen kuljetus kudoksiin jatakaisin maksaan

C. HDL­metabolia:apolipoproteiinien siirtyminen,kolesteroliesterin kuljetus,kolesterolin käänteiskuljetustakaisin maksaan

D. Kolesterolin ja sappihappojeneritys sapen kautta suoleen jaenterohepaattinen kierto

Surface MonolayerPhospholipids (5%)Free Cholesterol (1%)Protein (1%)

Hydrophobic CoreTriglyceride (93%)Cholesteryl Esters (1%)

A. Ravintoperäisen rasvojen kuljetus suolesta, vaputtaminenkudoksiin ja kulkeutuminen maksaanTriglyseridi (TG) rikkaat: Kylomikronit

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

A. Kylomikroni­katabolia

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

Ravinnosta tulevatpitkäketjuiset rasvahapotuudelleen esteröidääntriglyseridiksi suolenseinämän soluissa japakataan apo48:aa,apoA­I:tä ja apoA­IV:ääsisältäviksikylomikroneiksi, jotkasiirtyvät imunesteteidenkautta verenkiertoon

A. Kylomikroni­katabolia

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

Verenkierrossakylomikronitsaavat HDL:ltäapoC­II ja apoE:tä

Myös ApoA­I jaapoA­IV voi siirtyäkylomikroneihinHDL:ltäverenkierrossa

A. Kylomikroni­katabolia

(Cholesterol andAtherosclerosis, Grundy)

ApoC­II aktivoi rasva­ja lihaskudoksenhiussuontenendoteelin pinallaolevan LPL. LPLpilkkoo kylomikronientriglyseridejä vapaiksirasvahapoiksi jaglyseroliksi.

A. Kylomikroni­katabolia

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

ApoC:t (osin) jaapoA­I ja A­IVsiirtyvät takaisinHDL:lle

4

A. Kylomikroni­katabolia

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

KylomikronienapoE:tä sisältäväjäänne siirtyy apoE(LRP1) ja LDLreseptorien kauttaverenkierrostamaksaan

Surface MonolayerPhospholipids (12%)Free Cholesterol (14%)Protein (4%)

Hydrophobic CoreTriglyceride (65%)Cholesteryl Esters (8%)

B. Maksassa syntetisoituvien rasvojen kuljetuskudoksiin ja takaisin maksaan: TG Rikas VLDL

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

B. Maksa: VLDL:n synty ja eritysverenkiertoon

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

MicrosomalTG transferprotein (MTP)

Facilitates thetranslocation, foldingof apoB and additionof lipids to lipidbinding domains

ApoB100:täTG:tä jakolesteroliasisältävät VLDL­partikkelitmuodostuvatmaksassa

B. VLDLMetabolia

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

Verenkierrossa HDL:ltäsiirtyy apoC­II:a jaapoE:tä sekäkolesteroliesteriä(CETP) VLDL:lle.

B. Rasvahappojen kuljetus ja vapautuminen

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

VLDL:n ApoC­II aktivoiLPL:ia joka pilkkootriglyseridejä vapaiksirasvahapoiksi jaglyseroliksi. ApoC­IIIinaktivoi LPL jotenhiukkasen apoC­II/C­IIIsuhde on tärkeä LPLsäätelyssä

B. VLDL­IDLMetabolia

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

Apoliporoteiinitsiirtyvät takaisinHDL:lle

LPL pilkkoessaVLDL hiukkastentriglyseridejärasvahapoiksi jaglyseroliksi syntyyIDL hiukkanen(VLDL remnantti)

5

B.VLDL Remnanttien(IDL) siirtyminen

maksaan

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

VLDL:n apoE:täsisältävä jäänne IDLvoi siirtyä apoE(LRP1) ja LDLreseptorien kauttaverenkierrostamaksaan

B. IDL:n konversioLDL:ksi

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

Maksan lipaasin tai/ja LPLjatkaessa IDL:ntriglyseridien pikkomista IDLmenettää mm, apoE:n(HDL:lle) ja syntyy yhdenapoB­100 molekyylinsisätämä kolesterolirikasLDL partikkeli

Surface MonolayerPhospholipids (25%)Free Cholesterol (15%)Protein (22%)

Hydrophobic CoreTriglyceride (5%)Cholesteryl Esters(35%)

B. CE Rikas: LDL

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

B. LDL Metabolia

Cholesterol and Atherosclerosis, Grundy

Hepatic LipaseCholesteryl estertransfer protein

LDL:n apoB­100tunnistaa maksanparenkyymisolujen(muut kudoksen)LDL reseptorin jasiirtyy maksaan

B. LDL:n siirtyminen kudoksiin

Cholesterol andAtherosclerosis, Grundy

LDL reseptorin defekti johtaa familiaaliseenhyperkolesterolemiaan

X X

Surface MonolayerPhospholipids (25%)Free Cholesterol (7%)Protein (45%)

Hydrophobic CoreTriglyceride (5%)Cholesteryl Esters(18%)

C. CE Rikas: HDL

Cholesterol andAtherosclerosis, Grundy

6

C. HDL ja kolesterolin takaisinkuljetustiet

• HDL­reseptori(apoA, SR­BI)

• LDL­reseptori:­ HDL­CETP­VLDL­ VLDL (apoE)­ LDL (apoB)

• Maksalipaasi:HDL3­HDL2­HDL3­rengas

Metabolomiikka jalipidomiikka uutenavälineenä lipidi­ ja

lipoproteiinianalytiikassa

YFS study metabonomics Soininen P et al. Analyst. 2009;134:1781­5. Wurtz P et al. Mol Biosyst 2011;7:385­93.

Lipoproteiini alaluokat (NMR)

Cardiovascular Risk in Young Finns study 2007, n = 2160

7

• The LIPID MAPS Structure Database is a relational databaseencompassing structures and annotations of biologically relevantlipids, the largest public lipid­only database in the world.

• Number of lipids per category (21.4.2010)• Fatty acyls 3562• Glycerolipids 3036• Glycerophospholipids 1960• Sphingolipids 3909• Sterol lipids 2134• Prenol lipids 1177• Sacccharolipids 13• Polyketides 6709

TOTAL 22,500 lipid structures• http://www.lipidmaps.org/data/structure/index.html

Human Lipidome High­throughputShotgun Lipidomics

Ekroos, K. Book chapter: Unraveling Glycerophospholipidomes by Lipidomics. Vol. Biomarker Methods in Drug Discovery andDevelopment, Methods in Pharmacology and Toxicology, Humana Press, March 2008.

LipidView™ LipidView™ & othertools

QSTAR EliteAdvion NanoMateTriversa

HamiltonStar

TissueCellsBiofluids

Roboticlipidextraction

Automatedsampleinfusion

MultiplePrecursor IonScanning

Lipididentification

andquantification

Univariate andmultivariatedata analysis

Lipidome characterization extended by using Targeted Lipidomics

CE TAG DAG CER PEPG SMPCPI LPE LPCPS

CE 14:0CE 15:0CE 16:2

TAG 14:0/16:0/16:0TAG 16:0/18:0/18:0TAG 18:1/18:1/20:4

DAG 16:0/16:0DAG 16:0/18:0DAG 18:1/18:1

Cer  d18:1/18:0Cer  d18:1/24:0Cer  d18:1/24:1

PG 16:0/16:0PG 18:1/18:2PG 18:0/20:4

PE 16:0/16:0PE 18:1/18:2PE 18:0/20:4

PS 16:0/16:0PS 18:1/18:2PS 18:0/20:4

PI 16:0/16:0PI 18:1/18:2PI 18:0/20:3

PC 16:0/16:0PC 18:1/18:2PC 18:0/20:4

SM 16:0SM 18:1SM 20:4

LPE 16:0LPE 18:1LPE 20:4

LPC 16:0LPC 18:1LPC 20:4

PA

PA 16:0/16:0PA 18:1/18:2PA 18:0/20:4

LPG LPA

LPG 16:0LPG 18:1LPG 20:4

LPA 16:0LPA 18:1LPA 20:4

LPI LPS

LPI 16:0LPI 18:1LPI 20:4

LPS 16:0LPS 18:1LPS 20:4

ST  d18:1/18:0ST d18:1/24:0ST  d18:1/24:1

PGPCKOdiA­PCKDdiA­PC

CER SPH CERBRO ST GANGCer d18:1/24:1Cer t18:1/h18:0CerPh d18:1/16:0

SphingosineSphinganine

Sphingosine­1­phosphate

GluCer d18:1/24:1LacCer d18:0/h24:0GluCer d18.1/h24;0

GM1 d18:1/24:0GD1 d18:1/18:0GT1b d18:1/h24:0

oxPL

PIP2 16:0/20:4PIP 16:0/18:0PIP318:0/20:4

EICOPGE2TXA2LTB4

PIP

16:0­CoA24:0­CoA18:1n9­CoA

ENDOAEA2­AG2­OA

ACoA

Shotgun Lipidomics: µg of >1000 lipids

Shotgun & Targeted Lipidomics: µg of >1000 lipids

TVS lipidomics:In­depth Characterization ofthe Lipidome of atherosclerosis

Molecular lipids

Lipidomes are composed of Molecular Lipids, NOT Brutto Lipids

Molecular Lipids are found in Lipid related Disorders and Dysfunctions, therefore, it isthe information in Molecular Lipids that will generate biological insight for these diseases

?

No information on the fattyacid tails!

Only total # of carbon and double bonds

Tampere Vascular study (TVS)

• Aorta samples from 11 patients from TVS• Aorta intima and media layers were dissected

and analyzed separately and combared

Cholesteryl Esters

8

Eicosanoids

PGA

PGB

PGD

PGEPG F26­keto PGF1

With the current methodapproximately 85 differenteicosanoids are monitored

Eicosanoids

Liporoteiinien ja lipidienmerkitys ateroskleroosin jasydän ja verisuonitautien

kehittymisessä

ATEROSKLEROOSIN KEHITTYMINEN

Vaahtosolut

Rasva­juoste

Välimuotoinenleesio Aterooma

Fibroottinenplakki

Komplisoituleesio/

repeämä

Adapted from Pepine CJ. Am J Cardiol. 1998;82(suppl 104).

Ensimmäinenvuosikymmen

Kolmasvuosikymmen

Neljäsvuosikymmen

Endoteelidysfunktio

Endoteeli­solut

Sileälihassoluja

Intim

a

Lamina elastica interna

Lum

en

CD36SR­A

Erilaistuminen(GM­CSF)

MakrofagiVaahtosolu

T­lymfosyytti

CD40IFN­gamma

Aterooman kehittyminen

Lähde: Fan J, Watanabe T. J Atheroscler Thromb. 2003;10: 63–71.

Monosyytti

Adheesiomolekyyli­ja kemotaksisinduktio

AdheesioVCAM­1ICAM­1P­selektiiniE­selektiini

MigraatioMCP­1CCR­2oxLDL

Hapettuminen

SytokiinitMMP:t?Endoteliini­1

LDL,  ­VLDL, Lp(a)

Endoteeli­solut

Sileälihassoluja

Intim

a

Lamina elastica interna

LDL,  ­VLDL, Lp(a)

Monosyytti

Adheesiomolekyylejäja kemotaksis

AdheesioVCAM­1ICAM­1P­selektiiniE­selektiini

MigraatioMCP­1CCR­2oxLDL

Hapettuminen

SytokineesiMMP:itäEndoteliini­1

HDL­kolesterolinantiaterogeeniset vaikutukset

Lähde: Fan J, Watanabe T. J Atheroscler Thromb. 2003; 10:63–71.

Lum

en

HDL­kolesteroliestää LDL­kolesterolin

hapettu­mista

HDL­kolesteroli edistääkolesterolin kulkeutumista

vaahtosoluista

HDL­kolesteroli estääadheesiomolekyylien jaMCP­1:n ilmaantumista

endoteelisolujenpintaan

CD36SR­A

Erilaistuminen(GM­CSF)

MakrofagiVaahtosolu

T­lymfosyytti

CD40IFN­gamma

9

Käänteinen kolesterolinkuljetus:nykyteoria HDL:n tehtävästä

kolesterolitasapainossa

FC = Vapaa kolesteroli; CE = kolesteroliesteri; SR­B1 = SR­B1 reseptori Apo A­1 = apolipoproteiini A­1; TG = triglyseridit;LCAT = lesitiinikolesteroliasyylitransferaasi; ABCA1 = ATP:ta käyttävä kuljetin

Lähde: Cuchel M, Rader DJ. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 23: 1710–1712.

CETGSR­B1

FC

Makrofagi

FC

LCAT

ABCA1FC

Kypsä HDLApo A­I

Apo A­I

Kehittyvä,kiekkomainen HDLMaksa

CE

Ateroskleroosisairauden kliinisetilmentymät

Tukos oikeassasepelvaltimossa

Normaali valtimo

Ateroskleroottinenvaltimo

Leesiostairronnut pala

Irronnut palaaivoihin hapenpuute

•MOT: Verisuonikirugikollega esitti näytteenmillainen oli hänenpoistamansatukkeutuneen verisuonenrakenne.Hän kertoi, että hekilöllä,jolta näyte oli, ei löytynytkolesterolia, vaankalkkeutumaa. Lisäksipotilaana olleella ei ollutliiallista kolesterolia.

Plakkirepeämä jossa trombi

Thrombus Fibrous cap

1 mmLipid core

Illustration courtesy of Frederick J. Schoen, M.D., Ph.D.

Lipids Online

10

Millä tavalla valtimotautivaaraaarvioidaan?

Kiitos mielenkiinnosta

HDL:n heterogeenisyys

Rye KA et al. Atherosclerosis 1999;145:227­238.

Apolipoprotein Composition

A­I HDL A­I/A­IIHDL

A­II HDL

Particle Shape

Discoidal

Spherical

Lipid Composition

TG, CE, and PL

Particle Size

HDL2b HDL2a HDL3a HDL3b HDL3c

ApoC­II puutos

• Hypertriglyseridemia• > 12.0 mmol/l• Pankreatiitti• Hepatomegalia• Eruptiiviset

Xantoomat