microscopio elettronico a trasmissione (tem). coltura batterica al tem
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MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)
Coltura battericaal TEM
Schermo fluorescente
Binoculare
Lente proiettore
Campione
Apertura Lente obiettivo
condensatore
Fonte di elettroni
Fascio di elettroni primari
Elettroni secondari
SEM
TEM
Scattering anelastico Scattering elastico
Elettroni trasmessi
TEM
e- conscattering anelastico
e- conscattering elastico
TEM convenzionale
Scattering elastico Scatteringanelastico
Elettroni incidenti
Preparazione dei campioni per TEM
FISSAZIONE
a) FISSAZIONE CHIMICA con impiego di fissativi come GLUTARALDEIDE ePARAFORMALDEIDE (per stabilizzare le proteine) e post-fissativi come OSMIO (1%) per lafissazione di lipidi. I fissativi sono usati a concentrazioni 3-5% e sciolti in tamponi
b) CRIOFISSAZIONE, congelamento rapido per immersione del campione in azoto liquido(-190°C), in genere si usano anche composti crioprotettivi per evitare danni del campione
N.B: osmio e glutaraldeide vanno maneggiati condispositivi di sicurezza secondo il D.L. 626
DISIDRATAZIONE
Procedimento che porta alla totale rimozione dell’acqua nel campione e alla sostituzione con un solvente (etanolo)
Passaggi in etanolo 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%
INCLUSIONE IN RESINA
Le resine sono sostanze che polimerizzano in opportune condizionie una volta che sono entrate nel campione induriscono il campione e lo rendono sezionabile.Le resine usate per la microscopia convenzionale sono EPOSSIDICHE(costituite da miscele di aldeidi) e polimerizzano a 60°
Il campione viene immerso in un solvente intermedio che si miscela sia conL’etanolo sia con la resina (OSSIDO DI PROPILENE)
Passaggi: ossido di propilene-etanolo, ossido di propilene assoluto,
Ossido di propilene:resine (3:1) per 1h, 1:1per 1h, 1:3 per 2hResina assoluta per 2hPolimerizzazione in stufa a 60° per 3 giorni
SEZIONAMENTO
I campioni induriti vengono tagliati mediante ULTRAMICROTOMO insezioni ultrasottili (40-80 nm) e depositati su retini (anelli con griglie diOro, nichel, rame
retino
CONTRASTAMENTO
Con metalli pesanti come uranio e piombo si aumentalo scattering elastico di membrane e inclusi nellecellule
I retini su cui sono state deposte le sezioni vengonoimmerse prima in acetato di uranile, lavati e successivamente in citrato di piombo
COLORAZIONE NEGATIVA