Microbiologia - Cellula Batterica PROF MILICIMarch 14, 2012

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Microbiologia - Cellula Batterica PROF MILICIMarch 14, 2012

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cellula batterica____

• microorganismi procarioti (un nucleo non cirdondato da una membrana nucleare, hanno ununico cromosoma circolare nel citoplasma), mancano tutti i sistemi vescicolari tipici delleeucariotiche. abbiamo però i ribosomi, sede di sintesi proteica. il citoplasma è racchiuso dallamembrana citoplasmatica e da una parete batterica.• dimensione da 2-50 micron, possono essere osservati con il microscopio ottico• il metabolismo batterico +è molto rapido, tranne che per qualche particolare specie. il tempo digenerazione standard dei batteri è di 15-20 minuti.( fa eccezione il bacitto della TBC che ha untempo di generazione di circa 48 ore, quindi significa che ha bisogno di molto tempo per crescere,servono 60gg per isolarlo.)• tempo di generazione: tempo che intercorre tra una divisione cellulare e la successiva.____

raggruppamentimorfologici____

• morfologia:• i batteri possono avere forma: sferica (cocchi) a virgola (vibrioni) allungata (bacilli, che sonotutti gli enterobatteri, il bacillo della tbc) a spirale (spirilli, spirochete). coccobacilli: ne sferico neallungato.• i cocchi sono di forma sferica, e possono essere singoli o uniti (diplococchi, tetradi, streptococchi(lineari) stafilococchi)• i diplococchi possono raggrupparsi grazie alla loro parte terminale leggermente arrotondata chefacilita l'associazione (es. pneumococco)• i cocchi si dividono ma le cellule rimangono unite, formando lunghe catene streptococchi• se i cocchi si dividono secondo piani irregolari, rimanendo ammassati a grappolo abbiamo glistafilococchi• i raggruppamento dei bacilli sono anche essi vari: a v, a palizzata etc...• possono formare gli streptobacilli se si dividono per piani paralleli, rimanendo uniti.• gli spirilli hanno una struttura rigida, con poche spire, le spirochete sono sflessibili con moltespire (agente della sifilide treponema pallidum o spirochete pallidum)____

cromosomabatterico____

• oltre al cromosoma, in alcuni batteri, abbiamo dei fattori genetici extracromosomici: plasmidi.questi presentano dei geni che codificano per la produzione di tossine e per la resistenza adantibiotici.• una caratteristica fondamentale dei plasmidi è quella di replicarsi indipendetemente dalcromosoma batterico e di trasferirsi da una cellula all'altra tramite fenomeni di coniugazione(soprattutto nei gram negativi, che sono dotati dei pili sessuali: che sono pili cavi, struttureaccessorie, mediante i quali si trasferiscono geni da un batterio donatore ad uno ricevente)• un batterio che normalmente non è resistente ad un farmaco può acquisisre resistenza tramitetrasferimento di geni da altri batteri tramite i pili sessuali.• i fattori genetici extracromosomici quindi hanno la caratteristica di replicazione autonoma epossono essere trasferiti per coniugazione.____

ribosomi____

• tra i ribosomi batterici e quelli della cellula eucariotica c'è differenza per dimensione. quelli dellacellula superiore hanno coefficente di sedimentazione 80, quelli del batterio hanno coefficiente disedimentazione di 70. questo "peso" diverso è un vantaggio, perchè alcuni antibiotici possono agireselettivamente sul ribosoma batterico risparmiando i ribosomi eucariotici, ostacolandone lafunzione.• mentre i ribosomi delle cellule superiori aderiscono al RER, quelli citoplasmatici sono situatiliberi nel citoplasma in vicinanza della membrana batterica.• possono essere suddivisi in una sub 30s e una 50s.• la sub 30s è costitua da un rna (16s) e 21 proteine chiamate l1 l2 l3 etc...• la sub 50 è formata due rna (5s e 23s) e 34 proteine chiamate s1 s2 s3 etc...____

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membranacitoplasmatica____

• circonda il citoplasma e analogamente a quella delle cellule superiori è costituita da un doppiostrato fosfolipidico. i lipidi idrofobi sono rappresentati da acidi grassi. mentre le teste idrofile sitrovano all'interno e all'esterno del batterio, le code si trovano al centro della membrana. ladifferenza tra la cellula eucariotica e procaritica è l'assenza di steroli. (non gli interessa iltrasporto delle sostanze).• vi sono delle proteine trans membrana, responsabili del trasporto di sostanze nutrienti versol'interno anche contro gradiente di concentrazioene.• la membrana citoplasmatica ha funzione di regolazione di scambi metabolici tra interno e esternodella cellula trasportando sostanze con diversi meccanismi:• diffusione passiva, diffusione facilitata, trasporto attivo, traslocazione di gruppo.____

meccanismi ditrasporto____

• DIFFUSIONE PASSIVA: trasporto dall'esterno a maggior concentrazione, verso l'interno,secondogradiente di concentrazione. questo procedimento non richiede dispendio energetico. l'ossigenoviene trasferito con tale meccanismo.• DIFFUSIONE FACILITATA: molto simile al primo trasporto, ma in questo caso la sostanza datrasposrtare si lega ad un carrieri proteico. il glicerolo penetra con tale meccanismo• TRASPORTO ATTIVO: fa penetrare sostanze contro gradiente di concentrazione. le sostanze chepenetrano grazie al trap attivo sono amminoacidi, ioni inorganici, acidi organici etc...• TRASLOCAZIONE DI GRUPPO: simile al trasporto attivo, solo che le sostanze trasportate subisconouna trasformazione chimica durante il trasporto. ad esempio: glucosio, mannosio,n-acetilglucosammina prima di essere trasportate vengono fosforilate.____

altre funzioni dimembrana____

• nella membrana vi sono anche delle proteine che assolvono alla funzione mitocondriale. lafosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri nelle cellule eucariotiche. nei batteri, i mitocondrisono assenti e proteine di membrana assolvono a questa deficienza.• un'altra caratteristica è che la membrana presenta una invaginazione detta MESOSOMA, che sitrova al centro della cellula batterica. questo è importante perchè pare abbia un ruolofondamentale nella ripartizione del materiale genetico dopo la divisione cellulare.• la membrana batterica è sede di proteine molto importanti: permeasi (trasporto di sostanzenutritive all'interno e di enzimi all'esterno); proteine biosintetiche (sintesi di lipidi di membrana,peptidoglicani, acidi tecoici, lipopolisaccaridi); proteine respiratorie (sintesi di ATP durante iltrasporto di elettroni).____

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parete cellulare____

• una caratteristica peculiare della cellula batterica è la presenza della parete batterica checonferisce caratteristiche particolari al batterio:• la parete batterica innanzi tutto conferisce la morfologia al batterio; protegge la cellula dallalisosmotica: all'interno della cellula batterica vi è una pressione osmotica molto piu alta di quelladelle cellule eucariotiche, quindi vi sarebbe un richiamo d'acqua dall'esterno all'interno chefarebbe scoppiare la cellula. la parete batterica ha anche delle caratteristiche di colorazione: aseconda della colorazione possiamo capire che tipo di parete ha il batterio,se positivo o negativoalla colorazione gram: di conseguenza possiamo sapere a quali sostanze è più debole.• questa parete è costituita fondamentalmente dal peptidoglicano, che a sua volta è rappresentatodall'alternarsi di due amminozuccheri che sono: la N-Acetilglucosammina e l'acidoN-Acetilmuramico.• questi due amminozuccheri sono legati tra loro da un legame beta 1,4 glucosidico (tra duedimeri di n-acetilglucosammina e acido muramicoil legame è beta 1.6 glucosidico).• sul legame beta 1,4 glucosidico agisce un enzima che è il LISOZIMA, che si trova nella saliva, nellelacrime, nell'albume dell'uovo; quando agisce il lisozima si ha uno scompaginamento delproteoglicano• dall'acido muramico si diparte una catena tetrapeptidica rappresentata (in ordine) dallal-alanina, acido diglutammico, l-lisina (in alternativa acido mesodiamminopimedico) e infine la d-alanina.• i due amminozuccheri si alternano in maniera costante formando lunghi filamenti costituiti da20-30 amminozuccheri, e questi filamenti sono tenuti insieme da legami detti legami crociati, chesi stabiliscono tra il 3° amminoacido di una catena e il 4° dell'altra (tra l-lisina e d-alanina).• gli amminoacidi sono destrogiri (gli amminoacidi umanin sono levogiri); notiamo la presenza diamminoacidi che non rientrano tra i 20 umani, in particolare l'acido mesodiamminopimedico.• i vari elementi del peptidoglicano verranno formati in sede citoplasmatica. vengono quinditrasportati all'esterno della membrana citoplasmatica tramite un vettore chiamatoundecaprenolo (o bactoprenolo), un lipide a lunga catena. questo carrier lipidico permette disuperare la parete idrofobica.• quando tutti i componenti della parete si troveranno fuori dalla membrana verranno assemblatedalle transpeptidasi (legami tra il 3 e il 4 amminoacido della catena tetrapeptidica) e dalletransglicosilasi (legame tra acido muramico e l-alanina).• quando gli elementi sono stati assemblati, il residuo della vecchia parete è un segnale chimico perla cellula, per il quale vengono sintetizzati enzimi detti autolisine, che hanno il compito didisgregare la vecchia parete cellulare per permettere alla cellula di dividersi. le autolisinecomprendono due tipi di enzimi: le amidasi (scindono il legame tra l'acido muramico e lal-alanina) e le glicosilasi (scindono il legame tra monomeri o dimeri di acido muramico en-acetilglucosammina).____

parete cellulare(gram positivi)____

• la parete dei gram positivi è costituita da due filamenti di proteoglicani (molto sottile rispettoquella dei gram negativi).• mentre nei gram negativi, il legame tra 3 e 4 amminoacido della catena tetrapeptidica sonodiretti, nei gram positivi possono essere sia diretti che mediati da un ponte di pentaglicina (5molecole di glicina).• nei gram positivi oltre al peptidoglicano abbiamo gli acidi teicoici. gli acidi teicoici sono dal puntodi vista chimico dei polimeri di glicerolfosfato (triolo esterificato con acido fosforico) eribitolfosfato (pentolo). possiamo anche avere acidi lipoteicoici, e sono attaccati alla membranaplasmatica fungendo da ponte tra membrana e parete.• gli acidi teicoici stimolano una funzione immunitaria dell'organismo ospite; grazie alle lorocariche si oppongono all'ingresso di sostanze nocive favorendone quello delle sostanze nutritive,in oltre sono importanti per la stabilità della membrana. si oppongono anche all'azione delleautolisine.oltre al peptidoglicano abbiamo gli acidi teicoici. gli acidi teicoici sono dal punto di vistachimico dei polimiri di glicerolfosfato (triolo esterificato con acido fosforico) e ribitolfosfato(pentolo). possiamo anche avere acidi lipoteicoici, che sono attaccati alla membrana plasmaticafungendo da ponte tra membrana e parete.• gli acidi teicoici stimolano la funzione immunitaria dell'organismo ospite; grazie alle loro caricheelettriche si oppongono all'ingresso di sostanze nocive favorendone quello delle sostanze nutritive,in oltre sono importanti per la stabilità della membrana. si oppongono anche all'azione delleautolisine.____

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parete cellulare(gram negativi)____

• nei gram negativi, invece degli acidi teicoici abbiamo una membrana esterna, uguale a tutte lemembrane biologiche dal punto di vista chimico: costituita cioè da un doppio strato fosfolipidico.• fra la seconda membrana ed il peptidoglicano c'è sempre uno spazio detto spazio periplasmico.• la differenza tra membrana superficiale e profonda dei gram negativi è che nella membranaesterna c'è la presenza di proteine dette PORINE, che sono dei canali acquosi, carichinegativamente. esse sono responsabili di trasporto di alcune proteine.• la membrana esterna dei gram negativi delimita lo spazio periplasmico che, verso l'interno, èdelimitato dalla parete cellulare; si oppone all'azione della fagocitosi e all'azione del complemento;si oppone all'ingresso di sostanze nocive per il batterio, come proteine leucocitarie, antibiotici, salibiliari, enzimi digestivi dell'ospite. permette il transito di sostanze nutrienti e ostacola l'ingresso disostanze tossiche.• le porine sono classificabili in: porine non selettive e porine selettive.• le porine non selettive fanno passare qualsiasi sostanza le cui dimensioni siano compatibili con illoro diametro.• le porine selettive sono in comunicazione con pompe a trasporto attivo presenti nella membranacitoplasmatica INTERNA (non quella esterna), e quindi lasceranno passare solo i substraticompatibili con le quelle pompe.• nella membrana esterna dei gram negativi vi sono dei complessi importantissimi: come illipopolisaccaride LPS.• LPS è distinguibile in due frazioni:• Lipide A ha una funzione di tipo endotossico (corrisponde alle endotossine dei gram negativi), èuna porzione polisaccaridica, responsabile delle caratteristiche antigeniche dei gram negativi,(antigene O): è quindi il responsabile della risposta immunitaria. Il lipide A è formato da acidopalmidico, milistico e stearico.____

endotossine edesotossine____

• Cosa sono le endotossine? sostanze di natura lipopolisaccaridica prodotta dal batterio, che non vieneriversata fuori dalla cellula, ma ne rimangono all'interno, quindi vengono liberate al momento della lisi dellacellula. sono termoresistenti, agiscono a grandi dosi, e si differenziano dalle esotossine.• Invece, le esotossine sono sostanze di natura proteica (quindi termolabili), prodotte dal batterio e riversateall'esterno del batterio stesso. le esotossine agiscono anche a piccole dosi.• le esotossine hanno meccanismo d'azione specifico (ogni tossina ha un meccanismo specifico); le endotossinehanno tutte lo stesso meccanismo d'azione: sono dei pirogeni, cioè inducono febbre perchè agiscono sul centrodella termoregolazione, danno disturbi intestinali, provocano diminuzione di leucociti e piastrine, necrosi deitessuti, vasodilatazione e vasopermeabilizzazione con emorraggie puntiformi (petecchie), ipotensione, shockemorraggico e morte.• un'altra differenza importante tra le eso e le endo tossine è che le esotossine essendo termolabili, possonoessere trattate con il calore o con il formolo, per trasformarle in anatossine (o tossoide).• per definizione l'anatossina è quella tossina che ha perso il potere tossico, ma ha comunque il potereantigenico. quindi le anatossine possono essere utilizzate a scopo profilattico (per fare vaccini).• le endotossine non possono essere trasformate in sostanze profilattiche, perchè sono sostanze di naturalipidica e non possono essere trattate con il calore.____

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struttureaccessorie: capsulae glicocalice____

• alcuni batteri posseggono certe caratteristiche che altri non posseggono. queste strutture sonodette accessorie, e sono rappresentate da capsula flagelli spore• CAPSULA: struttura all'esterno della parete batterica il cui spessore molto spesso supera quellodella cellula batterica; non si colora (quando pensiamo di avere a che fare con batteri capsulatiricorriamo ad una colorazione negativa con inchiostro di china. avremo quindi il batterio ed ilcampo sostante colorato di nero, e la capsula apparira come alone incolore).• il GLICOCALICE presente nei batteri è costituito da uno strato di fibrille molto lasse che oltre aconsentire l'adesione dei batteri alle mucose dell'ospite forma una specie di biofilm, che ingloba ibatteri e li difende dall'aggressione da parte di sostanze antibatteriche che si trovanonell'ambiente circostante.• il glicocalice può evolvere in alcuni batteri verso la formazione di una vera e propria capsula, masolitamente queste due strutture non coesistono.• sia capsula che glicocalice facilitano quindi l'adesione e la successiva colonizzazione dei tessutidell'ospite; in particolare la capsula è responsabile dei processi morbosi causati dai batteri, perchèsi oppone alla fagocitosi (che fanno parte della componente aspecifica della difesa del nostroorganismo).• per fare un esempio di germe capsulato che verra studiato nella parte speciale lo (StaphilococcusPneumoniae) PNEUMOCOCCO può provocare la polmonite grazie alla presenza di questa struttura,considerato fattore di virulenza, perchè a parità di batterio patogeno, un batterio capsulato è piùvirulento.• virulenza: a parità di potere patogeno, virulenza è la capacità di indurre un grado maggiore di patogenicità• oltre al pneumococco altri batteri che possiedono la capsula sono la Klepsiella Pneumoniae, Bacillodel Carbonchio, Meningococco.• dal punto di vista chimico la capsula è di natura polisaccaridica, ad eccezione del bacillodel carbonchio che presenta una capsula di natura peptdicica, cioè costituita da polimeri diacido diglutammico.____

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struttureaccessorie: flagellipili e spore____

• FLAGELLI, adibiti a locomozione, hanno forma cilindrica, diametro di 20nm e una lunghezza dicirca 15-20 micron. a seconda della disposizione che hanno nei batteri possiamo distinguerebatteri monotrichi (vibrione del colera) batteri lofotrichi (ciuffo di flagelli localizzati ad un polodella cellula), batteri peritrichi (con tutta la superficie cellulare se hanno tutta la superficiecellulare ricoperta di flagelli) e batteri atrichi.• i flagelli sono costituiti da un composto proteico: la FLAGELLINA. studi al M.E: hanno consentito dievidenziare la struttura del flagello la quale è costituita da molecole di flagellina che aggregandosivariamente formano lunghe catene elicoidali dal cui intreccio si origina il cosiddetto filamentonella parte basale. il filamento si lega alla parete batterica tramite un sistema di dischisovbrapposti che costituiscono il corpo basale. mentre prende il nome di uncino il breve segmentoche collega il filamento al corpo basale.• la sintesi dei flagelli è molto complessa in quanto prevede l'intervento di circa 20-30 geni: unocodifica per la flagellina, gli altri codificano per l'uncino e il corpo basale.• il movimento dei flagelli è dovuto alla chemiotassi (movimento orientato e indotto da uncomposto chimico che provoca la rotazione di questa struttura molto rigida).• nei batteri gram positivi, che non hanno flagelli, o in alcune spirochete il movimento è dovuto:nei gram-positivi ai moti browniani, cioè all'urto delle molecole del fluido in cui sono immersi ibatteri; mentre nei secondi il movimento è dovuto ad un sottile filamento localizzato ad un polodella cellula.• alcuni batteri non patogeni per l'uomo si muovo per strisciamento, cioè per contrazione di sottilifilamenti, originanti da piccole sfere poste sulla parete batterica.• I flagelli possono essere eliminati da un batterio, perchè sono di natura proteica, e con il calore possonoessere degradate. verranno studiati dei batteri flagellati che verranno privati dei flagelli, e l'allontanamentodi queste strutture verrà utilizzato nella diagnostica virologica.• I PILI o FIMBRIE sono organi di adesione (l'adesività è il primo passo per esprimere il poterepatogeno: un batterio prima di penetrare nell'organismo ospite deve prima ADERIRE). questefimbrie sono più rigide e piccole, ma comunque di natura proteica, composte da PILINA.• distinguiamo pili sessuali (responsabili del trasferimento di geni (o virus) da un batterio all'altromediante fenomeni di coniugazione) e pili comuni (o fimbrie), atti a permettere l'adesività aitessuti dell'ospite.• Le SPORE hanno funzioni molto importantiperche sono molto resistenti anche alle granditemperature, e possono germinare. le spore rappresentano forme di resistenza del batterio incondizioni ambientali sfavorevoli (alterazioni di pressione, temperatura, ph). la spora può averediverse forme (sferica o allungata), può deformare il corpo batterico perche spesso si trovaall'interno al centro del batterio, e dato che può avere dimensioni superiori al batterio stesso puòindurne la deformazione. resistono per molti anni (si sono trovate spore batteriche in mummieegiziane, che sono state in grado di germinare).• date le particolari caratteristiche morfologiche, la spora è una particolarità esclusiva dei batterigram-positivi____

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spora,sporulazione egerminazione____

• la spora è composta dall'esterno all'interno come segue:• esosporio: uno strato lipoproteico molto sottile che non sempre è presente• tunica: costituita da un doppio strato proteicoin cui sono abbondanti i gruppi disolfuro S-S• corteccia: costituita da un doppiostrato di peptidoglicano con un numero di legami crociatosicuramente inferiore a quello presente nella parete dei gram positivi. questo strato dipeptidoglicano ci indica che la spora può essere soltato presente nei gram-positivi (perche lostrato di peptidoglicano dei gram negativi è molto sottile)• nucleo:circondato ed immerso nel citoplasma; presenta l'acido dipicolinico, presente sotto formadi sale (dipicolinato di calcio), di cui la cellula si arricchisce durante il processo di sporulazione(infatti non è mai presente nella cellula vegetativa). questo sale conferisce alla spora resistenzaall'essiccamento.• il processo che porta alla formazione di una spora da un batterio è detto sporulazione.• il processo che porta alla formazione di un batterio da una spora è detta germinazione.• funzione della spora - Esempio pratico: il bacillo del tetano vive nell'intestino dei grossi animali,nell'ambiente esterno non può vivere perchè è anaerobio obligato. quando viene espulso con losterco viene posto sotto forma di spora. nel caso in cui la spora entri in ferite nelle quali siverificherà assenza di ossigeno (assenza di sangue) la spora può germinare e formare il batterioche induce la patogenesi.• come si forma la spora?• inizia con la divisione dei cromosoma batterico: uno dei due cromosomi si circonda dei vari stratidella spora.• la spora è molto resistente all'essiccamento, ai disinfettanti fisici e chimici, ai raggi UV. quindiper eliminare spore da materiale patologico dobbiamo ricorrere a temperature di 121°C e pressionedi 760mmHg, che si può indurre in autoclave, dove si verifica un aumento di calore umido.____

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colorazione diGram____

• è un test semplice ed efficace per distinguere tra le due principali classi batteriche ed iniziare unaterapia.• per osservare i batteri dobbiamo utilizzare il microscopio ottico. per fare diagnosi di malattieinfettive, dopo il prelievo di materiale biologico è l'osservazione del materiale.• l'esame può essere condotto in diversi modi:• a fresco - consiste nel prelevare una piccola parte di materiale, metterla su un vetrino portaogetto, coprirla con un vetrino copri ogetto, e osservarla con il microscopio ottico. questo esameda scarse informazioni: da informazioni solo sulla morfologia, sul raggruppamento morfologico,sulla mobilità (perchè lavoriamo su batteri in vivo).• le informazioni maggiori si hanno colorando il preparato.• diciamo subito che i coloranti che adoperiamo in batteriologia devono essere necessariamentecoloranti BASICI perchè la cellula batterica è ricca in acidi nucleici, quindi basofila: alcuni colorantibasici sono il blu di metilene, il cristalvioletto (violetto di genziana), la fucsina basicafenicata (con acido fenico).• Le colorazioni possono essere semplici o differenziali• le colorazioni semplici comportano l'utilizzo di un solo colorante in un solo tempo.utilizziamo il blu di metilene da solo, o il nero di china (vedi sopra) ma pur ottenendo delle scarseinformazioni.• colorando non possiamo risalire al tipo di mobilità perchè affinchè possa iniziare la colorazione ilmateriale deve essere prima fissato. una delle tappe della fissazione è l'uccisione dei batteri. quindinon si muovono più (capitan ovvio).• PROCEDURA PER LA COLORAZIONE SEMPLICE : una volta che preleviamo il materialepatologico da esaminare lo stendiamo su vetrino portaoggetto, lo facciamo asciugare atemperatura ambiente e lo fissiamo (3 volte alla fiamma):• il fissaggio serve a fare aderire il materiale patologico al vetrino, che altrimenti, durante lacolorazione potrebbe essere asportato. il fissaggio rende i batteri piu permeabili alla colorazione, ein oltre la fissazione, li uccide: l'uccisione dei batteri riduce la possibilità di infezione dell'operatore.• a questo punto coloriamo con un solo colorante;• laviamo con acqua;• osserviamo al M.O. : SOLTANTO vedremo morfologia e raggruppamento• le colorazioni che i microbiologi devono utilizzare in laboratorio sono quelle dettedifferenziali, che comportano utilizzo di piu coloranti in piu tempi.• un metodo di colorazione differenziale, messo a punto da un medico danese, Gram, che nel 1884lavorava presso l'obitorio di Berlino, e utilizzo per primo questo metodo che serviva a differenziarei batteri dai nuclei delle cellule dei tessuti infetti.• questo metodo viene oggi adoperato nei laboratori e ci consente di dividere i batteri in grampositivi e negativi.• i diversi comportamenti dei batteri in questa metodica di colorazione sono dovuti in gran partealla diversa composizione chimica e strutturale della parete cellulare.• come procediamo? esempio pratico di COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM:• paziente con ascesso, prelievo materiale patologico (materiale purulento, PUS), lo sistemiamo sulvetrino, lo facciamo asciugare a temperatura ambiente o sotto una lampadina elettrica, lo fissiamo3 volte alla fiamma di un becco Bunsen, procediamo alla colorazione.• nella colorazione procediamo prima con il violetto di genziana, che colora la cellula in violetto.• successivamente utilizziamo un mordente il reattivo di Lugol (contiene iodio e ioduro dipotassio). il mordete reagisce con il colorante formando un complesso difficilmente dissociabiledalla successiva azione decolorante dell'alcool etilico.• cosa succede?• dopo l'utilizzo del Lugol, va utilizzato l'alcool, per pulire il composto, e si evidenziano le differnzetra gram positivi e gram negativi.• nei gram positivi, l'alcool ha difficoltà a penetrare nella parete batterica, e quindi la cellulaconserverà il violetto di genziana, che non può essere pulito• nei gram negativi la paretenatterica ha piu strati, ma anche pori più grandi. l'alcool riesce aentrare attraverso questi pori, e la sua natura a solubilizzare la componente lipidica della parete.questa solubilizzazione comporta la detersione del colorante. a questo punto la cellula risultaincolore.• per evidenziare queste cellule incolori si utilizza un colorante di contrasto: la safranina. lasafranina colora tutti i gram negativi, riuscendo a permeare alla parete batterica dei gram negativie rimanendovi.• i gram positivi sarano colorati in violetto per il violetto di genziana, i gram negativi sarannocolorati in rosso per la safranina____

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colorazione diZiehl-Neelsen____

• è un metodo particolare per i micobatteri come il bacillo di Koch per la tubercolosi o il batteriodella lebbra, che a differenza del primo non è coltivabile in laboratorio, perchè non è stato ancoratrovato un terreno di coltura che soddisfi la sua richiesta nutrizionale.• il batterio della lebbra viene meno ai postulati di Koch. questi dicono che bisogna isolare imicrorganismi da tutti i casi di malattia. e dopo essere coltivati in laboratorio in vitro, per essere inoculati inanimali da esperimento per creare lo stesso quadro clinico dell'uomo.• Per alcuni batteri, i postulati di Koch possono essere disattesi, in quanto nell'uomo possonoprovocare una certa sintomatologia mentre negli animali non inducono alcun tipo di risposta.• Questo metodo di colorazione è peculiare per i micobatteri, in quanto questi sono batteriacido-alcool resistenti.• l'acido alcool resistenza è conferita da un enorme contenuto lipidico che si trova sullaparete cellulare dei micobatteri; tra questi lipidi abbiamo delle cere (cera D, che si comporta daimmunoadiuvante, cioè coadiuva la risposta immunitaria); inoltre abbiamo i cosiddetti micosidi, aiquali appartiene anche il cosiddetto fattore cordale (che fa parte degli acidi micolici della parete)responsabile del raggruppamente a cordone che i micobatteri assumono in unterreno liquido.• PROCEDURA:• soggetto affetto da TBC,• arriva richiesta di isolamento di bacillo tubercolare per una sospetta tubercolosi polmonare.quindi bisgna ispezionare l'espettorato.• viene messo il materiale sul vetrino, viene fatto asciugare, viene fissato per 3 volte alla fiamma e procedoalla colorazione.• il primo colorante da usare è la fucsina basica fenicata. questa è rossa.• l'acido fenico viene posto sul vetrino insieme al colorante. l'acido fenico funge damordente. (in un solo passaggio si mette mordente e colorante)• questa colorazione deve avvenire a caldo, fino allo sviluppo dei primi vapori, perchè a causadel contenuto lipidico la fucsina non entra.• a questo punto trattiamo la soluzione con acido solforico al 10% o acido cloridrico al 4%(insomma acidi inorganici forti).• questo trattamento induce la pulitura da dalla fucsina di altri batteri con la parete nonacido-alcool resistente.• nonstante questo trattamento il micobatterio rimarra colorato in rosso per la fucsina,perchè sia l'acido che l'alcol, dato lo spessore e la composizione della parete non riescono adentrare nel batterio.• tutti i batteri che non sono acido alcool resistenti, venendoi privati della fucsina basicafenicata, e rimanendo incolore, vengono quindi colorati con blu di metilene.• se abbiamo micobatteri li troveremo colorati di rosso su sfondo blu; se non abbiamo mico batteritroviamo solo sfondo blu.• la tipologiadella parete dei micobatteri induce oltre l'acido alcool resistenza, anche una crescita molto lenta,perchè i nutrienti hanno difficolta ad entrare. infatti per dare una risposta di diagnosi per il bacillotubercolare si devono aspettare almeno 60gg, perchè la crescita potrebbe essere molto lenta, e un risultatonegativo, potrebbe diventare positivo.____

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colorazione diAlbert____

• peculriare per i corinebatteri (bacillo difterico)• la difterite era un tempo causa di morte per i bambini che morivano di collasso cardiocircolatorio,non per il batterio in se, che non è un bacillo invasivo (si ferma nella cavità orofaringea).l'esotossina del bacillo invade tutti i parenchimi: rene surrene fegato e cuore, che si sfianca e cessadi pompare.• la vaccinazione antidifterica è obbligatoria, è costituita da anatossina (o tossoide). cioè esotossina trattatacon calore che perde potere patologico ma mantiene il potere immunogenico.• esempio pratico: sospetta difterite; tampone faringeo, si colora il materiale con il metodo dialbert.• il bacillo difterico è caratterizzato dall'avere nel citoplasma dei granuli chiamati granulimetacromatici. la metacromasia è una caratteristica che possiedono alcuni batteri i quali hanno lacapacità di colorarsi in maniera diversa dal colorante adoperato. in questo tipo di colorazioneutilizziamo una miscela di blu di toluidina e verde di metile.• utilizziamo il reattivo di lugol come mordente in concentrazione doppia rispetto allacolorazione di gram• per il fenomeno della metacromasia i granuli citoplasmatici si coloreranno in violetto (viranoil blu al violetto per la metacromasia); mentre il corpo batterico si colorerà in verde pallido(sempre per la metacromasia).• oggi la difterite, grazie al vaccino obbligatorio, qui non esiste. eviteremo di parlarne, e ci dedicheremo adargomenti più attuali.• queste nozioni servono perchè molto spesso in passato il medico per salvare il bambino doveva ricorrere aduna tracheotomia, perchè a livello della trachea si formavano delle pseudomembrane dette CRUPT difterico,che impedivano la respirazione.____

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esame colturale____

• per fare diagnosi di malattie batteriche seguiamo sempre delle tappe: prelievo, esamemicroscopico (informazioni su morfologia, raggruppamento morfologico, caratteristiche tintorialiNON VITALITA); la seconda tappa è rappresentata dall'esame colturale.• dopo l'arrivo di materiale clinico dobbiamo approntare dei terreni di coltura per permettere albatterio causa della patologia di moltiplicarsi per studiarlo.• dobbiamo predisporre dei terreni validi per la crescita, altrimenti il batteri non crescerà mai.• i batteri hanno bisogno di fattori ambientali e di sostanze nutritive per crescere. in relazione allafonte di carbonio e di energia necessari per costruire le loro macromolecole i batteri possonoessere divisi in fotoautotrofo e fotoeterotrofi.• i fotoautotrofi utilizzano la luce solare come fonte di energia, e come fonte di carbonio l'anidridecarbonica• i fotoeterotrofi utilizzano come fonte di energia la luce solare, e come fonte di carbiono deicomposti organici• chemioautotrofi: utilizzano come sorgente di energia dei composti inorganici, fonte di carboiniol'anidride carbonica• chemioeterotrofi: utilizzano i composti organici come fonti sia di energia sia di carbonio• i batteri che hanno alte capacità biosintetiche, ma basse esigenze nutrizionali si accontentano diun terreno definito minimo. deve contenere acqua, azoto, fosforo e i vari metalli.• nei terreni di coltura dobbiamo sempre inserire delle fonti di carbonio (che generalmente èrappresentata dal glucosio, che funge anche da energia) una fonte di azoto (rappresentata dai salidi ammonio); una fonte di fosforo (per la biosintesi degli acidi nucleici) e dei metalli (rame ferromanganese magnesio) che servono ad attivare i sistemi enzimatici batterici: se non funzionano glienzimi i batteri non possono biosintetizzare nulla.• i batteri piu esigenti che partendo da questo terreno minimo non sono in grado di biosintetizzarele loro molecole hanno bisogno di terreni complessi, che contengono dei fattori di crescita ometaboliti essenziali;• i metaboliti essenziali sono delle sostanze che il batterio non è in grado di sintetizzare, edeve ricevere dall'esterno (vitamine, amminoacidi).• un'altra differenza nell'ambito dei terreni di coltura è una differenza dal punto di vista fisico:terreni liquidi e terreni solidi.• un esempio di terreno liquido è il brodo di carne. (anticamente si otteneva bollendo la carne,filtrandola, aggiustando il ph e aggiungendo il peptone , che è un derivato delle proteine. oraesistono i liofilizzati).• il principio del terreno liquido è che l'indice della coltura batterica è data dalla torbidità cheassume il liquido che all'inizio era limpido; non possiamo però sapere se si tratta di una sola speciebatterica o più specie.• per avere più informazioni bisogna trasferire questi batteri in un terreno solido.• il terreno solido utilizzato in laboratorio è l'agar nutriente: passa in funzione della temperaturadallo stato solido a quello liquido. sopra i 45° è fluido, non si può utilizzare come substrato per ibatteri. sotto i 45° si può utilizzare per colture.• l'agar di per ser non ha funzioni nutritive, è un polisaccaride solforato, diventa nutriente quandosi aggiunge il brodo.• l'agar nutriente si ottiene aggiungengo al brodo il 2% di agar (un polisaccaride). l'agar imprigionail brodo nutriente costituendo un substrato sia nutriente che solido.• nell'agar nutriente abbiamo la formazione di colonie.• dalle colonie, a seconda della loro colorazione e della loro morfologia possiamo risalire alle variespecie batteriche.• a seconda delle esigenze batteriche utilizziamo dei terreni complessi.• un esempio di terreno complesso è l'agar sangue.si ottiene aggiungendo all'agar nutriente il2-5% di sangue di montone o di coniglio.• questo si utilizza per la maggior parte dei batteri esistenti (monococchi, streptococchi,stafilococchi).• se aumentiamo la temperatura dell'agar sangue, per poi riportarla sotto i 45°, otteniamo ilcosiddetto sangue cotto, o agar cioccolato (per la caratteristica colorazione); in questa manieraavviene la lisi di globuli rossi per avere più emoglobina disponibile.• terreno chimicamente definito: terreno di cui conosciamo l'esatta composizione chimica delle sostanze, eviene adoperato per studiare il metabolismo dei batteri____

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terreno ditrasporto____

• se vogliamo trasportare in laboratorio materiale clinico, per il mantenimento di germi vividobbiamo utilizzare un terreno di trasporto, per mantenere le reciproche concentrazioni di batteripresenti, ne mantengo soprattutto la vitalità, non permettendo la loro moltiplicazione.• il trasporto è caratterizzato dall'assenza di fattori di crescita, di soluzioni saline tampone.altrimenti le colonie si moltiplicherebbero, e non possiamo più utilizzare le specie che ciinteressano____

terreno diarricchimento____

• il terreno di arricchimento è liquido, e ha lo scopo, partendo da un materiale polimicrobico, diisolare solo una specie.• ESEMPIO: tifo addominale - dobbiamo ricorrere deal terreno di arricchimento, per far aumentarela popolazione solo dei batteri patogeni, e che lasci inalterata la popolazione di latri batteriintestinali.• il terreno di arricchimento in questo caso è rappresentato dal brodo nutriente al selenito disodio.• in questo terreno manteniamo costanti le concentrazioni degli altri germi presenti (che fannoparte della popolazione microbica intestinale) e privilegiando la crescita logaitmica dei batteripatogeni che vogliamo isolare.____

terreno selettivo____

• è un terreno solido, che ci consente di isolare alcune specie patogene svantaggiando lacrescita di batteri concomitanti o contaminanti.• se io voglio isolare da un campione di feci una salmonella tiphi, devo ricorrere ad un terreno diarricchimento (che è liquido) e ad un terreno selettivo (che è solido).• sia terreno di arricchimento che terreno selettivo hanno funzione selettiva in quanto favoriscono solo unaspecie determinata.• il tereno selettivo per salmonella e shighella (detto terreno SS) è costituito da sali biliari(eliminano i batteri gram positivi), lattosio (che viene fermentato SOLO da batteri non patogenicome proteus o e.coli), un indicatore del pH (il rossofenolo) e dei sali di piombo: questi sonoimportanti perchè la salmonella tiphi ha la capacità di formare il solfuro di idrogeno. questo saleinteragisce con i sali di ferro o piombo, precipitando in solfuro di piombo o di ferro, econferendo alle colture di samonella un colore nerastro. in questo modo potremmo identificarele colonie incolore di shighella e le colonie nere di salmonella.• in questi tipi di terreni non abbiamo altri batteri oltre quelli per cui si creano situazioni idoneeper la crescita (per questo è detto terreno selettivo).• il terreno di Saboureaud è un tipo di terreno selettico che consente la crescita dei micetilievitiformi o filamentosi escludendo i batterio perchè contiene un alta concentrazione diglucosio e un pH molto acido intorno a 4,5 - 6. (il ph ottimale per i batteri è 7.2 - 8, un ph cosìbasso favorisce l'uccisione dei batteri).____

terrenodifferenziale____

• è un terreno che consente in laboratorio di discriminare tra i batteri lattosio-fermentanti e nonfermentanti (funge anche da terreno selettivo)• il terreno differenziale più utilizzato in microbiologia è il terreno Mac Conkey.• uso questo terreno se parto da un materiale polimicrobico e devo capire se i batteri che ho isolatofermentano il lattosio (quindi non patogeno) o non lo fermentano (patogeni).• in questo terreno lo zucchero chiave è il lattosio, bisogna anche usare un indicatore di ph ( ilrossoneutro, che tingerà le colonie in presenza di bassi pH), dei sali biliari (che inibiscono lamoltiplicazione di gram-positivi).• se il batterio fermenta il lattosio si ha produzione di acido, perciò le colonie si coloreranno dirosso.• se il batterio non fermenta il lattosio le colonie saranno incolore.• questo può fungere anche da terreno selettivo perchè la presenza di sali biliari elimina i grampositivi.____

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terreno per glianaerobi____

• sono detti anaerobi i batteri che cerescono in assenza assoluta di ossigeno.• in questi terreni vanno inserite delle sostanze riducenti come la cistenia, l'emina, tioglicollato cheallontanano l'ossigeno.• Metodo microbiologico.• Il terreno tioglicollato fluido è stato allestito da Brewer per la coltura rapida di anaerobi e aerobi.• Il peptone di caseina è stato aggiunto da Vera nel 1944.• Il terreno sostiene un buon livello di crescita per numerosi organismi, inclusi gli anaerobi stretti,• senza incubazione in atmosfera anaerobica. Il tioglicollato di sodio, oltre a ridurre il potenziale diossidoriduzione, è in grado di neutralizzare l’attività antibatterica dei composti del mercurio.• Queste caratteristiche rendono l’FTM particolarmente utile per stabilire la presenza di contaminanti neimateriali biologici e di altro tipo. Questa formula, grazie alla sua capacità di stimolare la crescita, è stataadottata dalla farmacopea statunitense (USP), dall'AOAC e dalla farmacopea europea (EP) per i test disterilità e come terreno di arricchimento.• Il terreno tioglicollato fluido è ampiamente usato in microbiologia clinica anche come arricchimento, inparticolare per i campioni prelevati da siti corporei normalmente sterili.• BD Fluid Thioglycollate Medium, avendo un basso potenziale di ossidoriduzione, non è il terreno di scelta pergli aerobi stretti, ad es. non fermentanti, Micrococcus e organismi simili.• Per questi organismi, utilizzare Tryptic Soy Broth o brodo di infuso cuore-cervello.• BD Fluid Thioglycollate Medium contiene glucosio, peptone ed estratto di lievito, che forniscono i fattorinecessari per la crescita batterica. Tioglicollato di sodio e L-cistina sono• agenti riducenti che impediscono l’accumulo di perossidi, che risultano letali per alcuni microrganismi. Laresazurina è un indicatore di ossidoriduzione che vira al rosa se viene• ossidata, mentre appare incolore se viene ridotta. Il piccolo quantitativo di agar contribuisce a tenere bassoil potenziale di ossidoriduzione, stabilizzando il terreno rispetto alle correnti di• convezione, per mantenere l’anaerobiosi negli strati più profondi del terreno. Spesso il terreno tioglicollatofluido appare lievemente opaco per il suo contenuto di agar. Durante l'allestimento, questo terreno prontoall'uso viene sottoposto a un getto di azoto, che scolora l'indicatore resazurina. Il terreno, tuttavia, può essereutilizzato finché non viene ossidato per circa il 30% (strato superiore), come indicato dalla colorazione rosadella resazurina in prossimità della superficie. Se l’ossidazione ha superato tale livello, il brodo può essereriscaldato una volta a vapore o in acqua bollente, raffreddato e utilizzato.• La farmacopea statunitense permette la presenza di acqua nel glucosio (destrosio) e quindi include 5,5grammi nella formula.• Poiché la presenza di umidità è nociva per il terreno disidratato, viene aggiunto un quantitativo equivalentedi glucosio in forma anidra.• quando dobbiamo processare un materiale anaerobio è opportuno operare sotto cappe con flussolaminare, dove l'ossigeno viene sostituito con un gas inerte, che è l'azoto.____

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condizioniambientali____

• se incubiamo il materiale biologico in condizioni non idonee non avremo mai formazioni dicolonie.• i fattori ambientali essenziali sono: la temperatura, l'ossigeno, il pH, l'umidità, la pressioneosmotica.• TEMPERATURA: tutti i batteri hanno un range tdi temperatura all'interno del quale c'è unoptimum al quale crescono. questo optimum è molto vicino al limite superiore di tolleranza (limitedi tolleranza: se aumentiamo la temperatura oltre il limite di tolleranza gli enzimi vengonodegradati, e i batteri non crescono).• in funzione del comportamento dei batteri in funzione della temperatura li distinguiamo inpsicrofisi, mesofili e termofili• gli psicrofili crescono a temperatura da 0 a 20 gradi centigradi. anche a -7 gradi. si trovanonei oceani, nelle zone polari e nei cibi refrigerati o congelati. sono detti psicrofili perchè sonoamanti del freddo. questi non sono patogeni per l'uomo, ma possono contaminare gli alimenti• i mesofili crescono dai 20 ai 40 con un optimum di 37°C. questi sono patogeni per l'uomo• i termofili crescono ad alte temperatura 50 - 90 gradi. anche a 250°C. si trovano in acquetermali, in sorgenti di vapore. la loro termostabilità diende dalla sequenza e composizione inamminoacidi dei loro enzimi. la sequenza degli amminoacidi è responsabile della comparsa dilegami forti, o legami a H, o altri legami deboli, che stabilizzano la struttura delle proteine.• i termofili non possono crescere a temperatura ambiente; e i mesofili non a temperature basse.MA siccome la maggior parte dei batteri che contamino gli alimenti, un abbassamento delletemperatura evita una contaminazione dei cibi.• le basse temperature generalmente non uccidono i batteri, ma bloccano la loro crescita. tornandoperò in condizoni favorevoli riprendono la loro crescita.• ESEMPIO: meingococco: molto sensibile anche alle basse temperature, anche quelle di frigorifero:non le sopporta perchè va in lisi. il materiale va processato subito, non può essere conservato,altrimenti il batterio può perdere la sua vitalità e non può essere studiato. ci sono dei mesofili chein presenza di temperature intorno i 50°C muoiono.• OSSIGENO ATEMOSFERICO: nei processi di respirazione, gli accettori finali di idrogenioni sonomolecole di ossigeno. alcuni batteri fanno a meno dell'ossigeno per la produzione di energia: fannouso della fermentazione. in questo modo usano invece dell'ossigeno un composto organico oinorganico come recettore finale di idrogenioni.• gli aerobi obligati sono il micobacterioum tuberculosis, che cresce solo in presenza di ossigeno.• gli anaerobi obbligati non tollerano l'ossigeno perchè mancano dell'enzima catalasi. questoserve a scindere il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno. quindi l'acqua ossigenata che siaccumula in processi metabolici si accumula, e la sua tossicità li uccide.• gli aerobi e anaerobi facoltativi possono crescere in persenza o assenza di ossigeno. peròcrescono sicuramente meglio in presenza di ossigeno ricorrendo quindi alla respirazione.• in fine i microaerofili crescono a basse tensioni di ossigeno e gradiscono un elevataconcentrazione di anidride carbonica (fino al 10%).• ESEMPIO: gonococco e meningococco, e l'agente eziologico della brucellosi Brucella Maelithensis.• per favorire la crescita degli anaerobi, questi devono essere incubati in particolari strutture dettegiare o GAS PAK. in questi vi è del palladio, un generatore di idrogeno (che elimierà l'ossigenointeragendo con esso e formando acqua). delle cartine imbevute di blu di metilene, che sono unindicatore di anaerobiosi: inizialmente sono azzurre, quando non vi sarà più ossigeno le cartinediventeranno bianche, e allora potremo incubare le piastre.• pH: tutti i batteri hanno un optimum di pH. per la maggior parte dei patogeni è intorno laneutralità: 6.8 - 7.2 ; il vibrione del colera ha un optimum di 8-10; i lieviti e le miceti hanno un pHpiu basso.• nei terreni di coltura bisogna tenere il pH costante, perchè durante le attività metaboliche vi è unaumento di pH. quindi abbiamo bisogno di sostanze tampone: fosfato monobasico di potassio efosfato bibasico di potassio, che mantengono il valore di pH il più possibile costante• UMIDITA': l'acqua del terreno non deve trovarsi legata, ma deve essere libera in maniera chepossa essere usata dal batterio nei processi metabolici.• ESEMPIO: agar 2% costituisce substrato solido ma contiene acqua libera; agar 15% costituiscesubstratosolido ma trattiene tutta l'acqua• PRESSIONE OSMOTICA: ha un valore importantissimo perchè l'acqua tende a passare da unmezzo ipertonico a uno ipotonico. se non vi fosse la parete tutta l'acqua dei terreni di colturapasserebbe dentro al batterio causando lisi. però vi sono batteri, come i lieviti, che sopportano alteconcentrazioni di zucchero, ma non sopportano alte concentrazioni di sali. al contrario gli alofilisopportano alte contentrazioni di sali. se vogliamo coltivare batteri come i micoplasmi, che nonhanno parete, dobbiamo utilizzare delle soluzioni per evitare la lisi data dall'osmosi____

Microbiologia - Miceti PROF MILICIMarch 28, 2012

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Microbiologia - Miceti PROF MILICIMarch 28, 2012

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generalità____

• struttura eucariotica, è quindi una cellula superiore. presenta un nucleo e sistemi vescicolaripresenti in una normale cellula superiore. hanno anzi una peculiarità rispetto ad una cellulasuperiore.• i miceti sono molto diffusi nell'ambiente esterno possono essere unicellulari o pluricellulari.• sono immobili, si riproducono per mezzo di spore, che hanno un significato diverso dalla sporabatterica: la spora batterica ha un significato di resistenza, le spore fungine hanno significato ditipo sessuale, infatti possono essere agamiche o sessuali.• i saprofiti sono delle specie fungine ambientali; altre specie possono essere patogene sia perl'uomo che per gli animali e i vegetali.• la micologia medica è la branca della microbiologia che si occupa dei miceti patogeni• i miceti causano i cosiddetti avvelenamenti che sono dovuti a ingesione di miceti macroscopici,micotossicosi dovute all'ingestione di sostanze tossiche elaborate da alcune specie fungine(Aspergillus flavus), forme allergiche, che sono secondarie ad una precedente esposizione adantigeni fungini (aspergillosi polmonare allergica), e le micosi che sono dovute alla penetrazione,colonizzazione e invasione dei tessuti viventi.• le micosi (malattie da funghi) si dividono in micosi superficiali, micosi cutanee, micosi delsottocutaneo, micosi sistemiche.____

cellula fungina____

• Nucleo circondato da una membrana molto porosa.• il numero di cromosom è difficile da determinare, ed è studiato solo nella candida albicans enell'aspergillus fumigadus (un lievito e una muffa) e sono 8.• questi 8 cromosomi sono stati determinati tramite elettroforesi in campo pulsato. anche conqueste metodiche molto raffinate la loro determinazione risulta difficile per la produzione dibande diverse da parte di cromosomi omologhi.• il RE presenta delle vescicole che sono addossate alla membrana nucleare;• l'apparato del golgi presenta delle lamelle che sono in prossimità di invaginazioni dellamembrana citoplasmatica• anche i mitocondri sono diversi da quelli delle cellule superiori, in quanto possono avere formaallungata o sferica, presentano DNA, e i vacuoli citoplasmatici posseggono pigmenti e materialenutritivo, soprattutto glicogeno.• ma la struttura peculiare della cellula fungina è la parete, che differisce da quella batterica.____

parete fungina____

• il componente fondamentale è la chitina, un polimero della n-acetilglucosammina, con legamibeta 1,4-glucosidici.• può essere unita a quote variabili di glucani (polimeri di glucosio) mannani (polimeri did-mannosio), lipidi e proteine.• le protenie, grazie a residui di cisteina, e formazione di legami S-S contribuiscono alla solidità diquesta parete.• in alcuni miceti (zigomiceti) avremo anche il chitosano. che è un polipeptide, polimero dellad-glucosammina.• durante la fase di accrescimento la parete subisce varaizioni qualitative e quantitative deicomposti: si può considerare una struttura dinamica.• queste cambia di forma e dimensione, e quindi occorre l'intervento di parecchi enzimi che sonosia idrolitici che biosintentici: abbiamo infatti delle glucanasi, e glucano sintetasi, e chitinasi echitino sintetasi.• la funzione della parete, analogamente a quella batterica, conferisce la morfologia alle cellule,inoltre, grazie alla presenza dei mannani, aderisce alle mucose e ai tessuti dell'ospite (è quindiresponsabile de''adesività).• ha delle caratteristiche antigeniche sempre grazie ai mannani, e inoltre modula la rispostaimmunitaria si a umorale che cellulo-mediata.____

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membrana fungina____

• la membrana fungina si differenzia da quella degli eucarioti superiori per la mancanza dicoleresterolo;• in sostituzione abbiamo l'ergosterolo: struttura tristratificata che regola gli cambi metabolici tracitoplasma e ambiente extracellulare.• in oltre contiene enzimi importanti per la biosintesi della parete fungina.• membrana, che è molto spessa, dall'esterno verso l'interno troviamo:• strato fibrillare• mannoproteine• i glucani• uno strato di glucanochitina• uno strato di mannoproteine di composizione diversa da quello precedente.____

strutturafacoltatova____

• l'unica struttura facoltativa dei miceti è la capsula• la capsula quali miceti la posseggono?• in alcuni miceti, oltre alla parete sempre presente nei funghi, abbiamo una struttura accessoria dinatura polisaccaridica i cui componenti fondamentali sono i galattomannani e un altropolisaccaride detto glucuronoxilomannano.• l'unica specie fungina che possiede la capsula è il Cryptococcus neoformans. la capsula si coloracon colorazione negativa con nero di china.____

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Corpo cellulare____

• il corpo di qualsiasi micete, unicellulare o pluricellulare prende il nome di tallo.• del tallo funginoesistono diverse varietà morfologiche utili per l'identificazione della specie.• i miceti hanno unamorfologia molto varia. il corpo tallofungino è costituito da elementi tubularichiamati IFE. le ife hanno diametro sempre uguale o superiore ad un micron.• questo serve a distinguerli dalle microife di alcuni batteri il cui diametro è sempre minore di unmicron.• le ife possono avere una cavità unica, e vengono dette IFE CENOCITICHE. Alcune IFE ossonopossederepiù cavità, dette setti, e vengono chiamate IFE SETTATE. anche nelle ife settate, il liberoscorrimento di sostanze, quali il citoplasma o acidi nucleici, da una cellula all'altra avviene graziead un poro che si trova nella parte centrale di ogni setto.• le ife settate possono essere mononucleate o plurinucleate.• le ife crescono in senso apicale, e man mano che crescono si intrecciano tra loro e costituiscono ilcosiddetto micelio. il micelio è un insieme di ife intrecciate tra loro.• in ogni colonia fungina, sia in ambiene naturale che in coltura distinguiamo due tipi di micelio:• micelio aereo: a contatto con l'aria e deputato alla riproduzione della specie fungina perhcècontiene spore sia gamiche che sessuali• micelio vegetativo immerso: a contatto con il substrato, ha una funzione trofica, cioè serve adassumere le sostanze nutrive.• i miceti che presentano IFE VERE ed un MICELIO VERO vengono detti miceti filamentosi, o muffe:ad esempio l'asperggilus, il penicillus, i dermatofiti (responsabili di malattie cutanee).• le muffe del pane, dei formaggi appartengono a questo gruppo perchè sono caratterizzate da unmicelio vero e ife vere.• un secondo gruppo di miceti è rappresentato dai lieviti, o miceti lievitiformi, che presentanocorpo unicellulare. ogni cellula ha forma ovale o rotondeggiante.• le cellule dei lieviti sono chiamate blastospore o blastoconidi perchè si riproducono pergemmazione.• quando le blastospore gemmano, formano delle lunghe catene che prendono il nome dipseudoife, che si differenziano dalle ife vere, perchè ogni cellula che costituisce la pseudoifa, hauna sua autonomia e non comunica con la cellula contigua.• le pseudoife presentano dei restringimenti tra una blastospora e l'altra.• questa scarsa connessione tra le pseudoife è causa della rottura di queste, dando luogo allesingole blastospore che le costituivano.• molto spesso l'operatore al M.O. ha difficoltà nella distinzione delle ife vere dalle pseudoife.• però possono essere distinte grazie al fatto che solo le pseudoife presentano restringimenti tra leblastospore; che nelle pseudoife nei punti di giunzione si formano dei grappoli di blastospore; ementre le ife vere hanno delle cellule terminali che sono più grandi delle precedenti, nellepseudoife le cellule terminali sono uguali o più piccole rispetto le altre.• le pseudoife non si formano mai nelle muffe. i lieviti non sviluppano mai un micelio aereo perchèsviluppano pseudoife, che si sfaldano in blastospore, non riuscendo a crescere.• esempio di miceti lievitiformi: Candida (pur essendo un lievito, soltanto nella Candida albicanspossiamo avere le ife vere. vive nel nostro organismo, si trova nel cavo orofaringeo, nelle mucosevaginali e gastrointestinali.esso è detto opportunista perchè diventa patogeno quando si èsottoposti a terapia cortisteroidea, nei portatori di protesi dentarie, lunga somministrazione diantibiotici, gli emodializzati, i portatori di cateteri); Malassetia furfur (micete che da quelle lesioniche sono localizzate al livello di decolleté e si vedono soprattutto in estate. PTIRIASIS VERSICOLOR.vive da commensale nella cute. analogamente alla candida, questo micete da commensale sipresenta come blastospore a grappolo d'uva. quando si presenta patogenico avremo lacontemporaena presenza di blastospore e pseudoife. la compresenza di questi due fattori èsufficiente per diagnosticare la virulenza di questo micete. è indotto virulento da diversi fattoricome la gravidanza, l'eccessiva sudorazione, non è contagiosa).• esempio: in seguito a vaginite si fa tampone vaginale e dopo osservazione si vedono blastospore.ci si deve preoccupare? no, perchè essendo un commensale, le spore devono si trovanonormalmente in basse quantità. bisogna notare se ci si presentano pseudoife o ife vere, indice divirulenza per la candida. quindi bisogna coltivare il materiale e vedere se la carica di candida èelevata. altrimenti, se vi sono poche colonie è normale: la candida è un commensale del nostroorganismo. la candida diventa virulenta perchè vi sono dei fattori che permettono il passaggiodalla fase di commensalismo alla fase di parassitismo.____

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miceti dimorfi____

• costituiscono un altro gruppo di miceti, che sono caratterizzati da una duplice morfologia:lievitiforme e filamentosa o in relazione alle condizioni ambientali, o meglio in rapporto all'azionepatogena che essi svolgono.• un esempio di micete dimorfo ci è Histoplasma capsulatum. Non ha una capsula, ma perchè il primoricercatore che l'ha isolato, per artefati di colorazione che simulavano una capsula, lo ha cihamatocosì.• questo fungo, nell'ambiente esterno, da saprofita, si presenta come una muffa, ed è caratterizzatoda ife settate, da micronidi (gli elementi infettanti), e macroconidi (dette anche aleurie) chehanno una forma rotondeggiante, una parete molto spessa, e delle protrusioni radiali.• in vivo, quando il micete da malattia (malattie molto gravi, letali) si presenta sotto forma dilievito.• un'altro esempio di dimorfismo è dato dal Coccidioides Immitis questo micete, in ambiente esternosi presenta sotto forma di ife settate, e artroconidi (o artrospore) che sono gli elementi infettanti.• in vivo, si presenta sottoforma di lievito, e più precisamente da delle sferule di formarotondeggiante, che sono dei lieviti.• N.B. la candida, ma massetia sono dei lieviti, ma molto spesso li definiamo ERRONEAMENTE dimorfiperchè da commensali diventano patogenici. il dimorfismo per questi due microorganismi riguardasolamente la natura patogenica.____

metabolismo deimiceti____

• i miceti sono eterotrofi, e per costruire le loro macromolecole devono degradare sostanzeorganiche.• sono aerobi o anaerobi facoltativi, non esistono in natura miceti anaerobi obbligati, per cuipossono sia respirare che fermentare.• come fonte di carbonio usano i composti organici, possono assimilare o fermentare molticomposti. queste prove di assimilazione e fermentazione vengono utilizzate per identificare lespecie funghine in laboratorio.• la Co2 viene solo fissata, e non utilizzata come fonte di carbonio.• come fonte di azoto usano nitrati o ammoniaca• come fonte di fosforo utilizzano fosfati, e per lo zolfo utilizzano solfati.• gli studi sul metabolismo dei miceti non sono ancora completi, ma sappiamo che le sostanzeliposolubili penetrano nella cellula fungina per diffusione passiva. le sostanze idrosolubilipenetrano attraverso pori che si trovano sulla membrana e sono trasportati da carrier proteici,mentre gli amminoacidi e gli zuccheri penetrano per trasporto attivo, per cui c'è dispendio dienergia da parte della cellula.• il trasporto degli amminoacidi è complesso, ed è finemente regolato dagli ioni ammonio degliamminoacidi stessi. in particolare controllano gli enzimi metabolici, e molto spesso reprimono isistemi di controllo.• per quanto riguarda i miceti dimorfi si è visto che l'eterotrofia è maggiore nella fase diparassitismo; e durante il trasporto di amminoacidi si evidenzia ancora di più il loro cambiamentomorfologico (da muffa a lievito o vicecersa).• i miceti si riproducono per mezzo di spore, sono corpuscoli che originano dal tallo, e sono ingrado di riprodurre la specie fungina purchè siano presenti adeguate situazioni nutrizionali edambientali.• i due tipi di riproduzione, sessuale ed agamica, si alternano in ogni specie fungina con ritmo efrequenza diversi a seconda della specie.• avviene nei funghi imperfetti (perchè usano spore dette spore imperfette).• le spore agamiche, o imperfette, non differiscono morfologicamente dalle altre cellule del corpofungino.• a seconda che siano prodotte da ife specializzate del corpo fungino, chiamate conidiofori, oda ife vegetative comuni del corpo fungino: prendono il nome rispettivamente di conidi etallospore.____

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riproduzioneagamica medianteconidi____

• i conidi si formano per gemmazione dal conidioforo, il conidio si forma sempre all'apice delconidioforo.• il conidio può essere singolo, o può essere raggruppato lassamente o compattamente. quandosono compatti prendono il nome di effluorescenze, mentre quando sono lassi prendono il nomedi capitoli.• molto spesso possono essere raggruppati a formare delle catenelle, il cui elemento più giovane èa contatto con il conidioforo, dato che si forma sempre per gemmazione.• in altre specie il primo deriva per gemmazione dal conidioforo, e i successiviche si formano,nascono sempre dai precedenti, per cui il più giovane è quello distale.• in altre specie fungine i conidi si formano con madiltà diversa: si differenziano dentro cellule digrosse dimensioni;• nel primo caso si differenziano in cellule chiamte fialidi (perchè hanno forma di fiala), il fialidepuò essere singolo o raggruppato insieme ad altri formando figure molto eleganti, complesse adesempio il genere penicillium; mentre se i fialidi si raggruppano in maniera compatta hannoconformazione tipica il genere aspergillum.• quando queste fialospore giungono a maturazione si riversano all'esterno, perchè si liberanodalla porzione apicale del fialide. l'aspergillus è un micete opportunista: da delle patologie quandole difese immuitarie sono compromesse (aspergillosi polmonare invasiva, aspergillosi polmonareallergica, aspergilloma). prima questi miceti erano considerari dei semplici contaminanti, ma oggihanno assunto un ruolo fondamentale in alcune patologie come le micosi delle unghia.• gli zigomiceti sono specie fungine che danno affezioni rinocerebrali molto spesso mortali lezigomicosi, causate dagli zigomiceti, difficili da diagnosticare.negli zigomiceti le spore, o conidi, sifidderenziano all'interno di una grossa cellula di forma rotondeggiante di nome sporangio, e lespore che vi crescono vengono dette sporangiospore.• lo sporangio si trova all'estremità di lunghe ife cenocitiche non settate [quando vedo ife cenocitichecon formazione rotondeggiante capiscono che si tratta di spore di zigomiceti, e sono molto pericolose]• quando le sporangiospore diventano mature si riversano all'esterno grazie alla lisi della paretedello sporangio.____

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riproduzioneagamica mediantetallospore____

• a seconda della modalità di formazione le tallospore sono divise in:• blastospore, derivano per gemmazione da un altra blastospora (si parla quindi di lieviti), oeccezionalmente da una pseudoifa, o ancora meno frequentemente da una cellula terminale di unifa vera.la gemmazione delle blastospore avviene la migrazione del nucleo dalla cellula madre allacellula figlia, ingrossamento della gemma, fino al raggiungimento di dimensioni analoghe a quelledella cellula madre, e in fine distacco della gemma per rottura della giunzione.• artrospore sono spore di forma rettangolare definite da alcuni autori "spore a barella", derivantida frammentazione di ife settate, o per dissoluzione di cellule intercalari prive di citoplasma.questa seconda modalità è tipica del Coccidioides Imitis. Le endospore rappresentano il mezzo diriproduzione del C.Immitis. Questo presenta infatti riproduzione mediante endospore eartospore.• endospore: questo micete si forma sotto forma di lievito, e darà delle cellule di piccoledimensioni chiamate sferule immature, all'interno delle quali le endospore si formano per unprocesso di divisione nucleare, addensamento del citoplasma, neosintesi della parete etrasformazione in cellule di maggiori dimensioni chiamate sferule mature. anche in questo caso,quando le endospore sono mature si liberano per lisi della membrana, andando a contaminare altritessuti.• aleurie sono spore agamiche, facilmente confondibili con i conidi, ma adifferenza dei conidi chesi formano dai conidiofori per gemmazione, le aleurie si formano per rigondfiamento otrasformazione di cellule terminali del corpo fungino; di conseguenza non vengono eliminatifacilmente, ma si staccano soltanto in seguito alla rottura dell'ifa portante. dal punto di vistadiagnostico sono molto importanti le auleurie unicellulari, tipiche dell'Histoplasma capsulatum,e aleurie pluricellulari, tipiche dei dermatofiti• clamidospore hanno la funzione delle spore batteriche, si formano quando le condizioniambientali diventano sfavorevoli alla sopravvivenza del micete: mancanza di sostanze nutritive,alterazione di ph, temperatura ecc. hanno forma rotondeggiante, parete molto spessa e si formanoin posizione apicale o intercalare di ife o pseudoife. quindi possiamo reperirle sia nei micetifilamentosi che lievitiformi. queste strutture hanno anche esse un valore diagnostico, perchèquando le troviamo in un lievito pensiamo subito alla Candida albicans o dubliensis, se le troviamo inmiceti filamentosi pensiamo ai dermatofiti dal punto di vista metabolico le clamidospore sonomolto lente, venivano definite spore dormienti. come facciamo a indurre la produzione diclamidospore in vistro? coltiviamo il micete in un terreno povero all'amido di riso o farina di mais,e grazie ad un vetrino coprioggetto, creiamo una parziale anaerobiosi. nel giro di 7-8 giornipossiamo trovare all'esame microscopico la presenza di clamidiospore. se troviamo questestrutture possiamo pensare sia alla candida albicans che dubliensis. come faccio a capire qualecandida è a produrre queste spore? possiamo capirlo attraverso saggi biochimici di fermentazione.____

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riproduzionesessuata____

• questo tipo di riproduzione ci aiuta nella tassonomia. infatti quelli che non hanno riproduzionesessuale sono detti imperfetti.• la spora sessuale deriva da fusione di due gameti, o da organuli del tallo fungino, che producono igameti e che vengono detti gametangi.• sia i gameti che i gametangi possono essere uguali per forma e dimensione e li chiamo quindiomogameti o omogametangi. possono essere diversi per forma e dimensione e verranno quindichiamati eterogameti po eterogametangi.• in ogni caso la spora si forma in 3 fasi:• plasmogamia: fusione di gameti o gametangi di segno opposto. in genere il gamete maschileviene indicato con il segno + e quello femminile con il segno -.• cariogamia: dalla spasmogamia origina lo zigote, l'unica cellula dipoide del micete, perchè tutti imiceti hanno un corpo aploide.• meiosi riduttiva: avviene solo dopo la formazione dello zigote.• abbiamo 3 forme di spore sessuali che caratterizzano 3 classi: zigospore (degli zigomiceti, cheusano anche riproduzione agamica, quindi sono miceti perfetti); le ascospore, che appartengonoagli ascomiceti, e le basidiospore caratteristiche dei basidiomiceti.• le zigospore si formano dall'unione del gametangio maschil,detto anteridio, e del gametangiofemminile, detto ascogonio. successivamente si ha cariogamia e meiosi riduttiva. per cui avremouna spora scura e bernoccoluta. dopo si formerà uno sporangio, perchè negli zigomiceti abbiamosia la riproduzione agamica che sessuata.• le ascospore, caratteristiche degli ascomiceti (tutti i dermatofiti e alcune specie di aspergillus.quindi anche questi possono usufruire di riproduzione sia sessuata agamica che sessuata). ilgametangio maschile si chiama anteridio, e ascogonio quello femminile. nella plasmogamia si hal'unione dei due gametangi, lisi della parete divisoria e trasferimento dei nuclei dall'anteridioall'ascogonio. dall'ascogonio fecondato si formano delle ife ascogene settate binucleate. questa èla fase di dicarion. la cariogamia, con la successiva meiosi riduttiva avvengono nella penultimacellula delle ife ascogene settate, la quale si trasformetà in un asco contenente 4 ascospore mature.se avverrà una mitosi il loro numero sarà portato a 8.• le basidospore sono spore che si formano per l'unione o plasmogamia di due micelimononucleati che fungono da gameti. quando due miceli mononucleati vengono a contatto tra diessi avviene uno scambio di nuclei, per cui si formerà un micelio secondario binucleato (fase dibicarion). la cariogamia e la successiva mitosi riduttiva avverranno nell'ultima cellula del miceliosecondario binucleato. in essa, che aumenterà molto di volume, appariranno protuberanzeall'interno delle quali migrano i nuclei che provengono dalla meiosi riduttiva. alla fine avremo unbasidio contenente 4 basidiospore mature. se ci sarà nua mitosi avremo un basidio con 8basidiospore. il Criptococcus neoformans è un basidiomicete, l'unico dei basidio miceti patologici perl'uomo.____

Microbiologia - Virus PROF MILICIMarch 30, 2012

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Microbiologia - Virus PROF MILICIMarch 30, 2012

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caratteristiche____

• sono molto semplici, e sono parassiti intracellulari obbligati. non hanno metabolismo autonomo edevono utilizzare necessariamente i meccanismi biosintetici della cellula ospite.• le loro dimensioni sono intono al nm. per cui non sono osservabili al microscopio ottico, per cuidobbiamo ricorrere al microscopio eletttronico.• i virus possiedono un solo tipo di acido nucleico: dna o rna. mai entrambi.• dna o rna funzionano come depositari dell'informazione genetica, per cui il virus può replicarsinella cellula, può trasferire il suo genoma da una cellula all'altra e può replicare le suemacromolecole, sempre servendosi degli apparati della cellula ospite.• una prima distinzione dei virus si può fare caratterizzando:• virus nudi che hanno l'acido nuclei dna o rna circondato da un involucro proteico che prende ilnome di capside. il capside ha quuindi il compito di proteggre l'acido nucleico. il calside ècostituito da subunità proteiche chiamate capsomeri; acido nucleico + capside = nucleocapside;• possiamo caratterizzare anche i virus che oltre al nucleocapside posseggono un involucropericapsidico detto anche envelope. l'envelope è costituito da un doppio strato fosfolipidico diderivazione della membrana della cellula ospite. il virus maturo fuoriesce dalla membrana dellacellula infetta, e questo envelope conterra proteine di derivazione cellulare e glicoproteine virali.• queste funzionano da antirecettori: questi sono deputati all'ancoraggio della particella virale allamembrana della cellula ospite.• nei virus nudi, senza envelope, la funzione antirecettoriale viene affidata alle proteine delcapside.• i virus possono essere a dna o rna che codifica per proteine funzionali e strutturali. le proteinestrutturali faranno parte della struttura dei virus, mentre quelle funzionali servono per la loroduplicazione.• la scarsa capacità codificante dei virus soprattutto a rna impone che il capside sia formato dapochi tipi di proteine, addirittura, nei virus piu piccoli, il capside sarà costituito da un soo tipo diproteine.• le singole catene polipeptidiche del capside si possono legare secondo legami non covalenti inmodo tale da costituire due simmetrie: cubica o icosaedrica e una simmetria di tipo elicoidale.• nella simmetria di tipo icosaedrico le singole catene proteiche, dette capsomeri, sidistribuiscono tra di loro a costituire un guscio quasi sferico all'interno del quale si troveràl'acido nucleico. nella simmetria di tipo icosaedrico i capsomeri si ritroveranno sulla superficie diun icosaedro (un poliedro regolare costituita da 20 faccie e 12 vertici). i capsomeri dei verticihanno un'aspetto pentagonale e quindi vengono detti pentoni; mentre i capsomeri che si trovanosulla superficie dell'icosaedro hanno un profilo di tipo esagonale e sono chiamati esoni.• nella simmetria di tipo elicoidale le singole unità proteiche chiamate protomeri si dispongonosecondo un asse elicoidale che circonda l'acido nucleico che i trova all'interno assumendo unastruttura di tipo bastoncellare. in questa simmetria, invece, i singoli protomeri ragiscono tra loro econ l'acido nucleico contenuto all'interno, formando strutture rigide, come accade per esempio nelvirus del mosaico del tabacco, oppure strutture con rigidità minore (virus animali, soprattutto nelvirus influenzale, che è elicoidale).• i virus a dna hanno simmetria prevalentemente di tipo icosaedrico, mentre i virus a rna possonoavere sia una simmetria icosaedrica che elicoidale• fanno eccezione i pox virus, ai quali appartiene il virus del vaiolo, che hanno una simmetria moltocomplessa, non ben definita (da alcuni definita a mattone).• i virus possono essere a dna o rna e in entrambi i casi gli acidi nucleici sono depositaridell'informazione genetica, che codificano per proteine strutturali e funzionali alla replicazione.____

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virus RNA____

• possono avere rna bicatenario, anche se normalmente sono monocatenari.• l'rna può essere mono- o pluri-segmentato.• può essere a polarità positiva o negativa• lineare o circolare• i virus a rna rappresentano l'unico esempio in cui l'rna funziona da depositario dell'informazionegenetica.• i virus a rna a polarità positiva possiedono all'estremità 5' delle sequenze nucleotidiche ugualiagli rna messaggeri cellulari, per cui l'rna a polarità positiva funge direttamente da messaggero, esubito tradotto in proteine a livello ribosomiale.• i virus a rna a polarità negativa non possono fungere da messaggeri, e quindi devono codificareper una rna polimerasi rna dipendente adatto a trascrivere la molecola di rna in messaggeri.inquesti tipi di virus questo enzima non è frutto dell'attività trascrizionale del nucleo della cellulaospite, per cui il virus lo porta con se insieme al genoma nel momento in cui viene liberato nellacellula.• la rna polimerasi rna dipendente dei virus a rna a polarità POSITIVA viene sintetizzata nel cicloreplicativo, e farà parte delle proteine funzionali.• questa rna polimerasi rna dipendente non è un enzima fedele, in quanto puo compiere deglierrori. e ciò è responsabile dell'alta frequenza di mutazione e variabilità che caratterizza il virus arna.• i virus a rna a polarità positiva si caratterizzano per il fatto che il genoma si disgrega dalleproteine in maniera tale che possa essere tradotto a livello ribosomiale (in quanto funge damessaggero). ciò NON accade per i virus a rna a polarità negativa, in cui l'rna rimane associato alleproteine del capside durate tutto il ciclo replicativo.____

virus DNA____

• vengono classificati sempre in base alle caratteristiche dell'acido nucleico.• a parte i parvovirus (piccoli virus) che hanno dna mono catenario; e a parte gli epadnavirus (virusepatite b) che hanno un genoma parzialmente bicatenario;• i virus a dna hanno un genoma aploide bicateniaro, che può essere linare o circolare.• è lineare negli adenovirus, herpesvirus, parvovirus e poxvirus (virus vaiolo)• è circolare negli papillomavirus, e nei poliomavirus e anche negli epadnavirus (questi oltread averlo parzialmente bicatenario è circolare)• la complessità genetica dei virus in generale dipende dalla grandezza del dna: più grande è ilgenoma più complessi sono.• i virus con un piccolo genoma, come i parvovirus hanno una complessità genetica paragonabile aquella devi virus a rna. i virus di grandi dimensioni possono codificare anche per cento proteine.• a differenza dei virus a rna che si replicano in sede citoplasmatica, ad eccezione del virusinfluenzale (che pur essendo a rna ha una fase nucleare), i virus a dna usano polimerasi chetrascriptasi della cellula ospite. quindi sia la trascrizione che la replicazione dei virus a dnaavverrà in sede nucleare. fanno eccezione i poxvirus (che pur essendo a dna si replicano nelcitoplasma).• i virus a dna sono caratterizzati da una minore variabilità genetica, in quanto la dna polimerasidella cellula ospite è un enzima fedele, e se vi sono errori la polimerasi correttore di bozze licorregge.____

classificazionesecondo acidonucleico____

• virus a dna monocatenario• virus a dna bicatenario• virus a rna o dna con attività retrotrascrizionale• virus a rna mono segmentato• virus a rna plurisegmentato• virus a rna monocatenario a polarità positiva• virus a rna monocatenario a polarità negativa• viroidi e prioni____

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replicazione virale____

• affinchè un virus si possa moltiplicare in una cellula ospite per dare luogo a nuove particelle viraliè necessario che la cellula sia sensibile e permissiva• una cellula sensibile deve contenere i recettori attraverso cui il virus può legarsi grazie ai suoiantirecettori.• una cellula permissiva deve contenere tutti i meccansimi biosintetici adatti all'espressione delgenoma virale, e alla sua replicazione.• soltanto in questo caso il ciclo virale è definito produttivo: cioè si formeranno paticelle viralimature che fuoiriusciranno dalla cellula infetta.• può accadere che la cellula sia sensibile ma non permissiva, in questo caso il ciclo viene definitoabortivo; si può verificare quando il virus presenta dei difetti nella sua replicazione op quando lacellula non permette al genoma virale la sua completa espressione. alcuni virus, come il parvovirusp19 si replicano esclusivamente in cellule che si trovano in fase s, cioè quando tutti i meccanismicellulari adatti alla sintesi di dna siano presenti ed efficienti.• nel caso in cui il ciclo è restrittivo o abortivo si possono verificare tanti eventi:• persistenza del virus dento la cellula: in questo caso il virus va in latenza, il genoma virale siintegra con la cellula ospite, si può replicare ad ogni ciclo cellulare; o può rimanere nel citoplasmasotto forma di episoma. in questi casi la cellula può andare int rasformazione, evento durante ilquale alcune proteine precoci del virus possono interferire con proteine che regolano laproliferazione cellulare, e si ha quindi una trasformazione della cellula (cancerogenesi).• nel caso in cui la cellula è sensibile e permissiva si avrà un ciclo replicativo completo. le variefasi del ciclo sono:• prima fase: assorbimento• seconda fase: penetrazione• terza fase: scapsidamento• quarta fase: espressione e replicazione del genoma• quinta fase: maturazione• sesta fase: liberazione____

prima fase:ASSORBIMENTO____

• presuppone una compatibilità tra recettori cellulari e antirecettori virali.• i recettori cellulari sono rappresentati proteine (virus hiv usa il recettore cd4; alcuni echovirususano il recettore cd55);• i recettori possono anche essere di natura glicidica. e dato che la maggior parte dei virus usanorecettori glicidici, questi virus hanno un ampio spettro d'ospite (per spettro d'ospite si intende ilnumero di specie animali che risultano sensibili all'infezione da parte di un determinato virus. Es.:virus poliomelite ha uno spettro d'ospite ristretto, perchè infetta uomo e scimmie; il virus dellarabbia ha uno spettro d'ospite molto ampio perhcè infetta molte specie animali).• alcuni virus, oltre ai recettori della cellula ospite utilizzano per l'assorbimento una molecolasecondaria, detta co-recettore. per i virus con envelope gli antirecettori virali appaiono comeproiezioni che si dipartono dalla superficie della particella virale; per i virus nudi, un esempio chepossiamo fare è il poliovirus, gli antirecettori si ritrovano in rientranze che solcano la superficiedel virus. l'interazione recettore-antirecettore si traduce in un legame di tipo sterico; e affinchè laparticella virale venga ancorata stabilmente alal membrana della cellula ospite occore un ambientericco di ioni, che serve a neutralizzare le cariche elettriche presenti sulle superfici complementariin maniera tale da ridurre la repulsione elettrostatica. questo processo non richiede dispendio dienergia ed è indipendente dalla temperatura.• per alcuni virus l'assorbimento rappresenta una fase irreversibile, perchè se all'assorbimentonon segue la penetrazione il virus perde la capacità infettante. ad esempio, nel poliovirus,durante l'assorbimento può venire persa una proteina del capside, per cui l'acido nuleico risultasensibile all'azione delle proteasi e delle ribonucleasi cellulari.• per altri virus, se all'assorbimento non consegue la penetrazione la particella virale conserva lacapacità infettante: un esempio ci è dato dagli orthomixovirus (a cui appartiene il virusdell'influenza) sulla cui superficie vi è una glicoproteina con funzione enzimatica dettaneuroamilidasi, la quale scinde il legame tra virus e cellula ospite. in questo caso il virus che sistacca dalla cellula può andare a infettare altre cellule.• oltre alla modalità solita di assorbimento vi è un metodo mediato da anticorpi: la particella viraleche deve penetrare nella cellula verrà circondata da anticorpi specifici e catturata da recettoricellulari per immunoglobiline: questa infezione prende il nome di infezione anticorpo-mediata,caratteristica del virus HIV e del virus dell'influenza A.____

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seconda fase:PENETRAZIONE____

• la fase di penetrazione avviene in maniera diversa a seconda che si tratti di virus nudi o conenvelope.• nei virus con envelope la penetrazione avviene per fusione della particella virale con lamembrana citoplasmatica. questa fusione avviene grazie alla presenza di proteine fusogene chesi trovano sulla particella virale.• ricordiamo la gp41 del virus dell'HIV e la proteina ha2 del virus dell'influenza a. questaproteina viene attivata dal pH acido degli endosomi, infatti il virus dell'influenza A penetra per endocitosi. ela successiva fusione della membrana avviene con la membrana dell'endosoma.• i virus nudi penetrano per endocitosi.• nei poliovirus abbiamo un fenomeno insolito, nel senso che una proteina del capside deipoliovirus durante la fase di penetrazione provoca la formazione di un poro sulla membrana dellacellula ospite, per cui l'rna verrà introdotto direttamente nel citoplasma: non avremo l'ingressodella particella in toto, ma solo la traslocazione dell'acido nucleico a livello citoplasmatico.____

terza fase:SCAPSIDAMENTO____

• uan volta che il virus è penetrato nella cellula ospite deve liberare l'acido nucleico daicomponenti proteici e dal capside.• per alcuni virus lo scapsidamento avviene automaticamente, in altri avviene ad opera di enzimiproteasi cellulari, per altri ancora avviene ad opra di enzimi lisosomiali che vengono scaricatinel vacuoli fagocitari.• una volta che il genoma si è liberato dai suoi costituenti che lo circonda può rimanere nelcitoplasma o raggiungere il nucleo.• tutti i virus a rna , ad eccezione del virus influenzale, si replicano nel citoplasma, e tutti i virus adna, ad eccezione del poxovirus, si replicano nel nucleo• i virus a dna, e il virus influenzale oltre a attraversare la membrana citoplasmatica devonoattraversare anche la membrana nucleare.• a livelo di questa troviamo il complesso del poro nucleare, costituito da 50 nucleoporine chehanno il compito di trasferire le molecole all'interno o all'esterno del nucleo.• studi recenti hanno dimostrato che attraverso il complesso del poro possono passareparticelle che hanno dimensione intorno a 36nm.• per cui si è visto che i parvovirus, che hanno dimensioni di 8-25 nm e gli epadnavirus,soprattuto il virus dell'epatite b, che hanno dimensioni intorno i 35nm possono attraversare lamembrana del poro senza bisogno di essere disassemblati, cioè privati dei costituenti esterni.____

quarta fase:ESPRESSIONE____

• il genoma virale deve provvedere a ricostruire tutti i componenti per dare luogo a un nuovaprogenie virale, per fare cio deve utilizzare tutti meccanismi biosintetici della cellula ospite.• la fase che piu dipende dalla cellula ospite è la sintesi proteica• i virus devono presentare ai ribosomi gli rna messaggeri in maniera tale essere letti e tradotti alivello poliribosomiale.• la cellula però pone dei limiti: essa forma i suoi rna messaggeri a livello del nucleo e sustampo del dna. i virus che possono raggiungere il nucleo e sono a dna possono raggiungereil nucleo e far sintetizzare messaggeri.• i virus a rna hanno rna che funge esso stesso da messaggero, oppure devono sintetizzare unapolimerasi rna dipendente che svolga questo compito.• esistono diverse strategie per fare cio a seconda che si tratti virus a dna o rna.• i virus a rna rappresentano gli unici esempi in cui l'rna funziona da depositario dell'informazionegenetica, e quindi, dato che la cellula non forma rna su stampo di rna, alcuni virus a rna devonopossedere una polimerasi in grado di operare la trascrizione.____

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replicazione deivirus a RNA____

• nei virus a rna noteremo 5 strategie di replicazione diverse:• nei virus a polarità positiva non hanno bisogno di essere trascritti, ma funzionano subito damessaggeri. nei poliovirus e nei flavivirus (rna a polarità +) il prodotto della trascrizione dellasuccessiva traduzione è una poliproteina che viene scissa da enzimi virali in proteine strutturalie proteine funzionali. le proteine strutturali sono quelle che faranno parte della struttura delvirus, mentre tra le proteine funzionali abbiamo la rna polimerasi rna dipendente la qualetrascrive l'rna genomico formando rna messaggero. quesro rna genomico funge da stampo per lasintesi di una rna a polarità negativa, la quale funzionerà da stampo per la sintesi di una rna apolaritò positivo che farà parte della progenie virale.• nei togavirus (rna +) vi sarà prima la traduzione dell'estremità 5' che codificano per le proteinefunzionali. dopo la replicazione del genoma si formeranno le proteine strutturali che faranno partedell'estremità 3'. questi virus rna+ chiaramente possiedono già una rna polimerasi rna dipendenteche viene sintetizzata tra le proteine funzionali all'inizio del ciclo replicativo, e non hanno bisognodi veicolarla con loro gia pronta.• nei virus a polarità negativa , non avendo rna+ non possono avere messaggeri, quindi hannobisogno della rna polimerasi rna dipendente veicolata dal virus stesso. il prodotto dellatraduzione è rappresentato da proteine funzionali e strutturali. tra le proteine funzionali siformerà la rna polimerasi rna dipendente la quale trascrive l'rna- in rna+ che viene dettofilamento antigenomico. questa molecola, pur essendo a polarità positiva non funge damessaggero, ma fungerà da stampo all'rna negativo che apparterrà alla progenie virale.• i virus a polarità negativa con rna plurisegmentato (orthomixovirus - virus influenza) hannola particolarità di avere un genoma costituito da 7-8 segmenti. ogni segmento verrà trascrittoseparatamenteo. in oltre, all'estremità 5' hanno sequenze nucleotidiche non virali, ma chehanno sottratto agli rna messaggeri cellulari, per tale motivo, pur essendo a rna hanno unafase nucleare.• vi sono virus rna detti ambisenso con polarità sia positiva che negativa. in questo casi ilvirus si comporta come avesse solo rna negativo: forma una molecola antigenomica che fungeràda stampo per il genoma delle nuove particelle virali.• i virus a rna bicatenari sono gli orbivirus, i rotavirus e i reovirus. questi sono caratterizzati dalfatto di un rna bicatenario circondato da un doppio involucro esterno. il virus nel citoplasmaperde l'involucro piu esterno: cio provoca la permeabilizzazione dello strato piu interno conattivazione della rna polimerasi rna dipendente che ha il compito di operare la trascrizionedell'acido nuclei virale. i prodotti della trascrizione sono rna messaggeri che vengono tradotti inproteine strutturali, e possono anche fungere da stampo per la sintesi del genoma, che all'iniziosarà monocatenario, e successivamente, quando sarà assemblaro per la costituzione di nuoveparticelle virali, assumerà struttura bicatenaria.• i retrovirus sono dei virus caratterizzati da due molecole di rna a polarità positiva identiche.gli rna verranno trascritti in rna messaggeri, che fungeranno da stampo per molecole diDNA. questo fenomeno insolito prende il nome di retrotrascrizione, operato dalla DNApolimerasi RNA dipendente (o trascrittasi inversa). la nuova molecola di dna raggiunge ilnucleo, e ad opera di un enzima detto integrasi verrà integrata al genoma cellulare. così puòdare luogo ad una infezione latente o può dare inizio ad un processo di trascrizione cheporterà ad un ciclo produttivo, oppure possono essere espresse alcune proteine virali.____

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replicazione deivirus a DNA____

• i virus a dna sono tutti a dna bicatenario, quasi sempre lineare, con eccezione del parvovirus,che ha un dna moncatenario lineare, gli epadnavirus, con dna parzialmente bicatenario, e lafamiglia papomviridae e papillomaviridae hanno un dna circolare.• i virus a dna normalmente si replicano in cellule che sono infase attiva di replicazione, moltospesso esistono virus che producono proteine che stimolano la cellula a entrare in fase direplicazione. come sempre abbiamo detto i virus a dna si replicano in sede nucleare ad opera dienzimi cellulari: dna polimearsi dna dipendente.• fa eccezione il poxvirus, (ai quali appartiene il virus del vaiolo) che si replica nel citoplasma.• in seguito alla traduzione del genoma negli adenovirus e herpesvirus si formeranno 3 gruppidi composti: proteine precocissime, precoci e tardive• le proteine precocissime e precoci hanno funzione enzimatica e regolatoria• le proteine tardive hanno esclusivamente funzione strutturale• nella famiglia papomaviridae e papillomaviridae si formeranno due classi di proteine:precoci e tardive• i poxvirus compiono il loro ciclo replicativo nel citoplasma ad opera di enzimi cellulari. dopo latrascrizione che avviene ad oipera di enzimi cellulari, si formeranno mrna che verranno tradotti inproteine precoci,e fra queste proteine precoci abbiamo degli enzimi che hanno la funzione direplicare l'acido nucleico. avremo dna e rna polimerasi e fattori di crescita necessari alla sintesi deldna.• una volta sintetizzato il dna, questo verrà in parte assemblato per la costituzione delle nuoveparticelle virali, in parte trascritto in rna messaggeri che codificheranno per proteine strutturali.• i parvovirus sono virus a dna monocatenari, e nell'ambito di questi virus dobbiamo distinguerequelli che possono replicarsi autonomamente da quelli che hanno bisogno di virus hepler (come gliadenovirus).• nel caso di virus autonomi, come ad esempio il parvovirus b19, in un primo tempo il virus cheha una sola catena di dna raggiunge il nucleo, in maniera tale che si possa formare la catenacomplementare ad opera di enzimi nucleari. questa si formerà grazie alla presenza all'estremità delgenoma di catene nucleotidiche ripetute invertite che replicandosi a forcina formano una specie diinnesco necessario alla polimerasi cellulare per la sintesi della catena. a questo punto si formerà unadoppia catena di dna, che successivamente verrà scissa da una proteasi virale in due catenepolinucleotidiche complementari.• gli epadnavirus, a cui appartiene il virus dell'epatite b, hanno dna parzialmente bicatenario conuna interruzine nella catena apolarità positiva. il virus raggiunge il nucleo dove ad opera di enzimicellulari verrà trasformato in una molecola completamenta bicatenaria. questa molecola completamentebicatenaria verrà traascritta in rna chiamati genomici e subgenomici. gli rna subgenomici funzionanoesclusivamente da messaggeri. mentre quelli genomici fungono da stampo per la sintesi dellamolecola negativa di DNA. analogamente ai retrovirus abbiamo un processo diretrotrascrizione, ad opera di una trascrittasi inversa.____

quinta fase:MATURAZIONE____

• la fase di assemblaggio avviene spontaneamente: le varie subunità virali si dispongonodiversamente nello spazio in modo da costituire la struttura virale.• l'assemblaggio per i virus nudi può avvenire nel citoplasma (poliovirus) o nel nucleo(adenovirus). durante la fase di assemblaggio possono avvenire nel virus modificazionnibiochimiche che lo portano a maturare, rendendolo pronto per uscire dalla cellula ospite.• la fase di assemblaggio può avere errori, perchè possono formarsi capsidi vuoi o incompleti.• per i virus nudi, l'uscita del virus dalla cellula ospite avviene per esocitosi, tramite variazionedella permeabilità cellulare e blocco delle sintesi macromolecolari della cellula.• per i virus con envelope la fuoriuscita avviene per gemmazione attraverso due modalità:attraverso la membrana citoplasmatica previo inserimento di proteine e glicoproteine viralisulla membrana della cellula che gemmerà, o attraverso la membrana nucleare.• per gli herpesvirus il processo di gemmazione avviene nella membrana nucleare, quindi l'involucroderiva dalla membrana nucleare. il virus si ritrova in vescicole secretorie che trasportano i virus attraverso ilcitosol cellulare e lo riversano all'esterno mediante fusione delle loro membrane con la membrana dellacellula ospite.• generalmente per i virus fuoriescono per lisi cellulare e si ha la morte della cellula, ma ci sonoalcuni virus, come il virus della rabbia e il virus della rosolia (virus teratogeno: provocamalformazioni al feto), che nonstante vengano liberati in continuazione dalla cellula ospite non necompromettono la vitalità.____

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effetto citopatico____

• se non disponiamo di un microscopio elettronico non vediamo virus, ma attraverso unmicroscopio ottico possiamo vedere le cellule, e dagli effetti che comporta un virus capire se lecellule sono infette.• la presenza di un virus altera le caratteristiche morfologiche, alterazioni antigeniche, blocco dellasintesi di componenti macromolecolari, e alterazioni del controllo del ciclo celulare.• la presenza di un virus in un tappeto cellulare, al suo moltiplicarsi, determinerà l'effettocitopatico, che induce: arrotondamento delle cellule che perdono la normale morfologia; lecellule si distaccano dalla superficie del vetro, si raggrinzano.• possono formarsi anche dei sincizi: cellule polinucleate. la formazione di sincizi avviene a causadella fusione di membrane cellulari dovute alle proteine fusogene che usano i batteri perpenetrare nella cellula.• per avere tappeti cellulari monostratificati tra le cellule che adoperiamo in laboratorio hannomolta importanza le cellule ila, che sono cellule tumorali che provengono da una donna che avevaun carcinoma uterino. queste cellule ancora si mantengono in tutti i laboratori del mondo. questevengono adoperate per coltivare materiali clinici da cui vogliamo isolare virus.• anche il trattamento con tripsina di reni di scimmia ci permette di avere tappeti cellularimonostratificati• possono formarsi inclusioni nucleari o citoplasmatiche, e possono formarsi in vivo. sono statidi grande aiuto nelle sezioni istologiche per la diagnosi di infezione virale• sono molto importanti le inclusioni date dal virus della rabbia, che si formano nelle cellulenervose (corpi del negri), nelle cellule epiteliali (corpi del guarneri); le inclusioni da herpesviruspossono verificarsi nelle cellule epiteliali• i poliribosimo cellulari sono occupati a tradurre proteine virali, e viene meno la sintesi dimacromolecole, in alcuni casi anche di dna e proteine (come negli herpesvirus). in altri casi siimpedisce il trasferimento del rna messaggero dal nucleo al citoplasma• il virus inserirà proteine o glicorpoteine virus-modificate, modificando la componente antigenicadella cellula.• la cellula, che per difendersi esporra complessi mhc1, verrà inibita dal virus in questa espressioneper evitare la apoptosi.• molti virus che hanno rilevanza patologica negli umani impediscono l'apoptosi: un processo che ilsistema immunitario mette in moto per proteggersi dai virus.• un altro meccanismo è quello di interferire conla proliferazione cellulare: la cellula va incontro aimmortalizzazione o trasformazione (cancerogenesi)____